CN103355164A

CN103355164A - 一种多倍体小桐子的诱导方法

Info

Publication number: CN103355164A
Application number: CN2013101526931A
Authority: CN
Inventors: 徐增富; 牛龙见; 陈茂盛; 付乾堂
Original assignee: Xishuangbanna Tropical Botanical Garden of CAS
Current assignee: Xishuangbanna Tropical Botanical Garden of CAS
Priority date: 2013-04-27
Filing date: 2013-04-27
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明公开了一种多倍体小桐子的诱导方法。在小桐子幼苗长出两片子叶和一片真叶时，将脱脂棉放在两片子叶中间的顶端生长点上，每天分三次用1％DMSO配制的0.1％-0.8%秋水仙素溶液滴到脱脂棉上；持续处理1～10天后的幼苗在培养室继续生长两个星期，移植到田间生长；待植株高度为50cm时根据叶片下表皮气孔大小筛选多倍体，再进一步采用流式细胞仪对成熟叶片细胞核内DNA含量进行测定，鉴定出多倍体；对于能正常开花结果的多倍体小桐子，对其萌发种子根尖细胞核中的染色体数目进行检测计数。本发明方法简便、实验室条件要求不高、实验重复性好、诱导周期短、效率高，在一年内即可得到多倍体第一代种子，具有很好的应用前景。

Description

一种多倍体小桐子的诱导方法

技术领域

本发明属于植物遗传育种技术领域，涉及诱导植物多倍体的方法，尤其是小桐子（Jatropha curcas L.）的多倍体诱导方法。

背景技术

多倍体（polyploid）是指具有三套及三套以上染色体组的生物体，多倍体化是生物界进化的一种方式。在自然界中，一些极端环境条件，如温度变化和宇宙射线等可导致多倍体产生。人工诱导植物多倍体主要是采用秋水仙素或氨磺灵等化学处理、物理辐射诱导以及原生质体融合等方法来获得。多倍体植物常常表现出抗逆性强、生长旺盛、有机营养成分含量高，因而在蔬菜、花卉、水果、中药和林木育种上被广泛应用。特别是通过多倍体技术获得的三倍体无籽西瓜是多倍体诱导技术在育种方面应用的一个里程碑。近年来通过异缘杂交和染色体加倍技术培养出的八倍体小黑麦更是展现了多倍体技术在培育植物新品种方面独具的优势。

小桐子（Jatropha curcas L.）又名小油桐、麻疯树、膏桐，属于大戟科(Euphorbiaceae)麻风树属（Jatropha），分布在热带和亚热带地区，其种子的含油量高达40%，是一种具有很大应用潜力的能源植物。然而由于小桐子缺乏优良的栽培品种，产量低，不能满足大规模商业化生产的需要。因此，利用多倍体诱导技术来获得小桐子多倍体，从而改良小桐子的遗传性状，获得抗逆性强的高产小桐子新品种，具有良好地应用前景。但目前已经报道的小桐子多倍体诱导方法多是建立在组织培养基础上的方法，对实施者技术和实验室条件要求较高。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简便、诱导周期短的多倍体小桐子的诱导方法，在非组织培养条件下，直接使用秋水仙素处理小桐子幼苗顶端生长点，诱导顶端生长点细胞染色体加倍，从而得到小桐子的多倍体。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。

一种多倍体小桐子的诱导方法，包括以下步骤：

（1）将成熟饱满的小桐子种子播种到育苗袋里，每个育苗袋播种两粒种子，置于25℃培养室，每天8小时光照，进行萌发；

（2）当小桐子幼苗长出两片子叶和一片真叶时，将脱脂棉放在两片子叶中间的顶端生长点上，脱脂棉与幼苗顶端生长点要尽可能接触；

（3）将小桐子幼苗置于25℃培养室，每天8小时光照生长，每天分别在8:00，16:00和23:00时，分三次用1％DMSO（二甲基亚砜）配制的0.1％～0.8%秋水仙素溶液滴到脱脂棉上对幼苗顶端生长点细胞进行处理，持续处理1～10天；

（4）处理后的小桐子幼苗在25℃培养室继续生长两个星期后，移栽至田间生长；

（5）待小桐子幼苗生长至植株高度为50cm时进行多倍体的筛选和鉴定。

优选的光照强度为5～8μmoles/m²/s。

优选以0.1%秋水仙素持续处理7天。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：一、操作简便，对操作人员的技术要求较低：二、实验条件要求较低，易于控制，实验重复性好；三、诱导周期短，在一年内即可得到多倍体第一代种子，可加快多倍体育种进程。

附图说明

图1二倍体、四倍体和八倍体小桐子的气孔。

图2二倍体、四倍体和八倍体小桐子叶片细胞核的流式细胞仪检测结果。

图3二倍体和四倍体小桐子的雌雄花以及花粉粒大小。

图4二倍体和四倍体小桐子的果实和种子照片。

图5二倍体和四倍体小桐子根尖细胞的染色体数量。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限制。

实施例1

1.取材：小桐子种子采自位于云南省西双版纳傣族自治州勐腊县勐仑镇的中国科学院西双版纳热带植物园内。

2.将成熟饱满的小桐子种子播种到育苗袋里（8×10cm），每个育苗袋播种两粒种子，置于25℃培养室（8小时光照，光照强度5-8μmoles/m2/s，下同），进行萌发。

3.当小桐子幼苗长出两片子叶和一片真叶时，将脱脂棉放在两片子叶中间的顶端生长点上。脱脂棉与幼苗顶端生长点要尽可能接触，以确保随后加到脱脂棉上的药液能完全作用到顶端生长点细胞。

4.将小桐子幼苗置于25℃的培养室（8小时光照）生长。每天分别在8:00，16:00和23:00时，分三次用1％DMSO（二甲基亚砜）配制的0.1％秋水仙素溶液滴到脱脂棉上进行处理，持续处理时间为1-10天。

5.处理后的小桐子幼苗在25℃的培养室继续生长两个星期后，移栽至田间生长。

6.秋水仙素处理后的小桐子幼苗生长至植株高度为50cm左右时进行多倍

体的筛选和鉴定。首先在显微镜下观察待检测的小桐子叶片下表皮气孔，将气孔长度显著大于未处理对照的植株筛选出来（图1）。

7.然后从上述筛选出的植株上取刚成熟的叶片，进一步使用流式细胞仪进行细胞核内DNA含量的测定，与未处理的二倍体对照植株进行比较，鉴定出四倍体或八倍体植株（图2）。采用0.1％秋水仙素处理不同时间诱导获得多倍体小桐子的效率见表1。

8.四倍体小桐子植株可以正常开花和结果（图3和图4），但八倍体小桐子植株矮小，不能正常开花。从成熟的四倍体小桐子植株上收获种子，进行萌发，待幼根长至3-5cm时，取5-8mm根尖，用醋酸洋红进行染色，然后进行镜检，进一步确认四倍体的染色体数目（图5，2n=22，4n=44）。

表10.1%秋水仙素处理诱导小桐子多倍体的效率

实施例2

重复实施例1，但有以下不同点：采用0.2％秋水仙素对小桐子幼苗顶端生长点细胞进行处理，其诱导效率见表2。

表20.2%秋水仙素处理诱导小桐子多倍体的效率

实施例3

重复实施例1，但有以下不同点：采用0.4％秋水仙素对小桐子幼苗顶端生长点细胞进行处理，其诱导效率见表3。

表30.4%秋水仙素处理诱导小桐子多倍体的效率

实施例4

重复实施例1，但有以下不同点：采用0.6％秋水仙素对小桐子幼苗顶端生长点细胞进行处理，其诱导效率见表4。

表40.6%秋水仙素处理诱导小桐子多倍体的效率

实施例5

重复实施例1，但有以下不同点：采用0.8％秋水仙素对小桐子幼苗顶端生长点细胞进行处理，其诱导效率见表5。

表50.8%秋水仙素处理诱导小桐子多倍体的效率

Claims

1.一种多倍体小桐子的诱导方法，包括以下步骤：

（3）将小桐子幼苗置于25℃培养室，每天8小时光照生长，每天分别在8:00，16:00和23:00时，分三次用1％DMSO配制的0.1％～0.8%秋水仙素溶液滴到脱脂棉上对幼苗顶端生长点细胞进行处理，持续处理1～10天；

2.根据权利要求1所述的多倍体小桐子的诱导方法，其特征在于：所述的8小时光照，其光照强度为5～8μmoles/m²/s。

3.根据权利要求1所述的多倍体小桐子的诱导方法，其特征在于：步骤（3）中优选以0.1%秋水仙素持续处理7天。