CN106508661B - 一种创建金线莲多倍体资源的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种创建金线莲多倍体资源的方法，所述的方法具体为：以金线莲为母本，血叶兰为父本，通过属间远缘杂交、杂种群体构建、2n配子杂种后代的鉴定、2n配子杂种后代的筛选以及2n配子杂种后代的自交后获得金线莲多倍体植株。本发明的目的是提供一种创建金线莲多倍体资源的方法，该方法采用金线莲为母本，血叶兰为父本进行杂交可以获得在较短的周期内获得金线莲多倍体资源，其操作性强、效率离、成本低等特点。
Description
技术领域
本发明涉及作物遗传育种技术领域，尤其涉及一种创建金线莲多倍体资源的方法。
背景技术
金线莲(Anoectochilusroxburghii)即花叶开唇兰，是兰科开唇兰属的一种多年生草本植物，主要分布于福建、浙江、广西、江西和台湾等地，以福建、台湾为主产地。金线莲是我国传统珍贵药材，有清凉解毒，滋阴降火，消炎止痛等功效，常被用于糖尿病、高血脂、肝炎等慢性疾病的治疗，有“药王”、“金草”等美誉。此外，金线莲株型小巧，叶型优美，叶脉金黄色或白色呈网状排列，具有极高的观赏价值。近年来，由于市场供不应求，人们过度采挖，环境恶化，金线莲自然资源日趋枯竭。目前，现有的金线莲均为二倍体，生长缓慢，株高仅5～10cm,产量很低，药效成分更低。植物多倍体化后根、茎、叶等营养器官变大，次生代谢物含量提高，因此培育多倍体金线莲是提高金线莲药材产量的途径之一。
植物多倍体的获得可通过物理、化学和生物学的方法创建。与传统的物理和化学法相比，利用生物学的2n配子途径创建多倍体具有独特的优势，不仅可直接获得三倍体、四倍体等多倍体资源，还可传递亲本更高的杂合性并能克服杂种不育。2n配子的发生即可自然发生，也可人工诱导。目前，人工诱导2n配子发生的方法主要有温度激变、气体诱变、电离辐射等物理法以及秋水仙素、安磺灵、氟乐灵、咖啡碱等化学诱变法。由于物理、化学诱导2n配子发生存在2n配子亲和力低下、诱导率低，效率不稳定等问题，物理、化学法诱导2n配子并未能有效地应用于育种实践。
发明内容
本发明的目的是提供一种创建金线莲多倍体资源的方法，该方法采用金线莲为母本，血叶兰为父本进行杂交可以获得在较短的周期内获得金线莲多倍体资源，其操作性强、效率离、成本低等特点。
本发明的技术方案为：一种创建金线莲多倍体资源的方法，所述的方法具体为：以金线莲为母本，血叶兰为父本，通过属间远缘杂交、杂种群体构建、2n配子杂种后代的鉴定、2n配子杂种后代的筛选以及2n配子杂种后代的自交后获得金线莲多倍体植株。
在上述的创建金线莲多倍体资源的方法中，所述的属间远缘杂交的具体步骤为：
待母本和父本开花后，取出金线莲花朵中的花粉块，将血叶兰的花粉块授于金线莲的蕊腔中。
在上述的创建金线莲多倍体资源的方法中，杂种群体构建的具体方法为：采收经过属间远缘杂交获得的成熟果实的种子进行培养，获得第一试管苗，将第一试管苗移栽后栽培至植株开花。
在上述的创建金线莲多倍体资源的方法中，所述的经过属间远缘杂交获得的成熟果实的种子进行培养获得第一试管苗的具体方法为：将种子均匀撒于种子萌发培养基中，在25～28℃条件进行暗培养直至种子萌发。当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx条件下进行生根壮苗培养，获得1～2cm高的第一试管苗。
在上述的创建金线莲多倍体资源的方法中，2n配子杂种后代的鉴定的具体方法为：鉴定经过杂种群体构建得到的植株的花朵的成熟花粉，统计2n花粉的发生频率。
在上述的创建金线莲多倍体资源的方法中，2n配子杂种后代的筛选的具体方法为：对于2n花粉发生率大于1％的植株分盆栽培获得2n花粉发生率持续至少2年大于1％的植株确定为2n配子杂种后代。
在上述的创建金线莲多倍体资源的方法中，2n配子杂种后代自交后还包括将2n配子杂种后代自交后得到的成熟果实中的种子进行培养获得第二试管苗，筛选获得金线莲多倍体植株。
在上述的创建金线莲多倍体资源的方法中，所述的将2n配子杂种后代自交后得到的成熟果实中的种子进行培养获得第二试管苗的具体方法为：将2n配子杂种后代自交后得到的成熟果实中的种子撒于种子萌发培养基中，在25～28℃条件进行暗培养直至种子萌发，当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx条件下进行生根壮苗培养，待第二试管苗长至5～8cm并具有2条以上根时，将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方放置3～5天后取出第二试管苗。
在上述的创建金线莲多倍体资源的方法中，从成熟果实中获取种子的过程中，包括对对成熟果实进行消毒处理，所述的消毒处理的方法具体为：成熟果实先用自来水冲洗10～20min后，用75％的乙醇浸泡20～40s后置于0.1vol％的升汞溶液中消毒15～30min，无菌水冲洗3～5次晾干后备用。
在上述的创建金线莲多倍体资源的方法中，所述的种子萌发培养基为：1/2MS、0.1～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8；
所述的壮苗培养基为：0.5～2.0g/L花宝1号、0.1～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100g/L香蕉汁、0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
需要说明的是：50～100g/L香蕉汁是指在1L培养基中，含有50-100g去皮香蕉。
50～100ml/L椰子汁是指1L培养基中，含有50-100ml天然椰汁或与天然椰汁浓度相同或相近的椰汁。
本发明的有益效果如下：
本发明利用金线莲(Anoectochilusroxburghii)×血叶兰(Ludisiadiscolor)进行属间远缘杂交产生2n配子杂种后代的方法，通过亲本选配、远缘杂交、杂种群体构建、2n配子杂种后代的鉴定等步骤，实现了金线莲多倍体资源的创建，从而实现了本发明的目的。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
本发明的创建金线莲多倍体资源的方法，包括以下的工艺步骤：
(1)亲本选配：在温室中选取生长健壮的金线莲(Anoectochilusroxburghii)作母本，血叶兰(Ludisiadiscolor)作为父本。
(2)远缘杂交：将步骤(1)的亲本进行精心栽培管理，待亲本开花时用镊子取出金线莲当天开花花朵中的花粉块，将血叶兰的花粉块授于金线莲的蕊腔中。
(3)杂种群体构建：采收步骤(2)远缘杂交获得的成熟果实经消毒后用解剖刀纵向切开果实，将种子均匀撒于种子萌发培养基中，在25～28℃条件进行暗培养直至种子萌发。当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx条件下进行生根壮苗培养。待试管苗长至5～8cm并具有2条以上根时，将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方放置3～5天后取出试管苗移栽于体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中，试管苗移栽后精心管理直至植株开花。
(4)2n配子的鉴定：待步骤(3)的植株开花后，采集植株新鲜成熟的花粉，采用直接压片法制片后于光学显微镜下观察2n花粉，统计2n花粉的发生频率。
(5)2n配子杂种后代的筛选：对经步骤(4)鉴定的2n花粉发生率大于1％的植株进行分盆栽培，并经两年以上重复鉴定，筛选出发生率高且稳定的植株即为2n配子杂种后代。
(6)2n配子杂种后代自交：对步骤(5)获得的2n配子杂种后代进行精心栽培管理，待植株开花后使其自然授粉。
(7)多倍体资源的获得：采收步骤(6)自交获得的成熟果实经消毒后用解剖刀纵向切开果实，将种子均匀撒于种子萌发培养基中，在25～28℃条件进行暗培养直至种子萌发。当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx条件下进行生根壮苗培养。待试管苗长至5～8cm并具有2条以上根时，将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方放置3～5天后取出试管苗，对试管苗采用根尖直接压片法制片后于光学显微镜下进行染色体计数，筛选多倍体植株。将筛选得到的多倍体植株移栽于体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得金线莲多倍体资源。
步骤(3)和(7)所采用的果实消毒处理为：采集回实验室的果实先自来水冲洗10～20min后，用75％的乙醇浸泡20～40s后置于0.1％的升汞溶液中消毒15～30min，无菌水冲洗3～5次晾干后备用；
步骤(3)和(7)所述的种子萌发培养基为：1/2MS+0.1～0.5mg/LNAA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂+50～100ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8；
步骤(3)和(7)所述的壮苗培养基为：0.5～2.0g/L花宝1号(HYPONeX1)+0.1～1.0mg/LNAA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂+50～100g/L香蕉汁+0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
为了进一步的对本发明的优势进行说明，本发明提供以下实施例进行进一步的论证。
实施例一
(1)亲本选配：在温室中选取生长健壮的福建产金线莲(Anoectochilusroxburghii)作母本，广西产血叶兰(Ludisiadiscolor)作为父本。
(2)远缘杂交：将步骤(1)的亲本进行精心栽培管理，待亲本开花时用镊子取出金线莲当天开花花朵中的花粉块，将血叶兰的花粉块授于金线莲的蕊腔中。授粉3～4个月后，结实率为43.6％。
(3)杂种群体构建：采收步骤(2)远缘杂交获得的成熟果实于自来水冲洗10min后，用75％的乙醇浸泡20s后置于0.1％的升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗3次晾干后用解剖刀纵向切开果实，将种子均匀撒于种子萌发培养基中，在25℃条件进行暗培养120天后种子开始萌发，萌发率为56.3％。当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为25℃，光照强度为1500lx条件下进行生根壮苗培养。待试管苗长至5～8cm并具有2条以上根时，将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方放置3天后取出试管苗移栽于体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中，试管苗移栽后精心管理直至植株开花。
(4)2n配子的鉴定：待步骤(3)的植株开花后，采集植株新鲜成熟的花粉，采用直接压片法制片后于光学显微镜下观察2n花粉，统计2n花粉的发生频率。杂交后代的2n配子发生率最高达到2.13％。
(5)2n配子杂种后代的筛选：对经步骤(4)鉴定的2n花粉发生率大于1％的植株进行分盆栽培，并经两年以上重复鉴定，筛选出发生率高且稳定的植株即为2n配子杂种后代。
(6)2n配子杂种后代自交：对步骤(5)获得的2n配子杂种后代进行精心栽培管理，待植株开花后使其自然授粉。授粉3～4个月后，结实率为56.4％。
(7)多倍体资源的获得：采收步骤(6)自交获得的成熟果实于自来水冲洗10min后，用75％的乙醇浸泡20s后置于0.1％的升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗3次晾干后用解剖刀纵向切开果实，将种子均匀撒于种子萌发培养基中，在25℃条件进行暗培养120天后种子开始萌发，萌发率为71.6％。当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为25℃，光照强度为1500lx条件下进行生根壮苗培养。待试管苗长至5～8cm并具有2条以上根时，将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方放置3天后取出试管苗，对试管苗采用根尖直接压片法制片后于光学显微镜下进行染色体计数，筛选多倍体植株，多倍体发生率为2.98％，其中以三倍体和四倍体为主。将筛选得到的多倍体植株移栽于体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得金线莲多倍体资源。
步骤(3)和(7)所述的种子萌发培养基为：1/2MS+0.2mg/LNAA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+50ml/L椰子汁，pH为5.4；
步骤(3)和(7)所述的壮苗培养基为：1.0g/L花宝1号(HYPONeX1)+0.3mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+50g/L香蕉汁+0.2g/L活性炭，pH为5.4。
实施例二
(1)亲本选配：在温室中选取生长健壮的台湾产金线莲(Anoectochilusroxburghii)作母本，广东产血叶兰(Ludisiadiscolor)作为父本。
(2)远缘杂交：将步骤(1)的亲本进行精心栽培管理，待亲本开花时用镊子取出金线莲当天开花花朵中的花粉块，将血叶兰的花粉块授于金线莲的蕊腔中。授粉3～4个月后，结实率为38.9％。
(3)杂种群体构建：采收步骤(2)远缘杂交获得的成熟果实于自来水冲洗15min后，用75％的乙醇浸泡25s后置于0.1％的升汞溶液中消毒18min，无菌水冲洗4次晾干后用解剖刀纵向切开果实，将种子均匀撒于种子萌发培养基中，在26℃条件进行暗培养120天后种子开始萌发，萌发率为39.6％。当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为26℃，光照强度为1800lx条件下进行生根壮苗培养。待试管苗长至5～8cm并具有2条以上根时，将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方放置4天后取出试管苗移栽于体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中，试管苗移栽后精心管理直至植株开花。
(4)2n配子的鉴定：待步骤(3)的植株开花后，采集植株新鲜成熟的花粉，采用直接压片法制片后于光学显微镜下观察2n花粉，统计2n花粉的发生频率。杂交后代的2n配子发生率最高达到1.56％。
(5)2n配子杂种后代的筛选：对经步骤(4)鉴定的2n花粉发生率大于1％的植株进行分盆栽培，并经两年以上重复鉴定，筛选出发生率高且稳定的植株即为2n配子杂种后代。
(6)2n配子杂种后代自交：对步骤(5)获得的2n配子杂种后代进行精心栽培管理，待植株开花后使其自然授粉。授粉3～4个月后，结实率为43.9％。
(7)多倍体资源的获得：采收步骤(6)自交获得的成熟果实于自来水冲洗15min后，用75％的乙醇浸泡30s后置于0.1％的升汞溶液中消毒20min，无菌水冲洗5次晾干后用解剖刀纵向切开果实，将种子均匀撒于种子萌发培养基中，在25℃条件进行暗培养120天后种子开始萌发，萌发率为57.1％。当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为26℃，光照强度为1800lx条件下进行生根壮苗培养。待试管苗长至5～8cm并具有2条以上根时，将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方放置5天后取出试管苗，对试管苗采用根尖直接压片法制片后于光学显微镜下进行染色体计数，筛选多倍体植株，多倍体发生率为1.38％，其中以三倍体和四倍体为主。将筛选得到的多倍体植株移栽于体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得金线莲多倍体资源。
步骤(3)和(7)所述的种子萌发培养基为：1/2MS+0.6mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+80ml/L椰子汁，pH为5.6；
步骤(3)和(7)所述的壮苗培养基为：1.5g/L花宝1号(HYPONeX1)+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+4.5g/L琼脂+70g/L香蕉汁+0.3g/L活性炭，pH为5.6。
实施例三
(1)亲本选配：在温室中选取生长健壮的江西产金线莲(Anoectochilusroxburghii)作母本，越南产血叶兰(Ludisiadiscolor)作为父本。
(2)远缘杂交：将步骤(1)的亲本进行精心栽培管理，待亲本开花时用镊子取出金线莲当天开花花朵中的花粉块，将血叶兰的花粉块授于金线莲的蕊腔中。授粉3～4个月后，结实率为60.7％。
(3)杂种群体构建：采收步骤(2)远缘杂交获得的成熟果实于自来水冲洗20min后，用75％的乙醇浸泡30s后置于0.1％的升汞溶液中消毒25min，无菌水冲洗5次晾干后用解剖刀纵向切开果实，将种子均匀撒于种子萌发培养基中，在26℃条件进行暗培养120天后种子开始萌发，萌发率为50.1％。当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为28℃，光照强度为2000lx条件下进行生根壮苗培养。待试管苗长至5～8cm并具有2条以上根时，将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方放置5天后取出试管苗移栽于体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中，试管苗移栽后精心管理直至植株开花。
(4)2n配子的鉴定：待步骤(3)的植株开花后，采集植株新鲜成熟的花粉，采用直接压片法制片后于光学显微镜下观察2n花粉，统计2n花粉的发生频率。杂交后代的2n配子发生率最高达到2.64％。
(5)2n配子杂种后代的筛选：对经步骤(4)鉴定的2n花粉发生率大于1％的植株进行分盆栽培，并经两年以上重复鉴定，筛选出发生率高且稳定的植株即为2n配子杂种后代。
(6)2n配子杂种后代自交：对步骤(5)获得的2n配子杂种后代进行精心栽培管理，待植株开花后使其自然授粉。授粉3～4个月后，结实率为63.8％。
(7)多倍体资源的获得：采收步骤(6)自交获得的成熟果实于自来水冲洗20min后，用75％的乙醇浸泡30s后置于0.1％的升汞溶液中消毒30min，无菌水冲洗5次晾干后用解剖刀纵向切开果实，将种子均匀撒于种子萌发培养基中，在25℃条件进行暗培养120天后种子开始萌发，萌发率为43.9％。当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为28℃，光照强度为1800lx条件下进行生根壮苗培养。待试管苗长至5～8cm并具有2条以上根时，将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方放置5天后取出试管苗，对试管苗采用根尖直接压片法制片后于光学显微镜下进行染色体计数，筛选多倍体植株，多倍体发生率为2.09％，其中以三倍体和四倍体为主。将筛选得到的多倍体植株移栽于体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得金线莲多倍体资源。
步骤(3)和(7)所述的种子萌发培养基为：1/2MS+1.0mg/LNAA+30g/L蔗糖+5.0g/L琼脂+100ml/L椰子汁，pH为5.8；
步骤(3)和(7)所述的壮苗培养基为：2.0g/L花宝1号(HYPONeX1)+1.0mg/LNAA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂+100g/L香蕉汁+0.3g/L活性炭，pH为5.8。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种创建金线莲多倍体资源的方法，其特征在于：所述的方法具体为：以金线莲为母本，血叶兰为父本，通过属间远缘杂交、杂种群体构建、2n配子杂种后代的鉴定、2n配子杂种后代的筛选以及2n配子杂种后代的自交后获得金线莲多倍体植株；杂种群体构建的具体方法为：采收经过属间远缘杂交获得的成熟果实的种子进行培养，获得第一试管苗，将第一试管苗移栽后栽培至植株开花；所述的经过属间远缘杂交获得的成熟果实的种子进行培养获得第一试管苗的具体方法为：将种子均匀撒于种子萌发培养基中，在25～28℃条件进行暗培养直至种子萌发。当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx条件下进行生根壮苗培养，获得1～2cm高的第一试管苗；所述的种子萌发培养基为：1/2MS、0.1～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8；所述的壮苗培养基为：0.5～2.0g/L花宝1号、0.1～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100g/L香蕉汁、0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
2.根据权利要求1所述的创建金线莲多倍体资源的方法，其特征在于，所述的属间远缘杂交的具体步骤为：
待母本和父本开花后，取出金线莲花朵中的花粉块，将血叶兰的花粉块授于金线莲的蕊腔中。
3.根据权利要求1所述的创建金线莲多倍体资源的方法，其特征在于，2n配子杂种后代的鉴定的具体方法为：鉴定经过杂种群体构建得到的植株的花朵的成熟花粉，统计2n花粉的发生频率。
4.根据权利要求3所述的创建金线莲多倍体资源的方法，其特征在于，2n配子杂种后代的筛选的具体方法为：对于2n花粉发生率大于1％的植株分盆栽培获得2n花粉发生率持续至少2年大于1％的植株确定为2n配子杂种后代。
5.根据权利要求4所述的创建金线莲多倍体资源的方法，其特征在于，2n配子杂种后代自交后还包括将2n配子杂种后代自交后得到的成熟果实中的种子进行培养获得第二试管苗，筛选获得金线莲多倍体植株。
6.根据权利要求5所述的创建金线莲多倍体资源的方法，其特征在于，所述的将2n配子杂种后代自交后得到的成熟果实中的种子进行培养获得第二试管苗的具体方法为：将2n配子杂种后代自交后得到的成熟果实中的种子撒于种子萌发培养基中，在25～28℃条件进行暗培养直至种子萌发，当种子苗长至1～2cm高时转接至壮苗培养基中，在培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx条件下进行生根壮苗培养，待第二试管苗长至5～8cm并具有2条以上根时，将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方放置3～5天后取出第二试管苗。
7.根据权利要求6所述的创建金线莲多倍体资源的方法，其特征在于，从成熟果实中获取种子的过程中，包括对成熟果实进行消毒处理，所述的消毒处理的方法具体为：成熟果实先用自来水冲洗10～20min后，用75％的乙醇浸泡20～40s后置于0.1vol％的升汞溶液中消毒15～30min，无菌水冲洗3～5次晾干后备用。
8.根据权利要求6所述的创建金线莲多倍体资源的方法，其特征在于，所述的种子萌发培养基为：1/2MS、0.1～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8；
所述的壮苗培养基为：0.5～2.0g/L花宝1号、0.1～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100g/L香蕉汁、0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
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