CN110249962A - 甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种农作物病虫害抗性鉴定方法，具体是甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法。该方法科学，操作过程简单，试验条件要求不高，制备蛭石、土壤和沙子混合土壤，加入甘薯根腐病菌，取几棵生长一致的苗床或田间甘薯茎尖薯苗，剪掉最下面2～3片叶片后用灭菌水清洗干净，放入致病混合培养土壤中，25～27℃室温下培养30天，调查各试验薯苗受根腐病侵染为害等级，计算各重复平均为害级别，通过为害级别的大小即可判断各供试品种薯苗对甘薯根腐病的抗感情况。
Description
技术领域
本发明涉及一种农作物病害抗性鉴定方法，具体的说就是甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法，属于农业植物保护领域。
背景技术
甘薯根腐病是一种主要危害甘薯根茎基部及薯块的重要真菌病害，是制约我国北方甘薯薯区发展的三大病害之一。1937年在山东省首次发现该病，1970年后在我国山东、江苏、河南等全国大范围内都有发生。甘薯根腐病主要发生在大田生长期，在苗床期也有发生。苗床期病薯比健薯出苗晚，出苗率低。出苗后叶色淡，生长缓慢，须根尖端和中部有黑褐色病斑，拔秧时易自病部折断。大田期病株茎蔓生长缓慢，植株矮小，分枝少，每节叶腋处都能现蕾开花，严重时薯蔓节间缩短，叶片自下而上变黄，增厚，干枯脱落，不结薯、结小薯或畸形薯，毛根多或主茎自上而下逐渐干枯死亡。块根受侵染初期表面产生大小不一的褐色至黑褐色病斑，稍凹陷，中后期表皮龟裂，易脱落。
该病为典型的土传性病害，蔓延迅速，防治困难，对甘薯产量影响大，发病地块一般减产20%～30%，严重时可达40%～50%，甚至绝收。
研究表明，目前尚未有有效防治该病害的化学药剂，抗病品种的选育和推广是控制该病害的主要手段。因此，有效、快速、准确的评价品种抗性显得尤其重要。目前对甘薯根腐病的抗性鉴定主要采用田间重病地自然诱发鉴定，但试验基地寻找困难，且需要大量人力物力。目前对甘薯根腐病室内抗性鉴定方法研究较少。1999年，谢逸萍等利用三角瓶，加入研磨成浆的甘薯根腐病菌和蛭石对薯苗进行根腐病抗性鉴定研究，尽管结果与田间结果高度相似，但利用三角瓶品口小不易栽种及存在后期不易管理等问题。邱瑞镰等（1990）采用大田薯蔓注射针接种鉴定，但由于不同品种间薯蔓长势及木质纤维素含量的不同，易导致结果的误差。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法。该方法首先将灭菌蛭石、土壤和细沙子按质量比1：1：1比例混匀后，加入到长80cm*宽40cm*深30cm种植箱中，每500g混合土壤加入首次纯化培养7天的甘薯根腐病菌1皿，将生长一致、去掉下部叶片的甘薯顶尖幼苗，采用株距2～3cm的密集型方式栽种到种植箱中，浇水，光照10h黑暗14h交替培养30天，保持土壤水分10%左右，观察不同品种薯苗对根腐病的抗感程度，能快速、准确的确定薯苗对根腐病的抗性程度，具有简便，易学，省时省力等优点，为甘薯抗病育种筛选大批材料提供技术支持。
本发明是以如下技术方案实现的：甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法，其特征在于：按如下步骤进行：
步骤（1）、病菌分离与培养：从田间采集发病甘薯样品，采用组织分离法获得根腐病菌，再转移至甘薯葡萄糖琼脂培养基上，25-28℃条件下，纯化培养7天，备用；
步骤（2）、参试薯苗准备：从苗床或田间剪取9棵生长一致的甘薯顶尖幼苗，根据薯苗节间长短，以5-6个节间为宜，带回试验室后从叶柄基部剪掉最下面2-3片叶，用灭菌水把薯苗茎基部清洗干净，备用；
步骤（3）、致病土壤制备：将灭菌蛭石、土壤和细沙子按照质量比1：1：1比例混匀，制备成混合土壤，每500g混合土壤加入1皿步骤（1）纯化培养的根腐病菌并混匀，制备致病土壤，备用；
步骤（4）、接种鉴定：将配制好的致病土壤分装在塑料种植箱中，将供试薯苗采用株距2～3cm的密集型方式栽种到种植箱中，浇水，在25～27℃条件下，光照10 h黑暗14 h交替培养30天，保持致病土壤的水分为10%左右；
步骤（5）、调查评价：30天后调查薯苗地上发病情况，并根据发病程度将薯苗受害分级为0～4级共5个等级，根据受害等级和病情指数对根腐病的抗性分为高抗、抗病、中抗、感病和高感五个级别；
薯苗受害分级标准：0 级:无任何症状；1 级：植株出现叶片发黄，其他正常；2 级：叶片显著发黄，分支少而短；3 级：植株萎蔫，生长停滞，显著矮化，老叶脱落；4级：全株死亡。
作为本发明所述的甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法的优选方案：所述病情指数是按以下公式计算：
病情指数单位为%，确定到0.1%；
根据病情指数确定种质甘薯根腐病的抗性；
高抗(病情指数≤20)；
抗病（20＜病情指数≤40）；
中抗（40＜病情指数≤60）；
感病（60＜病情指数≤80）；
高感(80＜病情指数)；
抗性至少为两次一致的鉴定结果，若不一致以抗性差的为准。
作为本发明所述的甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法的优选方案：所述组织分离法，是取发病植株病、健交界处组织，在无菌条件下，去掉表皮，切成2-3毫米长的病组织，用5%次氯酸钠溶液消毒3min，用灭菌的镊子将消毒病组织移至无菌水中漂洗3次，移至甘薯葡萄糖琼脂培养基上，25-28℃培养3-5天。
作为本发明所述的甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法的优选方案：所述甘薯葡萄糖琼脂培养基，是将甘薯洗净去皮取200g，切片加水1000mL煮沸20min，纱布过滤，将15g葡萄糖加入到过滤液中，继续加热搅拌至完全溶解，稍冷却再补充水分到1000mL，取150mL分装到含1.5g琼脂粉的三角瓶中，加塞、包扎，120℃灭菌20分钟后取出，冷却后贮存备用。
本发明的优点是：该方法以蛭石、土壤和细沙为混合培养土壤，近似田间土壤条件；接种从活体甘薯上分离出来的病原菌，创造了甘薯根腐病发病条件，解决了甘薯根腐病室内不易致病的特性；致病土壤中采用密集型栽种方式栽种薯苗，节约空间，30天后调查发病情况，能够准确、快速、直观的表现出不同品种薯苗对甘薯根腐病的抗性水平。该方法更接近于田间甘薯幼苗感染根腐病的实际情况，操作简单、易学，对实验设备要求不高，各育种单位均能开展鉴定工作。该鉴定方法能为甘薯抗病育种前期鉴定提供技术支持，剔除部分感病品种，为后期品种筛选减轻人力、物力。同时，以薯苗茎尖为鉴定材料，能最大限度的减少取材的差异性，降低试验误差。室内土壤灭菌后接种，易于试验条件控制，也增强了结果的准确性。该方法的推广使用，对于筛选抗病品种和指导甘薯抗病育种具有重要意义和现实作用。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法：我们对苗床或田间采集的14个甘薯品种（品系）的薯苗，具体品种见表1，以高感病品种胜利百号和高抗品种徐薯18分别为对照，进行甘薯根腐病抗性鉴定试验，按如下步骤进行：
（1） 病菌分离与培养：从田间采集发病薯块或薯苗，用组织分离方法分离出甘薯根腐病菌（茄病镰孢菌，Fusarium solani），25-28℃纯化培养在甘薯葡萄糖琼脂培养基上7天，备用；
（2） 参试薯苗准备：从苗床或田间剪取烟薯25、徐薯24等14个甘薯品种（品系）各9棵，要求生长一致的甘薯顶尖幼苗，薯苗节间长短以5-6个节间为宜，带回试验室后从叶柄基部剪掉最下面2-3片叶，用灭菌水把薯苗茎基部清洗干净，备用；
（3）致病土壤制备：将灭菌蛭石、土壤和细沙子按照质量比1：1：1比例混匀，制备成混合土壤，每500g混合土壤加入1皿步骤（1）纯化培养的根腐病菌并混匀，制备致病土壤，备用；；
（4） 接种鉴定：将配制好的致病培养基质分装到长80cm*宽40cm*深30cm的塑料种植箱中，将供试薯苗采用株距2～3cm的密集型方式栽种到种植箱中，浇水，在25～27℃下，光照10 h黑暗14 h交替培养30天，保持土壤水分10%左右；
（5） 调查评价：栽种30天后调查薯苗地上发病情况，并根据发病程度将薯苗分为0～4级共5个等级，根据受害等级和病情指数对根腐病的抗性分为高抗、抗病、中抗、感病和高感五个级别；
薯苗受害分级标准：0 级:无任何症状；1 级：植株出现叶片发黄，其他正常；2 级：叶片显著发黄，分支少而短；3 级：植株萎蔫，生长停滞，显著矮化，老叶脱落；4级：全株死亡。
病情指数按以下公式计算。
病情指数单位为%，确定到0.1%。
根据病情指数确定种质甘薯根腐病抗性。
高抗(病情指数≤20)
抗病（20＜病情指数≤40）
中抗（40＜病情指数≤60）
感病（60＜病情指数≤80）
高感(80＜病情指数)
抗性至少为两次一致的鉴定结果，若不一致以抗性差的为准。
所述组织分离法，是取发病植株病、健交界处组织，在无菌条件下，去掉表皮，切成2-3毫米长的病组织，用5%次氯酸钠溶液消毒3min，用灭菌的镊子将消毒病组织移至无菌水中漂洗3次，移至甘薯葡萄糖琼脂培养基上，25-28℃培养3-5天。
所述甘薯葡萄糖琼脂培养基，是将甘薯洗净去皮取200g，切片加水1000mL煮沸20min，纱布过滤，将15g葡萄糖加入到过滤液中，继续加热搅拌至完全溶解，稍冷却再补充水分到1000mL，取150mL分装到含1.5g琼脂粉的三角瓶中，加塞、包扎，120℃灭菌20分钟后取出，冷却后贮存备用。
病情指数计算：以品种烟薯25为例，调查发现重复Ⅰ3株发病级数均为4，因此重复Ⅰ病情指数（%）为（0×0+0×1+0×2+0×3+3×4）/3×4×100=100；
重复Ⅱ 2株发病级数为3，1株发病级数均为4，因此重复Ⅱ病情指数（%）为（0×0+0×1+0×2+2×3+1×4）/3×4×100=83.3；
重复Ⅲ 1株发病级数为3，2株发病级数均为4，因此重复Ⅲ病情指数（%）为（0×0+0×1+0×2+1×3+2×4）/3×4×100=91.6；
综上，平均病情指数（%）为（100+83.3+91.6）/3=91.6。
其它品种按照上述过程进行病情指数计算，具体试验鉴定结果见表1：
表1 甘薯苗期根腐病室内抗性鉴定结果
结论：从表1可以看出，本次所鉴定的14个甘薯品种（品系）中，徐薯24和济薯25 两个品种的薯苗对根腐病的抗性级别为“高抗”；商1414-14薯苗对根腐病的抗性级别为“抗病”；商1414-15、红心软、济08365和湘7-2共4个品种（品系）薯苗对根腐病抗性级别为“中抗”；商133-1、徐紫薯5号、浙紫薯5号和海南红等品种（品系）薯苗对根腐病抗性级别为“感病”；烟薯25、1227和Xu1215221等品种（品系）薯苗对根腐病抗性级别为“高感”。
Claims (4)
1.甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法，其特征在于：按如下步骤进行：
步骤（1）、病菌分离与培养：从田间采集发病甘薯样品，采用组织分离法获得根腐病菌，再转移至甘薯葡萄糖琼脂培养基上，25-28℃条件下，纯化培养7天，备用；
步骤（2）、参试薯苗准备：从苗床或田间剪取9棵生长一致的甘薯顶尖幼苗，根据薯苗节间长短，以5-6个节间为宜，带回试验室后从叶柄基部剪掉最下面2-3片叶，用灭菌水把薯苗茎基部清洗干净，备用；
步骤（3）、致病土壤制备：将灭菌蛭石、土壤和细沙子按照质量比1：1：1比例混匀，制备成混合土壤，每500g混合土壤加入1皿步骤（1）纯化培养的根腐病菌并混匀，制备致病土壤，备用；
步骤（4）、接种鉴定：将配制好的致病土壤分装在塑料种植箱中，将供试薯苗采用株距2～3cm的密集型方式栽种到种植箱中，浇水，在25～27℃条件下，光照10 h黑暗14 h交替培养30天，保持致病土壤的水分为10%左右；
步骤（5）、调查评价：30天后调查薯苗地上发病情况，并根据发病程度将薯苗受害分级为0～4级共5个等级，根据受害等级和病情指数对根腐病的抗性分为高抗、抗病、中抗、感病和高感五个级别；
薯苗受害分级标准：0 级:无任何症状；1 级：植株出现叶片发黄，其他正常；2 级：叶片显著发黄，分支少而短；3 级：植株萎蔫，生长停滞，显著矮化，老叶脱落；4级：全株死亡。
2.根据权利要求1所述的甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法，其特征在于：所述病情指数是按以下公式计算：
病情指数单位为%，确定到0.1%；
根据病情指数确定种质甘薯根腐病的抗性；
高抗(病情指数≤20)；
抗病（20＜病情指数≤40）；
中抗（40＜病情指数≤60）；
感病（60＜病情指数≤80）；
高感(80＜病情指数)；
抗性至少为两次一致的鉴定结果，若不一致以抗性差的为准。
3.根据权利要求1所述的甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法，其特征在于：所述组织分离法，是取发病植株病、健交界处组织，在无菌条件下，去掉表皮，切成2-3毫米长的病组织，用5%次氯酸钠溶液消毒3min，用灭菌的镊子将消毒病组织移至无菌水中漂洗3次，移至甘薯葡萄糖琼脂培养基上，25-28℃培养3-5天。
4.根据权利要求1或3所述的甘薯根腐病苗期室内抗性鉴定方法，其特征在于：所述甘薯葡萄糖琼脂培养基，是将甘薯洗净去皮取200g，切片加水1000mL煮沸20min，纱布过滤，将15g葡萄糖加入到过滤液中，继续加热搅拌至完全溶解，稍冷却再补充水分到1000mL，取150mL分装到含1.5g琼脂粉的三角瓶中，加塞、包扎，120℃灭菌20分钟后取出，冷却后贮存备用。
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