CN109729972A - 一种提高小麦ems诱变率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高小麦EMS诱变率的方法，包括：种子预处理、浸泡并清洗、萌发处理、诱变处理、终止及种植并筛选的过程。本发明基于幼嫩的组织与生长点对EMS最为敏感这一特性，利于EMS溶液对露白后的种子进行诱变处理，有效地提高了种子的突变率和工作效率。

Description

一种提高小麦EMS诱变率的方法

技术领域

本发明涉及小麦诱变技术领域，更具体地说是涉及一种提高小麦EMS诱变率的方法。

背景技术

小麦是重要的粮食作物，提高小麦产量最有效方法之一是选育优良新品种。在新品种的选育过程中，高产、稳产以及综合抗性好的优异种质资源可以大幅缩短育种时间、提高育种效率。

EMS(甲基磺酸乙酯，Ethyl Methane Sulfonate)诱变因其所需设备简单、成本低、诱变效果好，成为目前作物种质资源创新工作中应用最广泛的化学诱变剂。当前已有大量文献尝试利用不同浓度的EMS对小麦种子进行不同时间的诱变处理，但其M2代调查所有性状的总突变率均低于7％，诱变率较低。其原因可能是：种子的萌发是一个生理与形态动态的变化过程，需要经历吸胀、水合与酶的活化、细胞的分裂和增大以及胚突破种皮四个阶段，各阶段对EMS的敏感程度均存在较大的差异，尤以幼嫩的组织和生殖细胞发育阶段对EMS诱导最为敏感，现有报道种子处理的时间多集中在6-12h，一方面此时胚根尚未突破种皮，EMS诱变的有效性较弱；另一方面高浓度EMS会抑制种子萌发过程中的部分酶活性，影响种子萌发，降低了种子发芽率，二者共同作用最终直接导致诱变率较低的结果。此外，也有学者使用EMS溶液对小麦合子、幼穗、愈伤组织等部位进行诱变处理，尽管所报道的突变率较常规种子诱变有所提高，但其操作过程过于繁琐，工作效率不高。

因此，探索一种能够行之有效、便于操作且突变率高的小麦EMS诱变方是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种提高小麦EMS诱变率的方法，将种子进行发芽诱导，使其萌发至露白，基于幼嫩的组织与生长点对EMS最为敏感这一特性，利于EMS溶液对露白后的种子进行诱变处理，有效地提高了种子的突变率和工作效率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高小麦EMS诱变率的方法，包括下述步骤：

1)种子预处理，所述种子选取为纯系品种；

2)浸泡并清洗：将所述步骤1)中处理过的种子在灭菌水中于15-25℃条件下浸泡6-12h，在此过程中，每隔1-2h取出种子用超纯水清洗一次；此时期种子经历吸胀、酶活化的过程，温度过高容易腐烂，温度过低则酶活性降低，萌发时间较长；用灭菌超纯水清洗，洗净酶解后的渗出物，可以避免淀粉等养分物质会增加杂菌繁殖的概率；

3)萌发处理：将经所述步骤2)处理的种子取出平铺于装有灭菌滤纸的瓷盘上，于15-25℃条件下，每隔2h向所述灭菌滤纸上加入种子质量5％的超纯水，持续4-10h，直到种子露白1-2mm；此时期种子对EMS最为敏感，诱变效果最好。用灭菌超纯水清洗2-3次，去除呼吸作用产生的代谢产物，一方面避免养分物质引起杂菌繁殖，另一方面避免代谢产物与后续加入的EMS、乳化剂等发生副反应，影响诱变效果。

4)诱变处理：将所述步骤3)所得的种子浸泡于浓度为0.4-1.0％的EMS缓冲液中，于15-25℃条件下30rpm/min振荡4-6h；

5)终止：在所述步骤4)体系中加入浓度为5％的Na₂SO₃溶液50ml，终止诱变，然后用超纯水对诱变后的种子清洗2-3次，并将清洗后的种子置于阴凉处晾干。

6)种植并筛选。

可选的，所述步骤1)中种子的预处理包括：

(1)选用纯系品种：种子收获前，对种子田进行去杂处理，挑选遗传性状稳定的纯系品种进行单独收获，单独脱粒，得到纯系种子；此步骤的目的是为了保证种子纯度，避免因种子混杂或继续发生性状分离而在诱变后被误认为是突变株；

(2)种子的清选与消毒：将所述纯系种子过8目网筛，去除破粒、秕粒、黑胚粒，选取饱满籽粒，用0.1％HgCl₂对种子表面消毒15s，再以超纯水漂洗种子2～3次。

可选的，所述步骤6)中种植并筛选的过程包括：

(1)M1的种植：将所述步骤5)所得种子按照株距5cm～10cm，行距20cm～25cm的标准进行点播，成熟后分单株或单穗收获、脱粒；

(2)M2的种植：第二年将M1单穗或单株收获的种子分别数取30或40粒种植穗行，从苗期至成熟期对株高、穗长、穗型、叶型、分蘖、蜡质等主要农艺性状突变株进行调查，对目标性状突变株编号、挂牌，并于成熟期收获单株，分单株脱粒；

3)M3的种植：第三年，将从M2中筛选出的突变株每株选取40粒种植，从苗期至成熟期对主要农艺性状突变株进行调查，对目标性状突变株编号、挂牌，并于成熟期收获单株；

4)M4的种植：第四年将M3中筛选出的突变株每株选取40粒种植，从苗期至成熟期对主要农艺性状突变株进行调查，对已确定可以稳定遗传的目标性状突变株进行收获，得到性状稳定的突变株。

可选的，所述EMS缓冲液的配置方法包括：将4-10mL的EMS溶于0.1mol/L、pH7.0的1L磷酸缓冲液中，配制终浓度为0.4％-1.0％的EMS-磷酸缓冲液。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种提高小麦EMS诱变率的方法，达到的技术效果是：

1)诱变率高，本发明基于种子萌发各阶段对EMS的敏感程度存在较大的差异，尤以幼嫩的分生组织组织对EMS诱导最为敏感这一原理，前期对种子进行预处理，使其萌发至露白，利用EMS溶液处理露白的种子，最终大幅提高了EMS诱变率，较现有种子处理的突变率提高了114.85％～284.46％。

2)处理效率高。现有技术包含对花粉、幼穗、愈伤组织等部位进行诱变，其操作过程过于繁琐，增加处理量会引起工作强度大幅上升。本发明中对小麦种子进行精选-消毒-预处理-EMS处理一系列流程，提高了处理效率，增加种子量的同时，几乎不会增加诱变工作强度，便于大规模开展小麦种质资源创新工作，具有较强的应用性。

3)选择效率高。EMS诱导的突变多为点突变，自交纯合快，可缩短育种年限。本发明自M2代开始筛选突变株，并对重要性状突变株性状进行记录与编号，并在M3代时开始进行调查与验证，利于快速发现能够稳定遗传的优良性状。我们在多年的研究中发现许多突变性状在M4代已基本不再进行分离，部分优异性状突变体甚至可以直接用于新品种选育，大大提高了育种效率。

4)由于遗传背景一致，本发明所创造的大量突变体可直接用于小麦功能基因组的研究，是遗传学研究的宝贵资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明晋麦47的野生型和突变型性状图；

图2附图为本发明晋麦47的野生型和突变型性状图；

图3附图为本发明济麦22的野生型和突变型性状图；

图4为本发明济麦22的野生型和突变型性状图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一验证EMS-磷酸缓冲液的浓度和处理时间对小麦种子发芽率的影响：

本发明实施例公开了一种提高小麦EMS诱变率的方法，整个诱变过程在通风橱中进行，其特征在于，包括下述步骤：

1)种子预处理：(1)选用纯系品种：种子收获前，对种子田进行去杂处理，挑选遗传性状稳定的纯系品种进行单独收获，单独脱粒，得到纯系种子；

(2)种子的清选与消毒：将所述纯系种子过8目网筛，去除破粒、秕粒、黑胚粒，选取饱满籽粒，用0.1％的HgCl₂对种子表面消毒15s，再以超纯水漂洗种子2次。

2)浸泡并清洗：将所述步骤1)中处理的种子在灭菌水中于15℃条件下浸泡6h，在此过程中，每隔1h取出种子用超纯水清洗一次；

3)萌发处理：将经所述步骤2)处理的种子取出平铺于灭菌滤纸的瓷盘上，于15℃条件下，每隔2h向所述灭菌滤纸上加入种子质量5％的超纯水，持续4h，直到种子露白1mm；

4)诱变处理：将所述步骤3)所得的种子分别浸泡于浓度为0.4％、0.6％、0.8％及1.0％的EMS缓冲液中，并在15℃、30rpm/min条件下，于每种浓度下的缓冲液中分别振荡4h、6h及8h，记为A处理；同时选取相同的种子，按照常规的EMS诱变方法，且分别将种子浸泡于浓度为0.4％、0.6％、0.8％及1.0％的EMS缓冲液中，并在15℃、30rpm/min条件下，于每种浓度下的缓冲液中分别振荡4h、6h及8h，记为B处理；两种处理方式对小麦种子的发芽率影响见表一；

5)终止：将所述步骤4)中的体系中加入浓度为5％的Na₂SO₃溶液50ml，终止诱变，然后用超纯水对诱变后的种子清洗2次，并将清洗后的种子置于阴凉处晾干；

将清洗过的A、B种子进行发芽率试验，每份200粒，重复3次，试验结果见表一。

表一

表一结果显示：随着EMS缓冲液浓度的增加、处理时间的延长，小麦种子发芽率呈降低的趋势。以A方式(本发明的诱变方法)对种子进行处理，在处理6h、EMS缓冲液浓度为0.6％时，小麦种子达到半致死剂量；以B方式(常规的处理方法)对种子进行处理，在处理8h、EMS浓为1.0％时，小麦种子达到半致死剂量；本发明的处理方法较常规处理方法缩短了处理时间、减少了EMS使用量，在较短的处理时间与较低的处理浓度条件下即达到了半致死剂量，该结论也证实了露白种子对EMS更为敏感。此外，从上表还可看出，使用浓度为0.6％的EMS溶液对露白种子处理6h，是创制突变体的最适条件。

实施例二

试验材料：选择品种为晋麦47，该品种以12057为母本，旱522/K37-20为父本，经杂交系统选育而成。1995年4月通过了山西省审定，1998年2月通过了全国审定。晋麦47适应山西南郊及黄淮麦地区广大时地种植，适宜山西南部和陕西渭北等旱地及补充灌区种植，是国家和山西省旱地区试对照品种，获得1998年度山西省科技进步一等奖。

种子前处理：将晋麦47纯系种子过8目网筛，去除破粒、秕粒，采用数粒仪数出10000粒种子，以0.1％HgCl₂处理15s，用灭菌超纯水漂洗种子3次。将清洗好的种子用灭菌超纯水在20℃条件下浸泡8h，中间每隔2h取出用灭菌超纯水清洗一次。将浸泡后的种子平铺于湿润滤纸上，每隔2h加入灭菌超纯水保持滤纸湿润，使种子能够进行呼吸作用，待种子萌发直至露白。用灭菌超纯水清洗3次，将种子放置于阴凉处晾干。

种子的EMS处理与终止：将阴干的种子浸泡于0.6％的EMS-磷酸缓冲液中，20℃条件下30rpm/min震荡6h。处理完成后加入50ml浓度5％的Na₂S₂O₃溶液终止反应。用灭菌超纯水清洗3次，清洗过的种子放置于阴凉处晾干。

晋麦47诱变材料的种植与筛选：

M1：2012年秋，将处理后的种子进行点播，行距25cm，株距8cm，2013年夏天对成熟后每株选主茎单穗进行收获，共得到4663个单穗，将单穗种子分别进行脱粒，装入牛皮纸袋。

M2：2013年秋天每袋选取30粒进行点播，行距25cm，株距8cm，每20行插入晋麦47野生型作为对照。从苗期至成熟期对株高、穗长、穗型、叶型、叶色、分蘖数量、茎秆强度、蜡质多少、育性、芒长度、芒色、生育期、抗白粉病等性状突变株进行调查，对突变株进行编号、挂牌，并于2014年夏天收获单株，对单株脱粒后对粒色、籽粒大小以及籽粒形态进行了调查。对所有性状进行统计，共得到692个突变体，总突变率高达14.84％；野生型和突变型见附图1；1为野生型，2为突变型。

M3：2014年秋天将每个突变株选取40粒进行点播，行距25cm，株距8cm，从苗期至成熟期对突变性状逐个调查、记录，对突变株进行编号、挂牌，对上年度表达且本年度依然能够稳定表达的突变性状进行标记。根据自己的研究目的对突变性状进行选择，本研究中主要考虑种质资源创新与新品种选育，选择抗白粉病突变体共计26个，2015年夏天收获单株(如遗传研究则根据自己研究方向选择稳定遗传的目标性状突变体)。野生型和突变型见附图2；1为野生型，2-4为突变型。

M4：2015年秋天将26个晋麦47抗白粉单株种植株行，2016年夏天选择农艺性状好的株行混收，筛选出9个主要农艺性状表现与晋麦47野生型接近的抗白粉病材料。

结果表明：2016年将9个晋麦47抗白粉材料与晋麦47一起种植，2017年夏天收获时测产。从中选出2071-4、3542-4、4217-1三个品系，其产量性状分别较晋麦47产量提高了2.14％、4.31％和3.11％，且没有明显的缺陷。2017年秋天继续种植进行品比试验，2018年夏天选出两年产量性状稳定且能够抗白粉病的品系3542-4参加山西省旱地区试。

表二晋麦47M2代田间突变类型与突变率

表2调查结果显示：M2代突变体主要集中在茎秆高低与育性两方面，但也得到了许多其它农艺性状方面的突变体。4663个单株中，共得到692个突变株系，总突变率为14.84％，高于现有报道数据，进一步证实本发明诱变方法能有效提高EMS诱变率

实施例三

试验材料：济麦22是山东省农业科学院作物研究所最新育成的超高产、多抗、优质中筋小麦新品种，2006年9月和2007年1月分别通过山东省和国家审定。2004～2006年度参加山东省区试，两年均列第一名，平均亩产536.81公斤，比对照极显著增产10.79％，生产试验平均亩产519.1公斤，比对照增产4.05％；2004～2006年度参加国家黄淮北片区试，平均亩产518.08公斤，比对照显著增产4.67％。2006年6月经山东省农业厅和科技厅联合专家组在兖州实打验收，4.56亩实收亩产727.43公斤，创山东省历史最高记录。

种子前处理：将济麦22纯系种子过8目网筛，去除破粒、秕粒，称取1kg种子，0.1％HgCl₂处理15s，用灭菌超纯水漂洗种子3次。将清洗好的种子用灭菌超纯水在20℃条件下浸泡8h，中间每隔2h取出用灭菌超纯水清洗一次。将浸泡后的种子平铺于湿润滤纸上，每隔2h加入灭菌超纯水保持滤纸湿润，使种子能够进行呼吸作用，待种子萌发直至露白。用灭菌超纯水清洗3次，将种子放置于阴凉处晾干。

种子的EMS处理与终止：将阴干的种子浸泡于0.6％的EMS-磷酸缓冲液中，20℃条件下30rpm/min震荡6h。处理完成后加入5％的Na₂S₂O₃溶液终止反应。用灭菌超纯水清洗3次，清洗过的种子放置于阴凉处晾干。

济麦22诱变材料的种植与筛选：

M1：2012年秋将处理后的种子进行点播，行距25cm，株距8cm，2013年夏天对成熟后每株选主茎单穗进行收获，共得到9782个单穗，将单穗种子分别进行脱粒，装入牛皮纸袋。

M2：2013年秋天每袋选取40粒进行点播，行距25cm，株距8cm，每20行插入济麦22野生型作为对照。本研究目的是利用济麦22抗旱性与产量性状表现优异，希望在突变体中找到株高偏高的突变体种植于旱地中。故仅对株高发生突变的变异株进行了标记、记录与收获。株高变异株共计462株，仅株高突变率高达4.72％。参见附图3，1为野生型，2-8为突变型。

M3：2014年秋天将462个突变株每株选取40粒进行点播，行距25cm，株距8cm，每20行插入济麦22野生型作为对照。2015年夏天收获时仅对株高高于对照均值(73cm)的突变体进行收获，共计204株；参见附图4，1野生型，2-7为突变型。

M4：2015年秋天将204个济麦22株高突变体株种植株行，2016年夏天选择农艺性状好的株行混收，筛选出17个株高高于对照10cm以上且主要农艺性状表现较好的材料。

结果显示：2016年将17个济麦22株高突变体材料与济麦22一起种植，2017年夏天收获时测产。从中选出15-6、64-3、137-5、164-1和189-4五个品系，其产量性状分别较对照济麦22产量提高了5.14％、3.27％和4.22％、2.74％和4.21％。2017年秋天继续种植进行品比试验，2018年夏天选出两年产量性状稳定品系15-6参加山西省旱地区试。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种提高小麦EMS诱变率的方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)种子预处理，所述种子选取为纯系品种；

2)浸泡并清洗：将所述步骤1)中处理的种子在灭菌水中浸泡6-12h，在此过程中，每隔1-2h取出种子用超纯水清洗一次；

3)萌发处理：将经所述步骤2)处理的种子取出平铺于装有灭菌滤纸的瓷盘上，每隔2h向所述灭菌滤纸上加入种子质量5％的超纯水，持续4-10h，直到种子露白1-2mm；

4)诱变处理：将所述步骤3)所得的种子浸泡于浓度为0.4-1.0％的EMS缓冲液中，振荡4-6h；

5)终止：将所述步骤4)中的体系中加入浓度为5％的Na₂S₂O₃溶液，终止诱变，然后用超纯水对诱变后的种子清洗2-3次，并将清洗后的种子置于阴凉处晾干；

6)种植并筛选。

2.根据权利要求1所述的一种提高小麦EMS诱变率的方法，其特征在于，所述步骤1)中种子的预处理包括：

(1)选用纯系品种：种子收获前，对种子田进行去杂处理，挑选遗传性状稳定的纯系品种进行单独收获，单独脱粒，得到纯系种子；

(2)种子的清选与消毒：将所述纯系种子过8目网筛，去除破粒、秕粒、黑胚粒，选取饱满籽粒，用0.1％HgCl₂对种子表面消毒15s，再以超纯水漂洗种子2～3次。

3.根据权利要求1所述的一种提高小麦EMS诱变率的方法，其特征在于，所述步骤6)中种植并筛选的过程包括：

(1)M₁的种植：将所述步骤5)所得种子按照株距5cm～10cm，行距20cm～25cm的标准进行点播，成熟后分单株或单穗收获、脱粒；

(2)M₂的种植：第二年将M₁单穗或单株收获的种子分别数取30或40粒种植穗行，从苗期至成熟期对株高、穗长、穗型、叶型、分蘖、蜡质等主要农艺性状突变株进行调查，对目标性状突变株编号、挂牌，并于成熟期收获单株，分单株脱粒；

3)M₃的种植：第三年，将从M₂中筛选出的突变株每株选取40粒种植，从苗期至成熟期对主要农艺性状突变株进行调查，对目标性状突变株编号、挂牌，并于成熟期收获单株；

4)M₄的种植：第四年将M₃中筛选出的突变株每株选取40粒种植，从苗期至成熟期对主要农艺性状突变株进行调查，对已确定可以稳定遗传的目标性状突变株进行收获，得到性状稳定的突变株。

4.根据权利要求1所述的一种提高小麦EMS诱变率的方法，其特征在于，所述EMS缓冲液的配置方法包括：将4-10mL的EMS溶于0.1mol/L、pH7.0的1L磷酸缓冲液中，配制终浓度为0.4％-1.0％的EMS-磷酸缓冲液。