CN108617503A - 一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法 - Google Patents

一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法，包括以下步骤：水稻种子的灭菌及萌动处理；采用超声波辅助秋水仙碱处理水稻萌动种子，得到染色体加倍的水稻苗；将水稻苗转移到筛选培养基II上继续培养，直到幼苗逐渐生根完成即进行移栽。本发明成功实现了7个粳稻品系的染色体加倍，解决了传统秋水仙素直接处理水稻种子方法的加倍效率低的问题，以及秋水仙碱处理水稻愈伤组织加倍染色体法依赖复杂的植物组织培养技术等问题。

Description

一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法
技术领域
本发明属于染色体工程育种技术领域，具体地说，涉及一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法。
背景技术
多倍体化是高等植物进化的显著特征。伴随染色体的加倍，植株的器官和细胞表现出“巨大型”，增大作物的营养器官，如叶片、莲秆和穗子等。同时多倍体化增强了对不利的自然环境的抗逆性及提高光合作用，降低蒸腾作用。多倍体植物在自然界中普遍存在。与人们生活息息相关的粮油棉，如小麦、棉花、大豆及烟草等经济作物都是自然加倍形成的多倍体。目前大约有50％的被子植物，75％的禾本科植物，80％的草类，18％的豆类是多倍体，故多倍体被认为是推动植物进化的重要因素，是物种形成的途径之一。而且多倍体有可能使一些作物的经济性状发生有利的变化。因此，植物多倍体的研究和利用是育种工作中值得重视的途径之一。
中国杂交水稻育种在继20世纪70年代中期“三系法”获得成功之后在20世纪90年代“两系法”又取得了突破性进展。然而，在“两系法”杂交水稻育种已经取得重大成果的前提下，采用常规的水稻育种方法进一步提高单位面积产量的难度将更大。目前科技发展水平下，水稻多倍体化是其产量潜力的进一步挖掘的最有效的技术路线。因此，大量水稻染色体加倍工作被水稻育种家们开展，但水稻染色体加倍的成功案例却十分有限。尽管有水稻基因组加倍后出现的各种遗传不稳定性问题所导致的难以获得可稳定遗传后代的原因，但最主要原因是水稻染色体加倍技术的不成熟导致的水稻加倍效率极低，没有可供育种家选育和进行深入的生物学研究的大量加倍后水稻群体材料。
传统的秋水仙素直接处理水稻种子，尽管操作十分方便，但是加倍效率十分有限，对于远缘杂交稻的加倍效率通常在0.15～12％之间，而对于理论研究和种质创新十分有意义的水稻自交系，特别是具有优良食味和软糯口感的粳稻品种的加倍效率远低于0.1％，甚至有些品种无法获得多倍体植株。而另一种较为常见的水稻染色体加倍方法，即利用秋水仙素处理组织培养过程中获得的水稻愈伤组织获得水稻多倍体的方法，尽管能够获得更高的染色体加倍效率，通常情况下加倍效率能够达到50％以上，但由于其严重依赖于组织培养技术。这就导致了利用该方法进行水稻染色体加倍需要进行组织培养所需的一系列仪器设备、无菌操作空间、人工光照培养系统等昂贵和复杂的实验条件。并且，该方法的操作难度较大，还需要对不同待加倍水稻材料分别建立与之配套的植物组织培养体系，而每种水稻材料又因其遗传背景的差异导致的其在组织培养的愈伤组织诱导、继代培养、诱导分化等过程中植物激素的浓度和种类差异较大，无法在短时间内实现多种水稻材料的加倍工作。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种操作简单、适用广泛、加倍率高的超声波介导的秋水仙素加倍水稻染色体的方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法，
包括以下步骤：
步骤1、水稻种子的灭菌及萌动处理；
步骤2、采用超声波辅助秋水仙碱处理水稻萌动种子，获得染色体加倍的水稻苗；
步骤3、将步骤2得到的水稻苗转移到筛选培养基II上继续培养，直到幼苗逐渐生根完成即进行移栽。
可选地，所述的步骤1中的水稻种子的灭菌及萌动处理具体按照以下步骤实施：
步骤1.1、精选水稻种子，在超净工作台中将其置于无菌三角瓶中；首先加入酒精，进行快速润洗，随后迅速将酒精倒出，并立即用无菌水冲洗3次；然后，向盛有水稻种子的三角瓶中加入H2O2浸泡，期间摇晃三角瓶几次以便充分灭菌；最后，用无菌水反复冲洗水稻种子3-4次；
步骤1.2、向步骤1.1处理后的盛有水稻种子的三角瓶中加入赤霉素的无菌水溶液中，用透气的封口膜封口后，置于恒温培养箱内避光培养，然后用无菌水清洗种子3次以上；随后，向三角瓶中加入无菌水，继续在恒温培养箱内避光培养，直至种子露白。
可选地，所述的水稻种子为吉农大878、MY397、L19、D71或黑颖75中的一种或几种。
可选地，所述步骤1.1中的酒精体积浓度为75％，酒精的用量与水稻的用量比例为10:100-20:100ml/粒，酒精的润洗时间不超过40秒；H2O2的体积浓度为10％，H2O2的用量与水稻的用量比例为20:100-30:100ml/粒，H2O2的浸泡时间为10-20min。
可选地，所述步骤1.2中的赤霉素的质量浓度为0.1％，赤霉素的用量与步骤1.1处理后的无菌水处理后的水稻种子的用量的比例为10:100-20:100ml/粒，添加赤霉素的培养时间为10-15h，添加赤霉素的培养温度为25-35℃；无菌水的用量为10:100-20:100ml/粒水稻，添加无菌水的培养温度为25-35℃，添加无菌水的培养时间为8-36h。
可选地，所述步骤2中的采用超声波辅助秋水仙碱处理水稻萌动种子，获得染色体加倍的水稻苗具体为：将制备好的露白水稻种子在无菌操作台中，用镊子转移到含有超声处理培养液I的三角瓶中，并铝箔将三角瓶瓶身完全遮盖，在冰水浴中孵育，随即进行超声波处理；完成上述处理后，将溶液去除，加入常温的超声处理培养液II超声处理；处理后，用无菌水反复冲洗3-6次，最后用超声处理培养液III处理水稻种子，然后，将种子用无菌水取出反复冲洗3-6次，并在筛选培养基I上进行光照培养，直到水稻幼苗表现为茎芽膨大，且略出现绿色；继续培养12-15天，期间淘汰出现的白化苗和快速伸长的水稻苗。
可选地，所述的超声处理培养液I的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液I的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为10:100-15:100ml/粒，添加超声处理培养液I时的孵育时间为3-8min，超声波处理功率为90-180W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行12组循环；超声波发生探头的直径为10mm；
超声处理培养液II的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液II的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为10:100-20:100ml/粒，添加超声处理培养液II时的超声波处理功率为90-180W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行6组循环；超声波发生探头的直径为10mm；
超声处理培养液III的组成如下：KCl 0.75g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；添加超声处理培养液III时的处理时间为72h，期间每隔24h更换一次超声处理培养液III。
可选地，所述的筛选培养基I的组成如下：KCl 0.15g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；光照培养培养温度为21-31℃；光照培养培养时间为20-28h；在筛选培养基I上继续培养时间为12-15天。
可选地，所述步骤3中的筛选培养基II的组成如下：KCl 0.75g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；在筛选培养基II上继续培养时间为12-15天。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
本发明成功实现了7个粳稻品系的染色体加倍，加倍当代经统计染色体加倍率为32～71％之间，解决了传统秋水仙素直接处理水稻种子方法的加倍效率低的问题，以及秋水仙碱处理水稻愈伤组织加倍染色体法依赖复杂的植物组织培养技术等问题，为利用该技术创制大规模水稻多倍体群体，开展水稻多倍体育种研究与品种选育工作提供了技术保障
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明水稻种子萌动；其中，A:粳稻种子萌动情况；B：水稻露白的特写照片；
图2是本发明超声辅助秋水仙碱处理后的水稻种子在筛选培养基I上24h的表现；
图3是本发明超声辅助秋水仙碱处理后的水稻种子在筛选培养基I上12天的表现；其中，A:畸形苗和白化苗；B：非加倍的水稻植株；
图4是本发明超声波辅助秋水仙碱处理后的水稻种子，其中，A:加倍后的水稻种子；B：野生型水稻种子，从左到右依次是:吉农大878、MY397、L19、D71、黑颖75。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法，包括以下步骤：
步骤1、水稻种子的灭菌及萌动处理；
步骤1.1、精选水稻种子，在超净工作台中将其置于无菌三角瓶中；首先加入体积浓度为75％的酒精，酒精的用量与水稻的用量比例为10:100-20:100ml/粒，进行快速润洗，酒精的润洗时间不超过40秒；随后迅速将酒精倒出，并立即用无菌水冲洗3次；然后，向盛有水稻种子的三角瓶中加入体积浓度为10％的H2O2浸泡10-20min，H2O2的用量与水稻的用量比例为20:100-30:100ml/粒，期间摇晃三角瓶几次以便充分灭菌；最后，用无菌水反复冲洗水稻种子3-4次；
步骤1.2、向步骤1.1处理后的盛有水稻种子的三角瓶中加入质量浓度为0.1％的赤霉素的无菌水溶液中，赤霉素的用量与步骤1.1处理后的无菌水处理后的水稻种子的用量的比例为10:100-20:100ml/粒，用透气的封口膜封口后，置于温度为25-35℃的恒温培养箱内避光培养10-15h，然后用无菌水清洗种子3次以上；随后，向三角瓶中加入无菌水，继续在温度为25-35℃的恒温培养箱内避光培养8-36h，直至种子露白。
其中，水稻种子为吉农大878、MY397、L19、D71或黑颖75中的一种或几种。
步骤2、采用超声波辅助秋水仙碱处理水稻萌动种子，获得染色体加倍的水稻苗；
将制备好的露白水稻种子在无菌操作台中，用镊子转移到含有超声处理培养液I的三角瓶中，并铝箔将三角瓶瓶身完全遮盖，在冰水浴中孵育，随即进行超声波处理；完成上述处理后，将溶液去除，加入常温的超声处理培养液II超声处理；处理后，用无菌水反复冲洗3-6次，最后用超声处理培养液III处理水稻种子，然后，将种子用无菌水取出反复冲洗3-6次，并在筛选培养基I上进行光照培养，直到水稻幼苗表现为茎芽膨大，且略出现绿色；继续培养12-15天，期间淘汰出现的白化苗和快速伸长的水稻苗。
其中，超声处理培养液I的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液I的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为10:100-15:100ml/粒，添加超声处理培养液I时的孵育时间为3-8min，超声波处理功率为90-180W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行12组循环；超声波发生探头的直径为10mm；
超声处理培养液II的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液II的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为10:100-20:100ml/粒，添加超声处理培养液II时的超声波处理功率为90-180W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行6组循环；超声波发生探头的直径为10；
超声处理培养液III的组成如下：KCl 0.75g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；添加超声处理培养液III时的处理时间为72h，期间每隔24h更换一次超声处理培养液III。
筛选培养基I的组成如下：KCl 0.15g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；光照培养培养温度为21-31℃；光照培养培养时间为20-28h；在筛选培养基I上继续培养时间为12-15天。
步骤3、将步骤2得到的水稻苗转移到筛选培养基II上继续培养，直到幼苗逐渐生根完成即进行移栽。
筛选培养基II的组成如下：KCl 0.75g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；在筛选培养基II上继续培养时间为12-15天。
实施例1
步骤1、水稻种子的灭菌及萌动处理：
步骤1.1、精选水稻(粳稻品种及品系名称依次为，吉农大878、MY397、L19、D71、黑颖75，并不仅限于这些品种品系)种子200粒，在超净工作台中将其置于100ml无菌三角瓶中。首先加入30mL体积浓度为75％的酒精，进行快速润洗，时间不超过40秒，随后迅速将酒精倒出，并立即用无菌水冲洗3次，以彻底去除酒精残留。然后，向盛有水稻种子的三角瓶中加入约50mL的体积浓度为10％的H2O2浸泡15min，期间摇晃三角瓶几次以便充分灭菌。最后，用无菌水反复冲洗水稻种子3-4次，以便彻底去除残留的H2O2；
步骤1.2、完成上述过程后，向盛有水稻种子的三角瓶中加入30mL质量浓度为0.1％赤霉素的无菌水溶液中，用透气的封口膜封口后，置于30℃的恒温培养箱内，避光培养12hr，随后用无菌水清洗种子3次以上，以便完全去除赤霉素残留。随后，向三角瓶中加入30mL无菌水，继续在30℃的恒温培养箱内，避光培养8-36hr(根据具体粳稻品种或者品系的种子萌动时间而定)，直至种子露白，如图1所示。
步骤2、采用超声波辅助秋水仙碱处理水稻萌动种子，获得染色体加倍的水稻苗：
准备好的露白水稻种子在无菌操作台中，用镊子转移到含有25mL超声处理培养液的50mL三角瓶中，并铝箔将三角瓶瓶身完全遮盖，在冰水浴中孵育5分钟，随即进行超声波处理。超声波破碎仪使用φ10mm的超声波发生探头，并调节超声波强度为90-180W(优选条件为110W)，超声处理5s，间隔5s，进行12组循环处理。完成上述处理后，将溶液去除，加入约30mL常温的超声处理培养液II，超声处理5s，间隔5s，进行6组循环处理。处理后，用无菌水反复冲洗3-6次，最后用超声处理培养液III处理水稻种子72h，期间每隔24h更换一次超声处理培养液III。72h后，将种子用无菌水取出反复冲洗3-6次，并在筛选培养基I上，在温度为26±5℃条件下光照培养24h，此时水稻幼苗如图2所示表现为茎芽膨大，且略出现绿色。继续培养12-15天内所示，此时出现较多白化苗和少数快速伸长的水稻苗，前者为超声波及秋水仙碱公共处理导致的畸形苗和死亡苗，后者经显微镜镜检结果为未能加倍为多倍体水稻的水稻植株(图3)。此时对上述幼苗进行统计，仅计算经过染色体镜检证实具有成功加倍为四倍体水稻且具有成活能力的植株占供试水稻种子总数比例依次为：37％(吉农大878)、42.5％(MY397)、38.5％(L19)、49％(D71)、50.5％(黑颖75)上述数字均高于已知的秋水仙碱直接处理水稻种子的染色体加倍比例。如果去除死亡植株，则比例将全部上调至80％以上。
转移到筛选培养基II上继续培养12-15天后，幼苗逐渐生根完成即可进行移栽。
其中：
超声处理培养液I(共1000mL)：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，pH5.8；
超声处理培养液II(共1000mL)：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，秋水仙碱0.5g，pH5.8；
超声处理培养液III(共1000mL)：KCl 0.75g，秋水仙碱0.5g，pH5.8；
筛选培养基I(共1000mL)：KCl 0.15g，琼脂7.5g，pH5.8；
筛选培养基II(共1000mL)：KCl 0.75g，琼脂7.5g，pH5.8；
步骤3、对处理后的水稻进行种子筛选：
将经鉴定为四倍体的水稻植株移栽至营养钵中，并在16h光照，8h黑暗的温室内继续培养直至收获种子，逐个稻穗观察种子大小和形态改变，由于加倍后的水稻籽粒通常会出现种子大小增大，无芒到有芒的改变等，据此收集上述变化种子如图4所示，并进行发芽实验，剪去部分根尖细胞进行染色体观察，结果5份供试材料均获得了4倍体水稻材料。
进一步统计发现，不同水稻品种和品系中所收获的每种经超声波辅助秋水仙碱处理的种子全部数量中成功加倍的水稻籽粒比例依次为21.8％(吉农大878)、15.7％(MY397)、21.9％(L19)、5.4％(D71)、19.7％(黑颖75)。由此可知，通过该方法获得的加倍后水稻，尽管因为存在嵌合体或多倍体遗传不稳定等原因而出现部分后代种子染色体恢复为加倍前的二倍体状态，仍有超过5％的后代保持四倍体，这相对于直接秋水仙碱处理水稻种子的方法仅能获得极少数粳稻稳定遗传为四倍体后代甚至是无法获得四倍体后代的结果具有极显著的提高。
实施例2
一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法，包括以下步骤：
步骤1、水稻种子的灭菌及萌动处理；
步骤1.1、精选水稻种子，在超净工作台中将其置于无菌三角瓶中；首先加入体积浓度为75％的酒精，酒精的用量与水稻的用量比例为10:100ml/粒，进行快速润洗，酒精的润洗时间不超过40秒；随后迅速将酒精倒出，并立即用无菌水冲洗3次；然后，向盛有水稻种子的三角瓶中加入体积浓度为10％的H2O2浸泡20min，H2O2的用量与水稻的用量比例为20:100ml/粒，期间摇晃三角瓶几次以便充分灭菌；最后，用无菌水反复冲洗水稻种子3-4次；
步骤1.2、向步骤1.1处理后的盛有水稻种子的三角瓶中加入质量浓度为0.1％的赤霉素的无菌水溶液中，赤霉素的用量与步骤1.1处理后的无菌水处理后的水稻种子的用量的比例为20:100ml/粒，用透气的封口膜封口后，置于温度为25℃的恒温培养箱内避光培养15h，然后用无菌水清洗种子3次以上；随后，向三角瓶中加入无菌水，继续在温度为25℃的恒温培养箱内避光培养36h，直至种子露白。
其中，水稻种子为吉农大878、MY397、L19、D71。
步骤2、采用超声波辅助秋水仙碱处理水稻萌动种子，获得染色体加倍的水稻苗：
将制备好的露白水稻种子在无菌操作台中，用镊子转移到含有超声处理培养液I的三角瓶中，并铝箔将三角瓶瓶身完全遮盖，在冰水浴中孵育，随即进行超声波处理；完成上述处理后，将溶液去除，加入常温的超声处理培养液II超声处理；处理后，用无菌水反复冲洗3-6次，最后用超声处理培养液III处理水稻种子，然后，将种子用无菌水取出反复冲洗3-6次，并在筛选培养基I上进行光照培养，直到水稻幼苗表现为茎芽膨大，且略出现绿色；继续培养12天，期间淘汰出现的白化苗和快速伸长的水稻苗。
其中，超声处理培养液I的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液I的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为10:100ml/粒，添加超声处理培养液I时的孵育时间为8min，超声波处理功率为90W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行12组循环；超声波发生探头的直径为10mm；
超声处理培养液II的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液II的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为10:100ml/粒，添加超声处理培养液II时的超声波处理功率为90W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行6组循环；超声波发生探头的直径为10mm；
超声处理培养液III的组成如下：KCl 0.75g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；添加超声处理培养液III时的处理时间为72h，期间每隔24h更换一次超声处理培养液III。
筛选培养基I的组成如下：KCl 0.15g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；光照培养培养温度为21℃；光照培养培养时间为28h；在筛选培养基I上继续培养时间为12天。
步骤3、将步骤2得到的水稻苗转移到筛选培养基II上继续培养，直到幼苗逐渐生根完成即进行移栽。
筛选培养基II的组成如下：KCl 0.75g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；在筛选培养基II上继续培养时间为12天。
计算经过染色体镜检证实具有成功加倍为四倍体水稻且具有成活能力的植株占供试水稻种子总数比例依次为：7.6％(吉农大878)、10.4％(MY397)、13.4％(L19)、4.7％(D71)、11.4％(黑颖75)。
实施例3
一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法，包括以下步骤：
步骤1、水稻种子的灭菌及萌动处理；
步骤1.1、精选水稻种子，在超净工作台中将其置于无菌三角瓶中；首先加入体积浓度为75％的酒精，酒精的用量与水稻的用量比例为20:100ml/粒，进行快速润洗，酒精的润洗时间不超过40秒；随后迅速将酒精倒出，并立即用无菌水冲洗3次；然后，向盛有水稻种子的三角瓶中加入体积浓度为10％的H2O2浸泡10min，H2O2的用量与水稻的用量比例为30:100ml/粒，期间摇晃三角瓶几次以便充分灭菌；最后，用无菌水反复冲洗水稻种子3-4次；
步骤1.2、向步骤1.1处理后的盛有水稻种子的三角瓶中加入质量浓度为0.1％的赤霉素的无菌水溶液中，赤霉素的用量与步骤1.1处理后的无菌水处理后的水稻种子的用量的比例为10:100ml/粒，用透气的封口膜封口后，置于温度为35℃的恒温培养箱内避光培养10h，然后用无菌水清洗种子3次以上；随后，向三角瓶中加入无菌水，继续在温度为25-35℃的恒温培养箱内避光培养8h，直至种子露白。
其中，水稻种子为吉农大878、MY397、L19、D71或黑颖75。
步骤2、采用超声波辅助秋水仙碱处理水稻萌动种子，获得染色体加倍的水稻苗：
将制备好的露白水稻种子在无菌操作台中，用镊子转移到含有超声处理培养液I的三角瓶中，并铝箔将三角瓶瓶身完全遮盖，在冰水浴中孵育，随即进行超声波处理；完成上述处理后，将溶液去除，加入常温的超声处理培养液II超声处理；处理后，用无菌水反复冲洗3-6次，最后用超声处理培养液III处理水稻种子，然后，将种子用无菌水取出反复冲洗3-6次，并在筛选培养基I上进行光照培养，直到水稻幼苗表现为茎芽膨大，且略出现绿色；继续培养15天，期间淘汰出现的白化苗和快速伸长的水稻苗。
其中，超声处理培养液I的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液I的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为15:100ml/粒，添加超声处理培养液I时的孵育时间为3min，超声波处理功率为180W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行12组循环；超声波发生探头的直径为10mm；
超声处理培养液II的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液II的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为20:100ml/粒，添加超声处理培养液II时的超声波处理功率为180W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行6组循环；超声波发生探头的直径为10mm；
超声处理培养液III的组成如下：KCl 0.75g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；添加超声处理培养液III时的处理时间为72h，期间每隔24h更换一次超声处理培养液III。
筛选培养基I的组成如下：KCl 0.15g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；光照培养培养温度为31℃；光照培养培养时间为20h；在筛选培养基I上继续培养时间为15天。
步骤3、将步骤2得到的水稻苗转移到筛选培养基II上继续培养，直到幼苗逐渐生根完成即进行移栽。
筛选培养基II的组成如下：KCl 0.75g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；在筛选培养基II上继续培养时间为15天。
计算经过染色体镜检证实具有成功加倍为四倍体水稻且具有成活能力的植株占供试水稻种子总数比例依次为：4.7％(吉农大878)、9.4％(MY397)、11.2％(L19)、5.7％(D71)、9.2％(黑颖75)。
对比例1
将实施例1步骤1中的5个水稻品种的水稻种子各取200粒直接经0.05％秋水仙碱处理72h后种植在营养钵中，并在16h光照，8h黑暗的温室内继续培养直至收获种子，逐个稻穗观察种子大小和形态改变，并进行发芽实验，剪去部分根尖细胞进行染色体观察，结果5份供试材料所收获的每种经秋水仙碱直接处理的种子全部数量中成功加倍的水稻籽粒比例依次为0.1％(吉农大878)、0.7％(MY397)、0.3％(L19)、0％(D71)、0.4％(黑颖75)。上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、水稻种子的灭菌及萌动处理；
步骤2、采用超声波辅助秋水仙碱处理水稻萌动种子，获得染色体加倍的水稻苗；
步骤3、将步骤2得到的水稻苗转移到筛选培养基II上继续培养，直到幼苗逐渐生根完成即进行移栽。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述的步骤1中的水稻种子的灭菌及萌动处理具体按照以下步骤实施：
步骤1.1、精选水稻种子，在超净工作台中将其置于无菌三角瓶中；首先加入酒精，进行快速润洗，随后迅速将酒精倒出，并立即用无菌水冲洗3次；然后，向盛有水稻种子的三角瓶中加入H2O2浸泡，期间摇晃三角瓶几次以便充分灭菌；最后，用无菌水反复冲洗水稻种子3-4次；
步骤1.2、向步骤1.1处理后的盛有水稻种子的三角瓶中加入赤霉素的无菌水溶液中，用透气的封口膜封口后，置于恒温培养箱内避光培养，然后用无菌水清洗种子3次以上；随后，向三角瓶中加入无菌水，继续在恒温培养箱内避光培养，直至种子露白。
3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述的水稻种子为吉农大878、MY397、L19、D71或黑颖75中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述步骤1.1中的酒精体积浓度为75％，酒精的用量与水稻的用量比例为10:100-20:100ml/粒，酒精的润洗时间不超过40秒；H2O2的体积浓度为10％，H2O2的用量与水稻的用量比例为20:100-30:100ml/粒，H2O2的浸泡时间为10-20min。
5.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述步骤1.2中的赤霉素的质量浓度为0.1％，赤霉素的用量与步骤1.1处理后的无菌水处理后的水稻种子的用量的比例为10:100-20:100ml/粒，添加赤霉素的培养时间为10-15h，添加赤霉素的培养温度为25-35℃；无菌水的用量为10:100-20:100ml/粒水稻，添加无菌水的培养温度为25-35℃，添加无菌水的培养时间为8-36h。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤2中的采用超声波辅助秋水仙碱处理水稻萌动种子，获得染色体加倍的水稻苗具体为：
将制备好的露白水稻种子在无菌操作台中，用镊子转移到含有超声处理培养液I的三角瓶中，并铝箔将三角瓶瓶身完全遮盖，在冰水浴中孵育，随即进行超声波处理；完成上述处理后，将溶液去除，加入常温的超声处理培养液II超声处理；处理后，用无菌水反复冲洗3-6次，最后用超声处理培养液III处理水稻种子，然后，将种子用无菌水取出反复冲洗3-6次，并在筛选培养基I上进行光照培养，直到水稻幼苗表现为茎芽膨大，且略出现绿色；继续培养12-15天，期间淘汰出现的白化苗和快速伸长的水稻苗。
7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，所述的超声处理培养液I的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液I的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为10:100-15:100ml/粒，添加超声处理培养液I时的孵育时间为3-8min，超声波处理功率为90-180W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行12组循环；超声波发生探头的直径为10mm；
超声处理培养液II的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液II的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为10:100-20:100ml/粒，添加超声处理培养液II时的超声波处理功率为90-180W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行6组循环；超声波发生探头的直径为10mm；
超声处理培养液III的组成如下：KCl 0.75g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；添加超声处理培养液III时的处理时间为72h，期间每隔24h更换一次超声处理培养液III。
8.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，所述的筛选培养基I的组成如下：KCl0.15g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；光照培养培养温度为21-31℃；光照培养培养时间为20-28h；在筛选培养基I上继续培养时间为12-15天。
9.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤3中的筛选培养基II的组成如下：KCl 0.75g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；在筛选培养基II上继续培养时间为12-15天。
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