CN102202495A - 从胚珠进行麻风树的体细胞胚发生 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体细胞胚产生领域，具体涉及从胚珠进行麻风树的体细胞胚发生的方法。更具体地，本发明涉及从未开放花芽胚珠进行麻风树的体细胞胚发生的方法和培养基组合物。该方法非常适合麻风树转化，用于成批产生麻风树无性营养繁殖苗，用于产生单倍体、双单倍体、二倍体和无病小植株。

Description

从胚珠进行麻风树的体细胞胚发生

发明背景 

本发明涉及体细胞胚胎产生领域，尤其涉及一种从胚珠进行麻风树(Jatropha)的体细胞胚发生的方法。更具体地，本发明涉及一种从未开放花芽胚珠进行麻风树(Jatropha curcas)的体细胞胚发生的方法和培养基组合物。该方法非常适于麻风树转化和产生克隆营养繁殖苗用于大规模麻风树种植，以及用于产生单倍体、双单倍体、二倍体和无病小植株。

本文中使用的举例说明本发明背景或者提供额外关于实施的详细描述的出版物及其他材料援引加入本文，为方便起见分别附于参考文献中。

麻风树属于大戟科植物，原产拉丁美洲，广泛分布于世界热带干旱与半干旱地区。麻风树大属包含170种以上。印度最普通的品种是麻风树、有腺麻疯树(J.glandulifera)、棉叶麻风树(J.gossypifolia)、珊瑚花(J.multifida)、J.nana、琴叶珊瑚(J.panduraefolia)、J.villosa和佛肚树(J.podagrica)。麻风树是一种带有灰色光滑树皮、切开渗出白色水状液汁的小树或灌木。通常生长到3至5米高之间，但是在适宜条件下高度可以达到8或10米。它是耐干旱植物，在边缘土地生长存活达50年。

麻风树(Jatropha curcas)叶深绿色至淡绿色，交互对生。螺旋叶序列，3～5浅裂。花柄长6-23mm。花期热季。在湿度适宜和高温土壤中获得几次收获。在这种出现连续生长的条件下，雌或雄花产生的不平衡导致大量雌花。当冬季灌木无叶的时候产生果实。每个花序产生一串大约十个或十个以上的卵形果实。种子成熟并且肉质外果皮变干以后产生带有三个双瓣的小干果。受精二到四个月后荚膜从绿色变为黄色的时候种子成熟。黑色的薄壳种子是椭圆形类似小蓖麻种子。这种植物具有多种的医药应用，特别是在营养制品、药品、皮肤病和个人护理产品方面。麻风树(Jatrophacurcas)由于存在称作“麻风树碱”的生物碱，其汁液具有抗癌特性。嫩枝用于清洁牙齿。叶子汁应用于外用治疗痔疮。根用作蛇咬的解毒药。种子用于驱虫目的。树皮产生的深蓝色染料可以用于布、鱼网和线的染色。除了产油品种J.curcas和J.glandulifera，大多数麻风树品种是用于观赏的。这些品种种子包含半干性油，已经发现有助于医药和兽医目的。

种子中含油量是25-30％，核中50-60％。油含有21％的饱和脂肪酸和79％的不饱和脂肪酸。麻风树油包含亚麻酸(C18:2)和油酸(C18:1)，其总量达到油组分的80％。油中的其它脂肪酸是棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)。这种油是不可食用的，但是它可能提供一种有前途的有商业价值的柴油替代物，因为它具有柴油的所有合乎需要的物理化学和性能特性。植物J.curcas目前作为一种热带能源植物受到特别关注。因为种子油具有接近矿物燃料柴油的特性，因此可用作柴油动力燃料。此外由于它无毒和可生物降解的特性，麻风树生物柴油符合柴油发动机用纯的和混合的汽车燃料的欧洲EN14214标准。麻风树(Jatropha curcas)种子产量接近6-8MT/ha，带有大约37％的油。这种产量相当于能生产2100-2800升燃料油/ha，其能量相当于19800-26400kwh/ha(Gaydou等，1982)。因为其非常高的皂化值和无烟燃烧的性能，种子油具有商业用途。例如，广泛用于制造香皂。目前全世界对经济、环境和能源安全的担忧促使从矿物燃料向生物燃料替代物如生物乙醇和生物柴油的转变。由于生物燃料能从多种作物产生，每个国家采取策略开发所拥有作物的比较优势。

不同生物燃料作物中，Jatropha curcas由于生理和天然因素被认为是生产生物燃料的更好选择。对麻风树的油料的强烈兴趣对供应足够种植用的均质及高产种子已产生巨大压力。因此，目前急需大量繁殖精选树。同等急需的是改良麻风树的各种农学性状的方法。基因工程被认为是作物改良的快速方法。植物转化基本上是两步方法，即输送基因进入宿主细胞，随后再生转化细胞为植物。体细胞胚性愈伤组织或者体细胞胚发生悬浮培养物通常被认为是最有效的再生方法，因为大多数转化细胞已获得胚发生潜力，能非常自发地驱动它们发展为体细胞胚，这是类似于合子胚中的受精卵细胞的过程(Dodeman等，1997)。

体细胞胚适于经根癌农杆菌(Agrobacterium tuniefaciens)(Mathews等，1992)、显微注射(Neuhaus等，1987)和颗粒轰击(Wilde等，1992)转化。另外，体细胞胚或体细胞胚性愈伤组织可以用液氮冷冻保存而不丧失活性。因此它们是保持种质及细胞胚发生的理想材料。

体细胞胚在来源上是克隆的，因此用体细胞胚增殖可以具有非常高的无性增加速率的潜力，并因此有显著商业价值。经体细胞胚发生的再生是植物组织培养的有吸引力的选择。体细胞胚据报道提供比茎叶(shoot)更稳定 的再生体(regenerant)。使用体细胞胚的再生系统的另一个优势是它们的明显单细胞来源。这意味着再生体不太可能是嵌合来源的，因为如果再生体源自一簇细胞而非单细胞，则植物组织可能是嵌合的或者不稳定的并且产生非正常型(off-type)。

为了进一步改良该作物，可以利用诸如组织培养和转化的生物技术。20多年中，几份研究记录了使用各种外植体使用不同培养基组合物的麻风树再生。这些研究包括经由下胚轴、叶柄和叶子外植体(Sujatha和Mukta，1996)、上胚轴外植体(中国专利申请号200610020449.X)、叶盘(印度专利申请公开号490/MUM/2006)、茎尖和节外植体(欧洲专利申请公开号1817956；Datta等，2007)、叶愈伤组织的体细胞胚发生(Jha等，2007)和子叶盘外植体转化(Li等，2008)的植物再生。上述所有研究集中在愈伤组织介导和分生组织再生。经由生殖组织(花药或胚珠)器官发生或体细胞胚发生的小植株产生能引起产生单倍体、双单倍体或二倍体，其可产生典型的纯合特征，使该方法比植物育种计划有利。

倍数性检测通常通过计算染色的根尖上的染色体进行，但是这种方法费劲，对具有小染色体和高倍数水平的品种常常很艰难，还会引起对种质错误分类(Brummer等，1999)。所有染色体位于植物细胞核中，使得核DNA含量能够用于测定倍数性水平。最近几年，由于流式细胞仪的容易、快速和准确，已变成测定核DNA含量的优选技术(Rayburn等，1989；Heslop-Harrison，1995)。Arumuganathan和Earle(1991a)使用流式细胞仪测定了超过100种主要农作物品种的核DNA含量。Vogel等(1999)使用流式细胞仪测定多年生小麦染色体组的基础DNA含量。流式细胞仪也用于测定柳枝稷(Panicum virgatum L.)(Hultquist等，1997；Lu等，1998)、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)(Brummer等，1999)和草皮草种(Arumuganathan等，1999)的倍数性水平。植物细胞中的DNA数量用皮克(pg)表示成“C”值(Bennett和Smith，1976)。字母C表示单倍体核或染色体组的DNA“恒量”或数量；2C值表示二倍体体细胞核的DNA含量。用皮克表示的DNA数量可通过1pg＝980Mbp的转换因数转换成百万碱基对(Mbp)(Bennett等，2000)。

因此，本领域一直需要通过使用生殖组织(花药或胚珠)体细胞胚发生进行的小植株再生。尽管这些研究是成功的，但是本调查中我们首次提 出通过从麻风树(Jatropha curcas)未开放花芽分离的胚珠外植体的体细胞胚发生进行的高频再生，其是经济的，并允许产生单倍体、双单倍体、二倍体和无病小植株。

发明内容

本发明涉及体细胞胚胎产生领域，尤其是本发明涉及一种从胚珠进行麻风树(Jatropha)的体细胞胚发生的方法。更具体地，本发明涉及一种从未开放花芽胚珠进行麻风树(Jatropha curcas)的体细胞胚发生的方法和培养基组合物。该方法非常适于麻风树转化和产生克隆营养繁殖苗用于大规模麻风树种植，用于产生单倍体、双单倍体、二倍体和无病小植株。该方法也能高效转化这种植物。

因此，本发明一方面提供了一种从获得自麻风树(Jatropha curcas)胚珠的外植体产生体细胞胚的方法。根据这个方面，外植体从麻风树(Jatrophacurcas)健壮母株获得。一个实施方案中，胚珠外植体经由未开放花芽获得。另一实施方案中，胚珠是未受精的。再一实施方案中，胚珠外植体是无菌的。胚珠外植体放入包括MS基本培养基(Murashige和Skoog，1962)和含有用于愈伤组织诱导和体细胞胚发生的生长素的初始固体培养基。一个实施方案中，生长素是2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。一个实施方案中，为了形成胚性愈伤组织，胚珠外植体在初始培养基内暗培养。另一实施方案中，为了体细胞胚发育和成熟，胚性愈伤组织转入新鲜的初始培养基中光培养。成熟的体细胞胚转入包括MS培养基基础盐和生长素和赤霉酸(GA₃)的萌发固体培养基。一个实施方案中，生长素是吲哚丁酸(IBA)。一个实施方案中，萌发培养基还包含一种或多种细胞分裂素。另一实施方案中，萌发培养基还包含一种或多种有机添加剂。再一实施方案中，萌发培养基还包含一种或多种细胞分裂素和一种或多种有机添加剂。一个实施方案中，细胞分裂素是激动素(KN)、6-苄基氨基嘌呤(BA)、激动素活性的尿素衍生物(例如噻苯隆(TDZ))或其混合物。一个实施方案中，有机添加剂是干酪素水解物(CH)、硫酸腺嘌呤(AdSO₄)或其混合物。一个实施方案中，成熟的体细胞胚在萌发培养基内光培养。使萌发的小植株变壮，移入温室。

本发明方法包括完整、高效的系统，该系统可用于再生麻风树属植物，特别是Jatropha curcas种及其人工杂种。通过这个系统已经产生大量体细 胞胚，且再生体已经显示完全正常地营养生长和生殖生长。

如本文所示，经由未受精胚珠使用体细胞胚发生方法产生的小植株是单倍体。双倍体(例如双单倍体植物)通过用有丝分裂抑制剂(诸如秋水仙素和黄草消)处理胚发生愈合组织产生。

附图简述

图1A-1F出示了麻风树(Jatropha curcas L.)胚珠体细胞胚发生。图1A：20天后胚珠愈伤组织诱发。图1B：40天后胚珠胚性愈伤组织诱发。图1C：从胚珠愈伤组织的体细胞胚起始。图1D：75天后来自胚珠愈伤组织的体细胞胚不同发育阶段(球形期、心形期、鱼雷期和子叶期)。图1E和图1F：90天后来自初期体细胞胚的次期体细胞胚的发育(tor：鱼雷形体细胞胚；glo：球形体细胞胚)。

图2A-2F出示了麻风树(Jatropha curcas L.)胚珠体细胞胚发生的不同阶段。图2A：胚珠胚性愈伤组织诱发。图2B：球形期胚(glo)和心形胚(h)。图2C：鱼雷形胚(tor)。图2D和2E：子叶形体细胞胚(cot)(早期和后期)。图2F：发芽体细胞胚(r：根)。

图3A-3C出示了根据本发明再生的植物的倍数性分析。图3A：本文产生的植物。图3B：使用流式细胞仪测定的对照双倍体植物的DNA含量显示为2c。图3C：使用流式细胞仪测定的图3A所示植物的DNA含量显示为1c，指示植物为单倍体。

发明详述

本发明涉及体细胞胚胎产生领域，尤其是本发明涉及一种从胚珠进行麻风树(Jatropha)的体细胞胚发生的方法。更具体地，本发明涉及一种从未开放花芽胚珠进行麻风树(Jatropha curcas)的体细胞胚发生的方法和培养基组合物。该方法非常适于麻风树转化和产生克隆营养繁殖苗用于大规模麻风树种植，用于产生单倍体、双单倍体、二倍体和无病小植株。该方法也能高效转化这种植物。

通过体细胞胚发生繁殖是指在体外从小部分植物组织或者个体细胞中产生胚的方法。所述胚被称作体细胞胚，因为其衍生自体细胞(营养性)组织，而不是衍生自有性生殖过程。通过体细胞胚发生的无性繁殖能够捕获极其 优选的基因型的所有遗传获得量。此外，这些方法易于实现自动化和机械化。最后，对再生转化的细胞使用体细胞胚发生能够实现植物的高效转化。

根据本发明，通过在外植体组织上诱导体细胞胚形成产生体细胞胚。在一个实施方案中，从得自麻风树属植物的胚珠外植体中诱导体细胞胚。在一个实施方案中，胚珠来自未开放的花。另一实施方案中，胚珠未受精。将胚珠外植体置于固体培养基中，在此指初始培养基。在一个实施方案中，初始培养基是MS培养基并包括生长素。一个实施方案中，生长素是2，4-D。一个实施方案中，初始培养基中2，4-D浓度是大约2.26μM至大约9.04μM，优选大约4.52μM至大约6.78μM，更优选大约6.78μM。一个实施方案中，初始培养基还包括碳源。在一个实施方案中，碳源是大约2％至大约5％，优选大约2％至大约3％，更优选大约3％的蔗糖。另一实施方案中，碳源是大约2％至大约5％，优选大约3％至大约5％的葡萄糖。另一实施方案中，碳源是大约2％至大约5％，优选大约2％至大约3％的果糖。又一实施方案中，碳源是大约2％至大约5％，优选大约2％至大约3％的麦芽糖。另一实施方案中，碳源是蔗糖和葡萄糖混合物，蔗糖大约2％至大约3％，优选大约2％，葡萄糖大约2％至大约3％，优选大约2％。再一实施方案中，碳源是果糖和葡萄糖混合物，果糖大约1％至大约2％，优选大约1％，葡萄糖大约2％至大约3％，优选大约2％。又一实施方案中，碳源是麦芽糖和葡萄糖混合物，麦芽糖大约1％至大约2％，优选大约1％，葡萄糖大约2％至大约3％，优选大约2％。

一个实施方案中，将胚珠外植体置于初始培养基中培养大约30-60天，优选大约40天。一个实施方案中，维持大约25℃±2℃的暗培养，55％至60％的相对湿度。在初始培养基中培养的胚珠外植体诱导胚性愈伤组织的形成。

在初始培养基暗培养诱导胚性愈伤组织形成后，为了体细胞胚的发育和成熟，将胚性愈伤组织置于新鲜的初始培养基中。一个实施方案中，将胚性愈伤组织置于初始培养基中培养大约4-6周，优选4周。一个实施方案中，将带有正在发育和成熟的体细胞胚的胚性愈伤组织以2周周期继代培养。一个实施方案中，为使体细胞胚发育和成熟，胚性愈伤组织的培养维持大约25℃±2℃，16h/8h(光/暗)光周期，55％至60％的相对湿度。一个实施方案中，光周期是在大约25μEm^-2s^-1光密度的白色荧光下进行。

在培养产生成熟体细胞胚后，将体细胞胚放入固体培养基中，在此指 萌发培养基。在一个实施方案中，成熟体细胞胚是子叶形体细胞胚。在一个实施方案中，萌发培养基是MS培养基并包括生长素和GA₃。一个实施方案中，生长素是IBA。一个实施方案中，萌发培养基中IBA浓度是大约1.23μM至大约4.92μM，优选大约1.84μM至大约2.46μM，更优选大约2.46μM。一个实施方案中，萌发培养基中GA₃浓度是大约0.72μM至大约5.76μM，优选大约1.44μM至大约2.88μM，更优选大约2.88μM。一个实施方案中，萌发培养基还包含一种或多种细胞分裂素。一个实施方案中，细胞分裂素是KN、BA、激动素活性的尿素衍生物(例如TDZ)或其组合物。一个实施方案中，KN浓度是大约1.16μM至大约9.28μM，优选大约2.32μM至大约4.64μM，更优选大约4.64μM。另一实施方案中，BA浓度是大约1.10μM至大约8.86μM，优选大约2.21μM至大约4.43μM，更优选大约4.43μM。再一实施方案中，TDZ浓度是大约1.13μM至大约9.08μM，优选大约2.27μM至大约4.54μM，更优选大约4.54μM。另一实施方案中，细胞分裂素是KN和BA组合物，其中KN值是大约1.16μM至大约4.64μM，优选大约1.16μM至大约2.32μM，更优选大约2.32μM和BA值是大约1.10μM至大约4.43μM，优选大约1.10μM至大约2.21μM，更优选大约2.21μM。另一实施方案中，细胞分裂素是BA和TDZ组合物，其中BA值是大约1.10μM至大约4.43μM，优选大约1.10μM至大约2.21μM，更优选大约2.21μM和TDZ值是大约1.13μM至大约4.54μM，优选大约1.13μM至大约2.27μM，更优选大约2.27μM。再一实施方案中，细胞分裂素是KN和TDZ组合物，其中KN值是大约1.16μM至大约4.64μM，优选大约1.16μM至大约2.32μM，更优选大约2.32μM和TDZ值是大约1.13μM至大约4.54μM，优选大约1.13μM至大约2.27μM，更优选大约2.27μM。另一实施方案中，萌发培养基还包含一种或多种有机添加剂。一个实施方案中，有机添加剂是CH、AdSO₄或其组合物。在一个实施方案中，萌发培养基添加大约0.25g至大约1.5g，优选大约0.5g至大约1.0g，更优选大约1.0g的CH。一个实施方案中，萌发培养基中添加大约25mg至大约200mg，优选大约50mg至大约100mg，更优选大约100mg的AdSO₄。再一实施方案中，萌发培养基还包含一种或多种细胞分裂素和一种或多种有机添加剂。萌发培养基还包括碳源。萌发培养基中的碳源可与初始培养基中相同。优选实施方案中，碳源是大约2％至大约5％，优选大约2％至大约3％，更优选大约3％的蔗 糖。

一个实施方案中，将成熟体细胞胚置于萌发培养基中培养大约1-3周，优选2周。一个实施方案中，将成熟体细胞胚以2周周期继代培养。一个实施方案中，成熟体细胞胚的培养维持大约25℃±2℃，16h/8h(光/暗)光周期，55％至60％的相对湿度。一个实施方案中，光周期是在大约25μEm^-2s^-1光密度的白色荧光下进行。随后使发芽的体细胞胚，即小植株变壮。一个实施方案中，小植株在土壤、沙子、泥沼、木炭(1∶1∶2∶0.5v/v/v/v)或单独其它Houghland土壤或在Houghland土壤和沙子(2∶1v/v)限定比例的组合中变壮。

通过流式细胞仪分析DNA含量指示，本文描述的通过未受精胚珠体细胞胚发生方法产生的小植株产生单倍体植物。

双单倍体植物通过用有丝分裂抑制剂处理胚性愈伤组织产生。一个实施方案中，用有丝分裂抑制剂处理胚性愈伤组织1-3天，优选3天。一个实施方案中，有丝分裂抑制剂是秋水仙素。一个实施方案中，胚性愈伤组织用0.1％-0.5％，优选0.5％的秋水仙素处理。另一实施方案中，有丝分裂抑制剂是黄草消。一个实施方案中，胚性愈伤组织用0.1％-0.5％，优选0.5％的黄草消处理。在胚性愈伤组织转入新鲜的初始培养基前，将有丝分裂抑制剂加入上述的胚性愈伤组织诱导培养基中。添加有丝分裂抑制剂的培养物的培养条件与体细胞胚性愈伤组织诱导相同。用有丝分裂抑制剂处理后，胚性愈伤组织放入用于体细胞胚发育和成熟的新鲜初始培养基并如上述培养。成熟体细胞胚放入萌发培养基并如上述培养以使上述双单倍体小植株萌发。

另外，本发明提供了用于麻风树属植物转化的系统。这种转化/转染方法对于麻风树属植物的转化并不是关键的，目前可获得各种转化或转染方法。当获得转化作物或其它寄主细胞的更新方法，可以直接采用这些方法。相应地，研制出多种将DNA序列插入寄主细胞基因组以得到序列转录和/或翻译，从而实现生物体表型改变的方法。因而，可采用任何有效转化/转染的方法。例如参见Mathews等(1992)，Neuhaus等(1987)，Wilde等(1992)，美国专利号7241937，7273966和7291765和美国专利申请公开号2007/0231905和2008/0010704。还参见国际公开申请号WO2005/103271。

一个实施方案中，可采用本领域公知技术将外植体组织与农杆菌共同 培养，农杆菌菌株包含一个DNA构建体，DNA构建体包含一个或多个关注的基因或核酸。可使用本领域公知的常规技术选择转化组织。另一实施方案中，可采用本领域公知技术将胚发生液体悬浮培养物与农杆菌共同培养，农杆菌菌株包含一个DNA构建体，DNA构建体包含一个或多个关注的基因或核酸。可使用本领域公知的常规技术选择转化组织。再一实施方案中，使用常规技术如粒子轰击技术将DNA导入胚发生液体悬浮培养物的外植体组织或细胞。可使用本领域公知常规技术选择转化组织。可使用文中描述的方法再生转化或转基因植物。

类似地，插入麻风树属植物的DNA(关注的DNA)对于转化过程并不关键。通常导入植物的DNA是构建体的一部分。DNA可以是基因，例如蛋白编码序列，或者它可以是能调控基因表达的序列，例如反义序列、正义抑制序列或miRNA序列。构建体典型地包括有效地连接至关注的DNA5’侧和/或关注的DNA3’侧的调控区。包括全部这些元件的盒在此处同样指表达盒。表达盒另外可包括在表达盒构建体中的5’前导序列。调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或编码信号锚定的多聚核苷酸对于寄主细胞或者彼此可以是天然的/类似的。可选地，调控区和/或编码信号锚定的多聚核苷酸对于寄主细胞或者彼此可以是异源的。参见美国专利号7205453和美国专利申请公开号2006/0218670和2006/0248616。表达盒另外可包括可选择标记基因。参见美国专利号7205453和美国专利申请公开号2006/0218670和2006/0248616。

通常，为选择转化的细胞，表达盒会包括可选择标记基因。可选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。通常，具有合适的基因的植物可选择标记基因可编码抗生素抗性，所述合适的基因包括至少一组编码抗壮观霉素的基因、编码抗链霉素的链霉素磷酸转移酶(spt)基因、编码抗卡那霉素或遗传霉素的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、编码抗潮霉素的潮霉素磷酸转移酶(hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合成酶(als)基因。可选地，植物可选择标记基因可编码除草剂抗性，比如磺脲型除草剂、草丁膦、草甘膦、铵、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)抗性，包括编码抑制谷酰胺合成酶的作用的除草剂的抗性基因，，比如草胺膦或basta(例如bar基因)。通常参见WO02/36782，US专利号7205453和美国专利申请公开号2006/0248616和2007/0143880，并且本文引用这些参考文献。 并不限于这里罗列的可选择标记基因。可以使用任何可选择标记基因。

许多启动子可用于实施本发明。可以基于所需的结果选择启动子。即核酸可以与组成型、组织优选或者其它启动子组合以在宿主细胞中表达。这样的组成型启动子包括诸如Rsyn7的核心启动子(WO99/48338和美国专利号6072050)；核心CaMV^35S启动子(Odell等，1985)；水稻肌动蛋白(McElroy等，1990)；遍在蛋白(Christensen和Quail，1989和Christensen等，1992)；pEMU(Last等，1991)；MAS(Velten等，1984)；ALS启动子(美国专利号5659026)等等。其它组成型启动子包括诸如美国专利号5608149，5608144，5604121，5569597，5466785，5399680，5268463和5608142公开的启动子。

其它启动子包括诱导启动子，特别是来自病原诱导启动子。这种启动子包括那些来自病程相关蛋白(PR蛋白)的启动子，病原侵染后被诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白，β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶等。其它启动子包括那些在病原侵染位点上或周围表达的启动子。再一实施方案中，启动子可以是伤害诱导启动子。另一实施方案中，化学调控启动子可通过外源化学调节剂的施加调节植物基因表达。启动子可以是化学诱导启动子，其中施加化学制剂诱导基因表达，或者是化学抑制启动子，其中施加化学制剂抑制基因表达。另外，在特定植物组织内以增强多聚核苷酸的表达为目的能采用组织优选启动子。这些启动子中都在美国专利号6506962，6575814，6972349和7301069以及美国专利申请公开号2007/0061917和2007/0143880中描述。

当需要时，关注的DNA可被优化以增加在转化的植物中表达。即可以使用植物优选的密码子合成编码序列以改良表达。合成植物优选基因的方法是本领域现有方法。例如参见美国专利号5380831，5436391和7205453和美国专利申请公开号2006/0218670和2006/0248616。

除非另有说明，本发明实施采用化学、分子生物学、微生物、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术，都属于本领域技术。例如，参见Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，2nd Ed.(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook and Russell， 2001，Molecular Cloning，3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Ausubel et al.，1992)，Current Protocolsin Molecular Biology(John Wiley & Sons，including periodic updates)；Glover，1985，DNA Cloning(IRL Press，Oxford)；Russell，1984，Molecularbiology of plants：a laboratory course manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)；Anand，Techniques for theAnalysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Guthrie and Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press，New York，1991)；Harlow and Lane，1988，Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook OfExperimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，Essential Immunology，6th Edition，Blackwell ScientificPublications，Oxford，1988；Fire et al.，RNA Interference Technology：FromBasic Science to Drug Development，Cambridge University Press，Cambridge，2005；Schepers，RNA Interference in Practice，Wiley-VCH，2005；Engelke，RNA Interference(RNAi)：The Nuts & Bolts of siRNATechnology，DNA Press，2003；Gott，RNA Interference，Editing，andModification：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)，Human Press，Totowa，NJ，2004；Sohail，Gene Silencing by RNAInterference：Technology and Application，CRC，2004。

实施例

本发明参考以下实施例进行说明，所述实施例只是举例说明本发明， 无任何限制之意。利用本领域熟知的标准技术或者在下文特别描述的技术。

实施例1

母株的制备

某些实施方案中，筛选用于采集外植体的母株以鉴定健康样本和/或为无病状态或处理感病的处理。可通过评估植物的大小、重量、总体生长、外观和无污染或无传染来判断是否健康。J.curcas植物通常被“蛙眼病”(Cercospera spp.)，异翅亚目和黄金叶甲科甲虫(Podagrica species)的昆虫感染。通过向植物喷施诸如杀菌剂、杀虫剂、农药等来进行去污染。用于预处理母株的优选杀菌剂包括浓度大约为0.05％-0.2％的多菌灵^TM、克菌丹 ^TM、代森锌^TM或其组合物。用于预处理母株的优选杀虫剂包括但不限于浓度大约为0.005％-0.02％的乐果^TM、久效磷^TM、氰胺(Fastac^TM)、Ultracid^TM40-WP、硫丹^TM。

实施例2

未开放花芽的消毒

麻风树(Jatropha curcas L.)的未开放花芽收集自新加坡国立大学淡马锡生命科学研究室1研究Link，新加坡117604的温室中的母株(Hong Yon博士友好提供)。将花芽用氯己啶消毒水(100ml无菌水中滴两滴)清洗20分钟，接着用10％次氯酸钠溶液(商用漂白剂)将这些花芽再次表面消毒15分钟，随后用无菌水冲洗5次。为了保证完全无菌，在将这些花芽切开分离胚珠用作外植体之前再次用70％酒精清洗3分钟，随后用无菌水冲洗3次。

实施例3

培养基和激素

初始培养基为添加有蔗糖(3％)作为碳源的MS基础培养基(MS矿物盐和维生素)和包括作为凝胶剂的植物琼脂(0.8％)。培养基pH值为5.8。萌发培养基为添加有蔗糖(3％)作为碳源的MS基础培养基(MS矿物盐和维生素)和包括作为凝胶剂的植物明胶(0.25％)。培养基pH值为5.8。 培养基放入无菌佩氏培养皿(90×50mm大小，塑料聚碳酸酯，加拿大)。用于培养基制备的化学制剂具有分析级(Duchefa Biochemie，Haarlem，TheNetherlands and Sigma Aldrich公司，圣路易，美国)。

用于本发明培育方法的培养基中添加不同的激素。通常，培养基包含降低浓度的植物激素。在培养基中测试的激素是在组织培养的各个阶段会以所需的方式影响生长的植物激素。测试的植物激素例子包括天然或合成生长素(2，4-D、吲哚乙酸(IAA)、IBA)、细胞分裂素(BA、KN)、GA₃或激动素活性的尿素衍生物(例如TDZ)。单独或组合测试激素。只有2，4-D(2.26、4.52、6.78和9.02μM)对诱导胚性愈伤组织是有效的。其它生长素IAA(0.71、1.42、2.85和5.70μM)、IBA(0.615、1.23、2.46和4.92μM)以及2，4-D(2.26、4.52、6.78和9.02μM)或IAA(0.71、1.42、2.85和5.70μM)或IBA(0.615、1.23、2.46和4.92μM)与细胞分裂素、BA(1.10、2.20、4.43μM)、KN(1.16、2.32、4.64μM)和TDZ(1.13、2.27、4.54μM)的组合物单独或组合仅诱导非胚性愈伤组织。

IBA(1.23、1.84、2.46和4.92μM)和GA₃(0.72、1.44、2.88和5.76μM)对体细胞胚萌发是有效的。测试了GA₃(0.72、1.44、2.88和5.76μM)与IAA(1.42、2.85、5.70和8.56μM)和NAA(1.34、2.68、5.37和8.04μM)的组合，但是没有效果。添加细胞分裂素(1.16、2.32、4.64和9.28μM KN；1.10、2.21、4.43和8.86μM BA；1.13、2.27、4.54和9.08μM TDZ；1.16、2.32、4.64μM KN和1.10、2.21、4.43μM BA；1.10、2.21、4.43μM BA和1.13、2.27、4.54μM TDZ；1.16、2.32、4.64μM KN和1.13、2.27、4.54μM TDZ)和/或有机添加剂(0.25g、0.5g、1.0g CH；25mg、50mg、100mg、200mg AdSO₄；或其组合)增强了萌发小植株的生长。

实施例4

胚珠外植体的分离和培养

使用立体显微镜解剖消毒后的花芽，使用解剖针分离和损伤胚珠。受损的胚珠外植体接种于添加不同植物激素的初始培养基中暗培养40天。由这些胚珠诱导的愈伤组织转入新鲜的初始培养基中光(16h/8h(光/暗)光周期，25μEm^-2s^-1光密度)培养，用于体细胞胚发育和成熟。每2周继代培养带有正在发育和成熟的体细胞胚的愈伤组织。从该胚性愈伤组织发育的 成熟子叶形体细胞胚转入萌发培养基中以萌发。每2周继代培养正在萌发的体细胞胚。使萌发的小植株变壮，移入温室。所有培养物维持在25℃±2℃，55％至60％的相对湿度。每100mg胚性愈伤组织发育出将近12-15个成熟叶形体细胞胚，并且发育出95％的体细胞胚。

实施例5

麻风树(Jatropha curcas)体细胞胚发生

Jatropha curcas由于其高油含量被认为是产生生物燃料的更好选择，目前作为一种热带能源植物受到特别关注。由于具有高油含量的这些生理因素，所以提高其生物量产量是重要的。由于这个原因，可利用如组培和转化的生物技术。尽管有关于愈伤组织和分生组织再生(Sujatha和Mukta，1996；中国专利申请号200610020449；印度专利申请公开号490/MUM/2006；欧洲专利申请公开号1817956；Datta等，2007)和叶愈伤组织的体细胞胚发生(Jha等，2007)的报告，但是没有J.curcas经由生殖器官尤其是未受精胚珠作为外植体的体细胞胚发生再生的报告。本研究中，我们标准化了J.curcas使用未受精胚珠经由体细胞胚发生的再生。

在单独或组合包含不同生长素和细胞分裂素的MS培养基诱导愈伤组织。不同培养基类型中，包含2，4-D的MS培养基对于诱导胚性愈伤组织(图1A、1B和2A所示使用6.78μM 2，4-D)和体细胞胚发育(球形、心形、鱼雷形和子叶形)(图1C和1D、图2A-2E)是有效的。其它植物激素不能诱导胚性愈伤组织。体细胞胚在包含2，4-D的MS培养基中连续培养会形成畸形体细胞胚，不能萌发。

应当注意到光在胚性愈伤组织诱导中起重要作用。胚珠在添加2，4-D的MS培养基暗培养诱导胚性愈伤组织。但是，胚珠在添加2，4-D的MS培养基有光存在下培养不会诱导胚性愈伤组织。同样，体细胞胚仅在有光条件下发育，不会在无光条件下发育。

在添加GA₃和IBA的MS培养基培养引起体细胞胚萌发。添加细胞分裂素(KN、BA、TDZ、KN/BA、KN/TDZ和BA/TDZ)和有机添加剂(CH、AdSO₄、CH/AdSO₄)增强了萌发小植株的生长。还注意到次期体细胞胚和初期体细胞胚一起出现(图1E和1F)。

与此相反，Jha等(2007)报导了在添加有KN(9.3μM)的MS培养 基中诱导J.curcas叶外植体的胚性愈伤组织，在添加有KN(2.3μM)和IBA(1.0μM)的MS培养基中发育出体细胞胚。Jha等(2007)还报道了添加硫酸腺嘌呤(13.6μM)刺激体细胞胚发育过程。目前研究认为，在愈伤组织诱导培养基中添加AdSO₄导致绿色紧密愈伤组织的产生，该愈伤组织变为非胚性愈伤组织。仅仅2，4-D和暗条件对于胚性愈伤组织诱导是关键的。Kim等(2007)报导了在盾叶鬼臼上相同的研究结果。Jha等(2007)陈述了J.curcas体细胞胚发生系统需要12-16周。然而在本研究中完整的体细胞胚发生系统可以在少于12周内完成95％体细胞胚萌发。当未受精胚珠发育为体细胞胚的时候，该系统可用于产生单倍体、双单倍体或二倍体植物，这些植物用于植物育种和产生转基因植物。

实施例6

再生植物倍数性测定

本研究的目的是测定来自Jatropha curcas L未受精花芽以及在体生长的染色体数目为2n＝22的二倍体植物的小植株体细胞胚的核DNA含量。

Arumuganathan和Earle(1991b)和Tuna等(2001)描述的步骤用于测定每个核的DNA含量。简言之，该步骤包括切开植物组织制备完整细胞核的悬浮液，在混合有DNA标准液的MgSO₄缓冲液中和溶解原生质，和在包含无脱氧核糖核酸酶的核糖核酸酶溶液中用碘化丙啶(PI)给核染色。通过比较在体Jatropha curcas双倍体植物核的荧光强度来判断染色核的荧光强度。

从衍生自幼体细胞胚的枝切下将近500mg新鲜的绿色的组织，将其在35乘10mm的无菌塑料佩氏培养皿中置于冰上。添加大约500mg麻风树苗的叶组织作为标准。在1ml A溶解液(24ml MgSO4缓冲液(冰冷的)；25mg二硫苏糖醇；500μl碘化丙啶原液(1.0ml重蒸馏水中5.0mg碘化丙啶)；625μl聚乙二醇辛基苯基醚原液(10ml重馏水中1.0g聚乙二醇辛基苯基醚)中将叶组织切成0.25-1.0mm碎片。匀浆经由33μM尼龙网过滤后装入微量离心管，并以13000RPM转速离心(VS-15微型离心机，Shelton Scientific，Shelton，CT)20秒。丢弃悬浮液，微粒在400μl的B溶液(7.5ml A溶液；17.5μl核糖核酸酶(无脱氧核糖核酸酶))中再悬浮，微粒在流式细胞仪分析前于37℃培养15min。

制备的材料在纳米微量分光光度计中分析。为了测定，用CellQuest软件(Becton Dickinson Immuno cytometry system，San Jose，CA)采集20000核的PI荧光区域信号(FL2-A)。通过FL2-A和FSC-H参数使用活动门仪器结构，参数使得核的荧光测定产生FL2-A柱状图。通过CellQuest软件分析采集的数据确定样本和内标的G0/G1(核)峰的平均位置。每株植物的平均DNA含量是基于20000个扫描的核。将荧光值转换为DNA含量的公式是：核DNA含量＝(未知峰值的平均位置)/(已知峰值的平均位置)X已知标准的DNA含量。

Jatropha curcas二倍体对照植物的幼叶流式细胞仪的分析表明DNA脉冲幅度信号的二个峰值对应2C和4C染色体含量(图3B)。如果是来自小植株的体细胞胚(图3A)，仅仅看到一个峰值，其低于对应2C染色体含量的DNA脉冲幅度信号并且是2C DNA含量的将近一半(图3C)。观察到这个单独的峰值表明该植物是具有染色体数量为n＝11的单倍体，对照植物观察到两个峰值表明植物是具有染色体数量为2n＝22的双倍体。将单倍体和双倍体植物叶子的DNA含量量化，观测到单倍体和双倍体植物叶子分别包含245.15ng/μl和508.3ng/μl的DNA含量。当通过从J.curcas未受精花芽子房分离的胚珠的愈伤组织介导体细胞胚发生再生小植株的时候，小植株通过流式细胞仪确定为单倍体。已经报道了西葫芦(Cucubita pepo L.)甜菜(Beta vulgaris L.)的未受精胚珠的离体培养产生单倍体的相同观察结果(Metwally等(2004)；Gürel和Gürel(1998)；Bossoutrot和Hosemans.(1985)；Galatowitsch和Smith(1990)；Van Geyt等(1987))。未受精植物产生的单倍体植物在Jatropha curcas上是首次报道。

实施例7

麻风树(Jatropha curcas)双单倍体再生植物的产生

如实施例5中所述制备的将发育为体细胞胚(胚性愈伤组织诱导40天后)的胚性愈伤组织用不同浓度(0.1-1％)的秋水仙碱处理3天。培养条件(温度、光周期和光)与上述相同。在秋水仙碱处理后，处理的胚性愈伤组织转入新鲜的初始培养基(包含2，4-D(6.78μM)的MS培养基)，并且在上述用于体细胞胚发育的实施方案5中培养。成熟体细胞胚转入萌发培养基(添加GA₃和IBA的MS培养基)，并且在上述用于小植株发育的实 施例5中培养。

不同秋水仙碱处理中，0.5％的浓度在双单倍体产生中是最有效的。如果浓度超过0.5％，愈伤组织就会褐变死亡。秋水仙碱处理的小植株的形态学特性与双单倍体类似。这种技术还能用于植物育种计划。

除非特别指出或者上下文明确相反，否则本发明描述内容(特别是权利要求的上下文中)中，术语“一”、“所述”和类似词语应理解包括单数和复数。除非另外提到，否则术语“包括”、“具有”、“含有”、“包含”被认为是开放式术语(即，意味着“包括，但不限于”)。文中数值范围的列举仅仅是充当范围内每个单独数值一个一个提到的简写方法，除非特别指出，否则每个单独值并入说明书，如同一个一个在此提到。例如，如果公开了范围10-15，那么11、12、13和14也被公开了。除非特别指出或者上下文明确相反，否则文中描述的所有方法能以任何适宜顺序进行。任何实施例的使用，或者文中提供的举例语言(例如“诸如”)，除非文中要求保护，否则仅仅为了更好说明本发明，并不限制本发明范围。说明书语言不应解释为指定对于本发明实践关键的任何未要求元素。

应意识到本发明的方法和组合物包括各种形式的实施方案，本文仅仅公开了一小部分。本发明文中描述的实施方案包括本发明人已知的实施本发明的最好方式。本领域普通技术人员在阅读以上描述的基础上可显而易见实施方案的变化。本发明人期望技术人员可以适当应用这些改变，且可以本文所述不同的方式实施本发明。相应地，本发明包括适用法律允许的在所附权利要求中所述主题的所有修改和等价物。此外，除非特别指出或者上下文明确相反，则上述元素的所有可能范围内的任意变化组合均包含在本发明内。

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Claims (26)

1.一种经由体细胞胚发生再生麻风树的方法，包括步骤：

(a)在包括MS基本培养基和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的第一培养基中暗培养麻风树外植体，以诱导形成胚性愈伤组织，其中麻风树外植体是切开的未开放花芽的胚珠；

(b)在所述第一培养基中在光/暗光周期培养所述胚性愈伤组织，以诱导体细胞胚发育和成熟；和

(c)在包括MS基本培养基、吲哚丁酸(IBA)和赤霉酸(GA₃)的第二培养基中在光/暗光周期培养成熟的体细胞胚，以萌发小植株。

2.如权利要求1所述的方法，其中培养时间为：

第一培养基中大约30天至大约60天，以诱导胚性愈伤组织的形成；

第一培养基中大约4天至大约6周，以使体细胞胚发育和成熟；和

第二培养基中大约1周至大约3周，以萌发小植株。

3.如权利要求2所述的方法，其中在每种培养基中培养的时间为：

第一培养基中大约40天，以诱导胚性愈伤组织的形成；

第一培养基中大约4周，以使体细胞胚发育和成熟；和

第二培养基中大约2周，以萌发小植株。

4.如权利要求1所述的方法，其中培养时间为：

第一培养基中大约30天至大约60天，以诱导胚性愈伤组织的形成；

第一培养基中大约4周至大约6周，大约每2周继代培养，以使体细胞胚发育和成熟；和

第二培养基中大约1周至大约3周，大约每2周继代培养，以萌发小植株。

5.如权利要求4所述的方法，其中在每种培养基中培养的时间为：

第一培养基中大约40天，以诱导胚性愈伤组织的形成；

第一培养基中大约4周，以使体细胞胚发育和成熟；和

第二培养基中大约2周，以萌发小植株。

6.如权利要求1所述的方法，其中第二培养基还包含一种或多种细胞分裂素、一种或多种有机添加剂或一种或多种细胞分裂素和一种或多种有机添加剂的混合物。

7.如权利要求6所述的方法，其中细胞分裂素是激动素(KN)、6-苄基氨基嘌呤(BA)、噻苯隆(TDZ)或其混合物。

8.如权利要求6所述的方法，其中有机添加剂是干酪素水解物(CH)、硫酸腺嘌呤(AdSO₄)或其混合物。

9.如权利要求6所述的方法，其中(a)细胞分裂素是激动素(KN)、6-苄基氨基嘌呤(BA)、噻苯隆(TDZ)或其混合物和(b)有机添加剂是干酪素水解物(CH)、硫酸腺嘌呤(AdSO₄)或其混合物。

10.如权利要求1所述的方法，其中培养基包括：

第一培养基：MS基本培养基和大约2.26μM至大约9.04μM2，4-D；和

第二培养基：MS基本培养基、大约1.23μM至大约4.92μM IBA和大约0.72μM至大约5.76μM GA₃。

11.如权利要求10所述的方法，其中培养基包括：

第一培养基：MS基本培养基和大约6.78μM 2，4-D；和

第二培养基：MS基本培养基、大约2.46μM IBA和大约2.88μM GA₃。

12.如权利要求7所述的方法，其中一种或多种细胞分裂素浓度是：

(a)大约1.16μM至大约9.28μM KN；

(b)大约1.10μM至大约8.86μM BA；

(c)大约1.13μM至大约9.08μM TDZ；

(d)大约1.16μM至大约4.64μM KN和大约1.10μM至大约4.43μM BA；

(e)大约1.10μM至大约4.43μM BA和大约1.13μM至大约4.54μM TDZ；或

(f)大约1.16μM至大约4.64μM KN和大约1.13μM至大约4.54μM TDZ。

13.如权利要求12所述的方法，其中一种或多种细胞分裂素浓度是：

(a)大约4.64μM KN；

(b)大约4.43μM BA；

(c)大约4.54μM TDZ；

(d)大约2.32μM KN和大约2.21μM BA；

(e)大约2.21M BA和大约2.27μM TDZ；或

(f)大约2.32μM KN和大约2.27μM TDZ。

14.如权利要求8所述的方法，其中有机添加剂的量是：

(a)大约0.25g至大约1.0g CH；

(b)大约25mg至大约200mg AdSO4；或

(c)大约0.25g至大约1.0g CH和大约25mg至大约200mg AdSO₄。

15.如权利要求14所述的方法，其中有机添加剂的量是：

(a)大约1.0g CH；

(b)大约100mg AdSO₄；或

(c)大约1.0g CH和大约100mg AdSO₄。

16.如权利要求9所述的方法，其中

(a)一种或多种细胞分裂素浓度是：

(i)大约1.16μM至大约9.28μM KN；

(ii)大约1.10μM至大约8.86μM BA；

(iii)大约1.13μM至大约9.08μM TDZ；

(iv)大约1.16μM至大约4.64μM KN和大约1.10μM至大约4.43μMBA；

(v)大约1.10μM至大约4.43μM BA和大约1.13μM至大约4.54μMTDZ；或

(vi)大约1.16μM至大约4.64μM KN和大约1.13μM至大约4.54μMTDZ；和

(b)有机添加剂的量是：

(i)大约0.25g至大约1.0g CH；

(ii)大约25mg至大约200mg AdSO₄；或

(iii)大约0.25g至大约1.0g CH和大约25mg至大约200mg AdSO₄。

17.如权利要求16所述的方法，其中

(a)一种或多种细胞分裂素浓度是：

(i)大约4.64μM KN；

(ii)大约4.43μM BA；

(iii)大约4.54μM TDZ；

(iv)大约2.32μM KN和大约2.21μM BA；

(v)大约2.21μM BA和大约12.27μM TDZ；或

(vi)大约2.32μM KN和大约2.27μM TDZ；和

(b)有机添加剂的量是：

(i)大约1.0g CH；

(ii)大约100mg AdSO₄；或

(iii)大约1.0g CH和大约100mg AdSO₄。

18.如权利要求12-17任一项所述的方法，其中培养基包括：

第一培养基：MS基本培养基和大约2.26μM至大约9.04μM 2，4-D；和

第二培养基：MS基本培养基、大约1.23μM至大约4.92μM IBA和大约0.72μM至大约5.76μM GA₃。

19.如权利要求18所述的方法，其中培养基包括：

第一培养基：MS基本培养基和大约6.78μM 2，4-D；和

第二培养基：MS基本培养基、大约2.46μM IBA和大约2.88μM GA₃。

20.如前述权利要求任一项所述的方法，其中每种培养基还包括碳源。

21.如权利要求20所述的方法，其中碳源选自由蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖和葡萄糖混合物、果糖和葡萄糖混合物和麦芽糖和葡萄糖混合物组成的组。

22.如权利要求21所述的方法，其中碳源选自由大约2％至大约5％蔗糖、大约2％至大约5％葡萄糖、大约2％至大约5％果糖、大约2％至大约5％麦芽糖、大约2％至大约3％蔗糖和大约2％至大约3％葡萄糖混合物、大约1％至大约2％果糖和大约2％至大约3％葡萄糖混合物和大约1％至大约2％麦芽糖和大约2％至大约3％葡萄糖混合物组成的组。

23.如权利要求1所述的方法，还包括步骤(a)后和步骤(b)前的步骤(a1)，其中步骤(a1)包括用有丝分裂抑制剂处理胚性愈伤组织以诱导染色体加倍。

24.如权利要求23所述的方法，其中有丝分裂抑制剂选自由秋水仙素和黄草消组成的组。

25.如权利要求23或24所述的方法，其中用O.1％-O.5％的有丝分裂抑制剂处理胚性愈伤组织。

26.如权利要求23-25任一项所述的方法，其中胚性愈伤组织被处理1-3天。

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