CN100334203C - 农杆菌介导的相思树高效转化系统的建立 - Google Patents

Abstract

本发明成功建立了厚荚相思树(Acacia crassicarpa)通过器官发生的高效再生体系。该系统可利用厚荚相思树子叶、下胚轴、节间、成熟的叶状柄等各种外植体作为诱导再生材料在体外成功再生出完整的植株。通过在改良的MS培养基上添加多种不同组合浓度的植物生长调节剂，在最佳条件下，成熟的叶状柄可于10天即诱导出愈伤组织，40天诱导出不定芽，瘤状愈伤组织分化出不定芽的比例高达56.25%。不定芽经过伸长和生根，生根的小植株经过驯化，可成功移栽于土壤中，再生植株的生长表型正常。该再生技术具有简单、高效、易重复特点。利用本发明提供的高效再生系统，本发明还建立了土壤根癌农杆菌介导的转基因系统，通过该方法可成功地将外源基因导入到植物中。

Description

农杆菌介导的相思树高效转化系统的建立

一、技术领域

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及相思树高效再生系统以及农杆菌介导的相思树高效转化系统的建立。

二、背景技术

相思属(Acacia)是豆科(含羞草亚科)中一个重要的属，包括大约1200个种，盛产于澳大利亚，非洲，印度和美洲^[3](Simmons 1987；Jones et al.1990)，产于我国的仅台湾相思(A.confusa)一种。大多数相思可以出产上好的木柴，有一些则是生产纸浆，橡胶，蛋白质，鞣质，涂料，墨水以及食用香料的优良资源。相思树是一类优良的短轮伐山地造林树种，适应性强，速生，适合于热带、亚热带生长繁殖，尤为突出的是相思树的根系与根瘤菌共生，可迅速固氮，改良土壤，在人工造林和荒地开垦上有着巨大的价值(Palmberg 1981)。相思还可以有效地检测土壤腐蚀，并且有助于固定沙丘。

众所周知的是豆科树木在其自然环境中的再生率较低。厚荚相思树的扩大栽培需要优良无性系的克隆繁殖及其高效的体外繁殖技术，包括微繁和再生技术。此外，生物技术诸如遗传转化、体细胞克隆选择、单倍体生产也需要可靠、高效的再生系统。虽然相思树种再生困难，并且在其体外培养条件下会出现各种问题(Nangia and Singh，1996)，但近年来，文献报道了几种相思树的再生，包括儿茶A.catechu(Rout等.1995)，大叶相思A.auriculiformis(Rao和Prasad 1991)，马占相思A.Mangium(Ahmad 1991；Bhaskar and Subhash 1996；Galiana等.1991[只有一篇]a，b；Xie和Hong 2001a，b)，藤金合欢A.sinuata(Vengadesan等.2000，Vengadesan等.2002)，阿拉伯胶金合欢A.nilotica(Garg等.1996)以及刺球花A.farnesiana(Ortiz等.2000)，但再生率都较低。然而，有关厚荚相思再生系统的建立却未见报道，只是有文献报道其芽器官、萌芽条、以及带有顶芽的嫩茎微繁殖的报道。

树木的体外繁殖技术包括微繁殖，器官发生，体细胞无性系变异，诱变和体细胞胚胎发生。微繁殖是在林业生物技术中体外繁殖的重要途径，该技术可以在节省时间和空间的条件下产生几百万个相同的个体。相思树常规繁殖方法以种子繁殖为主，由于相思种子具有一定的分化性，其树形、生长量、抗性、纤维含量等性状表现差异大，在一定程度上约束了它们的开发利用。相思树种微繁殖的成功使得这些问题迎刃而解。目前，有多达20多种相思树种已经使用野生外植体来进行更普遍的微繁殖，如刺叶金合欢(A.senegal)，阿拉伯胶金合欢(A.nilotica)，大叶相思(A.auriculiformis)，藤金合欢(A.sinuata)和马占相思(A.mangium)，厚荚相思(A.Crassicarpa)，卷荚相思(A.cincinuata)，杂交相思莞屏一号(A.mangium×A。auriculiformis)等。

植物的离体器官发生是指离体的组织或细胞在组织培养的条件下形成不定芽、根和花芽等器官的过程。离体器官发生是植物再生完整植株的最主要的方式之一。它不仅在大量无性繁殖植物上具有重要的应用价值，而且是利用生物技术对植物进行遗传改良的前提和基础。在一些生物技术中如细胞融合培养体细胞杂种、利用花粉和胚乳获得单倍体或多倍体植株和培育转基因植物等等都需要进行离体器官发生和植株再生。器官发生一般受外源植物激素水平的诱导，并且直接从外植体组织或者通过愈伤组织发生。在大叶相思和柯阿金合欢中，从大田和无菌生长的幼苗上取下的茎尖外植体经过愈伤组织阶段可以产生不定芽。在台湾相思的组织培养中，子叶被认为是最佳的外植体。也有人尝试过在刺叶金合欢中，从高度分化的组织，比如形成层和韧皮部，诱导出愈伤组织。肯氏相思(A.cunninghamia)的茎尖、嫩茎段和叶片也可成功诱导出再生芽^[62]。其它的外植体还包括阿拉伯胶金合欢，藤金合欢和旋扭相思的下胚轴，儿茶和藤金合欢的成熟子叶，马占相思的子叶，子叶节，胚轴，小叶，叶柄，茎以及幼茎的薄细胞层。在诱导器官发生的过程中，大多使用植物生长素和细胞分裂素的组合。植物生长素选择的顺序是2，4-D＞NAA＞IAA＞IBA。在柯阿金合欢，大叶相思，藤金合欢和马占相思，台湾相思，肯氏相思的不定芽诱导中，6-BA是最常用的细胞分裂素。在相思树的器官发生过程中，一般认为BA可增加愈伤组织的紧密程度。也有研究报道指出，单独使用TDZ可在马占相思的愈伤组织中成功诱导不定芽。还有文献报道，KT也可用于大叶相思，儿茶和藤金合欢的器官发生。

在多数相思树种中，多种培养基类型都可以引起再生。其中MS培养基最为常用，1/2MS成功也可用于金合欢Acacia sinuate的再生。用MS培养基和1/2MS培养基对柯阿金合欢进行再生试验，结果发现MS培养基可诱导更多的不定芽。在儿茶相思中，WPM和1/2WPM也被成功的用来诱导再生芽。最近，Douglas(2000)和McNamara发现马占相思可以在DKW培养基中进行不定芽的再生。对于柯阿金合欢，Schenk和Hildebrandt培养基既可用于愈伤组织诱导，又可用于不定芽的再生。

体细胞胚胎发生来源于一个单细胞，与那些诸如器官发生和微繁殖等多细胞的繁殖是不同的。它是细胞全能性的最有力的证明，在很多木本树木中已经报道了体细胞胚胎发生，而木本豆科植物的体细胞胚胎发生较为困难。在许多相思树种中，不成熟的和幼龄的外植体常被用来诱导胚性愈伤。不成熟子叶，不成熟胚乳和不成熟合子胚被分别用来在儿茶，阿拉伯胶金合欢，刺球花，马占相思，大叶相思中诱导体细胞胚胎发生和获得幼苗。而藤金合欢用叶来进行体细胞胚胎发生的诱导，结果所有的愈伤组织都生成胚胎并且发育成植株。用子叶作为外植体在刺叶金合欢中诱导胚胎发生也获得了成功。在相思树的体细胞胚胎发生中，最先报道的是使用NAA在儿茶中由不成熟子叶通过悬浮培养获得的。使用NAA和KT生成愈伤组织和体细胞胚(球形胚，心形的，鱼雷形的)。只有在不添加生长调节剂的1/2MS培养基中，胚才能萌发。Das(1996)等使用浓度较低的NAA和KT诱导了儿茶的体细胞胚，只有在NAA存在的条件下胚胎才能发生。

在大叶相思获得胚性愈伤组织的过程中，激素的作用特别是2，4-D的作用最为关键。阿拉伯胶金合欢的不成熟胚乳在2mg/L的2，4-D和5mg/L的BA诱导下产生了胚性愈伤。暗培养增加了胚胎生成的频率。在由刺球花和藤金合欢的不成熟合子胚诱导胚性愈伤中，2，4-D也起重要作用，在MS基本培养基中可以得到不同的胚胎阶段。最近Xie和Hong(2001.b)使用TDZ和IAA诱导出了胚性愈伤。使用GA₃可以获得鱼雷形胚和子叶阶段的胚。Shahana和Gupta(2000)使用ZT(2mg/L)由刺叶金合欢的子叶直接获得胚胎发生。添加其它的植物生长素，如2，4-D和NAA，只能生成少量的胚，特别是NAA还增加了不正常胚出现的几率。尽管成熟期可以进行生根，但胚芽叶不发育。除刺叶金合欢要在KB培养基中由形成层组织进行增殖，大叶相思的胚性细胞较适合于在B5培养基上获得。在大多数愈伤组织诱导和再生过程中，WPM和MS培养基都可以使用。体细胞胚的发生使用WPM，MS和一般的MS培养基。而萌发和成熟，在马占相思，刺叶金合欢和刺球花中可以使用MS基本培养基或者1/2MS培养基。

林木传统育种选育时间长、效率低。基因工程为林木育种开辟了一条诱人的新途径，不仅可以大大地缩短育种周期，又可在基因水平上改造林木抗性遗传物质，更具科学性和精确性，提高了育种的目的性和可操作性。此外，还扩大了育种的范围，打破物种之间的生殖障碍，实现基因的共同性。随着各种转化体系的建立和逐步完善，以及林木基因工程基础研究的深入，今后对林木进行有目的、有针对性的遗传改良会更加容易。转基因林木的研究始于20世纪80年代，首例转基因林木于1986年在杨树上获得成功。十几年来，转基因这一生物技术在提高林木抗性、改良品质等方面的应用发展十分迅速，技术上日趋完善。

目前，转基因相思树的研究还处于起步阶段，国内外有关转基因相思树的研究仅限于几篇零星的报道。获得完整的转基因植株需要3个要素：建立高效的再生系统；构建携带外源基因的合适载体系统；建立高效的基因转化系统。其中高效再生系统的建立是成功获得转基因相思树的重要前提。目前，已报道的相思树的再生率都比较低，无论采用何种转基因技术，提高其转化率显得尤为关键。就转化技术而言，基因枪法转化具有不受转化受体的限制、操作简单、可调节等优点，但难以控制转基因的拷贝数，筛选的工作量较大。农杆菌介导的遗传转化在相思树转基因方面已有成功的报道。Xie D Y，Hong Y(2002)用含质粒pBI121的根癌农杆菌LBA4404感染马占相思体体外培养的茎段，获得了转NPTII基因的再生植株。

由于现有技术中相思树的再生系统再生率比较低，转基因的转化效率也比较低，因此，有必要开发一种相思树的高效再生系统，以及利用该系统进行的由农杆菌介导的高效转化系统。

三、发明内容

本发明的一个目的是提供相思树的高效再生系统。本发明的另一个目的是提供农杆菌介导的相思树高效转化系统。本发明的另一个目的是提供利用所述高效再生系统的相思树的体外繁殖方法。

本发明所要解决的技术问题是：现有技术中相思树的再生系统再生率比较低；转基因的转化效率也比较低；体外繁殖方法比较繁琐复杂，效率不高。

本发明通过以下技术方案实施：

1.通过合适的培养基，优选MS培养基，进行相思树种子的培养，选择相思树子叶、下胚轴、节间、成熟的叶状柄等作为外植体，在不同激素组合下诱导不定芽的再生，经过不定芽的伸长、生根以及生根苗的移栽试验确定相思树的高效再生系统。

2.在合适的培养基上培养含有目的表达载体的农杆菌，通过常规技术转化上述高效再生系统，即接种于子叶、下胚轴以及离体培养或温室生长的相思树幼嫩叶片(也称叶状柄)等外植体，经过继代培养、诱导生根以及移栽试验确定农杆菌介导的相思树高效转化系统。

本发明的技术效果如下：

1.建立了相思树的高效再生系统，该系统组成比较简单，建立所需时间较短，再生效率高，易重复。利用该系统，10天即诱导出愈伤组织(节结)，40天诱导出不定芽，瘤状愈伤组织(节结)分化出不定芽的比例高达56.25％，不定芽经过培养，生根率达到100％，生根的小植株经过驯化，可成功移栽于土壤中，再生植株的生长表型正常。

2.利用上述高效再生系统，建立了土壤根癌农杆菌介导的转基因系统，通过该方法可成功地将外源基因导入到植物中，该系统转基因效率高，并且可进行较大规模的转化。

四、附图说明

图1为瘤状愈伤图。

图2为瘤状愈伤表面发生的大量不定芽图。

图3为不定芽的伸长图。

图4为不定芽上产生的侧根图。

图5为不定芽经炼苗和移栽得到的植株图。

图6为经农杆菌转化的抗性瘤状愈伤图。

图7为抗性瘤状愈伤表面发生的大量不定芽图。

图8、9为经含0.1mg/l TDZ的筛选培养基诱导的不定芽的伸长图。

图10为经转化的不定芽的生根图。

图11为外源基因4CLI转化的PCR检测结果。泳道两边为2000bp标准分子量Marker；CK-和CK+为阴性和阳性对照；1-10为经转化的植株中4CLI基因PCR扩增的结果。

五、具体实施方式

以下具体实施例将对本发明作出解释和说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的限制。

下列实施例中所用材料均为市售可得。

相关术语的缩写如下：BA 6-苄基腺嘌呤·CM椰乳·GA₃赤霉酸·IBA 3-吲哚丁酸·KT激动素·MS Murashige and Skoog(1962)medium·NAAα-萘乙酸·IAA吲哚-3-乙酸·TDZ1-phenyl-3-(1，2，3-thiadiazol-5-yl)Ureathidiazuron)·2，4-D 2，4-二氯苯氧乙酸

实施例1厚荚相思树的高效再生系统

1.1植物材料与消毒处理

成熟的种子于100℃水中处理1分钟，再于蒸馏水中浸泡16小时，然后用70％的乙醇表面消毒5分钟，再于0.1％的HgCl₂中(加几滴土温20)消毒1分钟，用无菌水冲洗3-4次，消毒的种子再于1/2MS培养基上(含0.4％的琼脂)萌发。

1.2培养基的制备与培养条件

培养基在121℃灭菌15分钟。灭菌后用1N的NaOH(无菌的)溶液调整培养基pH至5.8。植物生长调节剂用0.2μm的滤膜进行过滤灭菌。除非特别指出，培养室温度为28℃，于光照条件下(光照强度为26μmols^-1m^-2)培养，每天光照16h。

1.3瘤状愈伤和不定芽的诱导

种子经表面消毒后接种于1/2强度、无糖MS培养基(含0.4％琼脂)上，并于10-12天内发芽。从60天龄的种子苗上取假叶，切成0.3×0.5-cm大小作为外植体。外植体在含有不同激素组合的培养基上培养10天----TDZ和NAA不同浓度组合；KT和2，4-D不同浓度组合；KT和NAA不同浓度组合；BA和IAA不同浓度组合；以及BA和2，4-D不同浓度组合。每个处理包括100个外植体，重复两次。所有培养基均加入5％(v/v)的椰乳，30g/l的蔗糖，以及0.4％(w/v)的琼脂。统计绿色或紫绿色瘤状愈伤的诱导率。

培养10天后，愈伤组织继代，继续在组成相同的培养基上诱导不定芽。每个处理包括100个愈伤组织，重复两次。每10天继代一次。原始数据于培养40天后记录，此时已有肉眼可见的不定芽发生。

1.4不定芽的伸长和生根

从含有0.5mg/l TDZ和0.5mg/l NAA的培养基上诱导出的带有羽状复叶的不定芽丛被用来进行下一步试验。不定芽接种于含有GA₃(0，0.5，1mg/l)和TDZ(0，0.1mg/l)的基本MS培养基上，进行两个月的培养。所有培养基均加入5％(v/v)的椰乳，30g/l的蔗糖，以及0.4％(w/v)的琼脂。切下2-3cm长的芽接种于含0.5mg/l IBA的1/2 MS培养基，进行生根。

1.5生根苗的移栽

生根培养经炼苗后，将带有至少15条侧根的无菌苗取出。在自来水下温和冲洗，洗净生根苗基部的培养基。移栽到灭菌的基质中，基质含沙、蛭石、园土0.5∶0.5∶1(v/v)。保持80％的相对湿度，光照强度为26μmols^-1m^-2，每天光照16h。每三天浇一次水。

1.6结果

1.6.1瘤状愈伤诱导

瘤状愈伤最初发生于假叶片断的切口处。所有种类的培养基均能诱导出瘤状愈伤(见图1)，且不同种类培养基间的效果差异不明显。

1.6.2不定芽的诱导

TDZ与NAA的组合，BA与IAA的组合成功诱导了不定芽的发生。经过40天的培养，瘤状愈伤的表面发生大量的不定芽(见图2)。

TDZ与NAA的不同组合诱导不定芽再生率从1.6％到56.25％不等。0.5mg/l TDZ与0.5mg/l NAA的组合再生率达56.25％。而3mg/l BA与0.6mg/l IAA组合的再生率低于5％。其他激素组合只产生了次生瘤状愈伤。

1.6.3不定芽的伸长与生根

含0.1mg/l TDZ的培养基有效诱导了不定芽的伸长(见图3)。伸长后被转到含0.5mg/l IBA的1/2MS培养基上进行生根。几乎所有的不定芽都在一个月内产生了10条侧根(见图4)。炼苗和移栽也获得了成功(见图5)。

可见，建立了一个较简单高效的厚荚相思(A.Grassicarpa.)通过器官发生的再生体系，以成熟厚荚相思假叶通过器官发生的方式成功地进行了再生。

实施例2农杆菌介导的厚荚相思树高效转化系统

2.1农杆菌的培养

(1)在含有合适的抗生素(即Kan 100mg/L，Str100mg/L)的YEB固体培养基上，把含有插入目的植物表达载体的农杆菌Agrobacterium tumefaciensLBA4404菌株划线涂板，于28℃培养48小时，该目的植物表达载体中含有杨树的4CLI基因；

(2)挑选步骤1中的活化的单菌落，接种于2ml的YEB(pH7.0)液体培养基中，该液体培养基中含有与步骤1中相同组成和浓度的抗生素(即Kan100mg/L，Str 100mg/L)，并于摇床上于28℃、220rpm条件下震荡过夜培养；

(3)取出震荡过夜培养的农杆菌，稀释接种于20-50ml的YEB(pH7.0)液体培养基中(培养基的用量取决于待转化植株外植体的数量)，该液体培养基中须添加与步骤1中相同组成和浓度的抗生素(即Kan100mg/L，Str 100mg/L)，并加入少量的乙酰丁香酮(AS)，于摇床上在28℃、220rpm条件下震荡过夜培养；

(4)低温(4℃)离心(10000rpm，5分钟)上述过夜培养的农杆菌，弃上清，收集沉淀，沉淀用1/2的MS液体培养基稀释备用。

2.2农杆菌转化相思树

子叶、下胚轴以及离体培养或温室生长的相思树幼嫩叶片(也称叶状柄)都可作为接种用的外植体，外植体的制备和接种方法按下列程序进行(改良的叶盘法)：

(1)子叶和下胚轴转化：从萌发7-10天的无菌苗上切下幼嫩子叶及下胚轴，每个子叶切成两半、并切去叶尖，下胚轴切成0.5cm长，然后立即置于盛有步骤4制备的农杆菌稀释液中，浸染时间为10-15分钟，并用手轻轻摇动；

(2)成熟叶片(叶状柄)转化：成熟叶片可取自萌发60天左右的无菌苗；也可取自温室培养的植物，对用作转化的温室培养植物，每周应喷洒适量浓度的杀菌剂，转化前再用20％(v/v)的市售的消毒液或5％的次氯酸钠表面消毒(并添加几滴土温20)10分钟，然后用无菌水冲洗数次。在某些情况下，也可使用0.05-0.1的氯化汞进行消毒，但对叶状柄的生活力及转化效率都有影响。然后再沿着叶脉把无菌的叶状柄切成5-7平方毫米的方块(并与叶脉垂直用无菌刀片轻轻制造一些伤口)，把新制备好的叶盘迅速侵入步骤4制备的衣杆菌稀释液中，浸染时间为10-15分钟，并用手轻轻摇动；

(3)迅速用镊子取出按上述方法转化的外植体，置于无菌滤纸上以吸收残留在外植体上的农杆菌液，然后再把外植体倒置于不含任何抗生素的再生培养基上黑暗条件下共培养2-3天(25℃)，使农杆菌成功浸染侵染叶片；

2.3转化外植体的培养

(1)取出暗培养后的外植体，用无菌水冲洗外植体3次，除去吸附在外植体表面的农杆菌。如果外植体表面生长有过多的农杆菌，可在无菌水中加入500mg/L的羧苄青霉素，冲洗3次，以杀死除去吸附在外植体表面过多的农杆菌。然后再把外植体置于含有抗菌素的选择性培养基上于28℃下光照培养、以选择转化的细胞，抗性培养基的组成为再生培养基加上20mg/L的卡那霉素(Kan)和500mg/L的羧苄青霉素(Cb)；

(2)继代培养：第一次继代培养的时间为步骤6后的第7-10天进行，把经过转化的外植体转移到新配制的选择性培养基上继续选择培养，选择性培养基的配方组成如步骤6。以后的继代培养以每两周为间隔进行，培养条件如步骤6，选择性培养基的配方组成如步骤6，直至愈伤组织形成不定芽为止；

(3)把在选择性培养基上形成不定芽的愈伤组织转移至选择性伸长培养基上培养使转化的愈伤组织上的小芽伸长，并杀死假阳性植株，选择性伸长培养基的组成为MS+3％蔗糖+5％椰乳+0.1mg/l TDZ+300mg/L Car+20mg/Lkan，该过程将继续2个月作用，继代培养周期和培养条件同步骤6；

(4)把长度2cm左右的抗性芽切下，置于选择性生根培养基上诱导生根，选择性生根培养基的组成为1/2MS+3％蔗糖+5％椰乳+0.5mg/L IBA+300mg/L Car+20mg/LKan，继代培养周期和培养条件同步骤6，2-3周后有根出现，但该过程一般需要一个多月。

2.4验证

(1)从已生根的转化植株上取1g作用的叶片，用微量法提取植物基因组DNA，通过PCR方法验证外源DNA的整合情况；

(2)把经过PCR验证的转基因相思树移植到土壤中，于室内练苗10天左右后，再置于温室生长，并从温室生长的植株上取幼嫩叶片进一步通过PCR，Southern，Northern检测。

2.5结果

2.5.1转化后抗性瘤状愈伤

瘤状愈伤最初发生于假叶片断的切口处。(见图6)

2.5.2转化植株抗性不定芽的获得

经过40天的培养，瘤状愈伤的表面发生大量的不定芽。(见图7)

2.5.3转化植株伸长

含0.1mg/L TDZ的筛选培养基有效诱导了不定芽的伸长，同时杀死了假阳性植株。(见图8，9)

2.5.4转化植株生根

在1/2MS+3％蔗糖+5％椰乳+0.5mg/L IBA+300mg/L Car+20mg/L Km培养基上成功生根。(见图10)

2.5.5转化植株PCR检测结果

取10株苗PCR检测转化的4CLI基因，结果证明4CLI基因已经成功转入相思树植株，成功构建了相思树转基因植株。(见图11)

利用所述高效再生系统的相思树的体外繁殖方法可如实施例1同样进行。

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Claims (5)

1.一种相思树的高效再生系统，包括相思树子叶、下胚轴、节间或成熟的叶状柄；愈伤组织诱导培养基，其为添加激素组合的基本培养基，激素组合由TDZ和NAA构成，组合中每种激素浓度为0.5mg/l；不定芽伸长培养基，为含有0.1mg/lTDZ的基本培养基；生根培养基，为含有0.5mg/lIBA的基本培养基。

2.如权利要求1的高效再生系统，其中成熟的叶状柄为60天的叶状柄。

3.如权利要求1的高效再生系统，其中基本培养基为MS培养基。

4.一种农杆菌介导的相思树高效转化系统，包括：含有外源目的基因的农杆菌以及上述权利要求1-3任一项的高效再生系统。

5.一种相思树的体外繁殖方法，包括：选取相思树子叶、下胚轴、节间或成熟的叶状柄；在含有0.5mg/l TDZ和0.5mg/l NAA植物生长调节剂组合的MS培养基上诱导10天，得到愈伤组织，在含有0.01-1.5mg/l TDZ和0-1mg/l NAA的MS培养基上诱导40天，得到不定芽；然后把不定芽转移到含有0.1mg/l TDZ的MS培养基上培养2个月；经过伸长的芽在含0.5mg/l IBA的1/2强度MS上培养1个月，生根，移栽得到再生植株。

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