CN111567403B

CN111567403B - 一种含甲壳素的植物组织培养用添加剂、含添加剂的培养基或栽培基质及其制备方法

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Publication number: CN111567403B
Application number: CN202010573726.XA
Authority: CN
Inventors: 王利民; 符真珠; 董晓宇; 袁欣; 蒋卉; 王慧娟; 王耀瑭; 高杰
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2022-12-23
Anticipated expiration: 2040-06-22
Also published as: CN111567403A

Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种含甲壳素的植物组织培养用添加剂、含添加剂的培养基或栽培基质及其制备方法。所述一种含甲壳素的植物组织培养用添加剂，包括以下重量份数的原料：1000份水、1.5～2.0份甲壳素、50～80份表面活性剂、10～20份分散剂和5～10份助溶剂。本发明的添加剂使培养基或栽培基质能够持续作用于组织培养各个阶段的植物植株，诱导抗性，提高植株的健壮程度。

Description

一种含甲壳素的植物组织培养用添加剂、含添加剂的培养基或栽培基质及其制备方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种含甲壳素的植物组织培养用添加剂及植物组织培养方法。

背景技术

组织培养已经成为植物繁殖的重要方法之一，也是生物工程研究领域重要的基础手段和技术，每年为果树、花卉、苗木、蔬菜和其他作物提供大量生产和试验用苗。但是由于组培苗移栽前生长在无菌的人工培养基上，生长环境弱光、恒温、高湿，因此其形态、解剖以及生理特性与自然状态下生长的植株不同。组培苗通常较弱小，自养能力差，移栽后很难适应剧烈变化的环境条件而容易死亡，导致成活率低；组培苗的叶片表面无蜡质层或蜡质层较薄，气孔发育差且开关能力低，造成叶片表面保护组织不发达或丧失，易感病或失水萎蔫；组培苗的组织幼嫩，结构松散，细胞含水率高，机械组织不发达，对病虫害敏感，抗病能力差，易感病死亡。不同植物种类组培苗健壮程度虽有差异，但都会不同程度地因以上原因影响移栽成活率。

甲壳素又名甲壳胺、壳聚糖、几丁质，是自然界中唯一含有氨基的均态多糖，学名为[(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖]，分子式为(C8H13NO5)n，是目前自然界中唯一带正电荷的天然高分子聚合物，属于直链氨基多糖，也称为氨基葡萄糖。甲壳素广泛存在于低等植物菌类以及海洋无脊椎动物的外壳中，每年的生物合成量可达2000亿吨，在自然界中的产量仅次于植物纤维，是人类取之不竭的资源。甲壳素脱乙酰基后可以得到一种天然的阳离子多糖—壳聚糖，分子式为(C6H11NO4)n，分子量约10万左右，是葡萄糖分子的多聚物，结构和纤维素相似。甲壳素及其衍生物具有可降解性、无毒性、吸附性、诱导抗病性、保湿性、生物相容性等特性，可广泛应用于农业、工业、医药和环保等行业中。

研究发现甲壳素可以作为激发子诱导相关的蛋白基因的表达，诱导植株产生几丁质酶，几丁质酶破坏昆虫的围食膜和病菌的细胞壁，从而使植物具备广谱抗病抗虫性；甲壳素可以激活、增强植株的生理生化机制，可以促使根系细胞分生，促使根毛大量发生，使根系更加发达，吸收力和抗逆性更强；甲壳素可诱导根部分泌出抗菌物质，防治根腐病等病害。

植物组织培养在无菌体系建立、增殖培养、生根培养、炼苗移栽的各个环节都可以通过添加甲壳素来提高组培苗的抗性和健壮程度。组织培养的整个过程需要的时间长短不尽相同，但大多在90天及以上，组培苗有足够的时间充分利用甲壳素参与自身的生理生化进程。但是因为甲壳素溶解度不高的特性限制了它在培养基或基质中的添加。本发明利用甲壳素悬浮液的制备代替溶液的制备，使得甲壳素可以均匀一致的形态进入培养基或栽培基质。因此，一种添加甲壳素的植物组织培养用添加剂及培养方法对于植物组培壮苗培养具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明提供了一种含甲壳素的植物组织培养用添加剂。该添加剂使培养基或栽培基质持续作用于组织培养各个阶段的植物植株，诱导抗性，提高植株的健壮程度。

本发明还提供了一种含添加剂的培养基或栽培基质。

本发明还提供了上述培养基或栽培基质的制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种含甲壳素的植物组织培养用添加剂，包括以下重量份数的原料：1000份水、1.5～2.0份甲壳素、50～80份表面活性剂、10～20份分散剂和5～10份助溶剂。

优选的，所述表面活性剂为木质素磺酸钙或十二磺基苯磺酸钠。

优选的，所述分散剂为聚乙烯醇或三聚磷酸钠。

优选的，所述助溶剂为柠檬酸或醋酸。

一种包含甲壳素的植物组织培养用添加剂的培养基或栽培基质。

优选的，培养基为MS、WPM或White培养基；栽培基质为草炭、珍珠岩和轾石中的一种或两种以上。

上述培养基或栽培基质的制备方法，包括以下步骤：

（1）将甲壳素倒入水中，加入助溶剂并搅拌10～60min，然后加入表面活性剂并搅拌

10～60min，最后加入分散剂并搅拌10～60min，得甲壳素悬浮液；

（2）将步骤（1）中的甲壳素悬浮液稀释后添加到培养基或栽培基质中，搅拌备用。

所述培养基或栽培基质可以用于下述任意一个或两个以上的培养步骤：植物组织的无菌体系建立、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等。

和现有技术相比，本发明的有益效果是：本申请的含甲壳素的植物组织培养用添加剂，一方面通过助溶剂、表面活性剂、分散剂优化调整，形成稳定的甲壳素悬浮液，便于向培养基或栽培基质中添加；另一方面使培养基或栽培基质中的甲壳素能够持续作用于组织培养各个阶段的植物植株，诱导抗性，提高植株的健壮程度。

附图说明

图1为实施例1中生根培养植株照片；其中左图为培养基未添加甲壳素悬浮液，右图为培养基添加甲壳素悬浮液100ml/L；

图2为实施例1中生根培养植株根系照片；其中左图为培养基未添加甲壳素悬浮液，右图为培养基添加甲壳素悬浮液100ml/L；；

图3为实施例1中未添加甲壳素悬浮液的基质中接种尖孢镰刀菌后的植株照片；

图4为实施例1中基质添加甲壳素悬浮液150ml/L定植的楸树组培接种尖孢镰刀菌后的植株照片；

图5为实施例1中未添加甲壳素悬浮液基质中定植的楸树组培苗接种尖孢镰刀菌感病群体照片；

图6为实施例1中基质添加甲壳素悬浮液150ml/L定植的楸树组培苗接种尖孢镰刀菌健壮生长群体照片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但其并不是对本发明的限制。

实施例中的甲壳素和聚乙烯醇厂家为国药集团化学试剂有限公司。

实施例1

称取2g甲壳素，将其加入到1L水中，然后加入10g助溶剂柠檬酸并搅拌30min，再加入50g表面活性剂十二磺基苯磺酸钠并搅拌30min，最后加入10g分散剂聚乙烯醇并搅拌30min，得到甲壳素悬浮液。

将本实施例制备的甲壳素悬浮液在各个阶段直接依量添加于培养基或栽培基质中。

（1）无菌体系建立

采集楸树半木质化枝条，剪去叶片，保留叶柄，每节茎段带一个芽即为外植体。灭菌后接种到诱导培养基。诱导培养基为：MS基本培养基，添加6-BA 0.6mg/L、IBA 0.2mg/L、蔗糖30 g/L和琼脂6 g/L。添加甲壳素悬浮液25ml/L，作为处理，不添加甲壳素悬浮液作为对照；

接种诱导培养基后，2～5 d（培养条件：光照强度为2000~2500LX，光照时间为12h/d，培养温度为（23±2）℃。）外植体开始萌动，培养12～15 d左右形成不定芽，此时即可认为无菌株系已建成。

（2）增殖培养

分切无菌体系建立中诱导形成的不定芽，然后接种于增殖培养基中。

增殖培养基以MS为基本培养基，添加6-BA 0.8 mg/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂6 g/L）。添加甲壳素悬浮液50ml/L作为处理，不添加甲壳素悬浮液作为对照；

在上述培养基中培养30天（培养条件：光照强度为2000~2500LX，光照时间为12h/d，培养温度为（23±2）℃），在愈伤组织上形成多数的增殖芽。

（3）生根培养

以增殖培养中优化后培养基中增殖芽为实验材料，切取生长健壮且高度不小于2cm的增殖芽接种到生根培养基上进行生根培养，以形成生根苗。

生根培养基以MS为基本培养基，其中大量元素减半，同时添加IBA 0.8mg/L、NAA0.08mg/L、蔗糖20g/L、琼脂6g/L，添加甲壳素悬浮液100ml/L作为处理，不添加甲壳素悬浮液作为对照；

在上述培养基中培养30天（培养条件：光照强度为2000~2500LX，光照时间为12h/d。培养温度为（23±2）℃），增殖芽基部产生多数根，生根培养植株照片见图1，其中左图未添加甲壳素悬浮液，右图添加100ml/L的甲壳素悬浮液。从图1中可以看出，采用甲壳素悬浮液处理后，培养基中组培苗高度约为对照的120%，叶片浓绿，而对照叶色偏黄。

生根培养植株根系照片见图2，其中左图未添加甲壳素悬浮液，右图添加100ml/L的甲壳素悬浮液。从图2可以看出，采用甲壳素悬浮液处理后，生根量大，根长度明显大于对照，根量约为对照的2倍，根长约为对照的3倍。

（4）炼苗、移栽

将生根培养中生根幼苗培养瓶置于温室中，敞开瓶口，炼苗7天左右。然后将生根幼苗从培养瓶中取出，清水洗掉基部培养基，用有效成分含量722g/L普力克1000倍液，浸泡1 min，移栽入草炭和珍珠岩体积比为2:1的基质中；在混合基质中加入甲壳素悬浮液150ml/L作为处理，以不添加甲壳素悬浮液作为对照。

移栽初期扣小拱棚保湿，保证棚内湿度在95%以上，10 d后逐渐掀开棚膜通风，正常管理。

定植后用3×10⁵个孢子/毫升的尖孢镰刀菌孢子悬浮液进行喷雾接种，30天后统计移栽成活率，结果见图3和图4，图3为未添加甲壳素悬浮液的基质中接种尖孢镰刀菌后的植株照片，图4为基质添加甲壳素悬浮液150ml/L定植的楸树组培接种尖孢镰刀菌后的植株照片。从图4中可以看出，植株强壮，抗性好。

炼苗移栽30天后进行统计，楸树组培苗在各个阶段添加相应的甲壳素悬浮液后接种尖孢镰刀菌，移栽成活率为95.2%，楸树组培苗在各个阶段未添加甲壳素悬浮液的，接种尖孢镰刀菌后移栽成活率为53.6%，结果见图5和图6，图5为基质未添加甲壳素悬浮液基质中定植的楸树组培苗接种尖孢镰刀菌感病群体照片，图6为基质添加甲壳素悬浮液150ml/L定植的楸树组培苗接种尖孢镰刀菌后健壮生长群体照片。从图6可以看出，添加甲壳素悬浮液基质植株成活率高，长势整齐，抗性好，未添加甲壳素悬浮液的植株移栽成活率低，长势弱。

由此可以看出，本实施例的添加剂用于楸树组织培养的各个阶段可以显著提高楸树组培苗的健壮程度，增强抗病性，提高移栽成活率。

需要说明的是，无菌体系建立和增殖阶段由于处于培养初期，而且未形成完整植株，甲壳素的效应从外观形态未能可见。在生根培养和炼苗移栽阶段，由于前期甲壳素效应的积累和完整植株的形成，壮苗和增强抗病性的效应得到逐步体现。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于：

称取1.5g甲壳素，将其加入到1L水中，然后加入5g助溶剂醋酸并搅拌10min，再加入60g表面活性剂木质素磺酸钙并搅拌60min，最后加入15g分散剂三聚磷酸钠并搅拌40min，得到甲壳素悬浮液。

将本实施例制备的甲壳素悬浮液在各个阶段直接依量添加于培养基或栽培基质中，其中无菌体系建立、增殖、生根、炼苗移栽阶段分别为50ml/L、80ml/L、120ml/L、180ml/L。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于：

称取1.75g甲壳素，将其加入到1L水中，然后加入7.5g助溶剂醋酸并搅拌30min，再加入65g表面活性剂十二磺基苯磺酸钠并搅拌30min，最后加入15g分散剂三聚磷酸钠并搅拌60min，得到甲壳素悬浮液。

将本实施例制备的甲壳素悬浮液在各个阶段直接依量添加于培养基或栽培基质中，其中无菌体系建立、增殖、生根、炼苗移栽阶段分别为30ml/L、60ml/L、100ml/L、150ml/L。

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于：

称取1.5g甲壳素，将其加入到1L水中，然后加入7.5g助溶剂柠檬酸并搅拌20min，再加入55g表面活性剂十二磺基苯磺酸钠并搅拌40min，最后加入15g分散剂聚乙烯醇并搅拌20min，得到甲壳素悬浮液。

将本实施例制备的甲壳素悬浮液在各个阶段直接依量添加于培养基或栽培基质中，其中无菌体系建立、增殖、生根、炼苗移栽阶段分别为80ml/L、100ml/L、150ml/L、200ml/L。

Claims

1.一种含甲壳素的植物组织培养用添加剂，其特征在于，包括以下重量份数的原料：1000份水、1.5～2.0份甲壳素、50～80份表面活性剂、10～20份分散剂和5～10份助溶剂；所述表面活性剂为木质素磺酸钙或十二烷基苯磺酸钠；所述分散剂为聚乙烯醇或三聚磷酸钠；所述助溶剂为柠檬酸或醋酸。

2.一种包含权利要求1所述含甲壳素的植物组织培养用添加剂的培养基或栽培基质。

3.根据权利要求2所述培养基或栽培基质，其特征在于，培养基为MS、WPM或White培养基；栽培基质为草炭、珍珠岩和蛭石中的一种或两种以上。

4.权利要求2或3所述培养基或栽培基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.权利要求2或3所述培养基或栽培基质在植物组织培养中的应用，其特征在于，用于下述任意一个或两个以上的培养步骤：植物组织的无菌体系建立、增殖培养、生根培养、炼苗移栽，所述植物组织培养为楸树组织培养。