CN109673513A - 一种利用色素万寿菊未授粉子房培养获得单倍体的方法 - Google Patents

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田雪莲
路小春
魏晓梅
王俊杰
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Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用色素万寿菊未授粉子房培养获得单倍体的方法。包括：1、获得无菌外植体；2、获得适宜培养的最佳发育期子房；3、获得能够有效提高愈伤组织诱导的低温预处理和高温热激处理时间；4、获得愈伤组织诱导的最佳培养基；5、获得不定芽分化适宜的激素组合；6、不定芽的生根培养。该发明利用色素万寿菊雄性不育株未授粉子房培养获得单倍体植株，既可以有效的保存母本资源，又可获得单倍体植株。同时，建立了色素万寿菊子房培养再生体系，为万寿菊种质资源保存及育种提供新的技术平台。

Description

一种利用色素万寿菊未授粉子房培养获得单倍体的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用色素万寿菊未授粉子房培养获得单倍体的方法。
背景技术
色素万寿菊(Tagets erecta L.)属菊科万寿菊属草本植物，其花瓣是提取叶黄素最高的植物性原料。叶黄素是理想的抗氧化剂，能够阻止太阳有害光线引起的皮肤损害；能防止老年视黄斑退化和视网膜的氧化损伤；对乳腺癌、皮肤癌、肺癌、前列腺癌有抑制作用，还可防止机体衰老引发的心血管硬化和冠心病。因此，色素万寿菊在医药、食品、保健品、化妆品、饲料等领域需求逐年加大，素有“软黄金”之美誉。
万寿菊杂交育种工作中，常利用雄性不育两用系的不育系作母本，与强优势的恢复系作父本配制杂交种,而在不育性的保持中，利用两用系姊妹交保持不育性，这使得万寿菊雄性不育株来之不易，若能通过离体繁殖保存万寿菊雄性不育材料，将对雄性不育的理论研究及杂交制种对原材料供给问题提供有效的解决途径。
国内外对万寿菊离体繁殖做了许多研究工作，Vanegas、Kothari 、林淦、张子刚等以万寿菊叶片为外植体获得了再生植株；Kumar 、伍亚平等建立了万寿菊雄性不育系植株的再生体系；苏福才、田广红等以腋芽或带腋芽的茎段为外植体，建立了离体扩繁技术；李甫等以花药为外植体进行单倍体诱导；Belarmino等研究认为胚轴为合适的外植体材料；Bespalhok 等以子叶为外植体得到了胚性愈伤组织并形成体胚。尽管对万寿菊离体快繁做了大量的研究工作，但对色素万寿菊离体雌核培养（未授粉的子房或胚珠）尚未见报道。
发明内容
本发明提供一种利用色素万寿菊未授粉子房培养获得单倍体的方法，其目的既可以有效的保存母本资源，又可获得单倍体植株。同时，建立了色素万寿菊子房培养再生体系，为万寿菊种质资源保存及育种实践提供新的技术平台。
一种利用色素万寿菊未授粉子房培养获得单倍体的方法，包括： 1、通过表面消毒，获得无菌外植体；2、获得适宜培养的最佳发育期子房；3、获得能够有效提高愈伤组织诱导的低温预处理和高温热激处理时间；4、获得愈伤组织诱导的最佳培养基；5、获得不定芽分化适宜的激素组合；6、不定芽的生根培养，获得完整的单倍体植株。
本发明的有益效果：1、利用不同的消毒剂双重处理获得无菌的外植体，减小了污染。2、比较子房发育时期，获得适宜培养的最佳发育期子房。3、不同时间低温预处理和高温热激处理，有效提高愈伤组织诱导率。4、不同生长调节剂随机组合，获得了愈伤组织诱导最佳培养基，有效提高了愈伤组织诱导率。5、愈伤组织继代3次，获得大量增殖的愈伤组织，避免盲目增加继代次数。6、利用6-BA与NAA随机组合进行不定芽分化培养，避免愈伤组织褐化、玻璃化，有效提高不定芽分化率。7、利用不同基本培养基与NAA组合进行不定芽生根培养，建立了良好、高效离体培养体系，获得了单倍体苗。8、避免万寿菊杂交育种时，难以收集并保存不育株，扩繁母本，以及母本基因型纯合慢等问题。
具体实施方式
一种利用色素万寿菊未授粉子房培养获得单倍体的方法，包括以下步骤。
步骤一 获得无菌外植体：将色素万寿菊雄性不育株未授粉花蕾在自来水下冲洗30min，再用75%酒精浸泡30s，然后用1 g·L-1HgCl2滴加2滴吐温80消毒12min，无菌水冲洗4-6次后用无菌滤纸吸干备用。
步骤二 获得适宜培养的最佳发育期子房：采集现蕾1-5d、6-10d、11-15d、16-25d的花蕾经表面灭菌后，切弃子房两端约0.5mm部分，接种于MS+2,4-D 0.5 mg·L-1 + NAA0.5 mg·L-1 + 6-BA 0.5 mg·L-1 + KT 0.5 mg·L-1+AgNO32 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1 +琼脂7g·L-1，pH5.8的培养基上。培养条件为：先暗培养10 d，再在10 mmol·m-2·s-1光下培养，光照16 h·d-1，温度25±1℃。
步骤三 获得能够有效提高愈伤组织诱导的低温预处理和高温热激处理时间：采集现蕾6-10d的花蕾， 4℃低温分别预处理0、1d、2d，3d、4d、5d后，接种于MS+2,4-D 0.5mg·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1 + 6-BA 0.5mg·L-1 + KT 0.5 mg·L-1+AgNO3 2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1 +琼脂7g·L-1，接种后在 35℃黑暗条件下分别培养 3d、5d、7d和10d, 同时以25℃为对照。培养条件为：先暗培养10 d，再在10 mmol·m-2·s-1光下培养，光照16 h·d-1，温度25±1℃。
步骤四 愈伤组织诱导与继代：采集现蕾6-10d的花蕾，经4℃低温2d后，接种于2，4-D 0.5、1.0 mg·L-1，NAA 0.5、1.0、1.5、2.0 、2.5 mg·L-1，6-BA 0.5、1.0、1.5、2.0 、2.5mg·L-1,KT 0.5mg·L-1共10种激素组合上，蔗糖30g·L-1，琼脂7g·L-1，AgNO32 mg·L-1，pH5.8，接种后35℃高温暗培养5d。增殖培养基为MS + 2,4-D 0.2 mg·L-1 + NAA 1.0 mg·L-1 + 6-BA 0.5 mg·L-1 +KT 0.5 mg·L-1 + +AgNO3 2 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1 +琼脂7g·L-1，每20 d增殖培养1次，共培养3次。
步骤五 愈伤组织分化：将增殖良好的愈伤组织接种于分化培养基中，以MS为基本培养基，NAA 浓度分别为 0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1，6-BA 浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg·L-1， 蔗糖30g·L-1 ，琼脂7g·L-1，pH5.8。培养条件为：25 mmol·m-2·s-1光下培养，光照14 h·d-1，温度25±1℃。
步骤六 不定芽的生根培养：将分化得到的芽转入1/2MS和MS培养中，添加 0-1.0mg·L-1的 NAA，蔗糖30g·L-1 ，琼脂7g·L-1，活性炭2g L-1, pH 5.8进行生根培养，获得完整的单倍体植株。待根长至 5 cm时，将生根植株炼苗 5d，移栽花盆中，30d 后统计成活率。培养条件为：30 mmol·m-2·s-1光下培养，光照14 h·d-1，温度25±1℃。
上述具体实施方式中，色素万寿菊子房发育6-10d，花丝刚好露出花萼，顶部呈圆柱状的花蕾愈伤组织诱导效果最好，为79.2%；低温预处理3d，高温培养5d有利于愈伤组织诱导；MS + 2,4-D 0.5 mg·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1 + 6-BA 0.5 mg·L-1 + KT 0.5 mg·L-1为愈伤组织诱导最佳培养基，诱导率高达85.8%；最佳浓度组合NAA 1.0 mg · L-1 + 6-BA 3.0 mg · L-1为不定芽分化适宜培养基，分化率达77.6%；1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1为生根适宜培养基，生根率93.5%。

Claims (1)

1.一种利用色素万寿菊未授粉子房培养获得单倍体的方法，包括以下步骤：
步骤一 获得无菌外植体，将色素万寿菊雄性不育株未授粉花蕾在自来水下冲洗30min，再用75%酒精浸泡30s，然后用1 g·L-1HgCl2滴加2滴吐温80消毒12min，无菌水冲洗4-6次后用无菌滤纸吸干备用；
步骤二 获得适宜培养的最佳发育期子房，采集现蕾1-5d、6-10d、11-15d、16-25d的花蕾经表面灭菌后，切弃子房两端约0.5mm部分，接种于MS+2,4-D 0.5 mg·L-1 + NAA 0.5mg·L-1 + 6-BA 0.5 mg·L-1 + KT 0.5 mg·L-1+AgNO3 2 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1 +琼脂7g·L-1，pH5.8的培养基上，培养条件为：先暗培养10 d，再在10 mmol·m-2·s-1光下培养，光照16 h·d-1，温度25±1℃；
步骤三 获得能够有效提高愈伤组织诱导的低温预处理和高温热激处理时间，采集现蕾6-10d的花蕾，4℃低温分别预处理0、1d、2d，3d、4d、5d后，接种于MS+2,4-D 0.5 mg·L-1 +NAA 0.5 mg·L-1 + 6-BA 0.5mg·L-1 + KT 0.5 mg·L-1+AgNO3 2 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1 +琼脂7g·L-1，接种后在 35℃黑暗条件下分别培养 3d、5d、7d和10d, 同时以25℃为对照，培养条件为：先暗培养10 d，再在10 mmol·m-2·s-1光下培养，光照16 h·d-1，温度25±1℃；
步骤四 愈伤组织诱导与继代，采集现蕾6-10d的花蕾，经4℃低温2d后，接种于2，4-D0.5、1.0 mg·L-1，NAA 0.5、1.0、1.5、2.0 、2.5 mg·L-1，6-BA 0.5、1.0、1.5、2.0 、2.5mg·L-1,KT 0.5mg·L-1共10种激素组合培养上，蔗糖30g·L-1，琼脂7g·L-1，AgNO32 mg·L-1，pH5.8，接种后35℃高温暗培养5d，增殖培养基为MS + 2,4-D 0.2 mg·L-1 + NAA 1.0mg·L-1 + 6-BA 0.5 mg·L-1 +KT 0.5 mg·L-1 + +AgNO3 2 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1 +琼脂7g·L-1，每20 d增殖培养1次，共培养3次；
步骤五 愈伤组织分化，将增殖良好的愈伤组织接种于分化培养基中，以MS为基本培养基，NAA 浓度分别为 0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1，6-BA 浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg·L-1， 蔗糖30g·L-1 ，琼脂7g·L-1，pH5.8，培养条件为：25 mmol·m-2·s-1光下培养，光照14 h·d-1，温度25±1℃；
步骤六 不定芽的生根培养，将分化得到的芽转入1/2MS和MS培养中，添加 0-1.0 mg·L-1的 NAA，蔗糖30g·L-1 ，琼脂7g·L-1，活性炭2g L-1, pH 5.8进行生根培养，获得完整的单倍体植株，培养条件为：30 mmol·m-2·s-1光下培养，光照14 h·d-1，温度25±1℃。
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