CN107568069A - 一种光皮桦组培苗高效增殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种光皮桦组培苗高效增殖方法，包括如下步骤：（1）选取光皮桦优良单株当年生的半木质化枝条作外植体，经过外植体无菌处理后，接种到诱导培养基中培养，诱导不定芽；（2）将所述的不定芽转入继代培养基中进行增殖培养，获得丛生芽；（3）将单个丛生芽接种到壮苗培养基中进行培养，获得健壮芽苗；（4）将所述健壮芽苗接至生根培养基中进行诱导生根培养，获得完整植株的生根苗。本发明的光皮桦优良单株的组织培养方法具有诱导率高、增殖倍数高及生根率高等优点，而且操作简单、易行，能获得较大的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于植物无性繁殖的技术领域，具体涉及一种光皮桦组培苗高效增殖的方法。
背景技术
光皮桦是我国特有的速生珍贵阔叶树种，具生长快、适应能力强、用途广、落叶量大等特性，零星分布于我国秦岭、淮河流域以南各省(区)，其木材呈淡黄色或淡红褐色，材质细致坚韧，切面光滑，用途广泛，已被国家列入一类材。近年来，由于木材深加工产业的发展和市场消费对于实木用材需求的增加，各地营造光皮桦人工林的积极性逐年增高，对光皮桦良种壮苗的需求迫切。然而，我国现存的光皮桦优树分布较为分散，种子成熟期短、发芽率低，采集困难，致使实生苗育苗操作难度加大，而且由于光皮桦是异花授粉树种，用种子繁殖，个体分化大，难以保持光皮桦母体的性状。组织培养技术不仅能保持苗木的优良遗传特性，而且还具有繁殖速度快、方法简单、操作简便、不受季节和地域限制等特点。有关光皮桦组织培养方面的研究已有相关报道，堪红辉等(谌红辉，曾杰，贾宏炎，黎明.光皮桦叶芽离体培养再生植株技术[J].广西林业科学，2006，35(3)：123-124.)对光皮桦叶芽进行离体培养，通过叶芽诱导及生根培养，增殖系数达3.2，生根率为86％。专利号为201410173069.4公开了光皮桦植物组织培养方法及其培养基，以叶芽为外植体，通过诱导及生根培养，平均增殖系数为3.4，生根率达82％。从检索到的文献表明，现有的技术存在诱导时间长、继代增殖倍数低、生根率低、操作较复杂等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种增殖倍数高和生根率高的光皮桦组培苗高效增殖方法，能够缩短光皮桦植物组织培养的诱导时间，提高继代增殖倍数和生根率，同时简化了步骤。
为了解决现有技术所存在的上述问题，本发明的技术方案如下：
一种光皮桦组培苗高效增殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体无菌处理：在采集前一天，用1000～1500倍的甲基托布津溶液喷洒待采集的光皮桦优良单株当年生抽稍的腋芽饱满的枝条，该处的当年生抽稍的枝条是指每一年从树枝顶端新生长出的嫩梢)。采集消毒过的枝条，并及时带回实验室，剪除枝条叶片，用清水洗去表面附着物，再用软毛刷沾取洗衣粉轻轻刷洗，将枝条剪成5.0～6.0cm茎段放置在烧杯中，用1000～1500倍甲基托布津浸泡5min，再先后置于流水下冲洗20～30min和无菌水冲洗2遍后，放置于无菌容器中，转入超净台。在超净台上用体积浓度为70％的乙醇浸泡外植体40s，无菌水冲洗1次后，再用质量浓度为0.1％氯化汞对外植体浸泡消毒4～12min，最后用无菌水冲洗外植体5次，每次1～2min。取消毒过的解剖刀将茎段两端断面切掉0.5cm左右，将茎段裁剪为长1.5～2.0cm带有一个腋芽的小茎段作为外植体；
(2)初代诱导培养：将无菌处理后的光皮桦优良单株的外植体接种到诱导培养基，进行不定芽诱导培养，所述初代诱导培养基的配方包括以下组分：3/4MS培养基、1.0～5.0mg/L的6-BA、0.01～0.05mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述诱导培养基的pH值为5.8～6.0，所述诱导培养的条件为温度25℃～27℃、光照强度1000～1500Lux，光照时间10～12h/d，6～12d后腋芽开始萌动，经培养25～30d获得不定芽，诱导率最高达91.7％；
(3)继代增殖培养：将步骤(2)获得的不定芽切取长度1.0～1.5cm左右接入继代培养基中进行增殖培养，所述继代增殖培养基的配方包括以下组分：MS培养基、3.0～5.0mg/L的6-BA、0.01～0.1mg/L的NAA、30～50g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述增殖培养基的pH值为5.8～6.0，所述增殖培养的条件为温度25℃～28℃、光照强度1500～2000Lux、光照时间10～12h/d，经25～30d培养后形成丛生芽，平均增殖倍数最高为6.5，有效苗率高达47.1％；
(4)壮苗培养：将步骤(3)获得的丛生芽切割分成1棵芽/丛，接种到壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基的配方包括以下组分：3/4MS培养基、0.1mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述壮苗培养基的pH值为5.8～6.0，所述壮苗培养的条件为温度25℃～28℃、光照强度2000～2500Lux、光照时间10～12h/d，培养20～25d后形成壮芽，待壮芽长到2～3cm后进行生根诱导；
(5)生根培养：将步骤(4)得到的壮芽接种到生根培育基中，所述生根培养基的配方包括以下组分：1/3MS培养基、0.5～1.5mg/L的IBA、0.01～0.1mg/L的NAA、0.1～0.3mg/L的生根粉、20～40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述生根培养基的pH值为5.8～6.0，所述生根培养条件为温度25℃～28℃、光照强度2000～2500Lux、光照时间12～16h/d，培养时间25～30d，获得完整植株的生根组培苗，生根率最高达100％，平均根数6.4条。
本发明具有如下有益效果：
(1)选择6-BA与NAA作为诱导培养基添加的细胞分裂素，并通过6-BA与NAA对诱导率的影响，设计出适宜的诱导培养基配方，使得不定芽诱导率提高至90％以上。
(2)通过选择适宜的培养基、选择适宜的激素、激素配比及激素间的交互作用，设计出适宜的继代培养基配方，使增殖周期缩短至25～30d，增殖系数达6.5，有效苗率达47.1％。
(3)利用含有IBA、NAA和生根粉的MS培养基诱导生根，能有效的缩短诱导生根时间，5～8天就能见根的发生，并极大地提高了生根率，生根率达100％，每个单株平均6.4条根。
(4)本发明的光皮桦组培苗高效增殖方法操作简单，增殖倍数高，成本低，效率高，所诱导的生根苗根系发达，植株生长健壮，成活率高。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明进行详细的说明。
本发明采用的试剂
6-BA：6-苄氨基嘌呤，国药集团化学试剂有限公司；
NAA：α-萘乙酸，国药集团化学试剂有限公司；
IBA：吲哚丁酸，国药集团化学试剂有限公司。
表1为以下具体实施例中光皮桦组培苗高效增殖培养用到的培养基成分
实施例1：灭菌时间对光皮桦外植体接种效果的影响
1选取外植体
选择光皮桦优良单株分枝末端的当年生抽稍的枝条作为组织培养外植体，枝条上的腋芽要饱满，枝条木质化程度达半木质化。
2外植体表面灭菌
提前一天用1500倍甲基托布津溶液喷洒待采集的枝条灭菌。采集的枝条剪去叶片，用清水洗去表面附着物，剪成5.0～6.0cm茎段放置在烧杯中，加入1500倍的甲基托布津浸泡5min后置于流水下冲洗30min，然后用无菌水冲洗2遍，放置于无菌容器中，转入超净台上用体积浓度为70％的乙醇灭菌40s，无菌水冲洗1次。再用0.1％氯化汞灭菌，灭菌时间设5个处理，分别为4min、6min、8min、10min和12min。灭菌后用无菌水冲洗外植体5次，每次1～2min。外植体表面灭菌后，用灭过菌的解剖刀切掉茎段两端断面0.5cm左右，然后将茎段剪成1.5～2.0cm长的带有一个腋芽的小茎段作为外植体，接种到已灭菌过的诱导培养基上，每瓶接种1个茎段，每种处理接种20瓶，试验重复3次，接种30天。
3初代诱导培养
将无菌处理后的光皮桦优良单株的外植体接种到诱导培养基，进行不定芽诱导培养，所述初代诱导培养基的配方包括以下组分：3/4MS培养基、4.0mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述诱导培养基的pH值为5.9，所述诱导培养的条件为温度26℃、光照1500Lux，光照10h/d，6～12d后腋芽开始萌动，经培养30d获得不定芽。
4继代增殖培养
将获得的不定芽切取长度1.0～1.5cm左右接入继代培养基中进行增殖培养，所述继代增殖培养基的配方包括以下组分：MS培养基、4.0mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述增殖培养基的pH值为5.9，所述增殖培养的条件为温度26℃、光照1500Lux、光照12h/d，经30d培养后形成丛生芽。
5壮苗培养
将获得的丛生芽切割分成1棵芽/丛，接种到壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基的配方包括以下组分：3/4MS培养基、0.1mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述壮苗培养基的pH值为5.9，所述壮苗培养的条件为温度26℃、光照2000Lux、光照12h/d，培养30d后形成壮芽，待壮芽长到2～3cm后进行生根诱导。
6生根培养
将得到的壮芽接种到生根培育基中，所述生根培养基的配方包括以下组分：1/3MS培养基、1.0mg/L的IBA、0.01mg/L的NAA、0.2mg/L的生根粉、20g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述生根培养基的pH值为5.9，所述生根培养条件为温度26℃、光照2000Lux、光照12h/d，培养时间30d，获得完整植株的生根组培苗。
其他条件不变，仅改变灭菌时间。培育好后观察统计外植体的诱导率、污染率和死亡率。诱导率(％)＝萌芽生长的外植体数÷接种瓶数×100％，污染率(％)＝污染的外植体数÷接种瓶数×100％，死亡率(％)＝死亡的外植体数÷接种瓶数×100％。
表2为不同灭菌时间对光皮桦外植体接种效果的影响
| 灭菌时间(min) | 外植体数量(个) | 诱导率(％) | 污染率(％) | 死亡率(％) |
| 4 | 60 | 96.7 | 18.3 | 1.7 |
| 6 | 60 | 93.3 | 10.0 | 3.3 |
| 8 | 60 | 91.6 | 3.3 | 5.0 |
| 10 | 60 | 86.7 | 1.7 | 8.3 |
| 12 | 60 | 80.0 | 0.0 | 11.7 |
如表2所示，在外植体不同灭菌时间处理中，随着0.1％氯化汞灭菌时间的增加，诱导率和污染率呈下降趋势，而死亡率呈上升趋势，这说明增加0.1％氯化汞的灭菌时间，能有效降低外植体的污染率，但同时会增加外植体的死亡率，减少外植体的诱导率。因此，综合考虑外植体的诱导率和得率，应选择0.1％氯化汞的灭菌时间控制在8～10min效果较好。
实施例2：不同激素浓度对外植体诱导的影响
1选取外植体
选择光皮桦优良单株分枝末端的当年生抽稍的枝条作为组织培养外植体，枝条上的腋芽要饱满，枝条木质化程度达半木质化。
2外植体表面灭菌
提前一天用1500倍甲基托布津溶液喷洒待采集的枝条灭菌。采集的枝条剪去叶片，用清水洗去表面附着物，剪成5.0～6.0cm茎段放置在烧杯中，加入1500倍的甲基托布津浸泡5min后置于流水下冲洗30min，然后用无菌水冲洗2遍，放置于无菌容器中，转入超净台上用体积浓度为70％的乙醇灭菌40s，无菌水冲洗1次。再用0.1％氯化汞灭菌，灭菌时间为8min。灭菌后用无菌水冲洗外植体5次，每次1～2min。
3初代诱导培养
外植体灭菌后，切成1.5～2.0cm长的小茎段，每个小茎段含一个饱满的嫩芽，接入诱导培养基中进行培养。诱导培养以3/4MS培养基为基本培养基，添加蔗糖40g/L，琼脂粉7.0g/L，pH值为5.9。同时，培养基中添加不同浓度的6-BA(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/L)和NAA(0.01、0.03、0.05mg/L)进行试验，培养条件为温度控制在26℃，光照强度1000Lux，光照时间12h/d，接种30天。
4继代增殖培养
将获得的不定芽切取长度1.0～1.5cm左右接入继代培养基中进行增殖培养，所述继代增殖培养基的配方包括以下组分：MS培养基、4.0mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述增殖培养基的pH值为5.9，所述增殖培养的条件为温度25℃、光照1500Lux、光照12h/d，经30d培养后形成丛生芽。
5壮苗培养
将获得的丛生芽切割分成1棵芽/丛，接种到壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基的配方包括以下组分：3/4MS培养基、0.1mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述壮苗培养基的pH值为5.9，所述壮苗培养的条件为温度25℃、光照2000Lux、光照12h/d，培养30d后形成壮芽，待壮芽长到2～3cm后进行生根诱导；
6生根培养
将得到的壮芽接种到生根培育基中，所述生根培养基的配方包括以下组分：1/3MS培养基、1.0mg/L的IBA、0.01mg/L的NAA、0.2mg/L的生根粉、20g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述生根培养基的pH值为5.9，所述生根培养条件为温度25℃、光照2000Lux、光照12h/d，培养时间30d，获得完整植株的生根组培苗。
其他条件不变，仅改变不同激素浓度，每种处理接种20瓶，试验重复3次。
表3为不同激素浓度对外植体诱导的试验结果
| 处理 | 6-BA(mg/L) | NAA(mg/L) | 接种数(个) | 诱导率(％) |
| 1 | 1.0 | 0.01 | 60 | 56.7 |
| 2 | 2.0 | 0.01 | 60 | 75.0 |
| 3 | 3.0 | 0.01 | 60 | 78.3 |
| 4 | 4.0 | 0.01 | 60 | 91.7 |
| 5 | 5.0 | 0.01 | 60 | 86.7 |
| 6 | 1.0 | 0.03 | 60 | 56.7 |
| 7 | 2.0 | 0.03 | 60 | 61.7 |
| 8 | 3.0 | 0.03 | 60 | 65.0 |
| 9 | 4.0 | 0.03 | 60 | 78.3 |
| 10 | 5.0 | 0.03 | 60 | 68.3 |
| 11 | 1.0 | 0.05 | 60 | 45.0 |
| 12 | 2.0 | 0.05 | 60 | 51.7 |
| 13 | 3.0 | 0.05 | 60 | 60.0 |
| 14 | 4.0 | 0.05 | 60 | 63.3 |
| 15 | 5.0 | 0.05 | 60 | 55.0 |
从表3可知，在诱导培养基中添加6-BA和生长素NAA，能有效提高外植体的诱导率，试验结果以3/4MS培养基添加4.0mg/L的6-BA和0.01mg/L的NAA时效果最好，诱导率可达91.7％，诱导芽的生长良好。
实施例3：不同培养基成分配比对继代增殖培养的影响
1选取外植体
选择光皮桦优良单株分枝末端的当年生抽稍的枝条作为组织培养外植体，枝条上的腋芽要饱满，枝条木质化程度达半木质化。
2外植体表面灭菌
提前一天用1500倍甲基托布津溶液喷洒待采集的枝条灭菌。采集的枝条剪去叶片，用清水洗去表面附着物，剪成5.0～6.0cm茎段放置在烧杯中，加入1500倍的甲基托布津浸泡5min后置于流水下冲洗30min，然后用无菌水冲洗2遍，放置于无菌容器中，转入超净台上用体积浓度为70％的乙醇灭菌40s，无菌水冲洗1次。再用0.1％氯化汞灭菌，灭菌时间为8min。灭菌后用无菌水冲洗外植体5次，每次1～2min。
3初代诱导培养
外植体灭菌后，切成1.5～2.0cm长的小茎段，每个小茎段含一个饱满的嫩芽，接入诱导培养基中进行培养。所述初代诱导培养基的配方包括以下组分：3/4MS培养基、4.0mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、40g/L的蔗糖、7.0g/L的琼脂粉，所述诱导培养基的pH值为5.9，所述诱导培养的条件为温度26℃、光照强度1500Lux，光照时间10h/d，光照时间12h/d，接种30天后获得不定芽。
4继代增殖培养
将诱导出的不定芽切成1.0～1.5cm长接入继代培养基中增殖培养。增殖培养以MS培养基为基本培养基，添加琼脂粉7.0g/L，pH值为5.9。同时，添加不同浓度的6-BA(3.0、4.0、5.0mg/L)、NAA(0.01、0.05、0.1mg/L)和蔗糖(30、40、50g/L)，选用L9(33)正交表进行试验，各试验处理接种10瓶，每瓶接种3个新芽，试验重复3次，培养条件为温度25℃，光照强度1500Lux，光照时间12h/d。培养30天后获得丛生芽。
5壮苗培养
将获得的丛生芽切割分成1棵芽/丛，接种到壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基的配方包括以下组分：3/4MS培养基、0.1mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述壮苗培养基的pH值为5.9，所述壮苗培养的条件为温度26℃、光照2000Lux、光照12h/d，培养30d后形成壮芽，待壮芽长到2～3cm后进行生根诱导。
6生根培养
将得到的壮芽接种到生根培育基中，所述生根培养基的配方包括以下组分：1/3MS培养基、1.0mg/L的IBA、0.01mg/L的NAA、0.2mg/L的生根粉、20g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述生根培养基的pH值为5.9，所述生根培养条件为温度26℃、光照2000Lux、光照12h/d，培养时间30d，获得完整植株的生根组培苗。
其他条件不变，仅改变继代增殖培养基中的6-BA、NAA和蔗糖的浓度，并调查统计增殖倍数、有效苗数和有效苗率，有效苗数为大于2.0cm可供生根的芽苗数量，增殖倍数＝继代一次后的总芽数÷原接种芽数，有效苗率＝有效苗数÷丛生芽苗总数×100％。
表4为不同培养基成分配比对继代增殖培养的影响
| 处理 | 6-BA(mg/L) | NAA(mg/L) | 蔗糖浓度(g/L) | 增殖倍数 | 有效苗率(％) |
| 1 | 3.0 | 0.01 | 30 | 2.4 | 17.2 |
| 2 | 3.0 | 0.05 | 40 | 4.2 | 19.6 |
| 3 | 3.0 | 0.1 | 50 | 2.7 | 23.0 |
| 4 | 4.0 | 0.01 | 40 | 6.5 | 47.1 |
| 5 | 4.0 | 0.05 | 50 | 4.3 | 44.3 |
| 6 | 4.0 | 0.1 | 30 | 4.5 | 53.1 |
| 7 | 5.0 | 0.01 | 50 | 2.1 | 26.7 |
| 8 | 5.0 | 0.05 | 40 | 4.2 | 33.0 |
| 9 | 5.0 | 0.1 | 30 | 2.0 | 17.8 |
由表4可知，继代苗的增殖和生长与外源激素的种类和浓度密切相关，其中处理4培养基时效果最佳，其次是处理6培养基，因此，光皮桦最佳的继代增殖培养基为MS基本培养基添加4.0mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA和40g/L的蔗糖。
实施例4：不同激素和蔗糖配比对生根培养的影响
1选取外植体
选择光皮桦优良单株分枝末端的当年生抽稍的枝条作为组织培养外植体，枝条上的腋芽要饱满，枝条木质化程度达半木质化。
2外植体表面灭菌
提前一天用1500倍甲基托布津溶液喷洒待采集的枝条灭菌。采集的枝条剪去叶片，用清水洗去表面附着物，剪成5.0～6.0cm茎段放置在烧杯中，加入1500倍的甲基托布津浸泡5min后置于流水下冲洗30min，然后用无菌水冲洗2遍，放置于无菌容器中，转入超净台上用体积浓度为70％的乙醇灭菌40s，无菌水冲洗1次。再用0.1％氯化汞灭菌，灭菌时间为8min。灭菌后用无菌水冲洗外植体5次，每次1～2min。外植体表面灭菌后，用解剖刀切掉茎段两端断面0.5cm左右，然后将茎段剪成1.5～2.0cm长的带有一个腋芽的小茎段作为外植体，接种到已经高压灭菌的诱导培养基上。
3初代诱导培养
外植体灭菌后，切成1.5～2.0cm长的小茎段，每个小茎段含一个饱满的嫩芽，接入诱导培养基中进行培养。诱导培养以3/4MS培养基为基本培养基，添加4.0mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、蔗糖40g/L和7.0g/L的琼脂粉，pH值为5.9。培养条件为温度控制在26℃，光照强度1000Lux，光照时间12h/d，接种30天获得不定芽。
4继代增殖培养
将诱导出的不定芽切成1.0～1.5cm长接入继代培养基中增殖培养。增殖培养以MS培养基为基本培养基，添加4.0mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，pH值为5.9。培养条件为温度25℃，光照强度1500Lux，光照时间12h/d。培养30天后获得丛生芽。
5壮苗培养
将获得的丛生芽切割分成1棵芽/丛，接种到壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基的配方包括以下组分：3/4MS培养基、0.1mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述壮苗培养基的pH值为5.8～6.0，所述壮苗培养的条件为温度25℃、光照2000Lux、光照12h/d，培养30d后形成壮芽，待壮芽长到2～3cm后进行生根诱导。
6生根培养
将经过壮苗培养的芽苗接种到生根培养基中诱导生根。生根培养以1/3MS为基础培养基，添加琼脂粉7.0g/L，pH值为5.9。同时，分别添加不同浓度的IBA(设0.5、1.0、1.5mg/L三个水平)、NAA(设0.01、0.05、0.1mg/L三个水平)、生根粉(设0.1、0.2、0.3mg/L三个水平)和蔗糖(设20、30、40g/L三个水平)，按L9(34)正交表进行试验，各处理培养接种20个单芽，重复3次。培养条件为温度26℃，光照强度2000～2500Lux，光照时间12～16h/d，培养30d后调查生根率、平均生根数及生长情况。生根率＝生根的株数÷接种的总株树×100％其他条件不变，仅改变生根培养基中不同激素和蔗糖的浓度配比。
表5为不同激素和蔗配比对生根培养的影响
从表5可知：以1/3MS为基本培养基时，在生根培养基中同时添加不同浓度的IBA、NAA、生根粉和蔗糖20g/L时，组培苗的生根情况得到明显改善，其中处理4的生根情况最佳，生根率为100％，平均生根数达6.4条，组培生根苗生长健壮。因此，最佳生根培养基为1/3MS添加1.0mg/L的IBA、0.01mg/L的NAA、0.2mg/L生根粉和20g/L蔗糖。
实施例5：
(1)将光皮桦优良单株当年生枝条叶片剪去，用清水洗去表面附着物，剪成5.0～6.0cm茎段放置在烧杯中，加入1000～1500倍的甲基托布津浸泡5min后置于流水下冲洗30min，然后用无菌水冲洗2遍，放置于无菌容器中，转入超净台上用体积浓度为70％的乙醇灭菌40s，无菌水冲洗1次。再用0.1％氯化汞灭菌8min。灭菌后用无菌水冲洗外植体5次后，用解剖刀切掉茎段两端断面0.5cm左右，然后将茎段剪成1.5～2.0cm长的带有一个腋芽的小茎段作为外植体。
(2)将外植体接种到装有诱导培养基的培养瓶中培养，将培养瓶置于培养室中培养，培养温度26℃，光照强度1000～1500Lux，光照时间12h/d。诱导培养基为：3/4MS培养基+6-BA4.0mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉7.0g/L，pH值5.9。6～12d后腋芽开始萌动，培养30d后，获得不定芽。
(3)将不定芽切成1.0～1.5cm长接入继代培养基中增殖培养，培养温度28℃，光照强度1500～2000Lux，光照时间12h/d。继代增殖培养基为：MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉7.0g/L，pH值5.9。增殖培养25～30d后，获得丛生芽。
(4)将丛生芽分割成单芽接种到壮苗培养基中培养，培养温度26℃，光照强度2000～2500Lux，光照时间10～12h/d。壮苗培养基为：3/4MS培养基+6-BA0.1mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉7.0g/L，pH值5.9。
(5)壮苗培养20～25d后接种到生根培养基中培养，培养温度26℃，光照强度2000～2500Lux，光照时间12～16h/d，培养时间25～30d，获得完整植株的生根苗。生根培养基为：1/3MS+IBA1.0mg/L+NAA0.01mg/L+生根粉0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉7.0g/L，pH值5.9。
本实施例为本发明的优选实施例，本实施例的有益效果为：进一步使外植体的污染率和死亡率降低至3.3％和5.0％，将不定芽诱导率提高至91.7％，继代培养的增殖倍数达6.5倍，同时有效苗率高达47.1％以上，生根率高达100％，平均生根数达6.4条。
实施例6：对照组
(1)外植体灭菌：将光皮桦优良单株当年生枝条叶片剪去，用清水洗去表面附着物，剪成5.0～6.0cm茎段放置在烧杯中，用无菌水冲洗2遍，放置于无菌容器中，转入超净台上用75％酒精1～1.5min处理后，无菌水冲洗1次，转入0.1％HgCI2溶液处理7min。灭菌后用无菌水冲洗外植体5次后，用解剖刀切掉茎段两端断面0.5cm左右，然后将茎段剪成1.5～2.0cm长的带有一个腋芽的小茎段作为外植体。
(2)诱导培养：将外植体接种到装有诱导培养基的培养瓶中培养，将培养瓶置于培养室中培养，培养温度26℃，光照强度1000～1500Lux，光照时间12h/d。诱导培养基为：MS培养基+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉7.0g/L，pH值5.9，培养30d后，获得不定芽。
(3)继代增殖培养：将不定芽切成1.0～1.5cm长接入继代培养基中增殖培养，培养温度28℃，光照强度1500～2000Lux，光照时间12h/d。继代增殖培养基为：MS+6-BA4.5mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉7.0g/L，pH值5.9。增殖培养25～30d后，获得丛生芽。
(4)生根培养：将丛生芽苗接种到生根培养基中培养，培养温度26℃，光照强度2000～2500Lux，光照时间12～16h/d，培养时间25～30d，获得完整植株的生根苗。生根培养基为：WH+IBA3.0mg/L+NAA1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.0g/L，pH值5.9。
实施例6为本实验室现有的光皮桦组织培育方法，具体见陈伟在福建林业科技上发表的光皮桦组织培养技术研究(陈伟，林镇斌，郑郁善.光皮桦组织培养技术研究[J].福建林业科技，2006，33(1)：67-71，101)。该技术的外植体灭菌污染率达41.6％，死亡率为45.6％，不定芽诱导率为89.4％，增殖系数达6.9，但有效苗率低，仅22.6％，生根率为95.1％。
综上所述，本发明提供的光皮桦优良单株的组织培养育苗方法的不定芽诱导率高达91.7％、增殖倍数为6.5倍、有效苗率为47.1％、生根率达100％、平均生根数6.4条，为光皮桦优良单株组培苗规模化生产提供技术支撑。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种光皮桦组培苗高效增殖方法，其特征在于，包括如下步骤：
外植体无菌处理：枝条采集前采用1000~1500倍的甲基托布津溶液对其进行灭菌处理，采集灭菌后的枝条并剪除叶片，清洗去除表面附着物，经清洗浸泡、流水冲洗、化学试剂消毒处理后，用解剖刀裁剪成带有一个腋芽的小茎段作为外植体；
初代诱导培养：将步骤（1）处理后的外植体接种到初代诱导培养基中光照培养，培养温度为25℃~28℃，光照强度1000~1500Lux，光照时间10~12小时/天，培养25~30天后，获得不定芽；
继代增殖培养：将步骤（2）获得的不定芽切取长度1.5~2.0cm接入继代培养基中进行增殖培养，培养温度为25℃~28℃，光照强度1500~2000Lux，光照时间10~12小时/天，增殖培养25~30天后，获得丛生芽；
壮苗培养：将步骤（3）获得的丛生芽切割分成1棵芽/丛，接种到壮苗培养基中培养，培养温度为25℃~28℃，光照强度2000~2500Lux，光照时间10~12小时/天，壮苗培养20~25天后，获得壮芽；
生根培养：将步骤（4）得到的壮芽接种到生根培育基中，培养温度为25℃~28℃，光照强度2000~2500Lux，光照时间12~16小时/天，生根培养25~30天后，获得完整的光皮桦植株组培苗。
2.如权利要求1所述的一种光皮桦组培苗高效增殖方法，其特征在于：步骤（1）中枝条选当年生抽稍的半木质化枝条作为组织培养外植体，所述半木质化枝条上具有饱满的腋芽。
3.如权利要求1所述的一种光皮桦组培苗高效增殖方法，其特征在于：所述初代诱导培养基的配方包括以下组分：3/4MS培养基、1.0~5.0mg/L的6-BA、0.01~0.05mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，用1mol/L的NaOH溶液调节所述诱导培养基的pH值为5.8~6.0。
4.如权利要求1所述的一种光皮桦组培苗高效增殖方法，其特征在于：所述继代增殖培养基的配方包括以下组分：MS培养基、3.0~5.0mg/L的6-BA、0.01~0.1mg/L的NAA、30~50g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述增殖培养基的pH值用1mol/L的NaOH溶液调至5.8~6.0。
5.如权利要求1所述的一种光皮桦组培苗高效增殖方法，其特征在于：所述壮苗培养基的配方包括以下组分：3/4MS培养基、0.1mg/L的6-BA、0.01mg/L的NAA、40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述壮苗培养基的pH值用1mol/L的NaOH溶液调为5.8~6.0。
6.如权利要求1所述的一种光皮桦组培苗高效增殖方法，其特征在于：所述生根培养基的配方包括以下组分：1/3MS培养基、0.5~1.5mg/L的IBA、0.01~0.1mg/L的NAA、0.1~0.3mg/L的生根粉、20~40g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉，所述生根培养基的pH值用1mol/L的NaOH溶液调为5.8~6.0。
7.如权利要求1所述的一种光皮桦组培苗高效增殖方法，其特征在于，步骤（1）的具体步骤为：将采集的枝条剪除叶片，用清水洗去表面附着物，再用软毛刷沾取洗衣粉轻轻刷洗，然后将枝条剪成5.0~6.0cm茎段放置在烧杯中，用1000~1500倍甲基托布津溶液浸泡5min后，先置于流水下冲洗20~30min，再用无菌水冲洗2遍后，放置于无菌容器中，转入超净台，用体积浓度为70%的乙醇浸泡外植体40s，无菌水冲洗1次后，再用质量浓度为0.1%氯化汞对外植体浸泡消毒4~12min，最后用无菌水冲洗外植体5次，每次1~2min，用解剖刀将茎段两端断面切掉0.5cm左右，然后将茎段裁剪为长1.5~2.0cm带有一个腋芽的小茎段作为外植体。
8.如权利要求4所述的一种光皮桦组培苗高效增殖方法，其特征在于：所述的MS培养基包含大量元素、微量元素和有机元素；所述大量元素包含1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、170mg/L KH2PO4、440mg/L CaCl2·2H2O和370mg/L MgSO4·7H2O；所述微量元素包括0.83mg/L KI、6.2mg/L H3BO3、22.3mg/L MnSO4·4H2O、8.6mg/L ZnSO4·7H2O、0.25mg/L Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、0.025mg/L CoCl2·6H2O、27.8mg/L FeSO4·7H2O和37.3mg/LNa2EDTA；所述有机元素包含100mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫胺素和0.5mg/L盐酸吡哆醇。
9.如权利要求3或5所述的一种光皮桦组培苗高效增殖方法，其特征在于：所述3/4MS培养基包含大量元素、微量元素和有机元素；所述大量元素包括1238mg/L NH4NO3、1425mg/LKNO3、128mg/L KH2PO4、330mg/L CaCl2·2H2O和278mg/L MgSO4·7H2O；所述微量元素包括0.83mg/L KI、6.2mg/L H3BO3、22.3mg/L MnSO4·4H2O、8.6mg/L ZnSO4·7H2O、0.25mg/LNa2MoO4·2H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、0.025mg/L CoCl2·6H2O、27.8mg/L FeSO4·7H2O和37.3mg/L Na2EDTA；所述有机元素包含100mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫胺素和0.5mg/L盐酸吡哆醇。
10.如权利要求6所述的一种光皮桦组培苗高效增殖方法，其特征在于：所述的1/3MS培养基包含大量元素、微量元素和有机元素；所述大量元素包括545mg/L NH4NO3、627mg/LKNO3、145mg/L CaCl2·2H2O、122mg/L MgSO4·7H2O和56mg/L KH2PO4；所述微量元素包括0.83mg/L KI、6.2mg/L H3BO3、22.3mg/L MnSO4·4H2O、8.6mg/L ZnSO4·7H2O、0.25mg/LNa2MoO4·2H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、0.025mg/L CoCl2·6H2O、27.8mg/L FeSO4·7H2O和37.3mg/L Na2EDTA；所述有机元素包含100mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫胺素和0.5mg/L盐酸吡哆醇。
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