CN112042543A - 一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，包括以下步骤：在无病虫害的梨树花枝上选择生长状态较好的花蕾，在开花当天摘下雌蕊作为外植体；将雌蕊先放在4℃冰箱内低温预处理3d，然后置于均匀磁场中处理60min；接种前先将雌蕊消毒，然后从子房中剥取胚珠接种在诱导培养基上培养至形成胚状体；将胚状体转入分化培养基培养25~40d，使其发育成具有根、茎、叶的完整小植株；将小植株转入生根培养基培养20~30d，炼苗3~4d后移栽；采用DNA流式细胞术鉴定再生植株倍性。本发明初步建立了梨未受精胚珠离体培养再生体系，并成功获得了单倍体植株，可为加速梨单倍体育种进程以及种质资源创新、新品种选育奠定基础。

Description

一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法
技术领域
本发明属于果树培育技术领域，具体涉及一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法。。
背景技术
梨又称梨子、鸭梨等，是蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloidme）梨属 （Pyrus）植物，为多年生乔木落叶果树。梨子被誉为百果之宗，不仅鲜甜可口、香脆多汁，而且营养丰富。梨子含有丰富的葡萄糖、蔗糖、水分以及纤维素、钙、碘、钾等微量元素，还含有一定量的蛋白质、维生素、胡萝卜素和苹果酸等物质。梨子味甘微酸、性凉，有降火、清心、润肺、化痰、止咳、退热、解疮毒和酒毒的功效。梨子还有降压、清热、镇静和利尿作用，对高血压、心脏病伴有的头晕目眩、心悸、耳鸣症状有一定的治疗效果。梨是我国的重要果树之一，栽培历史悠久，分布遍及全国，栽培面积和产量居世界首位。梨的种类和品种极多，我国梨的栽培品种主要可分为白梨系统、砂梨系统、秋子梨系统和西洋梨系统。
梨同大多数果树一样，多为异花授粉，自交不亲和、基因高度杂合、童期一般为5~7年，利用常规育种手段（如杂交育种、芽变或实生选种）难以准确掌握抗病、抗逆等重要育种目标的遗传信息，育种随机性较大。伴随人们对果品质量、适应性等需求的提高，加快梨的品种改良显得更加重要，而单倍体技术的出现为解决上述难题提供了新的途径。
单倍体是具有体细胞染色体数为本物种配子染色体数的生物个体。由于单倍体只含一套染色体，优良的隐性性状能在较早的世代中表现出来，从而可以提高选择效率、缩短育种年限；不良性状也能在较早的世代表达出来，使之迅速被淘汰。另一方面，单倍体经自然或人工加倍可得到纯合的二倍体，这一特点对异花授粉植物或杂种后代来说意义非凡，因为这样可以省去常规方法需要多代自交纯化亲本的步骤，快速获得自交系，大大加快育种进程。此外，单倍体培养和加倍过程中会出现基因突变，能够创新种质资源，增加群体遗传多样性；诱变单倍体能够快速发现隐性基因突变，有利于突变体筛选和基因功能的研究。
目前，获得单倍体的主要方法有2种：一种是孤雌生殖，包括辐射或化学诱导的孤雌生殖、远源花粉刺激的孤雌生殖和孤雌生殖诱导系诱导的孤雌生殖；另一种是植物单倍体组织离体培养，包括雄配子体（花药、花粉等单倍体组织）离体培养和未受精雌核（未受精的子房和胚珠等单倍体组织）离体培养。关于未受精子房和胚珠离体培养的研究，最早的工作始于 20 世纪 50 年代，但直到 70 年代末才出现了研究成功的报道，即San Noeum利用大麦未受精子房在离体条件下培养成功获得了单倍体再生植株。此后，国内外很多专家学者以此为基础，开始对各种植物的离体雌核培养进行了更广泛而深入的研究，并先后在烟草、小麦、向日葵、甜菜、韭菜、洋葱、西葫芦和黄瓜等多种植物上获得了单倍体植株，使得离体雌核发育成为产生单倍体植株的一个重要途径。
研究发现，利用未受精子房或胚珠进行离体培养诱导再生植株的这一过程十分复杂，影响因素较多，其内容大体包括：供体的基因型、供体植株（包括生长季节、生理状态及外植体的发育时期、取样的部位）、培养基的基本组成、碳源种类及浓度、激素的种类及浓度、预处理方法和持续的时间、培养的温、光、条件等。这些影响因素并不是独立存在的，通常是几个因素同时对整个诱导过程发生作用。
迄今为止，国内外有关梨未受精子房或胚珠离体培养的研究很少，并且也没有成功获得再生植株的报道。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是建立一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，以期能够加速梨单倍体育种进程，为今后梨种质资源创新、新品种选育奠定基础。
本发明所提供的技术方案是：
一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的获取：在无病虫害的梨树花枝上选择生长状态较好的花蕾，在开花当天摘下雌蕊作为外植体；
（2） 接种前的预处理：将雌蕊用湿纱布包好后先放在4℃冰箱内低温预处理3d，然后置于强度为200~400mT的均匀磁场中处理60min；
（3）胚状体的诱导：接种前先将雌蕊消毒，然后从子房中剥取胚珠接种在诱导培养基上，在温度26~28℃、黑暗条件下培养 10~15d，然后转移至光照条件下继续培养至形成胚状体；
（4）胚状体的分化：将步骤（3）中的胚状体转入分化培养基，在温度24~26℃、光照强度2000~3000lx、光周期13~15h/d 的条件下培养25~40d，胚状体可发育成具有根、茎、叶的完整小植株；
（5）根系的诱导与移栽：待步骤（4）中的小植株长至5~10cm高时，将其转入生根培养基，培养20~30d后植株的根长可达2~3cm，根粗可达0.5~1.0mm，在室内自然光下开瓶炼苗3~4d后移栽；
（6）再生植株倍性鉴定：采用DNA流式细胞术鉴定再生植株倍性。
所述步骤（3）中，雌蕊的消毒程序如下：把雌蕊置于超净工作台上，先用75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗1次；再用0.1%氯化汞水溶液浸泡15min，期间每隔3min 摇晃1次，最后以无菌水冲洗4次。
所述步骤（3）中，诱导培养基的成分为：KNO3 2680-2960mg/L，（NH4）2SO4 750-950mg/L， KH2PO4 340-420mg/L，CaCl2·2H2O 110-160mg/L，MgSO4·7H2O 175-225mg/L，MnSO4·4H2O 5.3-8.5mg/L，ZnSO4·7H2O 1.0-2.0mg/L，H3BO3 2.5-3.5mg/L，KI 0.7-0.8mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.2-0.3mg/L，CuSO4·5H2O 0.05-0.06mg/L，CoCl2·6H2O 0.02-0.03mg/L，乳酸亚铁29.7-32.1mg/L ，肌醇90-110mg/L，甘氨酸1.5-2.5mg/L，丝氨酸0.5-1.5mg/L，苏氨酸0.5-1.5mg/L，半胱氨酸4.0-6.0mg/L，丙氨酸4.0-6.0mg/L，维生素B1 0.8-1.2mg/L，维生素B6 0.4-0.6mg/L，烟酸1.0-1.4mg/L，叶酸4.0-6.0mg/L，泛酸钙0.5-0.9mg/L，6-BA0.8-1.2mg/L，NAA0.4-0.6mg/L，TDZ 0.04-0.06mg/L，2-氨基腺嘌呤1.8-2.2mg/L，二苯基脲磺酸钙1.0-2.0mg/L，茶多酚11-15mg/L，椰汁30-70ml/L，蔗糖30-50g/L，琼脂6-8g/L，pH为5.6-6.0。
所述步骤（3）中，光照条件为：光照强度1000~2000lx，光周期15~17h/d。
所述步骤（4）中，分化培养基的成分为：MS+NAA 0.5mg/L+ 6-BA 0.5mg/L + KT2.0mg/L +AgNO3 2.0mg/L +蔗糖 30g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.8。
所述步骤（5）中，生根培养基的成分为：1/2MS+NAA0.6mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.8。
所述步骤（5）中，生根的培养条件为：温度24~26℃，光照强度2500~3500lx，光周期13~15h/d。
所述步骤（5）中，移栽的方法为；将植株从瓶内取出，洗净附着在表面的培养基，移栽到装有蛭石的育苗钵中，温度保持在25~30℃，湿度保持在70~80%，约20d后移栽到大田。
本发明的有益效果：
1、本发明以梨的未受精胚珠为外植体，对影响梨未受精胚珠离体诱导胚状体的主要因素进行了探索，发现在接种前进行4℃低温预处理和磁场预处理，能够有效提高胚状体诱导率；在未受精胚珠离体培养过程中，培养基对雌核发育至关重要，本发明从培养基的大量元素、有机成分、激素种类和浓度、蔗糖浓度、附加成分等较全面地对胚状体诱导效果进行探究，获得了胚状体诱导最佳培养基，有效提高了胚状体诱导率。
2、本发明初步建立了梨的未受精胚珠离体培养再生体系，并成功获得了单倍体再生植株。本发明不仅奠定了梨离体雌核发育的研究基础，也为梨单倍体育种技术的应用提供技术支撑。
具体实施方式
实施例1
一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的获取：试验材料为梨栽培品种‘新世纪’和‘黄金’；在无病虫害的梨树花枝上选择生长状态较好的花蕾，在开花当天摘下雌蕊作为外植体。
（2） 接种前的预处理：将雌蕊用湿纱布包好后放在4℃冰箱内低温预处理3d，然后置于强度为200~400mT的均匀磁场中处理60min。
（3）胚状体的诱导：接种前把雌蕊置于超净工作台上，先用75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗1次；再用0.1%氯化汞水溶液浸泡15min，期间每隔3min 摇晃1次，最后以无菌水冲洗4次。从子房中剥取胚珠接种在诱导培养基上，在温度27℃、黑暗条件下培养 10~15d，然后转移至光照强度1500lx，光周期16h/d的光照条件下继续培养，观察胚状体的形成，统计胚状体诱导率；诱导培养基的成分为：KNO3 2820mg/L，（NH4）2SO4 850mg/L， KH2PO4 380mg/L，CaCl2·2H2O 135mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，MnSO4·4H2O 6.9mg/L，ZnSO4·7H2O 1.5mg/L，H3BO3 3.0mg/L，KI 0.75mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.055mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，乳酸亚铁30.9mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，丝氨酸1.0mg/L，苏氨酸1.0mg/L，半胱氨酸5.0mg/L，丙氨酸5.0mg/L，维生素B1 1.0mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸1.2mg/L，叶酸5.0mg/L，泛酸钙0.7mg/L，6-BA1.0mg/L，NAA0.5mg/L，TDZ 0.05mg/L，2-氨基腺嘌呤2.0mg/L，二苯基脲磺酸钙1.5mg/L，茶多酚13mg/L，椰汁50ml/L，蔗糖40g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
胚状体诱导率（%）=诱导出的胚状体数/接种胚珠总数×100。
（4）胚状体的分化：将步骤（3）中的胚状体转入分化培养基，在温度25℃、光照强度2500lx、光周期14h/d 的条件下培养25~40d，胚状体可发育成具有根、茎、叶的完整小植株；分化培养基的成分为：MS+NAA 0.5mg/L+ 6-BA 0.5mg/L+ KT 2.0mg/L +AgNO3 2.0mg/L +蔗糖 30g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.8。
（5）根系的诱导与移栽：待步骤（4）中的小植株长至5~10cm高时，将其转入生根培养基，在温度25℃，光照强度3000lx，光周期14h/d的条件下培养20~30d，植株的根长可达2~3cm，根粗可达0.5~1.0mm。在室内自然光下开瓶炼苗3~4d，将植株从瓶内取出，洗净附着在表面的培养基，移栽到装有蛭石的育苗钵中，温度保持在25~30℃，湿度保持在70~80%，约20d后移栽到大田；生根培养基的成分为：1/2MS+NAA0.6mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.8。
（6）再生植株倍性鉴定：采用DNA流式细胞术鉴定再生植株倍性。
实施例2低温预处理对胚状体诱导效果的研究
将‘新世纪’和‘黄金’的雌蕊分别放在4℃冰箱内低温预处理0、1、3、5、7d，然后置于强度为200~400mT的均匀磁场中处理60min，接着按照实施例1中的方法进行胚状体的诱导，统计胚状体诱导率，结果见表1。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
从表1可以看出，随着低温预处理时间的延长，‘新世纪’和‘黄金’的胚状体诱导率均呈现先升后降的趋势，并且两者对低温预处理的最佳时间反应一致，均在预处理 3d 时胚状体诱导率达到最高值，分别为19.41%、10.57%，预处理时间再长则胚状体诱导率逐渐下降。由此可知，两种试验材料适宜的低温预处理时间为3d。
实施例3磁场预处理对胚状体诱导效果的研究
将‘新世纪’和‘黄金’的雌蕊放在4℃冰箱内低温预处理3d，然后置于强度为0、200、400、600、800mT的均匀磁场中处理60min，接着按照实施例1中的方法进行胚状体的诱导，统计胚状体诱导率，结果见表2。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
从表2可以看出，一定强度的磁场预处理可以提高胚状体诱导率，其中‘新世纪’的胚状体诱导率在磁场强度为400mT时达到最高值，‘黄金’的胚状体诱导率在磁场强度为200mT时达到最高值；而随着磁场强度的继续提高，两种试验材料的胚状体诱导率有所下降，并且当磁场强度达到800mT时，‘黄金’的胚状体诱导率低于对照，出现了负效应。由此可知，两种试验材料适宜的磁场处理强度为200~400mT。
实施例4 2-氨基腺嘌呤对胚状体诱导效果的研究
按照实施例1中的方法，剥取两种试验材料的胚珠接种到添加不同浓度2-氨基腺嘌呤（0、1.0、2.0、3.0、5.0mg/L）的诱导培养基上进行胚状体的诱导，统计胚状体诱导率，结果见表3。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
从表3可以看出，2-氨基腺嘌呤浓度为0~2.0mg/L时，胚状体诱导率随其浓度的增加而提高，当其浓度为2.0mg/L时，两种试验材料的胚状体诱导率最高，分别为19.52%、9.76%；当2-氨基腺嘌呤浓度大于2.0mg/L时，随其浓度的增加胚状体诱导率降低，当其浓度为2.0mg/L时，两种试验材料的胚状体诱导率已经低于对照。因此诱导培养基中2-氨基腺嘌呤的最佳浓度为2.0mg/L。
实施例5二苯基脲磺酸钙对胚状体诱导效果的研究
按照实施例1中的方法，剥取两种试验材料的胚珠接种到添加不同浓度二苯基脲磺酸钙（0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L）的诱导培养基上进行胚状体的诱导培养，统计胚状体诱导率，结果见表4。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
从表4可以看出，诱导培养基中添加0.5~2.0mg/L的二苯基脲磺酸钙均可以提高胚状体诱导率，当添加二苯基脲磺酸钙浓度为1.5mg/L时对两种试验材料的胚状体诱导效果最好，‘新世纪’的诱导率达18.45%%，‘黄金’的达9.90%，均显著高于对照。因此诱导培养基中二苯基脲磺酸钙的最佳添加浓度为1.5mg/L。
实施例6再生植株倍性鉴定
以根尖染色体计数法对‘新世纪’和‘黄金’正常植株进行倍性鉴定，表明其染色体均为34条（2n=2x=34），以该材料为对照对实施例1中的再生植株进行DNA流式细胞术倍性鉴定。
操作方法为：切取0.5cm2待测植株幼嫩叶片置于培养皿中，加入细胞裂解液400µL，用刀片快速将叶片切碎，并使碎片完全浸于细胞裂解液中，避光静置2-5min，后再加1600µL染色缓冲液，快速混匀，避光静置染色5-8 min，后用孔径为30µm滤网将样品过滤到样品管内获得单细胞悬浮液。将样品管放入流式细胞仪测定待测植株细胞DNA的相对含量。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表5结果表明，再生植株群体中有单倍体、二倍体、混倍体同时存在，其中‘新世纪’有12株单倍体，6株二倍体，3株混倍体；‘黄金’有20株单倍体，33株二倍体，1株混倍体。115株再生植株中共有单倍体32株，单倍体率为27.8%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的获取：在无病虫害的梨树花枝上选择生长状态较好的花蕾，在开花当天摘下雌蕊作为外植体；
（2） 接种前的预处理：将雌蕊用湿纱布包好后先放在4℃冰箱内低温预处理3d，然后置于强度为200~400mT的均匀磁场中处理60min；
（3）胚状体的诱导：接种前先将雌蕊消毒，然后从子房中剥取胚珠接种在诱导培养基上，在温度26~28℃、黑暗条件下培养 10~15d，然后转移至光照条件下继续培养至形成胚状体；
（4）胚状体的分化：将步骤（3）中的胚状体转入分化培养基，在温度24~26℃、光照强度2000~3000lx、光周期13~15h/d 的条件下培养25~40d，胚状体可发育成具有根、茎、叶的完整小植株；
（5）根系的诱导与移栽：待步骤（4）中的小植株长至5~10cm高时，将其转入生根培养基，培养20~30d后植株的根长可达2~3cm，根粗可达0.5~1.0mm，在室内自然光下开瓶炼苗3~4d后移栽；
（6）再生植株倍性鉴定：采用DNA流式细胞术鉴定再生植株倍性。
2.根据权利要求1所述的一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，雌蕊的消毒程序如下：把雌蕊置于超净工作台上，先用75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗1次；再用0.1%氯化汞水溶液浸泡15min，期间每隔3min 摇晃1次，最后以无菌水冲洗4次。
3.根据权利要求1所述的一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，诱导培养基的成分为：KNO3 2680-2960mg/L，（NH4）2SO4 750-950mg/L， KH2PO4 340-420mg/L，CaCl2·2H2O 110-160mg/L，MgSO4·7H2O 175-225mg/L，MnSO4·4H2O 5.3-8.5mg/L，ZnSO4·7H2O 1.0-2.0mg/L，H3BO3 2.5-3.5mg/L，KI 0.7-0.8mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.2-0.3mg/L，CuSO4·5H2O 0.05-0.06mg/L，CoCl2·6H2O 0.02-0.03mg/L，乳酸亚铁29.7-32.1mg/L ，肌醇90-110mg/L，甘氨酸1.5-2.5mg/L，丝氨酸0.5-1.5mg/L，苏氨酸0.5-1.5mg/L，半胱氨酸4.0-6.0mg/L，丙氨酸4.0-6.0mg/L，维生素B1 0.8-1.2mg/L，维生素B6 0.4-0.6mg/L，烟酸1.0-1.4mg/L，叶酸4.0-6.0mg/L，泛酸钙0.5-0.9mg/L，6-BA0.8-1.2mg/L，NAA0.4-0.6mg/L，TDZ 0.04-0.06mg/L，2-氨基腺嘌呤1.8-2.2mg/L，二苯基脲磺酸钙1.0-2.0mg/L，茶多酚11-15mg/L，椰汁30-70ml/L，蔗糖30-50g/L，琼脂6-8g/L，pH为5.6-6.0。
4.根据权利要求1所述的一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，光照条件为：光照强度1000~2000lx，光周期15~17h/d。
5.根据权利要求1所述的一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，分化培养基的成分为：MS+NAA 0.5mg/L+ 6-BA 0.5mg/L + KT2.0mg/L +AgNO3 2.0mg/L +蔗糖 30g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.8。
6.根据权利要求1所述的一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，生根培养基的成分为：1/2MS+NAA0.6mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.8。
7.根据权利要求1所述的一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，生根的培养条件为：温度24~26℃，光照强度2500~3500lx，光周期13~15h/d。
8.根据权利要求1所述的一种通过梨未受精胚珠离体培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，移栽的方法为；将植株从瓶内取出，洗净附着在表面的培养基，移栽到装有蛭石的育苗钵中，温度保持在25~30℃，湿度保持在70~80%，约20d后移栽到大田。
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