CN109122319A - 一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，属于生物技术和农业科学领域。本发明的技术路线包括以下步骤：（1）新鲜花蕾的选取；（2）无菌花药的获得与接种；（3）花药辐射处理；（4）花药诱导培养；（5）愈伤组织分化培养；（6）健苗生根培养。本发明首次通过花药离体培养得到了高丛蓝莓单倍体植株，为进一步开展蓝莓的单倍体育种和相关理论研究提供了技术基础和实验材料。

Description

一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法
技术领域
本发明涉及一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，属于生物技术和农业科学领域。
背景技术
蓝莓（Vaccinium Spp）又名笃斯，为杜鹃花科越桔属多年生灌木，因果实呈蓝色，故称为蓝莓。野生蓝莓原产于北美洲，广泛分布于北半球，在我国主要分布在长白山区、大小兴安岭以及西南山区，长江流域有少量分布。现在市场上的蓝莓均为人工培育的栽培品种，其中以美国产的蓝莓品质最优。蓝莓果味酸甜，果实上有一层白色果粉，果肉细腻，甜酸适口，风味独特，营养丰富，被誉为“浆果之王”。研究表明，蓝莓具有很高的营养价值和保健功能。蓝莓鲜果富含蛋白质、不饱和脂肪酸、纤维素、维生素、微量元素和有机酸，能为人体提供丰富的营养元素。蓝莓果中还含有多种生物活性物质，例如花色素苷、类黄酮化合物等，其中花色素苷具有活化和促进视红素的再合成、抗炎症、提高免疫力、抗心血管疾病、抗氧化防衰老、抗癌等多种生理保健功能，因此，联合国粮农组织将蓝莓列为人类五大健康食品之一。此外蓝莓果实可以直接加工成果酱、果冻、果糕和饼馅等，蓝莓提取物可以作为天然色素、保健食品、高级化妆品的原料，因此蓝莓也被誉为21世纪前叶最具有发展潜力的果树树种。
当前栽培的蓝莓品种主要有高丛蓝莓、低丛蓝莓和兔眼蓝莓3大类群，其中高丛蓝莓又分为南高丛蓝莓、北高丛蓝莓及半高型高丛蓝莓3种。高丛蓝莓具有果实大、含糖量高、果色深、鲜食风味佳的优点，深受人们的喜爱。在国际市场上，蓝莓鲜果的售价居高不下，并且供不应求；蓝莓在食品加工和工业用途等方面也具较好的发展前景，因此发展蓝莓产业能带来极大的经济效益。
我国的蓝莓产业尚处于起步阶段，目前全国栽培的品种均引自欧美、日本等国，尚无具有自主知识产权的当家品种。然而我国具有较丰富的野生蓝莓资源，这些野生品种虽然产量低，但往往具有抗旱、抗寒、抗病等优良特性，可以用来改良现有的栽培品种，从而培育出适应我国气候环境、长势较为强健的优质高产品种，必将有力推动我国蓝莓的品种创制和长远发展。
常规杂交育种是蓝莓育种的主要方式，但其纯化材料周期长、见效慢，不能切实的满足生产上对优良品种的迫切需求。单倍体育种是现代生物技术育种手段之一，在育种上可以利用F1代杂交种花药、花粉或未受精的子房，通过离体培养获得单倍体材料经染色体加倍产生双单倍体，双单倍体（DH）具有完全纯合同质的特性并且是标准的自交系，因此通过单倍体育种不仅可以克服杂种性状的分离缩短育种年限，而且可以快速培育自交系，从而大大加快育种的进程。
花药离体培养是人工诱导单倍体的最常用手段，也是单倍体育种的物质基础。然而目前国内关于诱导蓝莓花药获得单倍体的专利还未见报道，相关的文献也很少，这说明蓝莓花药培养在实践过程中仍然存在诸多问题。花药培养能否成功在很大程度上依赖于物种基因型，表现为在离体培养过程中出现不同的愈伤组织诱导率、分化率、再生植株诱导率等。另一方面，除基因型外，花药培养还要受到预处理方式、培养基微环境、离体培养大环境等一系列外部因素的影响，这些影响因子彼此之间相对独立，因此只有在所有影响因子都处于合适范围内，才有可能获得成功。本研究团队以高丛蓝莓为材料，对花药培养的一些典型影响因素做了一系列的研究，初步建立了蓝莓花药培养再生体系，并获得了蓝莓再生单倍体植株，为以后蓝莓单倍体育种提供了纯系材料和储备技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，可以有效的在短期内获得高丛蓝莓单倍体植株，后期再通过染色体加倍即可获得纯系DH植株，为高丛蓝莓的品种改良和新品种培育提供亲本材料。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）新鲜花蕾的选取
在蓝莓盛花期于晴天上午9:00-11:00取材，采集健壮植株上的花蕾，用湿纱布包裹放入密封容器中带回实验室，筛选出小孢子处于单核中晚期的花蕾；
（2）无菌花药的获得与接种
将上述花蕾先用洗洁精清洗干净，在自来水下冲洗10-20min；然后置于超净工作台上，用75%乙醇浸泡30s，再用0.1%升汞溶液消毒10-15min，边消毒边摇晃；倒去升汞溶液后，用无菌水冲洗4-5次；用解剖针剥将花药完整剥离取出，切去花丝，接种在诱导培养基上，每瓶培养基接种30-40个花药；
所述诱导培养基的配方为：K2SO4 740~880mg/L，NH4NO3 533~595mg/L，MgSO4·7H2O 406~438mg/L，KH2PO4 104~122mg/L，Ca(H2PO4)2·H2O 487~503mg/L，MnSO4·4H2O 21~22mg/L，ZnSO4·7H2O 5.2~5.8mg/L，H3BO3 6.3~6.5mg/L， Na2MoO4·2H2O 0.21~0.23mg/L，CoCl2·6H2O 0.023~0.025mg/L，CuSO4·5H2O 0.18~0.22mg/L，Fe-Na2EDTA 32.8~34.4mg/L，肌醇107~115mg/L，烟酸1.2~1.6mg/L，甘氨酸1.7~2.5 mg/L，脯氨酸4.4~5.0 mg/L，牛肉浸膏24~30mg/L，盐酸硫胺素0.7~0.9mg/L，盐酸吡哆醇0.4~0.6mg/L，泛酸1.1~1.3mg/L，2-氨基嘌呤0.37~0.41mg/L，丁酰肼0.03~0.05mg/L，水溶性碳纳米管53~63mg/L，四甲基戊二酸0.6~1.0mg/L，番茄汁26~32mL/L，芸苔素内酯0.1~0.3mg/L，海藻提取液42~50mL/L，蔗糖11~15g/L，葡萄糖7~11g/L，黄原胶3~5g/L，pH值为5.0~5.4；
（3）花药辐射处理
将上述花药先置于28-30℃黑暗条件下培养3d，再用60Co-γ射线进行照射，得到辐射处理后的花药；
（4）花药诱导培养
将辐射处理后的花药置于温度24-26℃、光照强度600-800Lx、光照时间5-7h/d的培养条件下培养35-45d，花药可形成愈伤组织；
（5）愈伤组织分化培养
当愈伤组织大小长至2-3mm 时，及时转移至分化培养基上，培养14-21d后愈伤组织开始转绿，之后每20d左右继代1次，继代2次后愈伤组织分化出不定芽；培养条件控制为温度24-26℃，光照强度1000-1500Lx，光照时间10-12h/d；
（6）健苗生根培养
待步骤（5）中的不定芽长成1-2 cm高的芽苗时，将芽苗剪切成单苗，竖接于生根培养液中，使其基部与培养液接触，培养24-33d可形成根系发育旺盛的完整植株；培养条件控制为温度23-27℃、光照强度2000-2500 Lx，光照时间14-18h/d。
所述步骤（1）中筛选花蕾的方法为镜检法，具体操作方法为先将采集的花蕾进行标记，然后挑取花蕾中的花药2~4枚，置于载玻片上碾碎，释放出花粉，用醋酸洋红染色后压片，将载玻片置于显微镜下观察花粉发育时期，筛选出花粉小孢子处于单核靠边期的花蕾。
所述步骤（3）中60Co-γ射线的照射剂量为100 R 、剂量率为25.6 R/min。
所述步骤（2）中诱导培养基的最优配方为：K2SO4 800mg/L，NH4NO3 564mg/L，MgSO4·7H2O 422mg/L，KH2PO4 113mg/L，Ca(H2PO4)2·H2O 495mg/L，MnSO4·4H2O 21.5mg/L，ZnSO4·7H2O 5.5mg/L，H3BO3 6.4mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.22mg/L，CoCl2·6H2O 0.024mg/L，CuSO4·5H2O 0.20mg/L，Fe-Na2EDTA 33.6mg/L，K2Cr2O7 0.019mg/L，肌醇111mg/L，烟酸1.4mg/L，甘氨酸2.1 mg/L，脯氨酸4.7mg/L，牛肉浸膏27mg/L，盐酸硫胺素0.8mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，泛酸1.2mg/L，2-氨基嘌呤0.39mg/L，丁酰肼0.04mg/L，水溶性碳纳米管58mg/L，四甲基戊二酸0.8mg/L，番茄汁29mL/L，芸苔素内酯0.2mg/L，海藻提取液46mL/L，蔗糖13g/L，葡萄糖9g/L，黄原胶4g/L，pH值为5.2。
所述步骤（5）中分化培养基的配方为：WPM+脯氨酸9.5~10.5mg/L+2-氨基嘌呤0.33~0.39mg/L+TIBA(2,3,5-三碘苯甲酸)0.5~0.7mg/L+复硝酚钠0.15~0.20 mg/L+甘露醇22~27g/L+番茄汁39~45mL/L+活性炭0.4~0.6 g/L，pH值为5.0~5.4。
所述步骤（5）中生根培养液的配方为：1/2WPM（不添加琼脂和蔗糖）+聚蔗糖23~30g/L+微囊藻素30~37mg/L+4-碘苯氧乙酸 0.4~0.6mg/L+环己酮酸钙0.3~0.5mg/L+硅藻土0.32~0.38g/L+苹果汁36~44mL/L+丙三醇13.5~15.5mg/L，pH值为5.0~5.4。
所述诱导培养基配方中的海藻提取液为青岛蓝贝力海藻工业有限公司生产的产品。
本发明与已有技术相比具有如下有益效果：
1、本发明对高丛蓝莓花药进行辐射预处理，并切摸索出了适用于蓝莓花药培养的诱导培养基和分化培养基以及相应的培养条件，显著提高了愈伤组织的诱导率和不定芽分化率，从而综合提高了花药培养效率。
2、本发明成功地建立了一个有效的高丛蓝莓花药离体培养再生体系，并且获得了一定比例的单倍体植株，为越桔属植物花药培养提供了一个可参照的技术和方法，具有重要的实用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
2015年，以山东泰安航远苗木种植中心栽培的高丛蓝莓品种‘蓝丰’、‘布里吉塔’、‘美登’作为供试材料进行试验，包括以下操作步骤：
（1）新鲜花蕾的选取
4-5月为蓝莓盛花期，选择晴天上午9:00-11:00取材，采集健壮植株上的花蕾，用湿纱布包裹放入密封容器中带回实验室，先将采集的花蕾进行标记，然后挑取花蕾中的花药2~4枚，置于载玻片上碾碎，释放出花粉，用醋酸洋红染色后压片，将载玻片置于显微镜下观察花粉发育时期，筛选出花粉小孢子处于单核中晚期的花蕾。
（2）无菌花药的获得与接种
将上述花蕾先用洗洁精清洗干净，在自来水下冲洗10-20min；然后置于超净工作台上，用75%乙醇浸泡30s，再用0.1%升汞溶液消毒10-15min，边消毒边摇晃；倒去升汞溶液后，用无菌水冲洗4-5次；用解剖针剥将花药完整剥离取出，切去花丝，接种在诱导培养基上，每瓶培养基接种30-40个花药；
使用的诱导培养基的配方为：K2SO4 800mg/L，NH4NO3 564mg/L，MgSO4·7H2O 422mg/L，KH2PO4 113mg/L，Ca(H2PO4)2·H2O 495mg/L，MnSO4·4H2O 21.5mg/L，ZnSO4·7H2O 5.5mg/L，H3BO3 6.4mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.22mg/L，CoCl2·6H2O 0.024mg/L，CuSO4·5H2O 0.20mg/L，Fe-Na2EDTA 33.6mg/L，K2Cr2O7 0.019mg/L，肌醇111mg/L，烟酸1.4mg/L，甘氨酸2.1 mg/L，脯氨酸4.7mg/L，牛肉浸膏27mg/L，盐酸硫胺素0.8mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，泛酸1.2mg/L，2-氨基嘌呤0.39mg/L，丁酰肼0.04mg/L，水溶性碳纳米管58mg/L，四甲基戊二酸0.8mg/L，番茄汁29mL/L，芸苔素内酯0.2mg/L，海藻提取液46mL/L，蔗糖13g/L，葡萄糖9g/L，黄原胶4g/L，pH值为5.2；其中海藻提取液为青岛蓝贝力海藻工业有限公司生产的产品。
（3）花药辐射处理
将上述花药先置于28-30℃黑暗条件下培养3d，再用照射剂量为100 R 、剂量率为25.6R/min的60Co-γ射线进行照射（由山东省农科院原子能所协助），得到辐射处理后的花药。
（4）花药诱导培养
将辐射处理后的花药置于温度25℃、光照强度700Lx、光照时间6h/d的培养条件下培养35-45d，花药形成愈伤组织；此时统计花药愈伤组织诱导率 (形成愈伤组织花药数/接种花药数×100%)。
（5）愈伤组织分化培养
当愈伤组织大小长至2-3mm 时，及时转移至分化培养基上，培养14-21d后愈伤组织开始转绿，之后每20d左右继代1次，继代2次后愈伤组织分化出不定芽；此时统计不定芽分化率(分化出不定芽的愈伤组织数/转移愈伤组织数×100%)；培养条件控制为温度25℃，光照强度1300Lx，光照时间12h/d；使用的分化培养基的配方为：WPM+脯氨酸10.0mg/L+2-氨基嘌呤0.35mg/L+TIBA(2,3,5-三碘苯甲酸)0.6mg/L+复硝酚钠0.18mg/L+甘露醇24.5g/L+番茄汁42mL/L+活性炭0.5g/L，pH值为5.2。
（6）健苗生根培养
待步骤（5）中的不定芽长成1-2 cm高的芽苗时，将芽苗剪切成单苗，竖接于生根培养液中，生根培养液的配方为1/2WPM（不添加琼脂和蔗糖）+聚蔗糖26.5g/L+微囊藻素33.5mg/L+4-碘苯氧乙酸 0.5mg/L+环己酮酸钙0.4mg/L+硅藻土0.35g/L+苹果汁40mL/L+丙三醇14.5mg/L，pH值为5.2，使其基部与培养液接触，培养24-33d可形成根系发育旺盛的完整植株；培养条件控制为温度25℃、光照强度2200 Lx，光照时间16h/d。
实施例2
2015年，同样以山东泰安航远苗木种植中心栽培的高丛蓝莓品种‘蓝丰’、‘布里吉塔’、‘美登’作为供试材料进行试验，操作步骤和培养方法与实施例1相同，其中步骤（2）-（4）中使用的诱导培养基配方为WPM+6-BA0.5mg/L+2,4-D1.0 mg/L，pH值为5.5；步骤（5）中使用的分化培养基配方为WPM+6-BA0.5mg/L+NAA0.25mg/L，pH值为5.2；统计花药愈伤组织诱导率和不定芽分化率；本实施例使用的培养基配方均来源于文献《越橘离体培养倍性育种研究》。
一、结果统计
1）分别将实施例1、2中3个高丛蓝莓品种的愈伤组织诱导率和不定芽分化率统计如下表1。
二、再生植株倍性鉴定
将实施例1获得的3个高丛蓝莓品种的再生植株进行倍性鉴定。鉴定方法为：取3个品种的亲本植株作为对照，花培再生植株为待测植株，分别取对照植株和待测植株的新鲜叶片各 0.2g置于培养皿中，分别加入2ml裂解液，用锋利的刀片切碎、100目细胞筛网过滤，收集滤液，经800r/min离心6min后，弃掉上清液，再分别加入200μLPI（碘化丙啶，50μg/ml）染液对细胞核 DNA 进行荧光标记，置于黑暗条件下20min后，用流式细胞仪（美国BD公司）进行植株倍性鉴定，将鉴定结果统计如下表2。
由表1可以看出，采用实施例1即本发明的方法，可以有效地诱导高丛蓝莓花药分化和再生，3个品种的愈伤组织诱导率和不定芽分化率均显著高于实施例2；由表2可以看出，采用本发明的方法可以成功诱导出高丛蓝莓的单倍体植株，并且单倍体植株的再生频率达到了一个较高水平，为今后利用单倍体技术来进行蓝莓的品种改良和新品种选育提供有力手段。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）新鲜花蕾的选取
在蓝莓盛花期于晴天上午9:00-11:00取材，采集健壮植株上的花蕾，用湿纱布包裹放入密封容器中带回实验室，筛选出小孢子处于单核中晚期的花蕾；
（2）无菌花药的获得与接种
将上述花蕾先用洗洁精清洗干净，在自来水下冲洗10-20min；然后置于超净工作台上，用75%乙醇浸泡30s，再用0.1%升汞溶液消毒10-15min，边消毒边摇晃；倒去升汞溶液后，用无菌水冲洗4-5次；用解剖针剥将花药完整剥离取出，切去花丝，接种在诱导培养基上，每瓶培养基接种30-40个花药；
所述诱导培养基的配方为：K2SO4 740~880mg/L，NH4NO3 533~595mg/L，MgSO4·7H2O 406~438mg/L，KH2PO4 104~122mg/L，Ca(H2PO4)2·H2O 487~503mg/L，MnSO4·4H2O 21~22mg/L，ZnSO4·7H2O 5.2~5.8mg/L，H3BO3 6.3~6.5mg/L， Na2MoO4·2H2O 0.21~0.23mg/L，CoCl2·6H2O 0.023~0.025mg/L，CuSO4·5H2O 0.18~0.22mg/L，Fe-Na2EDTA 32.8~34.4mg/L，肌醇107~115mg/L，烟酸1.2~1.6mg/L，甘氨酸1.7~2.5 mg/L，脯氨酸4.4~5.0 mg/L，牛肉浸膏24~30mg/L，盐酸硫胺素0.7~0.9mg/L，盐酸吡哆醇0.4~0.6mg/L，泛酸1.1~1.3mg/L，2-氨基嘌呤0.37~0.41mg/L，丁酰肼0.03~0.05mg/L，水溶性碳纳米管53~63mg/L，四甲基戊二酸0.6~1.0mg/L，番茄汁26~32mL/L，芸苔素内酯0.1~0.3mg/L，海藻提取液42~50mL/L，蔗糖11~15g/L，葡萄糖7~11g/L，黄原胶3~5g/L，pH值为5.0~5.4；
（3）花药辐射处理
将上述花药先置于28-30℃黑暗条件下培养3d，再用60Co-γ射线进行照射，得到辐射处理后的花药；
（4）花药诱导培养
将辐射处理后的花药置于温度24-26℃、光照强度600-800Lx、光照时间5-7h/d的培养条件下培养35-45d，花药可形成愈伤组织；
（5）愈伤组织分化培养
当愈伤组织大小长至2-3mm 时，及时转移至分化培养基上，培养14-21d后愈伤组织开始转绿，之后每20d左右继代1次，继代2次后愈伤组织分化出不定芽；培养条件控制为温度24-26℃，光照强度1000-1500Lx，光照时间10-12h/d；
（6）健苗生根培养
待步骤（5）中的不定芽长成1-2 cm高的芽苗时，将芽苗剪切成单苗，竖接于生根培养液中，使其基部与培养液接触，培养24-33d可形成根系发育旺盛的完整植株；培养条件控制为温度23-27℃、光照强度2000-2500 Lx，光照时间14-18h/d。
2.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（1）中筛选花蕾的方法为镜检法，具体操作方法为先将采集的花蕾进行标记，然后挑取花蕾中的花药2~4枚，置于载玻片上碾碎，释放出花粉，用醋酸洋红染色后压片，将载玻片置于显微镜下观察花粉发育时期，筛选出花粉小孢子处于单核靠边期的花蕾。
3.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（3）中60Co-γ射线的照射剂量为100 R 、剂量率为25.6 R/min。
4.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（2）中诱导培养基的最优配方为：K2SO4 800mg/L，NH4NO3 564mg/L，MgSO4·7H2O422mg/L，KH2PO4 113mg/L，Ca(H2PO4)2·H2O 495mg/L，MnSO4·4H2O 21.5mg/L，ZnSO4·7H2O5.5mg/L，H3BO3 6.4mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.22mg/L，CoCl2·6H2O 0.024mg/L，CuSO4·5H2O0.20mg/L，Fe-Na2EDTA 33.6mg/L，K2Cr2O7 0.019mg/L，肌醇111mg/L，烟酸1.4mg/L，甘氨酸2.1 mg/L，脯氨酸4.7mg/L，牛肉浸膏27mg/L，盐酸硫胺素0.8mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，泛酸1.2mg/L，2-氨基嘌呤0.39mg/L，丁酰肼0.04mg/L，水溶性碳纳米管58mg/L，四甲基戊二酸0.8mg/L，番茄汁29mL/L，芸苔素内酯0.2mg/L，海藻提取液46mL/L，蔗糖13g/L，葡萄糖9g/L，黄原胶4g/L，pH值为5.2。
5.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（5）中分化培养基的配方为：WPM+脯氨酸9.5~10.5mg/L+2-氨基嘌呤0.33~0.39mg/L+TIBA(2,3,5-三碘苯甲酸)0.5~0.7mg/L+复硝酚钠0.15~0.20 mg/L+甘露醇22~27g/L+番茄汁39~45mL/L+活性炭0.4~0.6 g/L，pH值为5.0~5.4。
6.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（5）中生根培养液的配方为：1/2WPM（不添加琼脂和蔗糖）+聚蔗糖23~30g/L+微囊藻素30~37mg/L+4-碘苯氧乙酸 0.4~0.6mg/L+环己酮酸钙0.3~0.5mg/L+硅藻土0.32~0.38g/L+苹果汁36~44mL/L+丙三醇13.5~15.5mg/L，pH值为5.0~5.4。
7.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述诱导培养基配方中的海藻提取液为青岛蓝贝力海藻工业有限公司生产的产品。
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