CN110192526A - 一种蓝莓单倍体的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于果树生物技术领域，公开了蓝莓单倍体的培养方法。本发明以蓝莓品种“顶级”为研究材料，研究不同的花蕾预处理方式、愈伤组织诱导启动培养基和保持培养基以及不定芽和不定根诱导培养基对蓝莓花药愈伤组织诱导和分化效率的影响，并采用染色体计数法鉴定再生植株的倍数，最终建立起具有体系稳定、诱导效率高、环境友好等优点的蓝莓优良品种“顶级”的单倍体培养的技术体系，为蓝莓单倍体育种奠定基础。

Description

一种蓝莓单倍体的培养方法
技术领域
本发明属于果树生物技术领域，本发明特别涉及一种蓝莓单倍体的培养方法。
背景技术
果树单倍体育种在理论与实际应用中具有非常重要的意义。首先，果树单倍体育种材料可用来探讨原始亲本的染色体组成以及物种的进化过程，通过果树单倍体减数分裂的特征，例如形成二价体的可能性及其数目和形状，可以说明有无同源染色体及染色体组的可能；通过对果树单倍体减数分裂联会情况的分析，能够追踪各个染色体组之间的同源关系，并由此对物种之间的进化和亲缘关系进行研究。其次，果树单倍体材料中，每一种基因相对而言都是单一的，无论是显性拟或隐性，都能发挥各自的作用，故果树单倍体材料是研究基因与性状表达相互关系的理想材料。因此，世界各国非常重视果树单倍体的育种，并由此培育出一些优良的果树单倍体品种(或品系)。
蓝莓(Blueberry)是广泛种植的越桔属(Vaccinium ssp.)植物之一。大多数的蓝莓是多年生的落叶灌木，也有非常少量的常绿灌木，适合生长在疏松的酸性土壤环境中。蓝莓果实甜酸适口，还散发特有的清香，受到国内外水果爱好者的追捧。蓝莓果实还含有大量的维生素A、C、E、花青苷等生化物质，具有非常好的抗氧化、抗菌及净化效果，广泛应用于人类生活。
目前，我国关于蓝莓的研究主要集中在资源调查、栽培生产、结果习性、生长环境分析以及生态研究等方面，有关蓝莓品种培育尤其是单倍体培育的研究还很少，这将严重影响我国蓝莓产业今后的发展。
参考文献
[1]邓秀新,章文才,1987，柑橘花药培养研究.浙江柑橘,(1):11-12.
[2]费开伟,薛光荣,1981,“元帅”苹果花培单倍体植株的诱导,中国农业科学,14(4):41-44,98.
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[7]Bueno M.A.,Pintos B.,Prado M.J.,and Manzanera J.A.,2004,Androgenesis:a tool for woody plant breeding,Recent Res.Devel.Genet.Breed.,1:365-383.
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发明内容
为弥补现有技术的空白，本发明提供一种蓝莓单倍体的培养方法，本发明以蓝莓品种“顶级”为研究材料，研究不同的花蕾预处理方式、愈伤组织诱导启动培养基和保持培养基以及不定芽和不定根诱导培养基对蓝莓花药愈伤组织诱导和分化效率的影响，并采用染色体计数法鉴定再生植株的倍数，最终建立起具有体系稳定、诱导效率高、环境友好等优点的蓝莓优良品种“顶级”的单倍体培养的技术体系，为蓝莓单倍体育种奠定基础。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种蓝莓单倍体的培养方法，包括以下步骤：
S1.花蕾预处理；
S2.花药消毒与接种培养；
在超净工作台上，吸收预处理后花蕾表面的水分，转入灭菌剂中摇床振荡处理，再用无菌水冲洗、吸干表面水分后，将花药迅速接种于愈伤诱导培养基中；所述的灭菌剂由新鲜艾蒿叶片10～20g、新鲜芦荟叶片10～20g、新鲜洋葱10～20g，粉碎后加入茶树油10～20ml，用蒸馏水定容至500～1000ml，静置浸提12～24h后，滤液即得灭菌剂；培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％；
S3.愈伤组织诱导启动培养；
在愈伤组织诱导培养时，首先进行愈伤组织诱导的启动培养，启动培养的培养基为：MS+IAA 1.5～3.5mg/L+6-BA 1.5～3.5mg/L+2,4-D 1.5～3.5mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖+甘油15～35mL/L+次硫酸钠1.5～3.5g/L+皂土1.5～3.5g/L，pH5.6～5.8，启动阶段的时间为：0-48h，且为暗培养；培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
S4.愈伤组织诱导保持培养；
在启动培养之后，进行愈伤组织诱导的保持培养，愈伤组织诱导保持培养基组成为：MS+6-BA 0.2～2.0mg/L+2,4-D 1.0～3.0mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH5.6～5.8，诱导保持时间为30-40天，为暗培养；培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
S5.不定芽诱导培养；
不定芽的诱导培养基组成为：MS+6-BA0.5～3.0mg/L+2ip 0.5～3.0mg/L+IAA 0.1～0.5mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH5.6～5.8；培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％；
所述2ip为2-异戊烯基腺嘌呤；
S6.不定根诱导培养；
不定根的诱导培养基组成为：MS+IAA1.0～3.0mg/L+2ip 0.1～0.3mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH 5.6～5.8；培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％；
S7.组培苗的倍性鉴定。生根培养后取茎尖或根尖进行染色体数目鉴定。染色体鉴定步骤：当茎尖或根尖长至1-2cm时取材，洗净。卡诺氏固定液I低温4℃固定24h，用0.002mol/L 8-羟基喹啉在4℃下预处理24h，再用1mol/L HCl(60℃)恒温解离5min，最后在卡宝液中压片染色30min，观察，照相。
优选的，愈伤组织诱导启动培养基组成为：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。
优选的，所述蓝莓的品种名称为顶级。
优选的，愈伤组织诱导保持培养基组成为：MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。
优选的，不定芽的诱导培养基：MS+6-BA 2.0mg/L+2ip 2.0mg/L+IAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。
优选的，不定根的诱导培养基：MS+IAA 2.0mg/L+2ip 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。
所述步骤S1中花蕾预处理的最佳方式为：将花蕾先用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗3次再放入铺有湿润滤纸的培养皿中，期间喷水始终保持外植体表面及滤纸湿润同时避免培养皿的底部积水，于4℃冰箱中放置3天。
所述步骤S2中花药消毒与接种培养最佳方式为：在超净工作台上，先用无菌滤纸吸干预处理花蕾表面的水分，用70％酒精灭菌30s，用无菌水冲洗3次，然后转入灭菌剂中摇床振荡处理10min，所述摇床振荡处理条件为28℃，180r/min；再用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，接种时用小弯钩镊剥取花药，将花药迅速接种于愈伤诱导培养基中。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
1.本发明首次建立的优质蓝莓品种“顶级”单倍体培养的技术体系稳定性好；品种资源新颖。
2.本发明采用艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油等混合溶液作为外植体灭菌剂，灭菌率最高可达到100％，与传统的外植体灭菌方法相比无毒副作用，属于环境友好型灭菌剂；
3.本发明花药愈伤组织诱导时，采用了诱导启动培养和诱导保持培养，并在诱导启动培养基中加入四种试剂，即麦芽糖、甘油、次硫酸钠和皂土，其中麦芽糖，不仅作为碳源，还可以调节培养基的渗透压；甘油作为一种扩散剂和渗透剂，促进培养基中的激素等成分向外植体的扩散和渗透，促进诱导效果，甘油还具有抗氧化的作用，应该能够防止外植体褐化，提高诱导效果；次硫酸钠作为一种抗氧化剂，能够防止外植体褐化，提高诱导效果；皂土作为一种化学稳定剂可使其他化学物质的作用稳定发挥，在培养基中加入皂土，会稳定发挥启动诱导的效果。加入上述四种试剂的培养基效果显著好于不加的以及其他种类的培养基。此外还有MS基本培养基、植物生长素和细胞分裂素，使得愈伤组织诱导的效果显著提高。另本发明为了更好地进行愈伤组织诱导培养，开始时进行了12h的启动培养，使得愈伤组织诱导的效果更好。
附图说明
图1为实施例1染色体计数鉴定图。
图2为实施例3染色体计数鉴定图。
图3为实施例4染色体计数鉴定图。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例1
S1.花蕾预处理的选用最佳处理方式为：
晴天上午9:00-10:00在健壮无病虫害植株上取发育良好的花蕾：镜检为单核靠边期，置于冰盒中带回实验室。将花蕾先用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗3次再放入铺有湿润滤纸的培养皿中，期间喷水始终保持外植体表面及滤纸湿润同时避免培养皿的底部积水，于4℃冰箱中放置3天。
S2.花药消毒与接种培养
在超净工作台上，先用无菌滤纸吸干预处理花蕾表面的水分，用70％酒精灭菌30S，用无菌水冲洗3次，然后转入灭菌剂中，摇床振荡(28℃，180r/min)处理10min，再用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分。接种时用小弯钩镊剥取花药(尽量去除花丝)迅速接种于愈伤诱导培养基中。
所述灭菌剂选用最佳组合为新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片20g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤，备用。
培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％。
S3.愈伤组织诱导启动培养
选用最佳的愈伤组织诱导启动培养基和时间为：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
S4.愈伤组织诱导保持培养
最佳愈伤组织诱导保持培养基：MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。诱导保持时间为30天，为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
S5.不定芽诱导培养
诱导不定芽的最佳培养基：MS+6-BA 2.0mg/L+2ip 2.0mg/L+IAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％。
S6.不定根诱导培养
最适合生根诱导的培养基：MS+IAA 2.0mg/L+2ip 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％。
S7.组培苗倍性鉴定：生根培养后进行染色体数目鉴定；染色体鉴定实验步骤：当茎尖或根尖长至1cm时取材，洗净。卡诺氏固定液I低温4℃固定24h，用0.002mol/L 8-羟基喹啉在4℃下预处理24h，再用1mol/L HCl(60℃)恒温解离5min，最后在卡宝液中压片染色30min，观察，照相。
实施例2
本实施例考察不同处理方式对组培苗倍性的影响。
本实施例仅步骤S1与实施例1存在区别。
S1.花蕾材料预处理：
晴天上午9:00-10:00在健壮无病虫害植株上取发育良好的花蕾(镜检为单核靠边期)，置于冰盒中带回实验室，采用以下7种方式对花蕾进行预处理，
第1种处理方式为：不经任何处理，直接将花药接种在培养基上；
第2种处理方式为：自然状态下将花蕾放入干燥的培养皿中于4℃冰箱中处理3天；
第3种处理方式为：自然状态下将花蕾放入干燥的培养皿中于4℃冰箱中处理5天；
第4种处理方式为：自然状态下将花蕾放入干燥的培养皿中于4℃冰箱中处理7天；
第5种处理方式为：将花蕾先用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗3次再放入铺有湿润滤纸的培养皿中，期间喷水始终保持外植体表面及滤纸湿润(注意：避免培养皿的底部积水)，于4℃冰箱中处理3天；
第6种处理方式为：将花蕾先用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗3次再放入铺有湿润滤纸的培养皿中，期间喷水始终保持外植体表面及滤纸湿润(注意：避免培养皿的底部积水)，于4℃冰箱中处理5天；
第7种处理方式为：将花蕾先用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗3次再放入铺有湿润滤纸的培养皿中，期间喷水始终保持外植体表面及滤纸湿润(注意：避免培养皿的底部积水)，于4℃冰箱中处理7天。
实验结果见表1.1。
表1.1不同预处理方式蓝莓品种“顶级”花药愈伤诱导率(％)
对表1.1的结果进行方差分析，结果见表1.2。
表1.2对表1.1结果的方差分析
由P值可知，各处理之间差异极显著。于是，对个处理之间进行差异显著性分析，结果见表1.3。
表1.3对表1.1结果的差异显著性分析表
差异显著性分析表明：花蕾预处理的方式以处理5，即“将花蕾先用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗3次再放入铺有湿润滤纸的培养皿中，期间喷水始终保持外植体表面及滤纸湿润(注意：避免培养皿的底部积水)，于4℃冰箱中处理3天”最好。
实施例3
S1.花蕾预处理；
晴天上午9:00-10:00在健壮无病虫害植株上取发育良好的花蕾(镜检为单核靠边期)，置于冰盒中带回实验室，自然状态下将花蕾放入干燥的培养皿中于4℃冰箱中保存3天。
S2.花药消毒与接种培养
在超净工作台上，先用无菌滤纸吸干预处理花蕾表面的水分，用70％酒精灭菌30S，用无菌水冲洗3次，然后转入灭菌剂中，摇床振荡(28℃，180r/min)处理10min，再用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分。接种时用小弯钩镊剥取花药(尽量去除花丝)迅速接种于愈伤诱导培养基中。
所述灭菌剂由艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油配制而成，具体配制方法：新鲜艾蒿叶片10g、新鲜芦荟叶片10g、新鲜洋葱10g粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提12h后，过滤，备用。
培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％。
S3.愈伤组织诱导启动培养
在愈伤组织诱导培养时，首先进行愈伤组织诱导的启动培养，愈伤组织诱导启动培养基为：MS+IAA 1.5mg/L+6-BA 1.5mg/L+2,4-D 1.5mg/L+0.5％琼脂+2％麦芽糖+甘油15mL/L+次硫酸钠1.5g/L+皂土1.5g/L，pH5.6。启动阶段的时间设置为：6h，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
S4.愈伤组织诱导保持培养
在启动培养之后，进行愈伤组织诱导的保持培养，愈伤组织诱导保持培养基为：MS+6-BA 0.2mg/L+2,4-D 1.0mg/L+0.5％琼脂+2％麦芽糖，pH5.6。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。诱导保持培养为35天，为暗培养。
S5.不定芽诱导培养
诱导不定芽的培养基为：MS+6-BA 0.5mg/L+2ip 0.5mg/L+IAA0.3mg/L+0.5％琼脂+2％麦芽糖，pH5.6。培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％。
S6.不定根诱导培养
诱导不定根的培养基为：MS+IAA 1.0mg/L+2ip 0.2mg/L+0.5％琼脂+2％麦芽糖，pH5.6。培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％。
S7.组培苗的倍性鉴定：生根培养后进行染色体数目鉴定；染色体鉴定实验步骤：当茎尖或根尖长至1cm时取材，洗净。卡诺氏固定液I低温4℃固定24h，用0.002mol/L 8-羟基喹啉在4℃下预处理24h，再用1mol/L HCl(60℃)恒温解离5min，最后在卡宝液中压片染色30min，观察，照相。
实施例4
S1.花蕾预处理；
试验材料的预处理晴天上午9:00-10:00在健壮无病虫害植株上取发育良好的花蕾(镜检为单核靠边期)，置于冰盒中带回实验室，自然状态下将花蕾放入干燥的培养皿中于4℃冰箱中保存7天。
S2.花药消毒与接种培养
在超净工作台上，先用无菌滤纸吸干预处理花蕾表面的水分，用70％酒精灭菌30S，用无菌水冲洗3次，然后转入灭菌剂中，摇床振荡(28℃，180r/min)处理10min，再用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分。接种时用小弯钩镊剥取花药(尽量去除花丝)迅速接种于愈伤诱导培养基中。
所述灭菌剂由艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油配制而成，具体配制方法：新鲜艾蒿叶片15g、新鲜芦荟叶片15g、新鲜洋葱15g粉碎后加入茶树油15ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提18h后，过滤，备用。
培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％。
S3.愈伤组织诱导启动培养
在愈伤组织诱导培养时，首先进行愈伤组织诱导的启动培养，愈伤组织诱导启动培养基为：MS+IAA 3.5mg/L+6-BA 3.5mg/L+2,4-D 3.5mg/L+0.7％琼脂+2％麦芽糖+甘油35mL/L+次硫酸钠3.5g/L+皂土3.5g/L，pH5.7。启动阶段的时间设置为：48h，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
S4.愈伤组织诱导保持培养
在启动培养之后，进行愈伤组织诱导的保持培养，愈伤组织诱导保持培养基为：MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 3.0mg/L+0.7％琼脂+2％麦芽糖，pH5.7。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。诱导保持培养为40天，为暗培养。
S5.不定芽诱导培养
诱导不定芽的培养基为：MS+6-BA 3.0mg/L+2ip 3.0mg/L+IAA0.5mg/L+0.7％琼脂+2％麦芽糖，pH5.7。培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％。
S6.不定根诱导培养
诱导不定根的培养基为：MS+IAA 3.0mg/L+2ip 0.3mg/L+0.7％琼脂+2％麦芽糖，pH5.7。培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％。
S7.组培苗的倍性鉴定：生根培养后进行染色体数目鉴定；染色体鉴定实验步骤：当茎尖或根尖长至2cm时取材，洗净。卡诺氏固定液I低温4℃固定24h，用0.002mol/L 8-羟基喹啉在4℃下预处理24h，再用1mol/L HCl(60℃)恒温解离5min，最后在卡宝液中压片染色30min，观察，照相。
一、灭菌剂效果实验数据
采用艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油等混合溶液作为外植体灭菌剂，灭菌率最高可达到100％实验数据：
以蓝莓花蕾为例
配方A：新鲜艾蒿叶片10g、新鲜芦荟叶片10g、新鲜洋葱10g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提12h的过滤液。浸泡外植体20min。
配方B：新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片5g、新鲜洋葱5g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h的过滤液。浸泡外植体20min。
配方C：新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片20g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h的过滤液。浸泡外植体30min。
配方D：新鲜艾蒿叶片10g、新鲜芦荟叶片30g、新鲜洋葱10g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提12h的过滤液。浸泡外植体30min。
配方E：新鲜艾蒿叶片5g、新鲜芦荟叶片5g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提24h的过滤液。浸泡外植体30min。
每个配方每瓶接种10个花蕾，重复5次。计算无菌率。
实验结果如下表2.1-2.3所示：
表2.1外植体灭菌效果
表2.2外植体灭菌效果的方差分析
变异来源 自由度 平方和 均方 F值 F0.05 F0.01
处理间 4 5624.00 1406.00 43.94 2.87 4.43
误差 20 640.00 32.00
总变异 24 6264.00
表2.3外植体灭菌效果的差异显著性检验
从结果可以明显得到，本发明的灭菌技术方案：处理3(C)的灭菌效果极显著地由于其他配方。
二、灭菌剂具有协同作用实验数据
在实验中发现，艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油四种物质在一起时，对外植体的灭菌效果极显著地好于各自单独以及两两混合和三三混合的灭菌效果。这一结果实际上表明四者之间确实存在着协同作用，下面是实验结果。
在生长季，取蓝莓品种“顶级”的花蕾，自来水冲洗、擦干后，直接放入到以下各种灭菌剂中。
1号：艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油混合溶液(新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片20g、新鲜洋葱20g，粉碎后用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油20ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。
2号：艾蒿浸提液(新鲜艾蒿叶片80g，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。
3号：芦荟浸提液(新鲜芦荟叶片80g，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。
4号：洋葱浸提液(新鲜洋葱80g，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。
5号：茶树油水溶液(茶树油80ml，加蒸馏水定容至500ml，备用)。
6号：艾蒿和芦荟混合液(新鲜艾蒿和芦荟各40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。
7号：艾蒿和洋葱混合液(新鲜艾蒿和洋葱各40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。
8号：艾蒿和茶树油混合液(新鲜艾蒿40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油40ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。
9号：芦荟和洋葱混合液(新鲜芦荟和洋葱各40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。
10号：芦荟和茶树油混合液(新鲜芦荟40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油40ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。
11号：洋葱和茶树油混合液(新鲜洋葱40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油40ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。
12号：艾蒿、芦荟和洋葱混合液(新鲜艾蒿、芦荟和洋葱各26.67克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。
13号：艾蒿、芦荟和茶树油混合液(新鲜艾蒿和芦荟各26.67克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油26.67ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。
14号：芦荟、洋葱和茶树油混合液(新鲜芦荟和洋葱各26.67克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油26.67ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。
15号：艾蒿、洋葱和茶树油混合液(新鲜艾蒿和洋葱各26.67克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油26.67ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。
在上述15种浸提液中均浸泡20min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分，取花药接种到初代培养基上，每瓶接种20个花药，重复5次。观察、统计花药培养的无菌率。见下表3.1。
表3.1蓝莓品种“顶级”花蕾在不同灭菌剂中的灭菌效果(无菌率)
对表3.1进行方差分析(见表3.2)，结果表明，处理间存在着极显著差异，于是进行处理间差异显著性检验，见表3.3。
表3.2灭菌剂灭菌效果的方差分析
变异来源 自由度 平方和 均方 F值 F0.05 F0.01
处理间 14 16384.67 1170.33 108.03 1.86 2.39
误差 60 650.00 10.83
总变异 74 17034.67
表3.3灭菌剂灭菌效果差异显著性检验
由表3.3可以看出，处理1的灭菌效果极显著地好于其他处理，即：这四种物质在一起的时候，对外植体的灭菌效果极显著地好于各自单独以及两两混合和三三混合的灭菌效果。由于所有处理中试剂所用总量是相当的，如果这四种物质之间不存在明显的协同作用，处理1的灭菌效果不会极显著地好于其他处理。这一结果表明四者之间确实存在着协同作用。
三、培养基优选实验数据
(一)、愈伤组织诱导启动培养基的筛选
本研究设置5种启动阶段培养基(简称启动培养基)，即：
1.MS+IAA 1.5mg/L+6-BA 1.5mg/L+2,4-D 1.5mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8；
2.MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8；
3.MS+IAA 2.5mg/L+6-BA 2.5mg/L+2,4-D 2.5mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8；
4.MS+IAA 3.0mg/L+6-BA 3.0mg/L+2,4-D 3.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8；
5.MS+IAA 3.5mg/L+6-BA 3.5mg/L+2,4-D 3.5mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8。
启动阶段的时间设置为：0h、6h、12h、24h、36h、48h(编号依次为1、2、3、4、5、6)。实验共有30个处理组合(即11,12，…，16；21，22…，26；31，32…，36；41，42，…,46；51，52，…，56。说明：11中的前1代表培养基的序号，后1代表时间的编号，余者同此)，每个处理组合接种100个花药，每瓶接种20个花药，每个处理组合设置5次重复。实验结果如下：
表4.1启动培养对蓝莓品种‘顶级’花药愈伤组织诱导率的影响
注:不同的大写字母代表差异极显著(p<0.01)
Note:Different capital letters represent extremely significantdifferences(p<0.01)
由表4.1可知，最适愈伤组织诱导启动培养基为MS+IAA2.0mg/L+6-BA2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8。最适启动时间为12h。
(二)、愈伤组织诱导保持培养基的筛选
保持阶段培养基(简称保持培养基)设置为：
1.MS+6-BA 0.2mg/L+2,4-D 1.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖；
2.MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8；
3.MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8；
4.MS+6-BA 1.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8；
5.MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。
每种保持培养基配方接种100个花药，每瓶接种20个花药，每个处理设置5次重复。实验结果如下：
表4.2保持培养对蓝莓品种‘顶级’花药愈伤组织诱导率的影响
注:不同的大写字母代表差异极显著(p<0.01)
Note:Different capital letters represent extremely significantdifferences(p<0.01)
由表4.2可知，最适愈伤组织诱导保持培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。
(三)、不定芽诱导培养基的筛选
共设计了8种诱导不定芽的培养基，即：
1.MS+6-BA 0.5mg/L+2ip 0.5mg/L+IAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8；
2.MS+6-BA 0.5mg/L+2ip 0.5mg/L+IAA 0.2mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8；
3.MS+6-BA 1.0mg/L+2ip 1.0mg/L+IAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8；
4.MS+6-BA 1.0mg/L+2ip 1.0mg/L+IAA 0.2mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8；
5.MS+6-BA 2.0mg/L+2ip 2.0mg/L+IAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8；
6.MS+6-BA 3.0mg/L+2ip 3.0mg/L+IAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8；
7.MS+6-BA 2.0mg/L+2ip 2.0mg/L+IAA 0.2mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8；
8.MS+6-BA 3.0mg/L+2ip 3.0mg/L+IAA 0.2mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8；
每种培养基中接种10个愈伤组织，重复5次，经过不定芽的诱导后，统计不同培养基对诱导不定芽分化的影响(用分化率表示)。结果如下：
表4.3不同培养基对蓝莓品种‘顶级’诱导不定芽分化(％)的影响
注:不同的大写字母代表差异极显著(p<0.01)
Note:Different capital letters represent extremely significantdifferences(p<0.01)
由表4.3可知，最适不定芽诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+2ip 2.0mg/L+IAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。
(四)、不定根诱导培养基的筛选
共设计了10种诱导不定根的培养基，即：
1.MS+IAA 1.0mg/L+2ip 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8
2.MS+IAA 1.5mg/L+2ip 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8
3.MS+IAA 2.0mg/L+2ip 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8
4.MS+IAA 2.5mg/L+2ip 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8
5.MS+IAA 3.0mg/L+2ip 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8
6.MS+IAA 1.0mg/L+2ip 0.2mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8
7.MS+IAA 1.5mg/L+2ip 0.2mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8
8.MS+IAA 2.0mg/L+2ip 0.2mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8
9.MS+IAA 2.5mg/L+2ip 0.2mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8
10.MS+IAA 3.0mg/L+2ip 0.2mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8
每种培养基中接种10株无根苗，重复5次，经过不定根的诱导后，统计不定根的诱导情况。结果如下：
表4.4不同培养基对蓝莓品种‘顶级’不定根诱导的影响(生根率％)
注:不同的大写字母代表差异极显著(p<0.01)
Note:Different capital letters represent extremely significantdifferences(p<0.01)
由表4.4可知，最适生根培养基为MS+IAA 2.0mg/L+2ip 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。
四、麦芽糖、甘油、次硫酸钠和皂土四种物质具有协同作用实验数据
在实验中发现，麦芽糖、甘油、次硫酸钠和皂土这四种物质在一起时，对愈伤组织的诱导效果极显著地好于各自单独以及两两混合和三三混合的诱导效果。这一结果实际上表明四者之间确实存在着协同作用。
下面以最优的愈伤组织诱导启动培养基为例，说明四者的协同作用。
晴天上午9:00-10:00在健壮无病虫害植株上取发育良好的花蕾：镜检为单核靠边期，置于冰盒中带回实验室。将花蕾先用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗3次再放入铺有湿润滤纸的培养皿中，期间喷水始终保持外植体表面及滤纸湿润同时避免培养皿的底部积水，于4℃冰箱中放置3天。
在超净工作台上，先用无菌滤纸吸干预处理花蕾表面的水分，用70％酒精灭菌30S，用无菌水冲洗3次，然后转入灭菌剂中，摇床振荡(28℃，180r/min)处理10min，再用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分。接种时用小弯钩镊剥取花药(尽量去除花丝)迅速接种于愈伤诱导培养基中。
所述灭菌剂选用最佳组合为新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片20g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤，备用。
培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％。
将经过上述处理的外植体接种到以下愈伤组织诱导启动培养中，该实验用来考察在愈伤组织诱导启动培养基中加入如下四种物质，即：麦芽糖、甘油、次硫酸钠和皂土对愈伤组织诱导的效果。
1号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
2号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
3号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+甘油20mL/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
4号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+次硫酸钠2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
5号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+皂土2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
6号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
7号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+次硫酸钠2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
8号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+皂土2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
9号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
10号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+甘油20mL/L+皂土2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
11号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
12号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
13号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+甘油20mL/L+皂土2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
14号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
15号培养基：MS+IAA 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+0.7％琼脂+甘油20mL/L+次硫酸钠2g/L+皂土2g/L，pH5.8，启动时间为12小时，且为暗培养。培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％。
每种培养基接种100个花药，每瓶接种20个花药，即设置5次重复。通过后续培养，最后对愈伤组织诱导效果进行统计分析。结果见表5.1。
表5.1蓝莓品种“顶级”花药在15种愈伤组织诱导启动培养基中的诱导效果(％)
对表5.1的数据进行方差分析，结果见表5.2。
表5.2对表5.1数据的方差分析
变异来源 自由度 平方和 均方 F值 F0.05 F0.01
处理间 14 2864.67 204.62 23.16** 1.86 2.39
误差 60 530.00 8.83
总变异 74 3394.67
由表5.2可知，15种愈伤组织诱导启动培养基的诱导效果之间存在极显著差异，于是对它们的诱导效果进行差异显著性检验。结果见表5.3。
表5.3对表5.1数据的差异显著性检验
由表5.3可以看出，1号培养基的诱导效果极显著地好于其他培养基的，即：这四种物质(麦芽糖、甘油、次硫酸钠、皂土)在一起的时候，对愈伤组织的诱导效果极显著地好于各自单独以及两两搭配和三三搭配的诱导效果。这一结果表明四者之间确实存在着协同作用。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (8)

1.一种蓝莓单倍体的培养方法，其特征是，包括以下步骤：
S1.花蕾预处理；
S2.花药消毒与接种培养；
在超净工作台上，吸收预处理后花蕾表面的水分，转入灭菌剂中摇床振荡处理，再用无菌水冲洗、吸干表面水分后，将花药迅速接种于愈伤诱导培养基中；培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％；
S3.愈伤组织诱导启动培养；
在愈伤组织诱导培养时，首先进行愈伤组织诱导的启动培养，启动阶段的时间为：0-48h，为暗培养；培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％；
S4.愈伤组织诱导保持培养；
在启动培养之后，进行愈伤组织诱导的保持培养，诱导保持时间为30-40天，为暗培养；培养条件：培养温度为24～26℃，相对湿度为80～85％；
S5.不定芽诱导培养；
培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％；
S6.不定根诱导培养；
培养条件：培养温度为24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，相对湿度为80～85％；
S7.组培苗的倍性鉴定。
2.如权利要求1所述的一种蓝莓单倍体的培养方法，其特征是，所述步骤S1中花蕾预处理的方式为：将花蕾先用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗3次再放入铺有湿润滤纸的培养皿中，期间喷水始终保持外植体表面及滤纸湿润同时避免培养皿的底部积水，于4℃冰箱中放置3天。
3.如权利要求1所述的一种蓝莓单倍体的培养方法，其特征是，所述步骤S2中所述的灭菌剂由新鲜艾蒿叶片10～20g、新鲜芦荟叶片10～20g、新鲜洋葱10～20g，粉碎后加入茶树油10～20ml，用蒸馏水定容至500～1000ml，静置浸提12～24h后，滤液即得灭菌剂。
4.如权利要求1所述的一种蓝莓单倍体的培养方法，其特征是，所述步骤S2中花药消毒与接种培养方式为：在超净工作台上，先用无菌滤纸吸干预处理花蕾表面的水分，用70％酒精灭菌30s，用无菌水冲洗3次，然后转入灭菌剂中摇床振荡处理10min，所述摇床振荡处理条件为28℃，180r/min；再用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，接种时用小弯钩镊剥取花药，将花药迅速接种于愈伤诱导培养基中。
5.如权利要求1所述的一种蓝莓单倍体的培养方法，其特征是，所述步骤S3的启动培养的培养基为：MS+IAA 1.5～3.5mg/L+6-BA 1.5～3.5mg/L+2,4-D 1.5～3.5mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖+甘油15～35mL/L+次硫酸钠1.5～3.5g/L+皂土1.5～3.5g/L，pH5.6～5.8。
6.如权利要求1所述的一种蓝莓单倍体的培养方法，其特征是，所述步骤S4的愈伤组织诱导保持培养基组成为：MS+6-BA 0.2～2.0mg/L+2,4-D 1.0～3.0mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH5.6～5.8。
7.如权利要求1所述的一种蓝莓单倍体的培养方法，其特征是，所述步骤S5的不定芽的诱导培养基组成为：MS+6-BA 0.5～3.0mg/L+2ip 0.5～3.0mg/L+IAA 0.1～0.5mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH5.6～5.8；所述2ip为2-异戊烯基腺嘌呤。
8.如权利要求1所述的一种蓝莓单倍体的培养方法，其特征是，所述步骤S6的不定根的诱导培养基组成为：MS+IAA 1.0～3.0mg/L+2ip 0.1～0.3mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH 5.6～5.8。
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