DE10297827B4

DE10297827B4 - Verwendung von Phyllocladan-Diterpenoiden zur Förderung des Pflanzenwachstums und Abschwächung der wachstumshemmenden Wirkung von Allelochemikalien und Verfahren dazu

Info

Publication number: DE10297827B4
Application number: DE10297827T
Authority: DE
Inventors: Anil Kumar Singh; Guru Das Bagchi; Sarita Singh; Prem Dutt Dwivedi; Anil Kumar Gupta; Suman Preet Singh Khanuja
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2002-12-16
Filing date: 2002-12-16
Publication date: 2008-09-11
Anticipated expiration: 2022-12-17
Also published as: WO2004054363A1; CA2510132A1; AU2002348820B8; GB0512408D0; DE10297827T5; GB2411651A; GB2411651B; AU2002348820B2; CA2510132C; AU2002348820A1

Abstract

Verwendung von Phyllocladan-Diterpenoiden ausgewählt aus Calliterpenon, Calliterpenonmonoacetat, Calliterpenondiacetat, Isopropylidencalliterpenon und Trihydroxycalliterpenon als Pflanzenwachstumsförderer.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt pflanzenwachstumsfördernde Aktivitäten natürlicher, aktiver Pflanzeninhaltsstoffe bereit, wobei Calliterpenon und seine Derivate der Gruppe der Phyllocladan-Diterpenoide angehören. Diese Phytochemikalien und Derivate zeigen bemerkenswerte wachstumsfördernde Aktivitäten bei Pflanzenwurzeln und Trieben und fördern die Samenkeimung sowohl bei einkeimblättrigen als auch zweikeimblättrigen Pflanzen. Diese Phytomoleküle besitzen auch eine antagonistische Aktivität gegen Allelochemikalien mit einer das Pflanzenwachstum hemmenden Eigenschaft und können somit zur Abschwächung ihrer nachteiligen Wirkungen verwendet werden.
Hintergrund der Erfindung
Auxine und Gibberelline sind zwei Hauptklassen natürlicher Verbindungen, die gleichzeitig als Pflanzenwachstumsstimulatoren entdeckt worden. Neben diesen wurde auch von Zytokinen, Abszisinsäure, Ethylen und vielen anderen Verbindungen berichtet, daß sie das Pflanzenwachstum regulierende Eigenschaften aufweisen. Bisher sind mehr als 50 Gibberelline aus natürlichen Quellen entdeckt worden. Die wachstumsstimulierende Aktivität ist auch bei mehreren anderen Typen natürlicher Pflanzeninhaltsstoffe beobachtet worden. Von Kaurensäure und Steviol ist berichtet worden, daß sie natürlich vorkommende Verbindungen mit gibberellinähnlicher Aktivität sind (Srivastava HS. 1999. Elements of Biochemistry. Rastogi Publications, Shivagi Road Merrut. S. 245–246). Aus Helminthosporium sativum isolierte Helminthosporinsäure und aus Bohnensamen (Phaseolus-Art) isolierte Phaseolinsäure haben ebenfalls wachstumsfördernde Wirkungen gezeigt (Leopold A. C. und Kriedemann P. E., Plant Growth and Development, Tata McGraw Hill Publishing Company Ltd., New Dehli. 137–140. 1981).
In den letzten Jahren sind viele Veröffentlichungen und Patente erschienen, die sich mit den pflanzenwachstumsfördernden Eigenschaften natürlicher und synthetischer Verbindungen befassen. Wichtig davon sind Salicylsäure (HS Gehlot et al., Advances in Plant Physiologg, Bd. I, 273–289, 1998), Trioctanol (Ries et al., Science, 195: 1339, 1977) und andere Verbindungen, über die von Zeit zu Zeit berichtet wurde. Goyal R. et al. berichteten über drei oxygenierte Alantolide aus Inula racemosa (Phytochemistry 29 (7), 2341–2343, 1990). Drei Sesquiterpenoide, aus Saussurea lappa isoliertes Saussureal, Dehydrocostuslacton und Costunolid, haben ebenfalls wachstumsfördernde Aktivitäten gezeigt (I. P. Singh et al., Phytochemistry 31 (7) 2529–2531, 1992 & K. K. Talwar et al., Phytochemistry 31 (1) 336–338, 1992).
Unter den synthetischen Derivaten ist über viele Verbindungen wie Triazole als neuer Gruppe vielversprechender Pflanzenwachstumspromotoren berichtet worden (R. P. Raghava et al., Advances in Plant Physiology, Bd. I, 291–320, 1998). Von verschiedenen Derivaten organischer Säuren wurde berichtet, daß sie eine pflanzenwachstumsfördernde Aktivität aufweisen (z. B. offenbart das DE-Patent Nr. 1 916 054 A1 Verwendungen von α-Hydroxy und α-Ketoalkansäuren mit 7-10 Kohlenstoffatomen und ihrer Derivate; offenbart das US-Patent Nr. 3 148 049 A die pflanzenwachstumsfördernde Aktivität bestimmter halogenierter Ketosäuren unter Trockenheitsbedingungen). Mikami et al. (Agr. Biol. Chem. 1970 34, 977–979) berichteten über eine Anzahl Hydroxysäuren als Pflanzenwachstumsregulatoren. Kamuro et al. ( US-Patent Nr. 6 093 683 A , 2000; 5 776 860 A , 1998; 4 846 877 A , 1989, und 6 271 176 A , 2001) beschrieben Jasmonsäurederivate als Pflanzenwachstumspromotoren. Danzig Morris J. et al. ( US-Patent 4 806 149 A , 1989) offenbarten, daß Monoxanthate und Dixanthate von Dipropylenglykol und Triethylenglykol das Wachstum und die Konzentration von Chlorophyll in Pflanzen verstärken.
So ist bisher von vielen aktiven Verbindungen berichtet worden, daß sie das Wachstum bei Pflanzen fördern. Diese Verbindungen sind bei der Größenzunahme der Früchte, Wurzeln und Triebe und bei dem gesamten Erntertrag behilflich. Es ist jedoch schwierig, diese Verbindung in großen Mengen aus Pflanzen zu erhalten und die Kosten für ihre synthetische Herstellung sind sehr hoch.
Callicarpa macrophylla Vahl. (Verbanaceae) ist ein aufrechter Strauch, der in den Indus-Ganges-Ebenen und den bis auf 2000 m ansteigenden Gebieten unterhalb des Himalajas von Kaschmir bis Assam verbreitet ist. Die Blätter der Pflanze werden häufig bei Rheuma verwendet und das aromatische Wurzelöl wird bei Magenbeschwerden gegeben. Die Pflanze ist auch auf ihre chemischen Bestandteile untersucht worden (Asolkar et al., zweite Ergänzung zum Glossary of Indian Medical Plants with active principles, Teil 1, PID, CSIR, New Dehli, 155, 1992).
Die Isolierung von Calliterpenon und seinem Monoacetat aus Callicarpa macrophylla wurde zuerst von Chatterjee et al., Tetrahedron 28, 4319, 1972, berichtet und ihm wurde die Struktur eines 16α,17-Dihydroxy-ent-kauan-II-ons und seines 17-Acetats zuerkannt. Auf der Grundlage chemischer und spektroskopischer Hinweise wurden diese Strukturen jedoch zu 16α,17-Dihydroxyphyllocladan-3-on und seinem 17-Acetat auf der Grundlage weiter Studien der chemischen, H-NMR-, NOE-, LIS- und Röntgenkristallographiedaten durch Ahmad und Zaman (Tetrahedron Lett. 2179, 1973), Fujita et al. (Phytochemistry 14, 1975, 2249) und Wong et al. (Acta Crystallography Sec. C, 47, 1991, 906) korrigiert. Später wurde diese Verbindung auch aus einigen anderen Arten der Gattung Callicarpa isoliert.
Während früherer Untersuchungen an Callicarpa macrophylla wurden die natürlichen Verbindungen 16α,17-Dihydroxyphyllocladan-3-on (Calliterpenon), sein 17-Acetat (Calliterpenonmonoacetat) und zwei verwandte, untergeordnete Inhaltsstoffe 16α,17-Isopropylideno-3-oxo-phyllocladan (Isopropylidenocalliterpenon) und 3β,16α,17-Trihydroxyphyllocladan (Trihydroxycalliterpenon) isoliert und es wurde auch ein Diacetatderivat von Calliterpenon hergestellt (Singh et al., Phytochemistry 37, 1994, 587 und Indian Jour. of Chem. 33B, 1994, 1205). Die vollständige spektrale Zuordnung aller 5 Phyllocladan-Diterpenoide wurde ebenfalls durchgeführt (Agarwal et al., Ind. Jour. of Chem. 35B, 1996, 803–805).
Zusammenfassung der Erfindung
Die Grundlage der vorliegenden Erfindung ist der Befund, daß sich diese Phyllocladan-Diterpenoide beim Verwenden in bestimmten Konzentrationen als Wachstumspromotoren verhalten. Einige dieser Verbindungen bewirken eine größere Steigerung als die durch GA₃ (Gibberellinsäure) unter identischen Bedingungen erzeugte.
Die Erfindung stellt auch eine neue wachstumsfördernde Aktivität von Phyllocladan-Diterpenoiden wie aus Callicarpa macrophylla isoliertem Calliterpenon und Derivaten und ihre antagonisierenden Wirkungen gegen Pflanzenwachstumshemmer bereit.
Weiter stellt die vorliegende Erfindung auch die wirksame Menge an den aus Calliterpenon, Calliterpenonmonoacetat, Calliterpenondiacetat, Isopropylidencalliterpenon und Trihydroxycalliterpenon ausgewählten Phyllocladan-Diterpenoiden bereit, wobei 0,001 bis 0,1 μmol/l Konzentrationen der besagten Verbindungen als Sprühlösung oder in einem Medium in Gewebekulturen oder zum Tauchen von Samen, Wurzeln oder Trieben in die Lösungen verwendet werden können.
Die Lösungen werden durch Lösen der erforderlichen Menge in der Mindestmenge Wasser oder organische Lösungsmittel wie Ethylalkohol, Methanol, Propanol, gefolgt vom gelinden Erwärmen hergestellt und anschließend werden die gewünschten Konzentrationen durch Zufügen einer geeigneten Menge destilliertes Wasser erzielt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt die wachstumsfördernden Aktivitäten aus den Blättern der Pflanze Callicarpa macrophylla isolierter Phyllocladan-Diterpenoide, die nicht nur wohlfeil sind, sondern bei bestimmten Verdünnungen unter identischen Bedingungen eine bessere Aktivität als das wohlbekannte wachstumsfördernde Hormon Gibberellinsäure (GA₃) zeigen. Bei unseren Versuchen haben Calliterpenon, sein Monoacetat und bestimmte andere, aus der Pflanze Callicarpa macrophylla Vahl. (Verbanaceae) natürlich isolierte Derivate vielversprechende wachstumsfördernde Aktivitäten gezeigt.
Calliterpenon (16α,17-Dihydroxyphyllocladan-3-on), ein Phyllocladan-Diterpenoid, ist ein Stereoisomer von Abbeokuton (16,17-Dihydroxykauran-3-on). Abbeokuton weist ein kauranähnliches Gerüst auf, während Calliterpenon ein Phyllocladangerüst aufweist. Die antagonistische Aktivität dieser Phytoderivate gegen negative Allelochemikalien erhöht ihre Brauchbarkeit als das Pflanzenwachstum unterstützende Chemikalien viel stärker.
Wie vorstehend angemerkt wurde die Aktivität der bei der Ausführung dieser Erfindung verwendeten Phyllocladan-Diterpenoide bemerkt, als diese Verbindungen auf ihre Wirkungen auf die Samenkeimung und das Wurzel- und Triebwachstum bestimmter Pflanzenarten und ihre antagonistische Wirkung auf bestimmte Pflanzenwachstumshemmer durch das von Bagchi G. D. et al., Phytochemistry, 45 (6): 1131–1133, 1997, beschriebene Verfahren getestet wurden.
Da der Test das Wachstum der Pflanzen/Keimlinge in wäßriger Lösung umfaßt, zeigt er die Brauchbarkeit des Verfahrens zum Fördern des Pflanzenwachstums in Hydrokultur.
Gleichermaßen ist das Verfahren dieser Erfindung auch brauchbar, wenn Pflanzen durch Gewebekultur vermehrt werden oder die Lösungen auf die Pflanzen gesprüht werden.

Die Phyllocladan-Diterpenoide der vorliegenden Erfindung werden durch die allgemeine Formel

		R1	R2	R3	Mol.Form.	Mol.Gew
1	Calliterpenon	H	H	O	C₂₀H₃₂O₃	320
2	Calliterpenonmonoacetat	H	Ac	O	C₂₂H₃₄O₄	362
3	Calliterpenondiacetat	Ac	Ac	O	C₂₄H₃₆O₅	404
4	Isopropylideno-1-calliterpenon	=C(CH₃)₂	=C(CH₃)₂	O	C₂₃H₃₆O₃	360
5	Trihydroxypyllocladan	H	H	OH	C₂₀H₃₄O	322

dargestellt.

Von den bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Phyllocladan-Diterpenoiden wird beobachtet, daß sie mehr als einen Typ das Pflanzenwachstum regulierender Wirkungen bei den Pflanzen erzeugen. Diese Wirkung auf eine Pflanze hängt von der Anzahl der Variablen einschließlich des Typs der verwendeten Phyilo cladan-Diterpenoidverbindungen, ihrer Konzentration, dem Typ der Pflanzenarten und der wirksamen Menge der zum Erhalt der gewünschten Reaktion benötigten Verbindung ab. Die geeignetste Konzentration für eine bestimmte Anwendung wird leicht durch einen in den Beispielen angegebenen Durchmusterungstest bestimmt. Am bevorzugtesten ist das Phyllocladan-Diterpenoid Calliterpenon und Calliterpenonmonoacetat und die bevorzugte Konzentration ist 0,01 μmol/l–0,001 μmol/l.
Die Aktivität des bei der Durchführung dieser Erfindung verwendeten Phyllocladan-Diterpenoids wurde aufgefunden, als sie bei zwei einkeimblättrigen und zwei zweikeimblättrigen Pflanzen getestet wurden, wobei das früher beschriebene allgemeine Testverfahren (Bagchi G. D. et al. Phytochemistry, 45 (6): 1131–1133, 1997) angewendet wurde. Der Test zeigte, daß verschiedene Phyllocladan-Diterpenoide wachstumsfördernde Aktivitäten aufweisen, wenn sie in Konzentrationen zwischen 0,1 μmol/l und 0,001 μmol/l verwendet werden, während beim Erhöhen der Konzentration in bestimmten Fällen eine Wachstumshemmaktivität beobachtet wurde.
Für ein Phyllocladan-Diterpenoid war die optimale wachstumsfördende Konzentration 0,001 μmol/l. Die Phyllocladan-Diterpenoide, die bei der Durchführung dieser Erfindung allgemein brauchbar sind, sind Calliterpenon, Calliterpenonmonoacetat, Calliterpenondiacetat, Isopropylidencalliterpenon und Trihydroxycalliterpenon. Lösungen der Phyllocladan-Diterpenoide in Wasser, das der Pflanze zugefügt wird, werden bequem auf die Pflanzen angewendet und können durch Lösen der erforderlichen Menge in der Mindestmenge Wasser oder organische Lösungsmittel wie Aceton oder Ethylacetat, Methanol oder Propanol, gefolgt von gelindem Erwärmen hergestellt werden und anschließend können die gewünschten Konzentrationen durch Zufügen einer geeigneten Menge destilliertes Wasser erhalten werden. Von den Pflanzen benötigte Nährstoffe können dem Wasser zugesetzt werden. Die Lösung des Phyllocladan-Diterpenoids kann versprüht werden oder Wurzeln, Stämme und Samen können darin eingetaucht werden.
Die Phyllocladan-Diterpenoide Calliterpenon und Calliterpenonmonoacetat wurden aus der Pflanze Callicarpa macrophylla wie früher beschrieben (Singh und Agarwal, Phytochemistry 32 (2) 587–588, 1994) erhalten. Andere Phyllocladan-Diterpenoide können aus den Pflanzen isoliert werden oder können chemisch oder mikrobiologisch aus na türlich isoliertem Calliterpenon umgewandelt werden (A. K. Singh und P. K. Agarwal, Indian Journal of Chemistry 33 (B), 1205–1205, 1994).
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Testen verschiedener Verbindungen
Die das Pflanzenwachstum fördernde Aktivität von Calliterpenon, Calliterpenonmonoacetat und Calliterpenondiacetat wurde bei Konzentrationen von 0,1, 0,01 und 0,001 μmol/l untersucht. Die Tests wurden an Samen zweier einkeimblättriger (Hordeum vulgare und Triticum aestivum) und zweier zweikeimblättriger Pflanzen (Vigna radiata und Trigonella foenum-graecum) ausgeführt. Kontrollsamen wurden in destilliertem Wasser gekeimt und alle Beobachtungen wurden mit in GA₃ angezogenen Sämlingen verglichen. Das Wurzel- und Triebwachstum aller Pflanzenarten wurde durch die Phyllocladan-Diterpenoide beeinflußt, obschon sich das Ausmaß der Wirkung bei den Pflanzenarten mit den Chemikalien und ihren Konzentration beträchtlich änderte. Im allgemeinen waren die wachstumsfördernden Aktivitäten bei verdünnten Lösungen ausgeprägter, während sich die höheren Konzentrationen als für die getesteten Arten giftig erwiesen. Einzelheiten des angewendeten Verfahrens und der erhaltenen Ergebnisse werden in den verschiedenen Beispielen erörtert.
Beispiel 1:

Zum Erfassen der Wirkung von Phyllocladan-Diterpenoiden auf das Triebwachstum wurde Lösungen der Testverbindungen durch das folgende Verfahren hergestellt:
100 ml Vorratslösungen mit einer Konzentration von 0,1 μmol/l wurden durch Lösen der erforderlichen Mengen verschiedener Testverbindungen (in Abhängigkeit von ihren Molekulargewichten) in der Mindestmenge Ethanol oder Aceton und Zufügen von destilliertem Wasser hergestellt. Aus dieser Vorratslösung wurden 0,01 μmol/l und 0,001 μmol/l Konzentrationen hergestellt. Calliterpenon und Calliterpenondiacetat wurden in 2,0 ml absolutem Ethanol (Merck) gelöst, während Calliterpenonmonoacetat, Isopropylidenocalliterpenon und Trihydroxycalliterpenon in 2,0 ml Aceton mit spektraler Reinheit gelöst wurden. Die jeweiligen Kontrolltestlösungen aus destilliertem Wasser jeder Konzentration enthielten auch gleiche Mengen absolutes Ethanol oder Aceton. Zu einem Test wurden 10 Samen auf Whatman-Filterpapier gelegt (mit 5,0 ml Testlösung in einer Petrischale mit 9,0 cm Durchmesser angefeuchtet (dreifache Ausfüh rung)). Die Petrischalen wurden in einer Keimvorrichtung 9 Tage inkubiert und bei 25,0 ± 1,0°C und 90% Feuchtigkeit und 4 h Licht/Tag gehalten. Am Ende der Inkubation wurden die Beobachtungen an den Keimlingen als Keimung, Trieb- und Wurzelwachstum aufgezeichnet. Die Daten zur Länge des Triebs und der Wurzel der Keimlinge und die Anzahl der bei unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindungen gekeimten Samen wurden mit der Kontrolle verglichen, die als 100% angenommen wurde. Die so erhaltenen Daten sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1. Wirkung von Phyllocladan-Diterpenoiden auf das Triebwachstum ausgewählter ein- und zweikeimblättriger Kulturpflanzen

Verbindungen	Konzentration (μmol/l)	Prozent (%) Triebwachstum von Sämlingen bezogen auf die Kontrolle am 9. Tag nach dem Säen bei den Pflanzenarten
Verbindungen	Konzentration (μmol/l)	Hordeum vulgare	Triticum aestivum	Vigna radiata	Trigonella foenum graecum
Calliterpenon	0.1 0.01 0.001	102 103 118	95 100 105	128 134 121	121 130 121
Calliterpenonmonoacetat	0.1 0.01 0.001	118 117 113	109 107 106	123 130 138	133 134 135
Calliterpenondiacetat	0.1 0.01 0.001	105 106 198	103 106 109	119 115 111	94 121 81
Isopropylidenocalliterpenon	0.1 0.01 0.001	108 107 106	102 103 103	145 153 89	100 123 137
Trihydroxy-Phyllocladan	0.1 0.01 0.001	109 108 102	116 112 108	132 145 136	84 72 53
GA₃	0.1 0.01 0.001	55 91 104	113 115 120	183 196 126	93 112 116

Tabelle 1 läßt erkennen, daß die Lösung von Isopropylidenocalliterpenon bei einer Konzentration von 0,01 μmol/l und 0,001 μmol/l die höchste Wachstumsverstärkung (d. h. 153% und 137% bezogen auf die Kontrolle) bei den Trieben von V. radiata beziehungsweise T. foenum-graecum bewirkte und Calliterpenonmonoacetat eine geringfügig niedrigere Triebwachstumsverstärkung bei den vorstehend angeführten Arten (d. h. 138% beziehungsweise 135% bei einer Konzentration von 0,001 μmol/l) zeigte. Calliterpenon und Calliterpenondiacetat bewirkten 134% und 119% Verstärkung bei V. radiata beziehungsweise 130% und 121% Verstärkung bei T. foenum-graecum bezogen auf die Kontrollaufzeichnung als 100% Triebwachstum. Obschon Trihydroxyphyllocladan das Wachstum von Trieben von V. radiata bei Konzentrationen von 0,01 mol/l am höchsten (145%) verstärkte, erwies es sich gegenüber den Trieben von T. foenum-graecum als toxisch und verringerte ihr Wachstum bei allen getesteten Verdünnungen. Bei zwei anderen Arten Einkeimblättriger, d. h. H. vulgare und T. aestivum war die Wirkung nicht sehr ausgeprägt. Alle Lösungen der Verbindungen verstärkten entweder das Wachstum geringfügig oder übten keine bedeutende Wirkung auf sie aus. Bei V. radiata zeigten jedoch alle Phyllocladan-Diterpenoide eine leicht bessere oder gleiche wachstumsfördernde Aktivität wie die von GA₃ (Tabelle 1).
Beispiel 2:
Das Wachstum von Keimlingen wurde auf ähnliche Weise wie das Triebwachstum aus dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch gemessen.
Wirkung auf das Wurzelwachstum

Calliterpenon bewirkte in einer Konzentration von 0,01 μmol/l bei den Wurzeln von T. foenum-graecum beziehungsweise V. radiata das höchste Wachstum, während es bei T. aestivum und H. vulgare verglichen mit der Kontrolle 136% und 116% Wachstum bei einer Konzentration von 0,01 μmol/l bewirkte. Calliterpenonmonoacetat bewirkte bei 0,001 μmol/l Verdünnung eine maximale Wachstumserhöhung bei allen vier getesteten Arten, die von 104%–141% reichte. Isopropylidenocalliterpenon bewirkte das höchste Wachstum bei unterschiedlichen Konzentrationen bei verschiedenen Arten. 143% Wachstum wurde bei H. vulgare und 0,1 μmol/l, gefolgt von 132% Wachstum bei T. foenum-graecum bei 0,01 μmol/l beobachtet, während 109% Wachstumserhöhung bei T. aestivum bei einer Konzentration von 0,001 μmol/l vermerkt wurde. Calliterpenondiacetat bei Konzentrationen von 0,01 μmol/l und 0,001 μmol/l zeigte die höchste (136% und 125%) Erhöhung des Wurzelwachstums bei V. radiata beziehungsweise T. aestivum, gefolgt von 119% bei H. vulgare und 113% bei T. foenum-graecum bei Konzentrationen von 0,01 μmol/l beziehungsweise 0,001 μmol/l. Außer H. vulgare, das 145% Wurzelwachstumssteigerung zeigte, reagierten andere getestete Arten schlecht auf die Trihydroxycalliterpenonbehandlung. Alle getesteten Arten erzielten ein besseres Wurzelwachstum durch das eine oder andere Phyllocladanderivat als GA₃. Tabelle 2. Wirkung von Phyllocladan-Diterpenoiden auf das Wurzelwachstum ausgewählter ein- und zweikeimblättriger Kulturpflanzen

Verbindungen	Konzentration (μmol/l)	Prozent (%) Wurzelwachstum von Sämlingen bezogen auf die Kontrolle am 9. Tag nach dem Säen bei den Pflanzenarten
Verbindungen	Konzentration (μmol/l)	Hordeum vulgare	Triticum aestivum	Vigna radiata	Trigonella foeraum graecum
Calliterpenon	0.1 0.01 0.001	82 116 116	80 80 136	76 138 87	150 164 141
Calliterpenonmonoacetate	0.1 0.01 0.001	124 114 146	88 102 145	67 85 104	81 95 131
Calliterpenondiacetate	0.1 0.01 0.001	98 113 119	103 114 125	93 136 91	95 113 73
Isopropylidenocalliterpenon	0.1 0.01 0.001	143 115 118	78 107 109	124 131 91	91 123 132
Trihydroxyphyllocladan	0.1 0.01 0.001	106 112 145	111 113 90	93 102 100	82 68 55
GA₃	0.1 0.01 0.001	70 115 132	62 116 131	104 103 102	45 45 123

Beispiel 3:
Die Wirkung der Testverbindungen auf die Keimung wurde aus demselben Versuch wie in Beispiel 1 beschrieben beobachtet.
Wirkung auf die Samenkeimung:

Von den vier getesteten Samenarten zeigten zwei Arten, d. h. Vigna radiata und Trigonella foenum-graecum eine gewisse Wirkung auf ihre Keimung bei drei Diterpenoiden. Die Samenkeimung war 100–250% bei V. radiata verglichen mit 100% bei der Kontrolle und 200% bei GA₃-behandelten Samen. Die höchste Keimung (250%) wurde bei mit Calliterpenon in einer Konzentration von 0,001 μmol/l behandelten Samen registriert. Bei Trigonella foenum-graecum bewirkten Calliterpenon und sein Monoacetat eine geringfügig bessere Keimung, d. h. 113% verglichen mit 100% bei der Kontrolle und GA₃-behandelten Samen. Die anderen drei Diterpenoide verzögerten entweder die Keimung (63–88%) oder erzeugten bei verschiedenen Konzentrationen keine Wirkung. Tabelle 3. Wirkung von Phyllocladan-Diterpenoiden auf die Samenkeimung ausgewählter ein- und zweikeimblättriger Kulturpflanzen

Verbindungen	Konzentration (μmol/l)	Prozent (%) Keimung der Samen bezogen auf die Kontrolle am 9. Tag nach dem Säen bei den Pflanzenarten
Verbindungen	Konzentration (μmol/l)	Hordeum vulgare	Triticum aestivum	Vigna radiata	Trigonella foenum graecum
Calliterpenon	0.1 0.01 0.001	100 100 100	100 100 100	150 150 250	113 125 113
Calliterpenonmonoacetat	0.1 0.01 0.001	100 100 100	100 100 100	200 150 100	113 113 113
Calliterpenondiacetat	0.1 0.01 0.001	100 100 100	90 100 100	100 100 200	75 100 100
Isopropylidenocalliterpenon	0.1 0.01 0.001	100 100 100	100 100 100	100 100 150	100 113 100
Trihydroxy-Calliterpenon	0.1 0.01 0.001	100 100 100	100 100 100	150 150 100	88 75 63
GA₃	0.1 0.01 0.001	100 100 100	100 100 100	200 200 200	100 100 100

Auf der Grundlage der vorstehenden Ergebnisse kann gefolgert werden, daß alle Phyllocladan-Diterpenoide bei der einen oder anderen getesteten Konzentration bei nahezu allen getesteten Konzentrationen als Wachstumspromotor wirken, die Wirkungen von Calliterpenon und Calliterpenonmonoacetat bei allen Versuchen, d. h. Wurzelwachstum, Triebwachstum und Samenkeimung am ausgeprägtesten waren. Daher wurden weitere Versuche mit einigen unterschiedlichen Pflanzenarten zum Bestätigen der vorstehenden Befunde unternommen. Die aus Beispiel 4 erhaltenen Ergebnisse bestätigen frühere Ergebnisse und werden nachstehend beschrieben.
Beispiel 4:
Die Wirkung von Calliterpenon und seinen Derivaten auf die Samenkeimung und das Keimlingswachstum bei Hibiscus sabdariffa und Sesbania cannabina wurden auf ähnliche Weise gemessen wie sie bei Beispiel 1 gemessen wurden.
A. Wirkung von Calliterpenon

(i) auf das Wurzelwachstum: Calliterpenon bewirktee 157% Steigerung des Wurzelwachstums bei Hibiscus sabdariffa und 119% mehr Wurzelwachstum bei Sesbania cannabina in einer Konzentration von 0,001 μmol/l, verglichen mit ihren jeweiligen Kontrollen. Beim Vergleich mit der Wirkung von GA₃ auf das Wurzelwachstum wurde beobachtet, daß die Wirkung von Calliterpenon sogar besser als GA₃ war. Diese Verbindung zeigte 134% und 109% mehr Wurzelwachstum bei H. sabdariffa beziehungsweise S. cannabina als GA₃ am 9. Tag des Versuchs bei einer Konzentration 0,001 μmol/l verglichen mit GA₃, das als 100% angenommen wurde.
(ii) auf das Triebwachstum: beim Triebwachstum zeigte Calliterpenon 182% und 120% Verstärkung bei H. sabdariffa beziehungsweise S. cannabina verglichen mit ihren entsprechenden Kontrollen. Diese wachstumsfördernde Aktivität war sogar besser als GA₃. Calliterpenon zeigte 110% und 104% mehr Wachstum bei H. sabdariffa beziehungsweise S. cannabina verglichen mit GA₃ (100%) in einer Konzentration von 0,001 μmol/l.
(iii) auf die Keimung: Calliterpenon zeigte auch auf die Samenkeimung bei H. sabdariffa und S. cannabina eine gesteigerte Wirkung. Bei H. sabdariffa gab es 133% mehr Keimung, während es bei S. cannabina 150% mehr verglichen mit den entsprechenden Kontrollen bei einer Konzentration von 0,001 μ waren. Verglichen mit GA₃ wurden bei H. sabdariffa beziehungsweise S. cannabina bei derselben Konzentration 133% und 150% Zunahme beobachtet.

B. Wirkung von Calliterpenonmonoacetat

(i) auf das Wurzelwachstum: Calliterpenonacetat zeigte in S. cannabina eine bessere Aktivität als H. sabdariffa. Bei S. cannabina erzeugte es 114% mehr Wurzelwachstum als GA₃ bei einer Konzentration von 0,001 μmol/l.
(ii) auf das Triebwachstum: beim Triebwachstum wurde ebenfalls gefunden, daß Calliterpenonmonoacetat wirksamer bei S. cannabina als H. sabdariffa war. Bei S. cannabina bewirkte es 109% mehr Wachstum als seine Kontrolle und verglichen mit GA₃ wurde beobachtet, daß es 116% mehr Wachstum bewirkte.
(iii) auf die Keimung: diese Verbindung bewirkte keine Steigerung bei der Keimung von H. sabdariffa, während sie bei S. cannabina eine verstärkte Keimung zeigte. Sie bewirkte 150% mehr Keimung verglichen mit ihrer Kontrolle und GA₃- Behandlungen.

Informationen werden Tabelle 4 und 5 gegeben.
Beispiel 5:
Abschwächung der wachstumshemmenden Wirkung von Allelochemikalien:
Die allelopathische Beziehung zwischen verschiedenen Pflanzenarten ist insbesondere bei Kulturpflanzen eine bekannte Tatsache. Über Artemisia annua-Verbindungen wurde berichtet, daß sie die Keimung und das Wachstum anderer Arten hemmen [Bagchi G. D. et al., Phytochemistry, 45 (6): 1131–1133, 1977]. Eine Beobachtung einer äußerst schlechten Keimung und nahezu keines Wachstums und des schlußendlichen Todes auf dem Feld gezogener Hibiscus sabdariffa-Keimlinge nach der Ernte von Artemisia annua-Pflanzen veranlaßten uns zum Testen der allelopathischen Beziehung zwischen diesen beiden Arten.
Wirkung von A. annua-Samenextrakten auf die Keimung von Hibiscus sabdariffa:

2,0 g, 1,5 g, 1,4 g, 1,2 g, 1,1 g, 1,0 g und 0,75 g Samen von A. annua wurden gewogen und jeweils in 50 ml destilliertem Wasser eingeweicht, um unterschiedliche Konzentrationen des Samenextrakts herzustellen. Nach 24 h wurden die Extrakte filtriert und die Samen wurden zwei Mal mit 15 ml destilliertem Wasser gewaschen und der gesamte Extrakt wurde in einem Meßkolben durch Zufügen destillierten Wassers zu jedem Satz auf 100 ml aufgefüllt und autoklaviert. 10 Samen von Hibiscus sabdariffa in vier Ausführungen jeweils in unterschiedlichen Samenextrakten von A. annua wurden in sterilisierten Petrischalen 12 Tage wie in Beispiel 1–4 beschrieben gekeimt. Die Beobachtungen wurden mit den in destilliertem Wasser unter ähnlichen Bedingungen gekeimten Kontrollsamen verglichen. Es wurde beobachtet, daß die Keimung von H. sabdariffa-Samen und die Sterblichkeit ihrer Keimlinge zur Konzentration des Samenextrakts direkt proportional war. Dies zeigte eindeutig, daß A. annua-Samen bei Pflanzenarten eine allelopathische Wirkung erzeugen. Tabelle 6: Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen von Artemisia annua-Samenextrakten auf das Überleben von Hibiscus sabdariffa-Keimlingen

Konzentrationen des A. annua-Samenextrakts	Prozent (%) Sterblichkeit von Hibiscus sabdariffa-Sämlingen nach 12 Tagen Keimung verglichen mit der Kontrolle (0%)
0.75 g Samen/100 ml dw*	47
1.0 g Samen/100 ml dw	50
1.1 g Samen/100 ml dw	52
1.2 g Samen/100 ml dw	56
1.3 g Samen/100 ml dw	69
1.4 g Samen/100 ml dw	73
1.5 g Samen/100 ml dw	88
2.0 g Samen/100 ml dw	100

*dw- destilliertes Wasser

Tabelle 6 zeigte eindeutig, daß der A. annua-Extrakt eine nachteilige Wirkung auf die Samenkeimung und das Keimlingswachstum ausübte, was schlußendlich bei den Pflanzen eine Sterblichkeit verursachte. Andererseits ist aus Bsp. 1–4 offensichtlich, daß Phyllocladan-Diterpenoide keimungs- und wachstumsfördernde Aktivitäten bei verschiedenen Pflanzenarten hervorrufen. Zum Auffinden der kombinierten Wirkung des A. annua-Extrakts und der Phyllocladan-Diterpenoide auf die Keimung und das Keimlingswachstums verschiedener Pflanzenarten wurde ein 1:1-Verhältnis dieser Verbindungen und A. annua-Extrakt in den vorliegenden Versuchen getestet. Dazu wurden Hibiscus sabdariffa- und Sesbania cannabina-Samen in A. annua-Extrakt und Lösungen gekeimt, die durch Mischen dieses Extrakts mit 0,01 μmol/l Calliterpenon beziehungsweise Calliterpenonmonoacetat (Tabelle 7) hergestellt worden waren. Zur Herstellung von A. annua-Extrakt wurden 1,3 g Samen in 100 ml destilliertem Wasser 24 h zum Testen an H. sabdariffa eingeweicht. Da bei dieser Konzentration Samen dieser Art 69% Mortalität gezeigt haben, kann dies als guter Indikator genommen werden. Diese Wirkung wurde auch bei S. cannabina registriert. Da in diesem Fall die Samen nahezu vom halben Gewicht verglichen mit den Samen von H. sabdariffa waren, wurden demzufolge 0,65 g A. annua-Samen in 100 ml destilliertem Wasser 24 h unter Erzeugen ähnlicher Bedingungen bei S. cannabina eingeweicht.
Wirkung auf die Samenkeimung:

Zur Kontrolle wurden Samen in destilliertem Wasser gekeimt und alle Beobachtungen wurden damit verglichen. H. sabdariffa- und S. cannabina-Samen zeigten 33% und 67% Keimung, wenn sie in A. annua-Samenextrakt gezogen wurden. Wenn jedoch Calliterpenon mit A. annua-Extrakt im Verhältnis 1:1 gemischt wurde, wurde die Keimhemmwirkung des A. annua-Extrakts bei H. sabdariffa-Samen zunichte gemacht. Während Calliterpenonmonoacetat bei S. cannabina keine Verbesserung bei der Samenkeimung bewirkte, hemmte es andererseits beim Mischen mit A. annua-Extrakt im Verhältnis 1:1 nicht nur vollständig die Hemmwirkung von A. annua-Extrakt sowohl bei H. sabdariffa und S. cannabina, sondern förderten auch das Trieb- und Wurzelwachstum (Tabelle 6). Daher können Calliterpenon und manche seiner Derivate zum Aufheben der Wirkungen anderer Wachstumshemmer/Allelochemikalien auf deren Sanierungsgebieten verwendet werden. Tabelle 7: Antagonistische Wirkung von Calliterpenon und Calliterpenonmonoacetat mit Artemisia annua-Samenextrakt

Behandlungen	Prozent (%) Keimung und Sämlingswachstum bezogen auf die Kontrolle am 9. Tag nach dem Säen
	Hibiscus sabdarifa Sesbania cannabina
	Keimung	Sämlingswachstum		Keimung	Sämlingswachstum
	Keimung	Wurzel	Stengel	Keimung	Wurzel	Stengel
Artemisia annua-Extrakt	33	0	0	67	0	0
Artemisia annua-Extrakt + 0,01 μmol/l/Calliterpenon (50:50)	100	150	130	67	225	144
Artemisia annua-Extrakt + 0,01 μmol/l/Calliterpenonmonoacetat (50:50)	100	172	169	100	175	138

Tabelle 7 zeigt eindeutig, daß Calliterpenon und Calliterpenonmonoacetat beim Mischen in einer Konzentration von 0,01 μmol/l im Verhältnis 1:1 mit Artemisia annua-Wurzelwasserextrakt die Wachstumshemmwirkungen von Artemisia annua-Extrakten antagonisiert und ein besseres Wachstum als die Kontrolle (in Wasser eingeweichte Samen) bewirkten. Calliterpenon bewirkte 150% und 225% mehr Wachstum bei Wurzeln von Hibiscus sabdariffa und Sesbania cannabina, während Calliterpenonmonoacetat 172% beziehungsweise 175% mehr Wachstum bei Wurzeln beider Arten bewirkte. Ähnlich wurden 130% und 144% mehr Wachstum durch Calliterpenon bei Stengeln von Hibiscus sabdariffa und Sesbania cannabina festgestellt, während das Wachstum durch Calliterpenonmonoacetat 169% beziehungsweise 175% bei beiden Arten verglichen mit der als 100% angenommen Kontrolle war.

Claims

Verwendung von Phyllocladan-Diterpenoiden ausgewählt aus Calliterpenon, Calliterpenonmonoacetat, Calliterpenondiacetat, Isopropylidencalliterpenon und Trihydroxycalliterpenon als Pflanzenwachstumsförderer.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Phyllocladan-Diterpenoide auf die Pflanzen in einer Konzentration von 0,1 μmol/l bis 0,001 μmol/l in einer wäßrigen Lösung angewendet werden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Phyllocladan-Diterpenoide aus der Gattung Callicarpa isoliert sind.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Pflanze Callicarpa macrophylla ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Lösung so hergestellt wird, dass die Phyllocladan-Diterpenoide in der Mindestmenge Wasser oder Lösungsmittel gelöst und auf die gewünschte Konzentration durch Zufügen von Wasser verdünnt werden und dann auf die Pflanzen angewendet wird.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Anwendung von Phyllocalden-Diterpenoiden mittels Aufsprühens einer Lösung von Phyllocalden-Diterpenoiden auf Kulturpflanzen, Aufbringen einer Lösung von Phyllocalden-Diterpenoiden auf eine Gewebekultur oder Heranziehen von Keimlingen in einer Lösung von Phyllocalden-Diterpenoiden erfolgt.
Verfahren zur Behandlung von Samen, Keimlingen, oder Wurzeln zur Pflanzenwachstumsförderung durch das Aufbringen von Phyllocladan-Diterpenoiden ausgewält aus Calliterpenon, Calliterpenonmonoacetat, Calliterpenondiacetat, Isopropylidencalliterpenon und Trihydroxycalliterpenon auf Samen, Keimlingen, oder Wurzeln.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Phyllocladan-Diterpenoide in einer Konzentration von 0,1 μmol/l bis 0,001 μmol/l in einer wäßrigen Lösung verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Phyllocladan-Diterpenoide aus der Gattung Callicarpa isoliert sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Pflanze Callicarpa macrophylla ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Phyllocladan-Diterpenoide nach dem Lösen in der Mindestmenge Wasser oder Lösungsmittel und ihrem Verdünnen auf die gewünschte Konzentration durch Zufügen von Wasser auf die Pflanzen angewendet werden.
Verfahren wie in Anspruch 11, wobei die Behandlung aus Sprühen einer Lösung von Phyllocladan-Diterpenoiden auf Kulturpflanzen, Aufbringen der Lösung von Phyllocalden-Diterpenoiden auf eine Gewebekultur oder Heranziehen von Keimlingen in der Lösung von Phyllocladan-Diterpenoiden erfolgt.