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Zubereitungen der Blütenköpfchen der Echten Kamille (Chamomilla recutita (L. ) Rauschert, synonym mit Matricaria chamomilla L. ) finden wegen ihrer antiphlogistischen und spasmolytischen Wirkung eine breite therapeutische Verwendung und bilden einen wichtigen Bestandteil des pflanzlichen Arzneischatzes. Besondere therapeutische Bedeutung kommt dabei den Wirkstoffen (-)-a-Bisabolol und Chamazulen zu. Eine gute Kamillendroge sollte deshalb einen möglichst hohen Gehalt an diesen beiden Substanzen auf weisen.
Die natürlich vorkommenden diploiden Kamillen sind hinsichtlich ihres Wirkstoffgehaltes sehr heterogen. Insbesondere ist von den wichtigsten Wirkstoffen Chamazulen und (-)-a-Bisabolol nur einer vorhanden, oder diese beiden Wirkstoffe fehlen ganz beziehungsweise treten zusammen nur in sehr geringer Menge auf, wobei in solchen Fällen die Hauptkomponente des ätherischen Öls aus den weniger wirksamen Bisaboloiden (Bisabolonoxid A oder B, Bisabololoxid A) besteht.
Unter der Bezeichnung DEGUMILL (es handelt sich hierbei um die im Patentanspruch der deutschen Patentschrift 24 02 802 erwähnte Kamillensorte; DDR-Sortenschutzrecht Degumill; Italienisches Patent 1 035 096) ist eine Kamillensorte bekannt, die einen gleichzeitig hohen Gehalt an (-)-a-Bisabolol und Chamazulen aufweist. Der Chamazulen- und Bisabololgehalt dieser Kamillensorte DEGUMILL ist jedoch nur dann beständig, wenn jegliche Einkreuzung beziehungsweise Fremdbestäubung mit anderen Kamillensorten, deren Bisabolol- und Chamazulengehalt erheblich niedriger ist, beziehungsweise mit der überall vorhandenen wirkstoffarmen Wildkamille, verhindert wird.
Diese Etnkreuzungsgefahr durch Fremdbestäubung ist fast immer vorhanden, da die Wildkamille praktisch überall vorkommt Weiterhin sind verschiedene tetraploide Kamillensorten bekannt (beispielsweise BODEGOLD, DDR; POHORELICKY, CSSR, ZLOTY LAN, Polen; BK-2, Ungarn). Diese tetraploiden Kamillensorten weisen zwar einen befriedigenden Chamazulengehalt auf, jedoch ist der wichtige Wirkstoff (-)-a- Bisabolol in diesen bekannten tetraploiden Kamillensorten nur in äusserst geringer Menge vorhanden, und es herrschen stattdessen die übrigen Bisaboloide (Bisabololoxid A und B sowie Bisabolonoxid) vor, die zusammen mehr als die Hälfte des ätherischen Öls bei den bekannten tetraploiden Kamillensorten ausmachen.
Es wurde nun gefunden, dass ganz allgemein aus natürlich vorkommenden Kamillen- Populationen oder diploiden oder tetraploiden Zuchtkamillen durch bestimmte Behandlungs- beziehungsweise Verfahrens schritte bisabololreiche tetraploide Kamillenpflanzen erhalten werden können, die einerseits nicht mehr anfällig gegen die Fremdbestäubung mit natürlich vorkommenden Kamillen sind und andererseits einen gleichzeitig hohen Gehalt an Chamazulen und (-)-a-Bisabolol aufweisen, wobei der Gehalt an (-)-a-Bisabolol den Chamazulengehalt erheblich übertrifft und gleichzeitig die übrigen Bisaboloide praktisch nicht oder nur in sehr geringer Menge auftreten.
Von wesentlicher Bedeutung ist hierbei also, dass der hohe Gehalt an den Hauptwirkstoffen (-)-a-Bisabolol und Chamazulen bei der erfindungsgemäss zu verarbeitenden Kamille beständig ist, das heisst bei jeder Vermehrung erhalten bleibt.
Die Erfindung betrifft die durch die Patentansprüche definierten Gegenstände beziehungsweise Sachverhalte, insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung von Mitteln mit antiphlogistischer Wirkung aus Matricaria Chamomilla
Die neue verfahrensgemäss zu verarbeitende tetraploide Kamille zeichnet sich überraschenderweise gegenüber den bisher bekannten Kamillen beziehungsweise Kamillensorten durch eine Reihe von neuen und vorteilhaften Eigenschaften aus. Insbesondere ist sie nicht mehr anfällig gegen die Fremdbestäubung mit den natürlich vorkommenden Kamillen-Populationen (Wildkamille) wie die bekannte Kamillensorte DEGUMILL.
Gegenüber den übrigen bekannten di- ploiden Kamillen und tetraploiden Kamillensorten unterscheidet sich die neue Kamille überraschenderweise durch einen höheren Gehalt an dem wichtigen Wirkstoff (-)-a-Bisabolol (mindestens 200 mg%), während der Gehalt an den übrigen Bisaboloiden (zum Beispiel Bisabololoxiden) sehr gering ist und weniger als 50 mg% beträgt So weisen beispielsweise die bekannten und in der Literatur beschriebenen Kamillensorten alle einen sehr hohen Gehalt an Bisabololoxiden und zum Teil Bisabolonoxid auf, der in der Regel ca. 50 % des ätherischen Öls der Droge ausmacht (das heisst bei 1 % ätherischem 01-Gehalt ca 500 mg pro 100 g Droge).
Weiterhin ist die erfindungsgemäss zu verarbeitende Kamille im Gegensatz zu den bisher bekannten tetraploiden Kamillensorten inhaltsstoffmässig homogen, wobei die Eigenschaften chamazulen- und (-)-a-bisabololhaltig beständig (das heisst homozygot) sind
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Demgegenüber zeigt die Einzelpflanzentestung der bekannten tetraploiden Kamillensorten, dass die einzelnen Individuen verschiedenen Inhaltsstofftypen zuzurechnen sind, dass heisst jede Stichprobe einer hieraus hergestellten Droge liefert ein sowohl qualitativ als auch quantitativ unterschiedliches, inhomogenes Ergebnis.
Darüberhinaus unterscheidet sich die neue Kamille von den bekannten tetraploiden Kamillensorten überraschenderweise beispielsweise durch eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften : verbesserte Keimfähigkeit der Samen, geringerer Anfall von nicht brauchbarer Krautmasse (das heisst höherer Blütenertrag); niedrigerer Wassergehalt der Blüten (das heisst bessere Ausbeute an getrockneten Blüten und kürzere Trocknungszeiten); bessere Eignung für die maschinelle Ernte, weil die Blüten weitgehend in einer Ebene lokalisiert sind und die meisten Blüten gleichzeitig blühen (dadurch wird auch ein einheitlicher Erntetermin möglich); bessere Haltbarkeit der Droge (geringere Neigung zu Zerfall und Grusbildung); besonders aromatischer und typischer Kamillegeruch.
Die zuletzt genannten Vorteile treten beispielsweise auf, wenn ausser auf den Wirkstoffgehalt noch eine Selektion auf eines oder mehrere der vorgenannten Merkmale erfolgt, von den ausselektierten Pflanzen Saatgut gewonnen wird, aus den daraus gezogenen Nachkommen erneut selektiert wird und diese Massnahmen 3 - 5 mal wiederholt werden.
Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung einer neuen tetraploiden Kamille mit verbesserten Eigenschaften, insbesondere einem erhöhten Gehalt an (-)-a-Bisabolol.
Die Herstellung der neuen Kamille erfolgt dadurch, dass man a) bekannte diploide Kamillen, bei denen (-)-a-Bisabolol die Hauptkomponente des ätherischen Öls darstellt, tetraploidisiert (Genom-Mutation), die so erhaltenen tetraploiden Pflanzen ausselektiert und von diesen ausgewählten tetraploiden Pflanzen wiederum die Pflanzen ausselektiert, deren bei 40 C getrocknete Blüten einen Mindestgehalt an Chamazulen von 100 mg% ;
Mindestgehalt an (-)-a-Bisabolol von 200 mg% und einen Gehalt an übrigen
Bisaboloiden von höchstens 50 mg% aufweisen (Ernte der Blüten zu dem Zeitpunkt, wo
30 - 70 % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens aufgeblüht sind), und gegebenenfalls hieran weitere übliche Selektions und Vermehrungsschritte anschliesst (zum Beispiel
Mutterstammbaumzüchtung für vegetativ vermehrbare Fremdbefruchter) oder b) von tetraploiden Kamillen, bei denen (-)-a-Bisabolol die Hauptkomponente des ätherischen Öls darstellt, die Pflanzen ausselektiert, deren bei 40 C getrocknete Blüten einen
Mindestgehalt an Chamazulen von 100 mg%, einen Mindestgehalt an (-)-a-Bisabolol von
200 mg% und einen Gehalt an übrigen Bisaboloiden von höchstens 50 mg% aufweisen (Ernte der Blüten zu dem Zeitpunkt,
wo 30 - 70 % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens aufgeblüht sind), und gegebenenfalls hieran weitere übliche Selektions- und Vermehrungsschritte anschliesst (zum Beispiel Mutterstammbaumzüchtung für vegetativ vermehrbare
Fremdbefruchter).
Als diploide Ausgangskamillen kommen zum Beispiel in Frage: "Kamille argentinischer Provenienz" (siehe L.Z. Padula, R. V.D. Rondina und J.D. Coussio, Quantitative Determination of Essential Oil, Total Azulenes and Chamazulene in German Chamomile, Matricaria chamomilla, Cultivated in Argentina, Planta med. 30, Seiten 273-280,1976) sowie alle Kamillen, welche im ätherischen Öl deutlich messbare Konzentrationen an (-)-a-Bisabolol (in der Regel über 5 % des ätherischen Öls) aufweisen. Beispielsweise kommen solche diploiden Kamillen in Frage, die in folgenden Literaturstellen beschrieben sind: Schilcher, H. "Neuere Erkenntnisse bei der Qualitätsbeurteilung von Kamillenöl beziehungsweise Kamillenblüten", Planta med. 23,132-144 (1973) ; Motl, O., M. Felklovä, V. Lukes & M. Jasicovä "Zur gaschromatographischen Analyse und zu chemischen Typen von Kamillenöl", Arch.
Pharm. 310, 210-215 (1977) ; Franz, Ch., J. Hölzl & A. Vömel "Preliminary Morphological and Chemical Characterization of some Populations and Varieties of Matricaria chamomilla L.", Acta Hort. 73, 109-114 (1978).
Weiterhin kommt als Ausgangskamille die diploide Kamillensorte DEGUMILL (Deutsches Patent 24 02 802) in Frage. Auch in diesem Fall erhält man beispielsweise eine tetraploide Kamille mit einem Chamazulengehalt von mindestens 150 mg% und einem Bisabololgehalt von mindestens 200 mg%, falls die Ernte der Kamillenblütenköpfchen dieser Kamille in dem Vegetationsstadium erfolgt, wo erst 30 - 70 % der Röhrenblüten eines Köpfchens geöffnet sind,
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und die Trocknung bei einer Lufttemperatur von höchstens 50 C durchgeführt wird.
Durch nachgeschaltete Selektions- und Vermehrungsschritte gemäss dieser Anmeldung lassen sich die angegebenen Bisabolol- und Azulenwerte auch hier noch weiter erhöhen.
Das ätherische Öl der Kamille besteht in der Regel aus den Hauptkomponenten Famesen, Spathulenol, Chamazulen einem der 4 Bisaboloide ((-)-a-Bisabolol, Bisabololoxid A, Bisabololoxid B oder Bisabolonoxid, soweit es diploide Einzelpflanzen betrifft; in der Mischprobe der Population sowie in tetraploiden Individuen können mehrere Bisaboloide nebeneinander enthalten sein) sowie aus den Spiroäthern. Die genannten Stoffe machen zusammen meist 70 - 80 % des ätherischen Öls aus.
Besonders geeignet sind daher diploide Ausgangskamillen, wo (-)-a- Bisabolol die überwiegende Komponente (mehr als die Hälfte der Summe der vorgenannten Stoffe) darstellt Insbesondere kommen als Ausgangskamillen diploide Kamillen in Frage, bei denen zum Beispiel das (-)-a-Bisabolol mindestens 40 % des ätherischen Öls oder mindestens 90 % der Bisaboloide darstellt
Als tetraploide Ausgangskamillen kommen zum Beispiel in Frage: Die Kamillensorten Bodegold (DDR), Pohorelicky (CSSR), Zloty Lan (Polen), BK-2 (Ungarn) Diese Sorten sind in den folgenden Literaturstellen beschrieben : M. Chlädek und V. Kosova, Pharmazie 13,712-713 (1958), W Czabajska, Diss. Poznan (1963) ; W Poethke und P. Bulin, Pharm. ZHalle 108, 813-823 (1969) ; I Särkäny, Herb. Hungar 4 (1), 125-169 (1965).
Im übrigen gilt für die tetraploiden Ausgangskamillen hinsichtlich des (-)-a-Bisabololgehalts dasselbe wie für die diploiden Ausgangskamillen.
Insbesondere kommen solche diploiden und tetraploiden Kamillenpopulationen in Betracht, welche in der Drogen-Mischprobe in der Regel mindestens 100 mg% Chamazulen und 50 - 100 mg% (-)-a-Bisabolol aufweisen (bezogen auf die Trockensubstanz der bei 40 C getrockneten Blüten), das heisst aus solchen Kamillenpopulationen wird im Falle einer diploiden Ausgangskamille Saatgut gewonnen und dieses Saatgut tetraploidisiert (ohne Berücksichtigung und/oder Kenntnis des Bisabololgehaltes der Elternpflanzen). Im Falle einer tetraploiden Aus- gangskamille wird das wie oben beschriebene Saatgut dann unmittelbar den folgenden Selektions- und Vermehrungsschritten unterworfen.
Die geeigneten diploiden und tetraploiden Ausgangskamillen werden durch Einzelpflanzen- Untersuchungen herausselektiert. Im allgemeinen ist es erforderlich, von einer Ausgangspopulation beispielsweise 1000-10000 Individuen zu untersuchen, um einige Individuen zu finden, die einen hohen (-)-a-Bisabololgehalt gemäss den oben angegebenen Kriterien aufweisen und als Ausgangskamille geeignet sind. Von solchen ausgesuchten Individuen wird dann in üblicher Weise Saatgut gewonnen und dieses tetraploidisiert. Nach der abgeschlossenen Tetraploidisierung werden die tetraploiden Pflanzen von den übrigen diploid gebliebenen Pflanzen ausselektiert.
Von den so erhaltenen tetraploiden Pflanzen, gegebenenfalls nach vorhergehender Vermehrung, werden nun alle die Pflanzen ausselektiert, deren bei 40 C getrocknete Blüten mindestens 100 mg% Chamazulen, mindestens 200 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden enthalten. Die Ernte dieser Blüten erfolgt dabei in dem Entwicklungsstadium, wo 30 - 70 % aller Röhrenblüten des Blütenköpfchens geoffnet sind. Ge- gebenenfalls können sich hieran weitere Selektions und Vermehrungsschritte anschliessen, die zum Beispiel eine Verbesserung hinsichtlich folgender Merkmale beziehungsweise Eigenschaften bewirken : Gleichzeitiger Blühtermin, gleichmässige grundständige Verzweigung und schmale Blühzone (das heisst bessere Eignung für die maschinelle Ernte), grosse Blütenköpfchen, bessere Haltbarkeit der Droge, besonders aromatischer Geruch.
Falls man von vornherein von einer tetraploiden Kamille ausgeht, erfolgt lediglich die zuvor angegebene Selektion solcher Pflanzen, deren bei 40 C getrocknete Blüten mindestens 100 mg% Chamazulen, mindestens 200 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden enthalten, wobei ebenfalls die Ernte dieser Blüten in dem Entwicklungsstadium erfolgt, wo 30 - 70 % aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind.
Auch in diesem Fall können sich gegebenenfalls weitere Selektions- und Vermehrungsschritte anschliessen, aus denen weitere Verbesserungen (wie oben angegeben) resultieren
Eine besonders vorteilhafte Kamille erhält man, wenn bei der Selektion nach dem
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Chamazulen- und (-)-a-Bisabololgehalt solche Pflanzen (bekannte oder verfahrensgemäss hergestellte) ausselektiert werden, deren Chamazulengehalt mindestens 200 mg%, vorzugsweise 250 mg% und deren (-)-a-Bisabololgehalt mindestens 300 mg%, vorzugsweise 400 mg% beträgt (Gehalt an übrigen Bisaboloiden stets unter 50 mg%).
Die Tetraploidisierung kann beispielsweise in an sich bekannter Weise durch Behandlung von Pflanzenteilen (Samen, Wurzeln, Sprossspitzen, Keimen, Achselknospen) oder Gewebe der diploiden Ausgangs-Kamillenpflanzen mit Chemikalien, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder UV-Strahlen erfolgen. Sie kann weiterhin nach der Dekapitierungs-Kallus-Methode, durch Antherenkultur oder durch Anwendung von hohen oder auch niedrigen Temperaturen auf die Kamillenpflanzen beziehungsweise Pflanzenteile oder Gewebe der Kamillenpflanzen erfolgen Es wird hierzu beispielsweise auf das Buch von Werner Gottschalk "Die Bedeutung der Polyploidie für die Evolution der Pflanzen", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1976, insbesondere Seiten 13 bis 22 verwiesen.
Die Tetraploidisierung durch Chemikalien.
Als Chemikalien für die Tetraploidisierung kommen zum Beispiel in Frage: Colchicin, Acenaphthen, Alkaloide wie Atropin, Veratrin, Nicotin, Sanguinarin, Derivate des Benzols, Diphenyls und Phenanthrens, Naphthalin und Naphthalinderivate, Diphenylamin, Tribromanilin, Paradichlorbenzol, Methylnaphtochinon, Methylnaphthohydrochinon, Salicylsäure und verwandte Substanzen, Hexachlorhexan, Methamphetamin (Hydrochlorid), Alkyl-Alkali-Carbamate wie Isopropyl-Natrium-Carbamat, Phenylurethan, Salze der Kakodylsäure (zum Beispiel Natriumsalz), Glykoside von Convallaria wie Convallarin, Convallatoxin und Convallamarin, Heteroauxin, Germisan (Phenyl-mercuribrenzkatechin), organische Quecksilberverbindungen wie Ethyl- Quecksilber-Phosphat, Ethyl-Quecksilber-Chlorid, Phenyl-Quecksilber-Hydroxid, Phenyl- quecksilber-Dinaphthylrnethandisulfonat, Chloroform, Lachgas (N20)
sowie Gemische dieser Stoffe Weiterhin kommen auch Ölkuchen, Kompost und Kuhdung in Betracht.
Die Behandlung mit den hier erwähnten Stoffen erfolgt beispielsweise bei Temperaturen zwischen 0 und 35 C, vorzugsweise zwischen 12 und 30 C, insbesondere 15 und 25 C.
Die Applizierung erfolgt beispielsweise durch Behandeln von Samen, Sprossspitzen, Wurzeln (insbesondere Wurzelspitzen oder Wurzeln von Keimlingen), Fruchtknoten, von Schnittflächen an Blättern oder Stengeln, von Zellsuspensionen aus Meristem-Gewebe, von Kalluskulturen oder auch durch Injektion in die basale Stengelregion oder in den Bereich der Achselknospen. Die Chemikalien werden im allgemeinen in Form von Lösungen in Wasser, schwach alkoholischen (Alkoholgehalt in der Regel unter 5 %) oder schwach sauren Lösungen angewendet. Der pH-Wert der schwach sauren Lösungen liegt beispielsweise bei 5,5 - 6,5, wobei das Ansäuern bei- spielsweise mittels niederen organischen aliphatischen Säuren wie Essigsäure erfolgt Falls man alkoholische Lösungen verwendet, können diese ebenfalls schwach sauer sein.
Die Konzentrationen der Chemikalien in diesen Lösungen kann beispielsweise 0,01 bis 0,5 %, vorzugsweise 0,02 bis 0,2 %, insbesondere 0,05 bis 0,1 % betragen. Gasförmige Stoffe kommen als solche, gegebenenfalls unter Druck (zum Beispiel 1 bis 10 bar) zur Anwendung. Die Behandlungsdauer beträgt beispielsweise 1 bis 36, vorzugsweise 2 bis 12, insbesondere 4 bis 6 Stunden.
Die wirksamsten Konzentrationen sowie die Einwirkungsdauer sollten zweckmässig jeweils in Vorversuchen getestet werden.
Besonders günstig ist zum Beispiel die Behandlung mit Colchicin bei Temperaturen zwischen 0 und 35 C, vorzugsweise 12 bis 30 C, insbesondere 15 bis 25 C. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass Samen der diploiden Ausgangskamille in einer 0,01 bis 0,2 %igen, insbesondere 0,02 bis 0,1 %igen, vorzugsweise 0,05 %igen Colchicinlösung zum Quellen gebracht werden oder dass ausgekeimte, 5 bis 7 Tage alte gut entwickelte Keimlinge der diploiden Ausgangskamille (mit den Keimblättern nach unten) in eine 0,01 bis 0,2 %ige, insbesondere 0,02 bis 0,1 %ige, vorzugsweise 0,05 %ige Colchicinlösung getaucht werden Bei letzterem Verfahren soll die umgebende Atmosphäre nahezu 100 % relative Luftfeuchtigkeit aufweisen. Die Dauer der Colchicin-Behandlung beträgt beispielsweise 3 bis 36 Stunden, insbesondere 4 bis 10 Stunden.
Bei der Verwendung von Keimlingen ist im allgemeinen eine Einwirkungsdauer bis zu 10 Stunden ausreichend. Bei der Verwendung von Samen kann sich die Einwirkungsdauer gegebenenfalls bis zu 36 Stunden erstrecken.
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Nach der Behandlung mit den Chemikalien werden die gequellten Samen, Keimlinge, beziehungsweise sonstige Pflanzenteile, mit Wasser mehrmals gespült. Die gequellten Samen werden beispielsweise ausgesät. Die Pflanzen mit behandelten Wurzeln oder sonstige Pflanzen- teile oder die behandelten Keimlinge werden beispielsweise in Pflanzkisten pikiert Aus den so behandelten Samen beziehungsweise Keimlingen werden die Pflanzen aufgezogen (zum Beispiel im Gewächshaus : zwischen 18 bis 25 C am Tag und 10 bis 16 C nachts) und die Pflanzen ausgewählt, deren Pollen etwa 1 112 mal grösser sind als die Pollen des Ausgangsmaterials beziehungsweise eine Chromosomenzahl der somatischen Zellen von 36 aufweisen.
Falls man sonstige Pflanzenteile (ober- oder unterirdische Teile) der Chemikalienbehandlung unterwirft, werden ausschliesslich die aus den behandelten Teilen hervorgegangenen Triebe, Wurzeln oder Blüten/Samen einer späteren Untersuchung auf erfolgte Tetraploidisierung unterzogen. Wenn beispielsweise eine Sprossbehandlung oder eine Achselbehandlung vorgenommen wurde, wird anschliessend nur der aus dieser Achsel beziehungsweise aus diesem Spross entstehende neue Trieb und die auf ihm gebildeten Blüten beziehungsweise Samen auf Chromosomenzahl untersucht.
Die Pollengrössenmessungen und die Chromosomenzählung können beispielsweise so durchgeführt werden wie in Beispiel 3 angegeben ist.
Die Tetraploidisierung durch Strahlen.
Die Einwirkung erfolgt beispielsweise auf Samen oder Wurzelspitzen bei Temperaturen zwischen 0 und 35 C, vorzugsweise 10 und 30 C, insbesondere 15 und 25 C.
Bestrahlungssumme' 5 bis 50 Krad. Vorzugsweise kommen Gamma- oder Röntgenstrahlen in Frage. Als UV-Strahlen kommen beispielsweise solche mit einer Wellenlänge von 400 bis 30 nm, vorzugsweise von 350 nm in Frage
Die so bestrahlten Pflanzen beziehungsweise Pflanzenteile werden dann ebenso weiterbehandelt wie nach der Behandlung mit Chemikalien
Anwendung hoher und niedriger Temperaturen. Als hohe Temperaturen kommen beispielsweise Temperaturen zwischen 33 und 50 C, vorzugsweise 42 bis 45 C in Frage. Diesen Temperaturen werden beispielsweise ausgesetzt- gequollene Samen, Keimlinge, Triebspitzen und meristematisches Gewebe Dauer der Behandlung- zum Beispiel 1 bis 48, vorzugsweise 12 bis 24 Stunden.
Als niedrige Temperaturen kommen beispielsweise in Frage 0 bis 5 C, vorzugsweise 0,5 bis 4 C, insbesondere 2 C. Diesen Temperaturen werden beispielsweise ausgesetzt : gequollene Samen, Keimlinge, Triebe und meristematisches Gewebe. Dauer der Behandlung- zum Beispiel 1 bis 100, vorzugsweise 20 bis 40 Tage
Die so behandelten Pflanzen beziehungsweise Pflanzenteile werden ebenso weiterbehandelt wie nach der Behandlung mit Chemikalien.
Die Dekapitierungs-Kallus-Methode (Dekapitierung = Köpfung oder Entspitzung oder Rückschnitt).
Die Dekapitierung wird beispielsweise an Jungpflanzen am Stengel, vorzugsweise am Spitzenvegetationskegel, nach Ausbildung von 4 bis 6 Blättern oder auch an Blattstielen oder Seitentrieben durchgeführt Die aus dem Wundgewebe (Kallusgewebe) entstehenden Knospen beziehungsweise Sprosse werden abgeschnitten, zur Bewurzelung gebracht, in Töpfen weiterkultiviert und die tetraploidisierten Pflanzen in gleicher Weise wie bei der Chemikalienbehandlung ausselektiert. Für eine weitergehende Beschreibung der Dekapitierungs- Kallus-Methode die auf W. Gottschalk ..Die Bedeutung der Polyploidie für die Evolution der Pflanzen", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart 1776, Seiten 13 - 14, verweisen.
Antherenkultur (Erzeugung von Pflanzen mit einfachem Chromosomensatz aus den Staubbeuteln mit anschliessender spontaner oder künstlicher Tetraploidisierung).
Von blühenden Pflanzen werden geschlossene Röhrenblüten geerntet, deren Antheren (Staubbeutel) sich im Stadium vor der ersten Pollenmitose befinden. Die Antheren werden mittels Mikromanipulator aus den Blütenknospen entnommen und in Petrischalen übertragen, die beispielsweise mit dem Nährmedium nach Nitsch und Nitsch (Tabelle 1) gefüllt sind. Anschliessend werden die Petrischalen in einem Kutturraum im 16-Stunden-Tag bei 28 C Tag- und 20 C Nachttemperatur aufbewahrt. Nach circa vier Wochen beginnen die Antheren aufzubrechen und Pflänzchen herauszuwachsen.
Diese sind bei diploidem Elternteil haploid, bei tetraploidem
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Elternteil dihaploid, sie werden nach Ausbildung von Wurzeln beispielsweise in Gartenerde getopft und im Gewächshaus zum Blühen gebracht Diese (di)haploiden Pflanzen sind steril, können jedoch durch Sprossspitzen-, Wurzel- oder Stengelbehandlung mit Chemikalien, wie zum Beispiel Colchicin polyploidisiert werden, wobei homozygote Pflanzen entstehen, die sich dann über Samen weitervermehren lassen. Weiteres Vorgehen siehe bei der Behandlung mit Chemikalien (zum Beispiel Colchicinbehandlung).
Tabelle 1
Kulturmedium nach Nitsch und Nitsch (Science, 1969)
EMI6.1
<tb> mg/l
<tb>
<tb> KN03 <SEP> 950
<tb>
<tb>
<tb> NH4N03 <SEP> 720
<tb>
<tb>
<tb> MgSO4 <SEP> x <SEP> 7 <SEP> H2O <SEP> 185
<tb>
<tb>
<tb> CaCI2 <SEP> 166
<tb>
<tb>
<tb> KH2P04 <SEP> 68
<tb>
<tb>
<tb> MnS04 <SEP> x <SEP> 4 <SEP> H20 <SEP> 25
<tb>
<tb>
<tb> H3B03 <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb> ZnS04 <SEP> x <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb> Na2MoO4 <SEP> x <SEP> 2 <SEP> H20 <SEP> 0,25
<tb>
<tb>
<tb> CuS04 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> H2O <SEP> 0,025
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> ml <SEP> einer <SEP> Lösung <SEP> aus <SEP> 7,45 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Ethylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz
<tb>
<tb>
<tb> und <SEP> 5,
57 <SEP> g <SEP> FeS04 <SEP> x <SEP> 7H2O <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
<tb>
<tb> myo-Inosit <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb> Glycin <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb> Nicotinsäure <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb> Pyridoxin-HCI <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb> Thiamin-HCI <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb> Folsäure <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb> Biotin <SEP> 0,05
<tb>
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Fertignährboden <SEP> (DIFCO-Bacto-Agar) <SEP> 8 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Indolessigsäure <SEP> 0,1
<tb>
pH des Mediums eingestellt auf 5,5
Von den durch Pollengrössenmessung und/oder Chromosomenzählung ausselektierten tetraploiden Kamillenpflanzen, die nach den vorstehend beschriebenen Möglichkeiten erhalten werden können, werden dann die Pflanzen ausselektiert, die einen Mindestgehalt an Chamazulen von 100 mg% und einen Mindestgehalt an Bisabolol von 200 mg% aufweisen,
während der Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxide) unter 50 mg% (bezogen auf die getrockneten Blüten, siehe Beispiel 1) liegen soll.
Die so ausselektierten Pflanzen werden nach Entfernung aller bereits aufgeblühten Blütenkörbchen im Gewächshaus bei 18 - 24 C Tag- und 12 -14 C Nacht-Temperatur und einer Tageslänge von mindestens 14 Stunden abblühen lassen, wobei über einen Zeitraum von 4 Wochen alle Blütenköpfchen die verblüht oder kurz vor dem Zerfallen sind, zur Saatgutgewinnung geerntet werden. Nach Trocknen bei einer Lufttemperatur zwischen 20 - 35 C erhält man beispielsweise das Vermehrungsgut der erfindungsgemässen Kamille.
Als weitere Kriterien für diese Selektion können zusätzlich noch die folgenden zur Anwendung kommen : a) ungefähr gleichzeitiges Blühen, b) eine gleichmässige, grundständige Verzweigung und eine schmale Blühzone von circa 10, insbesondere 5 cm, c) grosse Blütenköpfchen mit einem Aussendurchmesser von circa 30 mm (20 bis 40 mm),
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insbesondere 25 - 35 mm,
Die Anwendung der zusätzlichen Kriterien a) , b) und/oder c) führt beispielsweise zu hohen Blüten- und Drogenerträgen und besserer Eignung für die maschinelle Ernte.
Falls man von bereits bekannten tetraploiden Kamillen ausgeht, erfolgt die zuvor beschriebene Selektion sowie gegebenenfalls die weiteren Selektions- und Vermehrungsschritte in gleicher Weise.
Um eine Kamille zu erhalten, die ausser einem Gehalt von mindestens 100 mg% Chamazulen und mindestens 200 mg% (-)-a-Bisabolol (bezogen auf die getrockneten Blütenköpfchen) auch noch einen hohen Blütenertrag aufweist und für die maschinelle Ernte besser geeignet ist, empfiehlt sich folgendes Vorgehen :
Dieausselektierten Pflanzen (wie oben beschrieben) werden vegetativ durch Stecklinge vermehrt und über 3 bis 5 Generationen ausgelesen, wobei die Auswahl stets nach dem oben angegebenen Kriterium sowie gegebenenfalls den zusätzlichen Kriterien a) - c) erfolgt Die gemäss diesen Kriterien ausgesuchten Pflanzen werden verklont, aus den verklonten Pflanzen wird Saatgut gewonnen, die hieraus erhaltenen Pflanzen wiederum nach dem oben angegebenen Mindestgehalt an Chamazulen und Bisabolol sowie gegebenenfalls den zusätzlichen Kriterien a) - c) ausselektiert und aus letzteren wieder Saatgut gewonnen
Die Sequenz Aussaat - Selektion gemäss dem oben angegebenen Mindestgehalt an Chamazulen von 100 mg% und (-)-a-Bisabolol von mindestens 200 mg% (andere Bisaboloide unter 50 mg%) sowie gegebenenfalls den zusätzlichen Kriterien a) - c)
- Saatgutgewinnung kann 3-5 mal wiederholt werden.
Daran schliesst sich nochmals eine Sequenz Aussaat - wie zuvor angegebene Selektion (gegebenenfalls Verklonung) - Saatgutgewinnung an. Das zuletzt erhaltene Saatgut ist dann das Vermehrungsgut der erfindungsgemässen Kamille.
Die Stecklingsvermehrung erfolgt dabei auf folgende Weise' Zur Stecklingsvermehrung müssen die Ausgangspflanzen (Klonmutterpflanzen) unter Kurztagbedingungen blüten- knospenfreie Kurztriebe ausbilden. Dies erfolgt im Winterhalbjahr im Gewächshaus ohne Zusatzbeleuchtung oder in Klimakammem bei einer Tageslänge von 6 bis 10, vorzugsweise 8 Stunden und Temperaturen von 10 bis 15 C, vorzugsweise 12 C. Zur Verklonung beziehungsweise Vermehrung eignen sich Blatt-, Trieb- und insbesondere Kurztrieb- (Seitentrieb-)Stecklinge.
Ihre Bewurzelung erfolgt bei 12 bis 18 C, vorzugsweise 15 C und Tageslängen von 12 bis 16, vorzugsweise 14 Stunden in gespannter Atmosphäre (ca. 100 % relative Luftfeuchte) Als Substrat kann beispielsweise ein Torf-Sand-Gemisch im Verhältnis 1 :1 verwendet werden; es eignen sich aber auch reiner Quarzsand, Steinwolle-Stecklingswürfel, Torf- Stecklingswürfel und ähnliches.
Für die Aussaat kommen hierbei beispielsweise folgende Böden in Betracht: Gartenerde ; humose, mittelschwere Lehmböden; lehmige oder humose Sandböden.
Es kann im Gewächshaus oder auch im Freiland ausgesät werden. Die Temperaturen für Keimung und Wachstum der Pflanzen liegen beispielsweise zwischen 12 bis 24 C, inbesondere 18 bis 20 C. Falls im Freiland ausgesät wird, wird vorzugsweise im Herbst (September/Oktober) oder im Frühjahr (März/April) gesät. Diese Termine gelten für sämtliche in Frage kommenden Anbaugebiete (zum Beispiel nördliche Hemisphäre, gemässigte bis subtropische Klimagebiete).
Die neue, verfahrensgemässe Kamille gehört zur Kufturpflanzenart der echten Kamille mit der botanischen Bezeichnung Matricaria Chamomilla L. (synonym Chamomilla recutita (L.), Rauschert) und wird durch die Wirkstoffangaben des Patentanspruchs 1 definiert. Die angegebenen Werte für die Wirkstoffgehalte an Chamazulen, (-)-a-Bisabolol und Bisabololoxiden beziehen sich jeweils auf dasjenige Blüten-Entwicklungsstadium, welches erreicht ist, wenn 30 bis 70 %, insbesondere 40 bis 60 % aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind (das heisst die für die Wirkstoffbestimmung verwendeten Blüten wurden zu diesem Zeitpunkt gepflückt und dann 72 Stunden bei 40 C im Trockenschrank getrocknet).
Falls die Ernte der Kamillenblüten zu einem Zeitpunkt erfolgt, in dem das Blüten- Entwicklungsstadium weiter fortgeschritten ist, das heisst, wo beispielsweise 100 % oder bis zu 100 % aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind (zum Beispiel Stadium der Vollblüte) und/oder falls die Trocknung der geemteten Blüten bei höherer Temperatur als 40 C erfolgt, kann der Gehalt an den Wirkstoffen (-)-a-Bisabolol und Chamazulen niedriger sein, da durch höhere Trockentemperaturen und/oder bei späterer Ernte ein stärkerer Abbau des Azulens
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und Bisabolols eintreten kann.
Unter der Bezeichnung "übrige Bisaboloide" in dem Anspruch 1 werden insbesondere verstanden : (-)-a-Bisabololoxid A und B; (-)-a-Bisabolonoxid A; Weitere Bestandteile des ätherischen Öls der verfahrensgemässen Kamillensorte sind En-In-Dicycloether, Famesen, Spathulenol und in geringen Konzentrationen verschiedene leichtflüchtige Terpenkohlenwasserstoffe.
Beispielsweise enthalten die im Trockenschrank bei 40 C getrockneten Blüten (geerntet wie oben angegeben) der verfahrensgemässen Kamille zwischen 100 bis 200 mg% Chamazulen, zwischen 200 bis 450 mg% (-)-a-Bisabolol und nur wenig, das heisst zwischen 5 bis 50 mg% andere Bisaboloide bezogen auf die Trockensubstanz (das heisst bezogen auf das absolute Trockengewicht der Blüten). Dieses absolute Trockengewicht wird durch Trocknung einer separaten Probe von Kamillenblüten der verfahrensgemässen Kamille im Trocken schrank bei 105
C bis zur Gewichtskonstanz (72 bis 96 Stunden) bestimmt. Der Wirkstoffgehalt der bei beispielsweise 35 bis 50 C getrockneten Blüten (Droge) wird dann auf die bei 105 C ermittelte
Trockenmasse der Blüten berechnet.
In ihrem Phänotyp ist die neue Kamille den bisher bekannten tetraploiden Kamillensorten (zum
Beispiel Bodegold, Zloty Lan, BK-2, Pohorelicky Velkokvety) ähnlich ; sie unterscheidet sich von diesen insbesondere dadurch, dass bei der neuen Kamille (-)-a-Bisabolol die
Hauptkomponente des ätherischen Öls der Blüten ist und ausserdem der Gehalt an den übrigen
Bisaboloiden (Bisabololoxide A und B, Bisabolonoxid) ganz erheblich niedriger ist. Weitere
Bestandteile des ätherischen Öls der Kamille sind Farnesen, Spathulenol und En-In-Dicycloäther.
Die neue Kamille kann auf allen Böden mit Ausnahme von Böden mit einem Gehalt von mehr als 20 % an organischer Substanz (Humusstoffe und Bodenorganismen) erfolgreich angebaut werden; es sind keine besonderen agrotechnischen Verfahren oder Kulturmassnahmen erforderlich, Lediglich ist für den Anbau ein Langtag mit über 13 Stunden maximale Tageslänge notwendig, das heisst für den Anbau kommen insbesondere die gemässigten Zonen und die
Subtropen in Frage.
Die neue Kamille weist häufig zusätzlich noch folgende Vorteile auf : Ertrag, mittelspäter Erntetermin, einheitliche Wuchshöhe mit schmaler Blühzone und grosse
Blütenköpfchen; daher besondere Eignung für die mechanische Ernte. Hinzu kommt, dass zu gleicher Zeit ausgesäte Pflanzen im allgemeinen praktisch zur gleichen Zeit gemeinsam abblühen, so dass auch hierdurch die Ernte sehr vereinfacht und erleichtert wird.
Die zuletzt genannten Vorteile treten dann auf, wenn folgende Verfahrensbedingungen zur
Anwendung kommen: Von den tetraploiden Kamillenpflanzen, die einen Mindestgehalt an Chamazulen von 100 mg% und an (-)-a-Bisabolol von 200 mg% aufweisen, während der Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxiden) unter 50 mg% liegt (alle Werte bezogen auf die getrockneten
Blütenköpfchen), werden nur diejenigen ausselektiert, welche - ungefähr gleichzeitig blühen, - eine gleichmässige grundständige Verzweigung und eine schmale Blühzone von ca. 10 cm sowie - grosse Blütenköpfchen mit einem Aussendurchmesser von ca 30 mm aufweisen.
Die ausselektierten Pflanzen werden vegetativ über Stecklinge vermehrt und über 3-5
Generationen ausgelesen, wobei die Auswahl stets nach den oben genannten Kriterien erfolgt.
Die ausgesuchten Pflanzen werden vegetativ vermehrt (verklont), gemeinsam abblühen gelassen, und es wird hiervon das Saatgut gewonnen. Die aus dem Saatgut erhaltenen Pflanzen werden wiederum nach den oben angegebenen Kriterien selektiert und die Sequenz Aussaat-Selektion-
Saatgutgewinnung-Aussaat wird 3 - 5 mal wiederholt.
Eine aus der neuen Kamille hergestellte Droge enthält den maximalen Gehalt an den
Wirkstoffen Chamazulen und (-)-a-Bisabolol dann, wenn die Ernte der Kamillenblütenköpfchen in dem Vegetationsstadium erfolgt, wo beispielsweise 30 bis 70 %, vorzugsweise 40 bis 60 %, das heisst im allgemeinen 50 % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die
Trocknung bei einer Lufttemperatur von höchstens 50 C, beispielsweise 35 bis 50 C, insbesondere 40 C, erfolgt
Die Trocknung kann entweder durch künstliche Luftzufuhr oder auch durch Trocknung im
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Schatten, gegebenenfalls auch in der Sonne erfolgen, wobei jedoch darauf geachtet werden soll, dass die Wärmezufuhr nicht über das zur vollständigen Trocknung erforderliche Mass hinausgeht.
Es ist also vorteilhaft, dass man sich durch Kontrollwägungen von der erreichten Gewichtskonstanz überzeugt. Die Trocknung kann spontan oder künstlich (zum Beispiel mit künstlicher Warmluft) erfolgen Die Wirkstoffausbeute ist am grössten bei spontaner Trocknung unter Ausschluss des Sonnenlichts, vorzugsweise bei 40 - 60 C, insbesondere 40 - 50 C. Der Trocknungsprozess soll möglichst bald beziehungsweise umgehend nach der Ernte stattfinden. Die Trocknung soll in dünnen Schichten, beispielsweise von 5 bis 20 cm, vorzugsweise 10 cm Dicke durchgeführt werden. Die Trocknung ist zum Beispiel auch in gut durchlüfteten Hallen bei einer Lufttemperatur zwischen 20 - 30 C möglich. Im allgemeinen soll die Lufttemperatur für die Trocknung nicht höher als 60 C sein. Günstig ist zum Beispiel eine Lufttemperatur zwischen 35 und 50 C.
Der Wirkstoffgehalt einer erfindungsgemäss aus der Kamille hergestellten Droge, insbesondere an den Hauptwirkstoffen Chamazulen und (-)-a-Bisabolol ist abhängig von dem Vegetationsstadium, in dem sich die Blüten zum Erntezeitpunkt befinden und von der Trocknung der geemteten Blüten. Je höher die Trocknungstemperatur ist, desto stärker ist der Abbau der Wirkstoffe, das heisst, desto niedriger der Gehalt der getrockneten Blüten an den Wirkstoffen. Aus dem gleichen Grund hat direktes Sonnenlicht bei der Trocknung einen nachteiligen Einfluss und soll nach Möglichkeit vermieden werden.
Das Vegetationsstadium einer Blüte wird dadurch charakterisiert, wieviel % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens zu einem bestimmten Zeitpunkt (hier dem Zeitpunkt der Ernte) geöffnet sind. Es können also Blüten geerntet werden, wo beispielsweise zwischen 30 - 50 %, 30 - 70 %, 40 - 60 %, 60 - 100 % oder 90 - 100 % der Röhrenblüten eines Köpfchens geöffnet sind ; DerWirkstoffgehalt ist abhängig davon, in welchem Stadium sich die Blüten jeweils befinden und er ist bei der erfindungsgemäss zu verarbeitenden Kamille am grössten, wenn 40 - 60 % aller Röhrenblüten geöffnet sind und er ist sowohl bei weniger als auch bei mehr geöffneten Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geringer.
Es ist daher gerade ein grosser Vorteil der neuen Kamille, dass bei dieser das Abblühen der einzelnen Pflanzen gleichmässig erfolgt, das heisst dass von einer Aussaat die überwiegende Zahl der Pflanzen jeweils das gleiche Blühstadium aufweisen, das heisst, dass beispielsweise bei den weitaus meisten Pflanzen 40 - 60 % aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens zum gleichen Zeitpunkt geöffnet sind Dadurch ist gerade bei der neuen Kamille eine vollständige Erfassung der Blütenköpfchen zum optimalen Zeitpunkt möglich und die neue Kamille deshalb besonders geeignet für die mechanische Ernte.
Der Zusammenhang des Gehalts an Chamazulen und (-)-#-Bisabolol einerseits mit dem Blühstadium zur Zeit der Ernte und andererseits mit der Trocknungstemperatur bei der Drogengewinnung ist beispielsweise in folgender Tabelle dargestellt (der Gehalt an übrigen Bisaboloiden ist in allen Fällen weniger als 50 %).
EMI9.1
<tb>
Trocknungs- <SEP> Vegetationsstadium <SEP> der <SEP> Blüten <SEP> zum <SEP> Erntezeitpunkt
<tb>
<tb>
<tb> temperatur <SEP> 30 <SEP> - <SEP> 70% <SEP> aller <SEP> Röhren- <SEP> 70 <SEP> - <SEP> 100% <SEP> aller <SEP> Röhren-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (Luft- <SEP> blüten <SEP> eines <SEP> Blüten- <SEP> blüten <SEP> eines <SEP> Blüten-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> temperatur) <SEP> köpfchens <SEP> eöffnet <SEP> köpfchens <SEP> geöffnet
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Wirkstoffgehalt <SEP> im <SEP> ge- <SEP> Wirkstoffgehalt <SEP> im <SEP> ge-
<tb>
<tb>
<tb> trockneten <SEP> Material: <SEP> trockneten <SEP> Material:
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nicht <SEP> höher <SEP> Chamazulen: <SEP> Chamazulen:
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> als <SEP> 50 C <SEP> mindestens <SEP> 100 <SEP> mg% <SEP> mindestens <SEP> 40 <SEP> mg%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (-)-a-Bisabolol:
<SEP> (-)-a-Bisabolol:
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mindestens <SEP> 200 <SEP> mg% <SEP> mindestens <SEP> 120 <SEP> mg%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Wirkstoffgehalt <SEP> im <SEP> Wirkstoffgehalt <SEP> im
<tb>
<tb>
<tb> alkoholischen <SEP> Auszug <SEP> alkoholischen <SEP> Auszug
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nicht <SEP> höher <SEP> Chamazulen: <SEP> Chamazulen:
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> als <SEP> 50 C <SEP> mindestens <SEP> 5,0 <SEP> mg% <SEP> mindestens <SEP> 2,0 <SEP> mg%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (-)-a-Bisabolol:
<SEP> (-)-a-Bisabolol:
<tb>
<tb>
<tb> mindestens <SEP> 10,0 <SEP> mg% <SEP> mindestens <SEP> 6,0 <SEP> mg%
<tb>
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EMI10.1
<tb> Wirkstoffgehalt <SEP> im <SEP> ge- <SEP> Wirkstoffgehalt <SEP> im <SEP> ge-
<tb>
<tb>
<tb> trockneten <SEP> Material- <SEP> trockneten <SEP> Material:
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> zwischen <SEP> Chamazulen- <SEP> Chamazulen:
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 50-70 C <SEP> mindestens <SEP> 50 <SEP> mg% <SEP> mindestens <SEP> 30 <SEP> mg%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (-)-a-Bisabolol: <SEP> (-)-a-Bisabolol:
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mindestens <SEP> 150 <SEP> mg% <SEP> mindestens <SEP> 100 <SEP> mg%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Wirkstoffgehalt <SEP> im <SEP> Wirkstoffgehalt <SEP> im
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> alkoholischen <SEP> Auszug <SEP> alkoholischen <SEP> Auszug
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> zwischen <SEP> Chamazulen:
<SEP> Chamazulen:
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 50-70 C <SEP> mindestens <SEP> 2,5 <SEP> mg% <SEP> mindestens <SEP> 1,5 <SEP> mg%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (-)-a-Bisabolol <SEP> (-)-a-Bisabolol.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mindestens <SEP> 7,5 <SEP> mg% <SEP> mindestens <SEP> 10,0 <SEP> mg%
<tb>
Hieraus folgt, dass aus der Kamille, die zur Herstellung der erfindungsgemässen Mittel eingesetzt wird, beispielsweise bei einer Ernte, die im Vegetationsstadium stattfindet, wo zwischen 30 - 100 % der Röhrenblüten der Blütenköpfchen geöffnet sind und die Trocknung bei Lufttemperaturen bis zu 70 C erfolgen kann, ein trockenes Material erhalten wird, dessen Chamazulengehalt in jedem Fall mindestens 30 mg% und dessen (-)-a-Bisabololgehalt mindestens 100 mg% beträgt, während der Gehalt an übrigen Bisaboloiden stets geringer als 50 mg% ist.
In den alkoholischen Auszügen ist der Gehalt an übrigen Bisaboloiden stets niedriger als 10 mg%.
Der Gehalt des ätherischen Öls, welches gemäss den Bedingungen der vorstehend angegebenen Tabelle aus einem getrockneten Material hergestellt wird, an Chamazulen und Bisabolol ist stets mindestens 3,5 % Chamazulen, mindestens 10 % (-)-a-Bisabolol und weniger als 10 % an übrigen Bisaboloiden.
Die Bestimmung des Chamazulens erfolgt spektralphotometrisch ähnlich der bei Kamillenextrakten üblichen Weise.
Die Bestimmung des (-)-a-Bisabolols sowie der übrigen Inhaltsstoffe des Kamillenöls erfolgt nach der hierfür üblichen gaschromatographischen Methode Eine genaue Schilderung der analytischen Bestimmungsmethoden enthält die Anlage A.
Der Wirkstoff Chamazulen liegt in den Kamillenblüten nicht als solcher, sondern in Form des Sesquiterpenlactons Matricin vor. Das Matricin besitzt eine pharmakologische Wirkung, die ähnlich derjenigen des Chamazulens ist. Aus dieser Vorstufe Matricin entsteht beispielsweise beim Erhitzen (zum Beispiel Wasserdampfdestillation, Teeaufguss) sofort das Chamazulen. Es ist daher üblich, bei der Kamille nicht den Gehalt an Matricin, sondern den Gehalt des sich hieraus bildenden Chamazulens anzugeben.
Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäss zu verarbeitenden Kamille sind beispielsweise : Gewinnung von Kamillendroge, Kamillenöl, Kamillenextrakten sowie (-)-a- Bisabolol, Charoazulen und anderen Kamilleninhaltsstoffen. So können aus der Droge, die aus der neuen Kamille erhalten wird, zum Beispiel durch Extraktion mit Alkoholen beziehungsweise wässrigen Alkoholmischungen oder durch Extraktion mit überkritischen Gasen Kamillenauszüge beziehungsweise Kamillenextrakte erhalten werden. Weiterhin können aus der Droge Kamillenöl, (-)-a-Bisabolol, Chamazulen und andere Kamilleninhaltsstoffe erhalten werden.
Alkoholische Auszüge der Droge enthalten beispielsweise mindestens 1,5 mg%, vorzugsweise 5,0 mg% Chamazulen und mindestens 5,0 mg%, vorzugsweise mindestens 10 mg% (-)-a- Bisabolol im alkoholischen Drogenauszug und weniger als 8 mg% an übrigen Bisaboloiden. Die Herstellung solcher Auszüge erfolgt in der hierfür üblichen Weise.
Für die Extraktion können beispielsweise Mischeinrichungen, zum Beispiel sogenannte Muldenmischmaschinen, Perkolatoren und andere geeignete Extraktionsapparaturen verwendet werden. Die Temperatur während der Extraktion beträgt beispielsweise 10 bis 50 C. Eine Kühlung ist nicht erforderlich.
<Desc/Clms Page number 11>
Als Lösungsmittel kommen insbesondere gerade oder verzweigte aliphatische, ein- oder mehrwertige Alkohole mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen wie zum Beispiel Methanol, Ethanol, Propanol-(2), Butanol, Glycerin, Isopropylidenglycerol und ähnliche in Frage, sowie Gemische dieser Lösungsmittel mit Wasser
Es können auch Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden. Die Mindestmenge an Lösungsmitteln beträgt 2 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil des getrockneten Materials. Im allgemeinen verwendet man 2 bis 20 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil des getrockneten Materials, insbesondere 3 bis 10 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil des getrockneten Materials.
Für die Herstellung von Extrakten, insbesondere alkoholischen Extrakten, können auch frische Kamillen- blüten beziehungsweise eingefrorene Kamillenblüten (falls frische Blüten eingefroren wurden) verwendet werden
Ein aus der Droge erhaltenes ätherisches Öl enthält mindestens 3,5 % Chamazulen, vorzugsweise mindestens 5 % Chamazulen und mindestens 10 % (-)-a-Bisabolol, vorzugsweise mindestens 15 % (-)-a-Bisabolol und weniger als 10 % an übrigen Bisaboloiden.
Die Herstellung eines solchen ätherischen Öls erfolgt im allgemeinen dadurch, dass man die Droge mit Wasser, beispielsweise in Gegenwart von Ascorbinsäure (zum Beispiel als Salz, insbesondere als Natriumsalz) bei einem pH-Wert zwischen 4 und 6, vorzugsweise 5 bis 5,5 zum Sieden erhitzt Der pH-Wert wird beispielsweise mittels einer Säure, wie Salzsäure, eingestellt. Auf 1 Gewichtsteil des getrockneten Materials werden beispielsweise 10 bis 50 Gewichtsteile Wasser und gegebenenfalls 0,1 bis 1 Gewichtsteil Ascorbinsäure verwendet. Es wird im allgemeinen 2 bis 8 Stunden erhitzt.
Das erhaltene wässrige Destillat wird mehrmals mit einem niederen aliphatischen, flüssigen Kohlenwasserstoff (zum Beispiel Petrolether (zum Beispiel Kp 35 - 60 C), Pentan, Xylol, Decalin) mehrmals ausgeschüttelt, die organische Phase getrocknet (zum Beispiel mittels Natriumsulfat) und das organische Lösungsmittel in schonender Weise entfernt (beispielsweise durch Ab- destillieren im Rotationsverdampfer oder durch Destillation bei 40 - 70 C, vorzugsweise bei 50 - 60 C). Bei höhersiedenden Lösungsmitteln wird dieses Abdestillieren unter Vakuum durchgeführt.
Die Bestimmung der Inhaltsstoffe erfolgt wie bereits angegeben.
Werden die Blüten der erfindungsgemäss zu verarbeitenden Kamille in einem Vegetationsstadium geerntet, wo 30 - 100 % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur bis zu 70 C getrocknet, so enthält eine so erhaltene Droge beispielsweise mindestens 30 mg% Chamazulen, mindestens 100 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden und ein aus dieser Droge durch Destillation in Gegenwart von Wasser hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5 % Chamazulen, mindestens 10 % (-)-a-Bisabolol und weniger als 10 mg% an übrigen Bisaboloiden, und ein durch Extraktion mit niederen Alkoholen hergestellter alkoholischer Kamillenauszug mindestens 1,5 mg% Chamazulen, mindestens 5,0 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 10 mg% an übrigen Bisaboloiden.
Werden die Blüten der erfindungsgemäss zu verarbeitenden Kamille in dem Vegetationsstadium geerntet, wo 30 - 70 % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur von nicht höher als 50 C getrocknet, so enthält eine solche Droge beispielsweise mindestens 100 mg% Chamazulen, mindestens 200 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden, ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5 % Chamazulen, mindestens 10 % (-)-a-Bisabolol und weniger als 10 % an übrigen Bisaboloiden, und ein aus dieser Droge hergestellter alkoholischer Auszug mindestens 5,0 mg% Chamazulen, mindestens 10,0 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 10,0 mg% an übrigen Bisaboloiden.
Werden die Blüten der erfindungsgemäss zu verarbeitenden Kamille in dem Vegetationsstadium geemtet, wo 30 - 70 % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur zwischen 50 - 70 C getrocknet, so enthält die so erhaltene Droge zum Beispiel mindestens 50 mg% Chamazulen, mindestens 150 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden, ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5 % Chamazulen, mindestens 10 % (-)-a-Bisabolol und weniger als 10 % an übrigen Bisaboloiden und ein aus einer solchen Droge hergestellter alkoholischer Auszug mindestens 2,5 mg% Chamazulen, mindestens 7,5 mg% (-)-a-Bisabolol und
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weniger als 10,0 mg% an übrigen Bisaboloiden.
Werden die Blüten in dem Vegetationsstadium geerntet, wo 70 - 100 % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur von nicht hoher als
50 C getrocknet, so enthält die so erhaltene Droge beispielsweise mindestens 40 mg%
Chamazulen, mindestens 120 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen
Bisaboloiden, ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5 %
Chamazulen, mindestens 10 % (-)-a-Bisabolol und weniger als 10 % an übrigen Bisaboloiden und ein aus dieser Droge hergestellter alkoholischer Auszug mindestens 2,0 mg% Chamazulen, mindestens 6,0 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 10,0 mg% an übrigen Bisaboloiden.
Werden die Blüten der erfindungsgemäss zu verarbeitenden Kamille in dem
Vegetationsstadium geerntet, wo 70 - 100 % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur zwischen 50 - 70 C getrocknet, so enthält die so erhaltene Droge beispielsweise mindestens 30 mg% Chamazulen, mindestens 100 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden, ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5 % Chamazulen, mindestens 10 % (-)-a-Bisabolol und weniger als 10 % an übrigen Bisaboloiden und ein aus dieser Droge hergestellter alkoholischer
Auszug mindestens 1,5 mg% Chamazulen, mindestens 10 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als
10,0 mg% an übrigen Bisaboloiden.
Beispiel 1 (Ausgangskamille ist tetraploid)
Durch Einzelpflanzenvariabilitätstests von 10 000 Pflanzen der tetraploiden Kamillensorte, die von I. Särkäny (Herba Hungar. 4 (1), 125 - 169 (1965) beschrieben wurde, wurde gefunden, dass auf etwa 1000 Individuen eine Pflanze kommt, die im ätherischen Öl einen hohen
Chamazulengehalt von 20 Gewichtsprozent sowie einen hohen (-)-a-Bisabololgehalt von 50 Ge- wichtsprozent aufweist, wobei gleichzeitig der Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere (-)-a-Bisabolonoxid) sehr gering (weniger als 5 Gewichtsprozent) ist Diese Individuen wurden ausselektiert und folgenden Schritten unterworfen:
Schritt 1:
Von der Nachkommenschaft der (wie oben beschriebenen) aus selektierten tetraploiden
Kamillenpflanzen wurden diejenigen Individuen ausgelesen, die
A) etwa gleichzeitig blühen,
B) eine gleichmässige, grundständige Verzweigung und eine schmale Blühzone von ca.
10 cm, vorzugsweise 5 cm, aufweisen,
C) grosse Blütenköpfchen mit einem Aussendurchmesser von ca. 30 mm, vorzugsweise 25 -
35 mm aufweisen,
D) einen Mindestgehalt für Chamazulen von 150 mg% und Bisabolol von 300 mg% erreichen oder überschreiten und deren Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxide) deutlich unter 50 mg% liegt. (Sämtliche Werte beziehen sich auf Blütenköpfchen, die bei 40 C getrocknet wurden und deren Ernte in dem Stadium erfolgte, wo 30 - 70 % aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind.
Diese Pflanzen wurden verklont. Hierzu wurden die Pflanzen (Klonmutterpflanzen) zunächst auf circa 15 cm Sprosslänge zurückgeschnitten, unter 8 bis 10 Stunden Tageslänge und 12 bis
14 C zum Neuaustrieb (kurze Seitentriebe) gebracht Die Kurztriebe wurden geschnitten und in ein Torf-Sand-Gemisch gesteckt. Bei circa 100 % relativer Luftfeuchte, 15 C Lufttemperatur und einer Tageslänge von 14 Stunden dauerte die Bewurzelung der Stecklinge 7 bis 14 Tage.
Anstelle der angegebenen konventionellen Verklonung (Steckling s Vermehrung) kann auch die in-vitro-Vermehrung teilungsfähiger Gewebspartien der Pflanze eingesetzt werden (sogenahnte Meristem-Vermehrung). Zur Etablierung einer Kamillen-Kultur eignen sich verschiedene Teile der Pflanze, vorzugsweise die Sprossspitzen oder die Achselknospen.
Nach Abspülen der Pflanzen mit H2O2 werden unter aseptischen Bedingungen im "Laminar
Flow" (Hochleistungs-Schwebstoff-Filter mit turbulenzarmer Verdrängungsströmung) Sprossspitzen der Blattachselknospen entnommen und in Reagenzgläser übertragen, die mit einem
Nährmedium, beispielsweise nach Murashige und Skoog (Physiol.Plant. 15, 473 - 497,1962) gefüllt sind Die Reagenzgläser werden in einen Klimaraum mit 12-18, vorzugsweise 16 Stunden
Tageslänge (erreicht durch Fluoreszenz-Leuchtstoff röhren), einer Lichtintensität von 500 -
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10.000 lux, vorzugsweise 1.000 - 3.000 lux und einer Temperatur von 15 - 30 C, vorzugsweise 22 - 27 C gestellt.
Sobald die Explantate ein gutes Wachstum zeigen, werden sie auf ein obengenanntes Nährmedium, jedoch mit einer höheren Cytokininkonzentration* (zum Beispiel 30 mg/l 6- Isopentenyladenin) und wenig oder gar keinem Auxin (0 - 0,3 mg/l Indolessigsäure) überführt. In der Folge strecken sich die Achsen und es werden Adventivorgane sowie vermehrt Achselknospen gebildet Diese können nach der vorerwähnten Weise entnommen und angezogen werden.
Die für die Pflanzenvermehrung in grösserer Zahl bestimmten Explantate (der 3. Passage = 3.
Vermehrungsgeneration) werden nach Anwachsen und Ausbildung der Blätter auf dem erstgenannten Nährmedium auf einen Nährboden übertragen, welcher 10 mg/l Indolessigsäure oder 3-lndolbuttersäure oder 0,1 - 0,3 mg/l a-Naphthylessigsäure enthält Dabei bewurzeln sich die Pflänzchen und können nach etwa 4 Wochen in mit sterilisierter Gartenerde (12 Stunden bei 120 C gedämpft) gefüllte Topfe gepflanzt und im Gewächshaus (unter Bedingungen wie für die konventionelle Stecklingsvermehrung üblich) weiterkultiviert werden.
Nährmedium nach Murashige & Skoog: mg/l mg/l NH4N03 400 Indolessigsäure 2,0 Ca(NO3)2 4H2O 144 Furfuryladenin 0,1 KNO3 80 Thiamin 0,1 KH2P04 12,5 Nicotinsäure 0,5 MgS047H20 72 Pyridoxin 0,5 KC1 65 Glycin 2,0 NaFe-EDTA 25 myo-Inosit 100 H3B03 1,6 Casein-Hydrolys. 1000 MnS044H20 6,5 Saccarose 2 % ZnS047H20 2,7 gereinigtes KJ 0,75 Agar-Pulver 1 % * Cytokinine sind Phytohonnone, welche die Zellteilung fördern
Schritt 2.
Die nach Schritt 1 erhaltenen Pflanzen blühten unter isolierten Bedingungen im Gewächshaus gemeinsam ab. Die Pflanzen standen hierbei in 11-cm-Töpfen, gefüllt mit Gartenerde, bei 18 bis 24 C Tag- und 12 bis 14 C Nacht-Temperatur. Die Tageslänge betrug mindestens 14 Stunden und wurde im Winterhalbjahr durch Zusatzbelichtung (200 Watt/m2) erreicht. Die Wasserversorgung erfolgte nach Bedarf.
Von der Gesamtheit der selektierten Individuen wurden über einen Zeitraum von 4 Wochen laufend diejenigen Köpfchen zur Saatgutgewinnung geerntet, die verblüht und kurz vor dem Zerfallen waren. Trocknung erfolgte in einer gut durchlüfteten Halle bei einer Lufttemperatur zwischen 20 - 30 C ; anschliessend wurde das Saatgut mittels eines Schlitzsiebes (5 x 0,4 mm) abgesiebt und durch einen Steigsichter nachgereinigt.
Schritt 3:
Aus dem nach Schritt 2 erhaltenen Saatgut wurde eine Stichprobe entnommen und hieraus circa 2000 Nachkommen gezogen (ökologische Bedingungen wie bei Schritt 2) und nach den gleichen Kriterien A) bis D) von Schritt 1 selektiert. Mit den so selektierten Individuen wurde dann gemäss Schritt 2 verfahren.
Schritt 4:
Von dem Saatgut gemäss Schritt 3 wurde ein Teil an zwei verschiedenen Standorten im Herbst ausgesät.
Standort I)
450 m NN, 48,5 N/11,5 O
750 mm Jahresniederschlagssumme, feucht-gemässigtes Klima,
Januar -10 bis 0 C,
Juli +10 bis +20 C,
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NN = nördlich Normalnull = Seehöhe N = nördliche Breite (ngrad) O = östliche Länge (ngrad)
Standort 11)
200 m NN, 42 N / 1 0,
400 mm Jahresniederschlagssumme, mediterranes Klima,
Januar 0 bis +10 C,
Juli +20 bis +30 C.
Die Aussaat erfolgte an beiden Standorten Ende September/ Anfang Oktober.
Die so erhaltenen Feldversuchsbestände wurden hinsichtlich homogenem Wuchs, Blütengrösse und Emtetermin überprüft und beurteilt (bonitiert), ausserdem wurden Stichproben der Blüten auf die Wirkstoffgehalte untersucht. Aus dem Feldbestand wurden emeut diejenigen Individuen selektiert, die den bei Schritt 1 genannten Parametern entsprechen. Von diesen wird Saatgut entsprechend Schritt 2, letzter Satz, gewonnen.
Schritt 5:
Mit dem Saatgut gemäss Schritt 4 wurden die Schritte 3 und 4 in der angegebenen Reihenfolge und Weise wiederholt
Schritt 6:
Aus dem nach Schritt 5 gewonnenen Saatgut wurden circa 1500 Individuen gezogen (ökologische Bedingungen wie bei Schritt 2) und nach dem gleichen Prinzip, wie bei Schritt 1 angegeben ist, selektiert. Von den so ausselektierten Pflanzen wurden 34 Individuen ausgewählt und gemäss Schritt 1 verklont. Je 10 Pflanzen jedes Klons wurden in zufälliger Verteilung im Abstand 40 x 30 cm im Freiland (Standort I, siehe Schritt 4) an isolierter Stelle aufgepflanzt. Der Boden war Lösslehm, pH 7,0; die Pflanzung erfolgte Anfang Juni, die erste Ernte der Samen Mitte Juli, danach wurden die Pflanzen zurückgeschnitten, blühten nochmals und lieferten Mitte bis Ende August eine zweite Saatguternte.
Die Saatgutgewinnung dieses Materials erfolgte gemäss Schritt 2
Das nach Schritt 6 erhaltene Saatgut ist das Vermehrungsgut der neuen Kamille.
Blüten von Pflanzen aus diesem Vermehrungsgut (Aussaat September/Oktober, Ernte Anfang Juni des darauffolgenden Jahres), die zu dem Zeitpunkt gepflückt werden, wenn 30 - 70 % der Röhrenblüten geöffnet sind, und die sofort anschliessend im Trockenschrank bei 40 72 Stunden getrocknet wurden, enthalten, bezogen auf das Gewicht der getrockneten Blüten (Trockensubstanz), beispielsweise mindestens : mg% Chamazulen, 300 mg% (-)-a-Bisabolol und höchstens 50 mg% übrige Bisaboloide.
Weitere beispielhafte Angaben zu den gemäss dem Beispiel erhaltenen Pflanzen der neuen Kamille:
1. Wuchs
Stengel: aufrecht, wenig verzweigt;
2. Belaubung
Blatt: fiederteilig, 2- bis 3fach;
Stärke : mittel,
Fiederblatt, Farbe mittelgrün;
Fiederblatt (Stengelmitte); Fiederung : mittel bis stark gefiedert;
3 Blütenstand
Blütenkörbchen (Blütenköpfchen): circa 30 mm äusserer Durchmesser, circa 15 mm innerer Durchmesser,
Einzelkörbchengewicht (trocken) : circa 45 mg;
Blütenspross, Länge (mm) : circa 700, jedoch abhängig von Anbauort (Klima), Aussaattermin, Boden, Düngung, Pflanzenbehandlung, Witterung;
Beginn der Blüte (Tag ab 1. Januar): circa 160. Tag (Aussaat September, Standort Freising Bundesrepublik Deutschland,
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ansonsten abhängig von den oben genannten Faktoren)
Blüte.
Mitte Juni (siehe oben);
Blütenstände ohne Stiel, Gehalt an ätherischem Öl (% der Trockensubstanz): circa 1,0 %;
Gehalt an Azulen im ätherischen Öl mindestens 15 %;
Zerfall der getrockneten Blütenstände, Blütendroge: gering, wenn vor öffnen der letzten Röhrenblüten geerntet,
Pollendurchmesser: circa 30 um;
Samenlänge: circa 1,25 mm;
Chromosomenzahl der somatischen Zellen: 4 n = 36,
4. Frucht Tausendkornmasse (TKM) der Samen : bis 0,13 g;
5. Keimfähigkeit (KF) ca. 75 %;
6. Reinheit
94 - 95 %;
7. Weitere Merkmale Eintrocknungsverhältnis frisch : trocken (Blüte) = 5,5 bis 6 :1, aromatischer
Geruch der Droge, fein aromatischer, typischer Geschmack des Teeaufgusses.
Darüberhinaus können folgende Eigenschaften vorliegen : EinheitlicheWuchshöhe (Ausgeglichenheit) mit schmaler Blühzone, daher besonders geeignet für die mechanische Ernte, grosse Blütenköpfchen, mittelhoher Ertrag;grundständig verzweigte (3 bis 5fach) Form.
Gewinnung der Droge:
Die gemäss diesem Beispiel erhaltene Kamille wird in üblicher Weise feldmässig ausgesät Sobald die Pflanzen sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in dem Vegetationsstadium sind, wo etwa 50 % der Röhrenblüten geöffnet sind, werden diese Blütenköpfchen mit einer
Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände der Pflückmaschine so eingestellt sind, dass nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten zu 50 % offen sind, abgestreift werden. Das
Emtegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet. Anschliessend werden die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der
Gewichtsverlust beträgt etwa 80 %.
Die Trocknung erfolgt im Schatten an einer gut belüfteten Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10 cm.
Nach etwa 2-3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und Blütengrus wird die Kamillendroge gesiebt und anschliessend in Ballen gepresst
Analyse Ätherisches Öl 960 mg%
Chamazulen: 162 mg% (-)-a-Bisabolol: 330 mg%.
Erfolgt die Trocknung beispielsweise in einer stationären Bandtrockenanlage mittels künstlich erwärmter Luft bei einer Temperatur zwischen 50 und 70 C, so ist die Trocknung nach etwa 4-5 Stunden beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und Blütengrus wird die Droge gesiebt und anschliessend in Ballen gepresst.
Die Analysenwerte einer solchen Droge sind zum Beispiel.
Ätherisches Öl 870 mg%
Chamazulen: 94 mg% (-)-a-Bisabolol: 197 mg%.
Beispiel 2 (Ausgangskamille ist tetraploid)
Durch Einzelpflanzenvariabilitätstests von 10 000 Pflanzen der tetraploiden Kamillensorte, die von I. Särkäny (Herba Hungar. 4 (1), 125 - 169 (1965) beschrieben wurde, wurde gefunden, dass auf etwa 1000 Individuen eine Pflanze kommt, die im ätherischen Öl einen hohen Chamazulengehalt von 20 Gewichtsprozent sowie einen hohen (-)-Ó-Bisabololgehalt von 50 Gewichtsprozent aufweist, wobei gleichzeitig der Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere (-)-a-Bisabolonoxid sehr gering (weniger als 5 Gewichtsprozent) auf weist.
Diese Individuen wurden ausselektiert und folgenden Schritten unterworfen:
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Schritt 1 :
Von der Nachkommenschaft der wie oben beschriebenen ausselektierten tetraploiden Kamillenpflanzen wurden diejenigen Individuen ausgelesen, die einen Mindestgehalt für Chamazulen von 100 mg% und für (-)-a-Bisabolol von 200 mg% erreichen oder überschreiten und deren Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxiden) unter 50 mg% liegt.
Sämtliche Werte beziehen sich auf Blütenköpfchen, die bei ca. 40 C getrocknet wurden und deren Ernte in dem Stadium erfolgte, wenn ca. 30 - 70 % aller Röhrenblüten eines Köpfchens geöffnet sind
Schritt 2:
Von den nach Schritt 1 erhaltenen Pflanzen wurden alle aufgeblühten Blütenkörbchen entfernt, anschliessend kamen die Pflanzen in ein Gewächshaus und blühten unter isolierten Bedingungen gemeinsam ab. Die Pflanzen standen hierbei in 11-cm-Töpfen, gefüllt mit Gartenerde, bei 18 bis 24 C Tag- und 12 bis 14 C Nacht-Temperatur. Die Tageslänge betrug mindestens 14 Stunden und wurde im Winterhalbjahr durch Zusatzbelichtung (200 Watt/m2) erreicht Die Wasserversorgung erfolgte nach Bedarf.
Von der Gesamtheit der selektierten Individuen wurden über einen Zeitraum von 4 Wochen laufend diejenigen Köpfchen zur Saatgutgewinnung geemtet, die verblüht und kurz vor dem Zerfallen waren. Trocknung erfolgte in einer gut durchlüfteten Halle bei einer Lufttemperatur zwischen 20 - 30 C ; anschliessend wurde das Saatgut mittels eines Schlitzsiebes (5 x 0,4 mm) abgesiebt und durch einen Steigsichter nachgereinigt
Das nach Schritt 2 erhaltene Saatgut ist das Vermehrungssaatgut der neuen Kamille.
Blüten von Pflanzen aus diesem Vermehrungsgut (Aussaat September/Oktober, Ernte Anfang Juni des darauffolgenden Jahres), die zu dem Zeitpunkt gepflückt werden, wenn 30 - 70 % der Röhrenblüten geöffnet sind, und die sofort anschliessend im Trockenschrank bei 40 C 72 Stunden getrocknet wurden, enthalten, bezogen auf das Gewicht der getrockneten Blüten, mindestens 100 mg% Chamazulen, mindestens 200 mg% (-)-a-Bisabolol und höchstens 50 mg% übrige Bisaboloide.
Gewinnung der Droge:
Die gemäss diesem Beispiel erhaltene Kamille wird in üblicher Weise feldmässig ausgesät.
Sobald die Pflanzen sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in dem Vegetationsstadium sind, wo etwa 50 % der Röhrenblüten geoffnet sind, werden diese Blütenköpfchen mit einer Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände der Pflückmaschine so eingestellt sind, dass nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten zu 50 % offen sind, abgestreift werden. Das Erntegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet. Anschliessend werden die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der Gewichtsverlust beträgt etwa 80 %.
Die Trocknung erfolgt im Schatten an einer gut belüfteten Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10 cm,
Nach etwa 2-3 Tagen ist die Trocknung beendet Zur Entfernung von Stengelteilen und Blütengrus wird die Kamillendroge gesiebt und anschliessend in Ballen gepresst.
Analyse Ätherisches Öl 940 mg%
Chamazulen: 132 mg% (-)-a-Bisabolol: 243 mg%.
Erfolgt die Trocknung beispielsweise in einer stationären Bandtrockenanlage mittels künstlich erwärmter Luft bei einer Temperatur zwischen 50 und 70 C, so ist die Trocknung nach etwa 4 - 5 Stunden beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und Blütengrus wird die Droge gesiebt und anschliessend in Ballen gepresst.
Die Analysenwerte einer solchen Droge sind zum Beispiel: Ätherisches Öl 775 mg%
Chamazulen: 65 mg% (-)-a-Bisabolol. 163 mg%.
Beispiel 3 (Ausgangskamille ist diploid)
Durch Einzelpflanzenvaribilitätstests der diploiden, nur wenig Bisabolol enthaltenden, aber
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nicht bisabololfreien Kamillen, die in Franz, Ch., J Hölzl und A Vömel: Acta Horticulturae 73,
109 -114 (1978) beschrieben werden, wurde gefunden, dass maximal bis zu 20 % aller Individuen im ätherischen Öl einen Chamazulengehalt von etwa 20 Gewichts-% und/oder einen hohen (-)-a- Bisabololgehalt von 50 Gewichts-% aufweisen, wobei gleichzeitig der Gehalt an den übrigen Bisaboloiden (insbesondere (-)-a-Bisabolonoxid) sehr gering ist.
Diese Individuen wurden ausselektiert und wie folgt tetraploidisiert.
Samen der so ausselektierten Kamillenpflanzen wurden auf ein mit 0,05 %iger wässriger Colchicinlösung getränktes Filterpapier aufgebracht und bei Raumtemperatur (20 C) 6 Stunden quellen lassen. Daraufhin wurden sie vom Filterpapier entfernt, mit Wasser mehrmals gespült und in Saatkisten (Gewächshaus) ausgesät : Torf-Sand-Gemisch 1 :1, 18 bis 20 C, relative Luftfeuchtigkeit: circa 60 %, Tageslänge bei künstlicher Belichtung, 14 Stunden.
Die keimenden Pflanzen wurden bis zur Blüte beobachtet, der Polyploidisierungserfolg wurde durch Vergleichsmessung der Pollen- und Samengrösse sowie durch Chromosomenzählung der Pflanzen (F,-Nachkommenschaft = erste, aus Samen gezogene Nachkommenschaft der als tetraploid bestätigten colchicinierten Pflanzen) festgestellt.
Die Tetraploidisierung kann auch auf folgende Weise erfolgen: Auf wassergetränktem Filterpapier ausgekeimte, 5 bis 7 Tage alte, gut entwickelte Kamillenkeimlinge wurden bei Raumtemperatur (20 C) für 4 bis 6 Stunden mit den Keimblättem nach unten in eine 0,05 %ige Colchicinlösung gestellt Die empfindlichen Keimwurzeln wurden dabei geschont, um Trockenschäden an ihnen zu vermeiden, muss die umgebende Atmosphäre nahezu 100 % relative Luftfeuchte auf weisen. Nach der Behandlung wurden die Keimlinge mit Wasser mehrmals gespült und in Pflanzkistchen pikiert. Die weitere Behandlung erfolgte wie bei den Samen.
Die Pollengrössenmessungen werden mit einem Leitz-Binokular-Forschungsmikroskop mit Mikrometer-Messokular und Mikrometer-Objektträger durchgeführt
Die Chromosomen zahlung findet an Wurzelspitzen statt : Von den im Gewächshaus gezogenen Jungpflanzen oder Stecklingspflanzen werden 1 bis 2 cm lange frische Wurzelenden gesammelt, 5 Stunden in 0,002 molare Hydroxychinolin-Lösung und anschliessend 15 Minuten in 1N HCL eingelegt. Zur Untersuchung werden circa 1 mm der Wurzelspitzen mit 2 %iger Orcein-Essigsäure angefärbt und in Ölimmersion mikroskopisch untersucht. Bei den in Mitose befindlichen Zellen kann so der 4-fache Chromosomensatz der somatischen Zellen bestimmt werden (4n = 36).
Diejenigen Pflanzen, bei welchen der Pollendurchmesser um circa 50 % grösser als derjenige des diploiden Ausgangsmaterials (circa 30 statt circa 20 um) und bei denen der Chromosomensatz der somatischen Zellen auf 36 verdoppelt war (bei dem diploiden Ausgangsmaterial ist die entsprechende Zahl 18) sind tetraploid. Diese wurden ausselektiert.
Ungefähr 0,1 bis 0,5 % der Samen beziehungsweise der Keimlinge wurden bei der oben angegebenen Methode tetraploidisiert und entwickelten blühfähige, intakte Pflanzen. Es schliessen sich nun beispielsweise die Schritte 1 und 2 entsprechend Beispiel 2 an.
Die Blüten der so erhaltenen Kamille enthalten beispielsweise mindestens 100 mg% Chamazulen, 200 mg% (-)-a-Bisabolol und höchstens 50 mg% an übrigen Bisaboloiden (Ernte zu dem Zeitpunkt, wo 30 - 70 % der Röhrenblüten geöffnet sind und 72 stündiges Trocknen im Trocken schrank bei 40 C).
Gewinnung der Droge:
Die gemäss diesem Beispiel erhaltene Kamille wird in üblicher Weise feldmässig ausgesät.
Sobald die Pflanzen sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in dem Vegetationsstadium sind, wo etwa 50 % der Röhrenblüten geöffnet sind, werden diese Blütenköpfchen mit einer Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände der Pflückmaschine so eingestellt sind, dass nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten zu 50 % offen sind, abgestreift werden. Das Erntegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet. Anschliessend werden die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der Gewichtsverlust beträgt etwa 80 %. Die Trocknung erfolgt im Schatten an einer gut belüfteten Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10 cm.
Nach etwa 2 - 3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und
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Blütengrus wird die Kamillendroge gesiebt und anschliessend in Ballen gepresst.
Analyse Ätherisches Öl 910 mg %
Chamazulen: 117 mg% (-)-a-Bisabolol: 252 mg%
Beispiel 4 (Ausgangskamille ist diploid)
Durch Einzelpflanzenvaribilitätstests der diploiden, nur wenig Bisabolol enthaltenden, aber nicht bisabololfreien Kamillen, die in Franz, Ch., J. Hölzl und A. Vömel: Acta Horticulturae 73, 109 - 114 (1978) beschrieben werden, wurde gefunden, dass maximal bis zu 20 % aller Individuen im ätherischen Öl einen Chamazulengehalt von etwa 20 Gewichts-% und/oder einen hohen (-)-a-Bisabololgehalt von 50 Gewichts-% aufweisen, wobei gleichzeitig der Gehalt an den übrigen
Bisaboloiden (insbesondere (-)-a-Bisabolonoxid) sehr gering ist. Diese Individuen wurden ausselektiert und genau wie in Beispiel 3 angegeben ist tetraploidisiert und die tetraploiden
Individuen ausselektiert.
Ungefähr 0,1 bis 0,5 % der Samen beziehungsweise der Keimlinge wurden tetraploidisiert und entwickelten blühfähige, intakte Pflanzen.
Es schliessen sich nun beispielsweise die Schritte 1 bis 6 entsprechend Beispiel 1 an.
Die Blüten der so erhaltenen Kamille enthalten beispielsweise mindestens 150 mg%
Chamazulen, 300 mg% (-)-a-Bisabolol und höchstens 50 mg% an übrigen Bisaboloiden (Ernte zu dem Zeitpunkt, wo 30 - 70 % der Röhrenblüten geöffnet sind und 72 stündiges Trocknen im
Trockenschrank bei 40 C).
Die übrigen Eigenschaften entsprechen denen der nach Beispiel 1 erhaltenen Kamille
Gewinnung der Droge:
Die gemäss diesem Beispiel erhaltene Kamille wird in üblicher Weise feldmässig ausgesät.
Sobald die Pflanzen sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in dem Vegetationsstadium sind, wo etwa 50 % der Röhrenblüten geöffnet sind, werden diese Blütenköpfchen mit einer
Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände der Pflückmaschine so eingestellt sind, dass nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten zu 50 % offen sind, abgestreift werden. Das
Erntegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert und dort bis zur
Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet. Anschliessend werden die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der
Gewichtsverlust beträgt etwa 80 %. Die Trocknung erfolgt im Schatten an einer gut belüfteten
Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10 cm.
Nach etwa 2-3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und
Blütengrus wird die Kamillendroge gesiebt und anschliessend in Ballen gepresst.
Analyse Ätherisches Öl 1020 mg%
Chamazulen: 173 mg% (-)-a-Bisabolol 418 mg%
Beispiel 5 Herstellung eines Extraktes aus Kamillendroge
Die Kamillenblüten für die eingesetzte Droge werden gemäss Beispiel 1 zu einem Zeitpunkt geerntet, wo 50-70 % der Röhrenblüten geöffnet sind und bei einer Lufttemperatur von nicht hoher als 50 C getrocknet.
400 g der so erhaltenen Kamillendroge mit einem Gehalt von 105 mg% Chamazulen und
212 mg% (-)-a-Bisabolol werden mit 2100 g wässerigem Ethanol (40 Gewichtsprozent Ethanol) in einem Muldenmischer bei einer Drehzahl des Mischwerks von 50 Umdrehungen pro Minute
3 Stunden lang extrahiert. Das Drogengut wird anschliessend abgepresst und der Extrakt filtriert.
Im Extrakt wird der Wirkstoffgehalt in bekannter Weise ermittelt:
Chamazulen: 3,7 mg% (-)-a-Bisabolol 10,2 mg%
Beispiel 6: Herstellung eines Extraktes aus Frischkamille
758 S frische Kamillenblüten einer Kamille, die gemäss Beispiel 1 zu einem Zeitpunkt geerntet werden, wo 50-70 % der Röhrenblüten geöffnet sind (Wassergehalt: 74 %), werden mit 510 g
Ethanol (84 Gewichtsprozent) in einem Muldenmischer bei einer Drehzahl des Mischwerks von 65
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Umdrehungen pro Minute 50 Minuten lang extrahiert. Das Drogengut wird anschliessend abgepresst und der Extrakt filtriert.
Im Extrakt wird der Wirkstoffgehalt in bekannter Weise ermittelt
Chamazulen: 11,7 mg% (-)-a-Bisabolol: 16,5 mg%
Beispiel 7' Herstellung eines ätherischen Kamillenöls
200 g gemäss Beispiel 1 erhaltene getrocknete Kamillenblüten (Trocknung erfolgte bei 50 C unter Ausschluss von Sonnenlicht) werden in einem 5-Liter-Rundkolben mit 3,6 I Wasser und 2 g Natriumascorbat versetzt, das Gemisch wird mit 1 N HCI auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt.
Nach Zugabe von Siedesteinen wird zum Sieden erhitzt. Innerhalb von ca. 5 Stunden werden ca.
1,2 I Destillat aufgefangen.
Nach beendeter Destillation wird das Destillat dreimal mit je 100 ml Petroläther ausgeschüttelt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird filtriert und das Lösungsmittel anschlissend im Rotationsverdampf er abdestilliert.
In dem erhaltenen ätherischen Öl wird anschliessend der Gehalt an Chamzulen und (-)-a-Bisabolol bestimmt.
Anlage A
Gewinnung des ätherischen Öls.
Ausgangsmaterial ist eine Droge aus der erfindungsgemässen Kamille. Zur Herstellung der Droge werden nur solche Blütenköpfchen verwendet, bei denen 30 bis 70 %, insbesondere 40 bis 60 % der Röhrenblüten geöffnet sind. Die Trocknung erfolgt in einem Trockenschrank bei 40 C während 72 Stunden.
Das ätherische Öl der Kamillenblüten wird wie im folgenden beschrieben durch zweistündige Wasserdampfdestillation der Droge gewonnen:
2,0 g unzerkleinerte Droge werden in einem Liter-Rundkolben mit 250 ml entsalztem Wasser versetzt und einer zweistündigen Rücklaufdestillation in einer Clevenger-Apparatur (Wasserdampf-Destillations-Rücklauf-Apparatur zur quantitativen Bestimmung kleiner Mengen ätherischer Öle) unterzogen. Als Vorlage dient 1 ml Pentan pro analysi. Die Rücklaufgeschwindigkeit beträgt 40 4 Tropfen/Minute. Nach Beendigung der Destillation wird das in Pentan gelöste ätherische Öl möglichst wasserfrei in Reagenzgläser abgelassen und eventuell restliches in der Apparatur anhaftendes ätherisches Öl mit Pentan nachgespült.
Zur Entfernung eventueller Wasserreste wird der Lösung eine Spatelspitze getrocknetes Na2S04 zugesetzt und die Lösung anschliessend durch eine Glasfilternutsche der Porosität D 3 oder D 4 in Rollrandfläschchen abgenutscht. Nach Abdunsten des Pentans bei 40 C im Wasserbad und Nachtrocknen im Exsikkator wird die Ölmenge gravimetrisch bestimmt.
In dem so erhaltenen Öl (ca. 20 mg) werden anschliessend das Chamazulen und das Bisabolol bestimmt.
EMI19.1
Messlösung: Das gesamte, aus 2g Droge erhaltene ätherische Öl (ca. 20 mg) (erhalten wie vorstehend beschrieben) wird in 25 ml n-Hexan oder Cyclohexan gelöst.
Messgerät : Filterphotometer (zum Beispiel Eppendorf).
Wellenlänge: 578 nm Küvette : 1 cm Spezifische Extinktion von Chamazulen (1 g/100 ml ; cm): 20,8 Kompensations- flüssigkeit: n-Hexan oder Cyclohexan Gefundener Gehalt an Chamazulen in mg/100 g- 120 E578
Steht zur Messung kein Filterphotometer zur Verfügung, so kann die Bestimmung auch mit einem Spektralphotometer durchgeführt werden: Messgerät Spektralphotometer (zum Beispiel PM Q ll / oder PM Q lll "ZEISS")
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Wellenlänge: 605 nm Küvette : 1 cm Spezifische Extinktion von Chamazulen (1 g/100 ml; 1 cm): 24,5 Kompensationsflüssigkeit: n-Hexan oder Cyclohexan Gefundener Gehalt an Chamazulen in mg/100 g: 102 E605
In der Messlösung wird anschliessend das Bisabolol bestimmt.
EMI20.1
Gaschromatograph:
Hewlett Packard Modell5750,
Erba Fractovap 2350 oder ähnliches Gerät Detektor : Flammen-lonisations-Detektor Trägergas: Helium Säule: 1/8 Zoll; 200 cm, Stahl Säulenfüllung: 3 % Nitrilsilicongummi "XE 60" auf Kieselgur silanisiert "Chromosorb WAW HP"
125 bis 150 um als Trägermaterial Temperatur Detektor : 320 C Einspritzblock: 220 C Säule: 85 - 220 C Temperaturprogrammierung' 4 /Minute Probenlösung: Es wird die Messlösung für das Chamazulen verwandt Vergleichslösung' Circa 15 mg Standard-Bisabolol werden in Cyclohexan zu 25 ml gelöst Einspritzmenge : Von Probenlösung und Vergleichslösung je 5 l Auswertung :
Die Auswertung erfolgt durch Peakflächenvergleich Gehalt an Bisabolol in mg pro 100 g Droge : x Einwaage (Vergleich) /mg/x x
Fläche (Probe)
Fläche (Vergleich)
Die Bestimmung der übrigen Bisaboloide kann ebenfalls durch Gaschromatographie, beispielsweise unter folgenden Aufnahmebedingungen erfolgen: Geräte : Packard, Modell 7721, Serie 800 beziehungsweise Erba Fractovap Serie
2350 Säulen:
Glassäulen, 3 m/2 mm im Durchmesser; 2m/ 2 mm im Durchmesser Fullung: 3 % Methylphenylsilicongummi "OV 1" auf Kieselgur silanisiert "Gaschrom Q" 125 bis 150 um als Trägermaterial Trägergas : 30 ml/Minute N2 Temperatur-Programm : 80 bis 180 C, 2,5 (3) C/Minute Injektor/Detektor- Temperatur : 200 C Detektor: Flammen-lonisations-Detektor Einspritzmenge : ca 2 l des ca 1:50 verdünnten ätherischen Öls
Die Auswertung erfolgt teils ohne, teils mit innerem Standard. Als innerer Standard eignen sich Laurinsäuremethylester oder Hexadecan für chamazulenanne beziehungsweise chamazulenfreie Öle. Bei Ölen mit einem Chamazulengehalt über 5 % ist dieser als innerer Standard vorzuziehen, wobei die Gehaltsbestimmung photometrisch (bei 578 nm) erfolgt.