DD240135A5 - Verfahren zur Herstellung eines neuen Mittels mit antiphlogistischerWirkung - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines neuen Mittels mit antiphlogistischerWirkungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines neuen Mittels mit antiphlogistischer Wirkung, die zum Beispiel in der Diaetetik, in der Kosmetik sowie in Form von Tees verwendet werden koennen. Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Mittels mit vorteilhaften Eigenschaften unter Verwendung von tetraploiden Kamillen zur Verfuegung gestellt. Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung eines neuen Mittels mit antiphlogistischer Wirkung, welches sich insbesondere durch einen erhoehten Gehalt an (-)-alpha-Bisabolol und Chamazulen auszeichnet. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, dass aus einer tetraploiden Kamille, bei der (-)-alpha-Bisabolol die Hauptkomponente des aetherischen Oels darstellt, diejenigen Pflanzen ausselektiert, deren bei 40 Grad C getrocknete Blueten mindestens 100 mg % Chamazulen, mindestens 200 mg % (-)-alpha-Bisabolol und weniger als 50 mg % (-)-alpha- an uebrigen Bisaboloiden enthalten, und von den so erhaltenen Pflanzen, gegebenenfalls nach weiteren Selektions- und Vermehrungsschritten, die Blueten in dem Vegetationsstadium, wo 30 bis 100 % der Roehrenblueten eines Bluetenkoepfchens offen sind, erntet und bei einer Temperatur von hoechstens 70 Grad C getrocknet, um ein trockenes Material zu erhalten, das mindestens 30 mg % Chamazulen, mindestens 100 mg % (-)-alpha-Bisabolol und weniger als 50 mg % an uebrigen Bisaboloiden enthaelt, und gegebenenfalls aus dem so erhaltenen trocknenen Material durch Destillation in Gegenwart von Wasser ein aetherisches Oel herstellt, das mindestens 3,5 % Chamazulen, mindestens 10 % (-)-alpha-Bisabolol und weniger als 10 % an uebrigen Bisaboloiden enthaelt, oder durch Extraktion mit niederen Alkoholen einen alkoholischen Kamillenauszug herstellt.
Description
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines neuen Mittels mit antiphlogistischer Wirkung, die zum Beispiel in der Diätetik, in der Kosmetik, sowie in Form von Tees verwendet werden können.
Die bisherigen Mittel mit antiphlogistischer Wirkung, die aus Kamille erhalten wurden, haben einen geringeren Gehalt an den Hauptwirkstoffen Chamazulen und Bisabolol als die erfindungsgemäßen Mittel. Außerdem ist der Gehalt an übrigen Bisaboloiden höher. Insbesondere ist ein gleich hoher Gehalt an den beiden Hauptwirkstoffen Azulen und Bisabolol nicht vorhanden, ausgenommen, es wird die diploide Kamillensorte Degumill verwendet. (Degumill ist Gegenstand eines DDR-Srotenschutzrechts sowie der deutschen Patentschrift 2402802). Diese diploide Kamillensorte Degumill hat jedoch den Nachteil, daß sie gegenüber Fremdbestäubung nicht beständig ist und der Wirkstoffgehalt dieser Kamillensorte nur dann beständig ist, wenn jegliche Einkreuzung beziehungsweise Fremdbestäubung mit anderen Kamillensorten, deren Bisabolol- und
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Chamazulengehalt erheblich niedriger ist, verhindert wird. Unabhängig davon ist jedoch der Gehalt der erfindungsgemäßen Mittel an den Hauptwirkstoffen Azulen und Bisabolol infolge der besonderen Verfahrensmaßnahmen dieser Anmeldung auch höher als wenn die Kamillensorte Degumill zur Herstellung der Mittel verwendet wird.
Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Mittels mit antiphlogistischen Eigenschaften unter Verwendung von tetraploiden Kamillen bereitgestellt, die eine breite Anwendung finden.
Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung eines neuen Mittels mit antiphlogistischer Wirkung, welches sich insbesondere durch einen erhöhten Gehaltan (-)-a-Bisabolol und Chamazulen auszeichnet, wobei der Gehaltan Chamazulen mindestens 30 mg %, an (-)-a-Bisabolol mindestens 100 mg % und der Gehalt an übrigen Bisaboloiden weniger als 50 mg % ist. Unter der Bezeichnung „übrige Bisaboloide" wird insbesondere verstanden: (-)-a-Bisabololoxid A und B; H-a-BisabolonoxioJA.
Arzneimittel und kosmetische Mittel aus Zubereitungen der Blütenköpfchen der Echten Kamille (Chamomilla recutita [L.] Rauschert, synonym mit Matricaria chamomilla L.) finden wegen ihrer antiphlogistischen und spasmolytischen Wirkung eine breite Verwendung. Besondere Bedeutung kommt dabei den Wirkstoffen (-)-a-Bisabolol und Chamazulen zu. Ein aus Kamille hergestelltes Mittel sollte deshalb einen möglichst hohen Gehalt an diesen beiden Substanzen aufweisen.
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Mittels mit vorteilhaften Eigenschaften unter Verwendung von
tetraploiden Kamillen gefunden. /
Die Erfindung betrifft die durch die Patentansprüche definierten Gegenstände beziehungsweise Sachverhalte.
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels werden tetraploide Kamillen, bei denen (-)-a-Bisabolol die Hauptkomponente des ätherischen Öls darstellt, verwendet.
Von diesen Kamillen werden die Pflanzen ausselektiert, deren bei 40°C getrocknete Blüten einen Mindestgehalt an Chamazulen von 100mg %, einen Mindestgehalt an (-)-a-BisaboloI von 200mg % und einen Gehalt an übrigen Bisaboloiden von höchstens 50mg % aufweisen (Ernte der Blüten zu dem Zeitpunkt, wo 30-70% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens aufgeblüht sind), und gegebenenfalls hieran weitere Selektions- und Vermehrungsschritte angeschlossen (Mutterstammbaumzüchtung für vegetativ vermehrbare Fremdbefruchter; siehe Beispiele).
Als tetraploide Ausgangskamillen kommen zum Beispiel in Frage: Die Kamillensorten Bodegold (DDR), Pohorelicky (CSSR), Zloty Lan (Polen), BK-2 (Ungarn). Diese Sorten sind in den folgenden Literaturstellen beschrieben:
M.Chlädek und V. Kosova, Pharmazie 13,712-713 (1958);
W.Czabajska, Diss. Poznan (1963); W.Poethke und P.Bulin, Pharm. Z. Halle 108, 813-823 (1969); I.Särkäny, Herb. Hungar. 4 (1), 125-169 (1965).
Im übrigen gilt für die tetraploiden Ausgangskamillen hinsichtlich des (-)-a-Bisabololgehalts dasselbe wie für die diploiden Ausgangskamillen (siehe weiter unten).
Die tetraploide Ausgangskamille kann jedoch auch aus diploiden Kamillen, bei denen (-)-a-Bisabolol die Hauptkomponente des ätherischen Öls darstellt, gewonnen werden. Solche diploiden Kamillen werden tetraploidisiert (Genom-Mutation), die so erhaltenen tetraploiden Pflanzen ausselektiert und von diesen ausgewählten tetraploiden Pflanzen wiederum die Pflanzen ausselektiert, deren bei 4O0C getrocknete Blüten einen Mindestgehalt an Chamazulen von 100mg %; einen Mindestgehalt an (-)-a-Bisabolol von 200 mg % und einen Gehalt an übrigen Bisaboloiden von höchstens 50 mg % aufweisen (Ernte der Blüten zu dem Zeitpunkt, wo 30—70% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens aufgeblüht sind), und gegebenenfalls hieran weitere Selektions- und Vermehrungsschritte gemäß den Beispielen angeschlossen.
Die diploiden Ausgangskamillen werden zum Beispiel ausfolgenden Kamillen erhalten: „Kamille argentinischer Provenienz" (siehe L. Z. Padula, R. V. D. Rondina und J. D. Coussio, Quantitative Determination of Essential Oil, Total Azulenes and Chamazulene in German Chamomile, Matricaria chamomilla, Cultivated in Argentina; Planta med. 30, Seiten 273-280,1976) sowie alle Kamillen, welche im ätherischen Öl deutlich meßbare Konzentrationen an (-)-a-Bisabolol (in der Regel über 5% des ätherischen Öls) aufweisen. Beispielsweise kommen solche diploiden Kamillen in Frage, die in folgenden Literaturstellen sind:
Schilcher, H. „Neuere Erkenntnisse bei der Qualitätsbeurteilung von Kamillenö! beziehungsweise Kamillenblüten", Planta med.
23,132-144(1973); Motl, O., M.Felklova, V. Lukes &M.Jasicovä „Zur gaschromatographischen Analyse und zu chemischen Typen von Kamillenöl", Arch. Pharm. 310,210-215 (1977); Franz, Ch., J.Hölzl &A.Vömel „Preliminary Morphologiealand Chemical Characterization of some Populations and Varieties of Matricaria chamomilla L.", Acta Hort. 73,109-114 (1978).
Weiterhin kommt als Ausgangskamille die diploide Kamillensorte DEGUMILL (Deutsches Patent 2402802) in Frage. Auch in diesem Fall erhält man beispielsweise eine tetraploide Kamille mit einem Chamazulengehalt von mindestens 150 mg %und einem Bisabololgehaltvon mindestens 200mg %, falls die Ernte der Kamillenblütenköpfchen dieser Kamille in dem Vegetationsstadium erfolgt, wo erst 30-70% der Röhrenblüten eines Köpfchens geöffnet sind, und die Trocknung bei einer Lufttemperatur von höchstens 5O0C durchgeführt wird.
Durch nachgeschaltete Selektions- und Vermehrungsschritte gemäß dieser Anmeldung lassen sich die angegebenen Bisabolol- und Azulenwerte auch hier noch weiter erhöhen.
Das ätherische Öl der Kamille besteht in der Regel aus den Hauptkomponenten Farnesen, Spathulenol, Chamazulen einem der 4 Bisaboloide (H-d-Bisabolol, Bisabololoxid A, Bisabololoxid B oder Bisabolonoxid, soweit es diploide Einzelpflanzen betrifft; in der Mischprobe sowie in tetraploiden Individuen können mehrere Bisaboloide nebeneinander enthalten sein) sowie aus den Spiroäthern. Die genannten Stoffe machen zusammen meist 70-80% des ätherischen Öls aus. Besonders geeignet sind daher diploide Ausgangskamillen, wo (-)-a-Bisabolol die überwiegende Komponente (mehr als die Hälfte der Summe der vorgenannten Stoffe) darstellt. Insbesondere kommen als Ausgangskamillen diploide Kamillen in Frage, bei denen zum Beispiel das (-)-a-Bisabolol mindestens 40% des ätherischen Öls oder mindestens 90% der Bisaboloide darstellt.
Insbesondere kommen solche diploiden und tetraploiden Kamillenpopulationen in Betracht, welche in der Drogen-Mischprobe
in der Regel mindestens 100 mg %Chamazulen und 50-100 mg % (-)-a-Bisabolol aufweisen (bezogen auf die Trockensubstanz der bei 40°C getrockneten Blüten), das heißt aus solchen Kamillenpopulationen wird im Falle einer diploiden Ausgangskamiile Saatgut gewonnen und dieses Saatgut tetraploidisiert (ohne Berücksichtigung und/oder Kenntnis des Bisabololgehaltes der Elternpflanzen). Im Falle einer tetraploiden Ausgangskamille wird das wie oben beschriebene Saatgut dann unmittelbar den folgenden Selektions- und Vermehrungsschritten unterworfen.
Die geeigneten diploiden und tetraploiden Ausgangskamillen werden durch Einzelpflanzen-Untersuchungen herausselektiert. Im allgemeinen ist es erforderlich, von einer Ausgangspopulation beispielsweise 1 000-10000 Individuen zu untersuchen, um einige Individuen zu finden, die einen hohen (-)-a-Bisabololgehalt gemäß den oben angegebenen Kriterien aufweisen und als Ausgangskamille geeignet sind. Von solchen ausgesuchten Individuen wird dann in üblicherweise Saatgut gewonnen und dieses tetraploidisiert. Nach der abgeschlossenen Tetraploidisierung werden die tetraploiden Pflanzen von den übrigen diploid gebliebenen Pflanzen ausselektiert. Von den so erhaltenen tetraploiden Pflanzen, gegebenenfalls nach vorhergehender Vermehrung, werden nun alle die Pflanzen ausselektiert, deren bei 4O0C getrocknete Blüten mindestens 100mg % Chamazulen, mindestens 200 mg % (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg % an übrigen Bisaboloiden enthalten. Die Ernte dieser Blüten erfolgt dabei in dem Entwicklungsstadium, wo 30-70% aller Röhrenblüten des Blütenköpfchens geöffnet sind. Gegebenenfalls können sich hieran weitere Selektions- und Vermehrungsschritte anschließen, die zum Beispiel eine Verbesserung hinsichtlich folgender Merkmale beziehungsweise Eigenschaften bewirken: Gleichzeitiger Blühtermin, gleichmäßige grundständige Verzweigung und schmale Blühzone (das heißt bessere Eignung für die maschinelle Ernte), große Blütenköpfchen, bessere Haltbarkeit der Droge, besonders aromatischer Geruch.
Falls man von vornherein von einer tetraploiden Kamille ausgeht, erfolgt lediglich die zuvor angegebene Selektion solcher Pflanzen, deren bei 40°C getrocknete Blüten mindestens 100mg % Chamazulen, mindestens 200mg % (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg % an übrigen Bisaboloiden enthalten, wobei ebenfalls die Ernte dieser Blüten in dem Entwicklungsstadium erfolgt, wo 30-70% aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind. Auch in diesem Fall können sich gegebenenfalls weitere Selektions- und Vermehrungsschritte anschließen, aus denen weitere Verbesserungen (wie oben angegeben) resultieren.
Besonders günstig ist es, wenn bei der Selektion nach dem Chamazulen- und (-)-a-Bisabololgehalt solche Pflanzen (bekannte oder verfahrensgemäß hergestellte) ausselektiert werden, deren Chamazulengehalt mindestens 200 mg %, vorzugsweise 250mg % und deren (-)-a-Bisabololgehalt mindestens 300mg %, vorzugsweise 400mg % beträgt (Gehalt an übrigen Bisaboloiden stets unter 50mg %).
Die Tetraploidisierung erfolgt durch Behandlung von Pflanzenteilen (Samen, Wurzeln, Sproßspitzen, Keimen, Achselknospen) oder Gewebe der diploiden Ausgangs-Kamillenpflanzen mit Chemikalien, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder UV-Strahlen. Sie kann weiterhin durch Antherenkultur mit anschließender Tetraploidisierung oder durch Anwendung von hohen oder auch niedrigen Temperaturen auf die Kamillenpflanzen beziehungsweise Pflanzenteile oder Gewebe der Kamillenpflanzen erfolgen. Die Tetraploidisierung durch Chemikalien.
Als Chemikalien für die Tetraploidisierung kommen zum Beispiel in Frage: Colchicin, Acenaphthen, Alkaloide wie Atropin, Veratrin, Nicotin, Sanguinarin, Derivate des Benzols, Diphenyls und Phenanthrene, Naphthalin und Naphthalinderivate, Diphenylamin, Tribromanilin, Paradichlorbenzol, Methylnaphtochinon, Methylnaphthohydrochinon, Salicylsäure und verwandte Substanzen, Hexachlorhexan, Methamphetamin (Hydrochlorid), Alkyl-Alkali-Carbamate wie Isopropyl-Natrium-Carbamat, Phenylurethan, Salze der Kakodylsäure (zum Beispiel Natriumsalz), Glykoside von Convallaria wie Convallarin, Convallatoxin und Convallamarin, Heteroauxin, Germisan (Phenylmercuribrenzkatechin), organische Quecksilberverbindungen wie Ethyl-Quecksilber-Phosphat, Ethyl-Quecksilber-Chlorid, Phenyl-Quecksilber-Hydroxid, Phenyl-Quecksilber-Dinaphthylmethandisulfonat, Chloroform, Lachgas (N2O) sowie Gemische dieser Stoffe. Weiterhin kommen auch Ölkuchen, Kompost und Kuhdung in Betracht.
Die Behandlung mit den hier erwähnten Stoffen erfolgt beispielsweise bei Temperaturen zwischen 0 und 35°C, vorzugsweise zwischen 12 und 30°C, insbesondere 15 und 25°C.
Die Applizierung erfolgt beispielsweise durch Behandeln von Samen, Sproßspitzen, Wurzeln (insbesondere Wurzelspitzen oder Wurzeln von Keimlingen), Fruchtknoten, von Schnittflächen an Blättern oder Stengeln, von Zellsuspensionen aus Meristem-Gewebe, von Kalluskulturen oder auch durch Injektion in die basale Stengelregion oder in den Bereich der Achselknospen. Die Chemikalien werden im allgemeinen in Form von Lösungen in Wasser, schwach alkoholischen (Alkoholgehalt in der Regel unter 5%) oder schwach sauren Lösungen angewendet. Der pH-Wert der schwach sauren Lösungen liegt beispielsweise bei 5,5-6,5, wobei das Ansäuern beispielsweise mittels niederen organischen aliphatischen Säuren wie Essigsäure erfolgt. Falls man alkoholische Lösungen verwendet, können diese ebenfalls schwach sauer sein. Die Konzentrationen der Chemikalien in diesen Lösungen kann beispielsweise 0,01 bis 0,5%, vorzugsweise 0,02 bis 0,2%, insbesondere 0,05 bis 0,1 % betragen. Gasförmige Stoffe kommen als solche, gegebenenfalls unter Druck (zum Beispiel 1 bis 10 bar) zur Anwendung. Die Behandlungsdauer beträgt beispielsweise 1 bis 36, vorzugsweise 2 bis 12, insbesondere 4 bis 6 Stunden.
Die wirksamsten Konzentrationen sowie die Einwirkungsdauer sollte zweckmäßig jeweils in Vorversuchen getestet werden. Besonders günstig ist zum Beispiel die Behandlung mit Colchicin bei Temperaturen zwischen 0 und 35 °C, vorzugsweise 12 bis 30°C, insbesondere 15 bis 250C. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß Samen der diploiden Ausgangskamille in einer 0,01 bisO,2%igen, insbesondere 0,02 bis 0,1 %igen, vorzugsweise 0,05%igen Colchicinlösung zum Quellen gebracht werden oder daß ausgekeimte, 5 bis 7 Tage alte gut entwickelte Keimlinge der diploiden Ausgangskamille (mit den Keimblättern nach unten) in eine 0,01 bis 0,2%ige, insbesondere 0,02 bis 0,1%ige, vorzugsweise 0,05%ige Colchicinlösung getaucht werden. Bei letzterem Verfahren soll die umgebende Atmosphäre nahezu 100% relative Luftfeuchtigkeit aufweisen. Die Dauer der Colchicin-Behandlung beträgt beispielsweise 3 bis 36 Stunden, insbesondere 4 bis 10 Stunden. Bei der Verwendung von Keimlingen ist im allgemeinen eine Einwirkungsdauer bis zu 10 Stunden ausreichend. Bei der Verwendung von Samen kann sich die Einwirkungsdauer gegebenenfalls bis zu 36 Stunden erstrecken.
Nach der Behandlung mit den Chemikalien werden die gequellten Samen, Keimlinge, beziehungsweise sonstige Pflanzenteile, mit Wasser mehrmals gespült. Die gequellten Samen werden beispielsweise ausgesät. Die Pflanzen mit behandelten Wurzeln oder sonstige Pflanzenteile oder die behandelten Keimlinge werden beispielsweise in Pflanzkisten pikiert. Aus den so behandelten Samen beziehungsweise Keimlingen werden die Pflanzen aufgezogen (zum Beispiel im Gewächshaus: Temperatur zwischen 18 bis 250C am Tag und 10 bis 16°C nachts) und die Pflanzen ausgewählt, deren Pollen etwa 11/2mal größer sind als die Pollen des Ausgangsmaterials beziehungsweise eine Chromosomenzahl der somatischen Zellen von 36 aufweisen. Falls man
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sonstige Pflanzenteile (ober-oder unterirdische Teile) der Chemikalienbehandlung unterwirft, werden ausschließlich die aus den behandelten Teilen hervorgegangenen Triebe, Wurzeln oder Blüten/Samen einer späteren Untersuchung auf erfolgte Tetraploidisierung unterzogen. Wenn beispielsweise eine Sproßbehandlung oder eine Achselbehandlung vorgenommen wurde, wird anschließend nur der aus dieser Achsel beziehungsweise aus diesem Sproß entstehende neueTrieb und die auf ihm gebildeten Blüten beziehungsweise Samen auf Chromosomenzahl untersucht.
Die Pollengrößenmessungen und die Chromosomenzählung können beispielsweise so durchgeführt werden wie in Beispiel 3 angegeben ist.
Die Tetraploidisierung durch Strahlen.
Die Einwirkung erfolgt beispielsweise auf Samen oder Wurzelspitzen bei Temperaturen zwischen 0 und 35°C, vorzugsweise 10 und 3O0C, insbesondere 15 und 25°C. Bestrahlungssumme: 5 bis 50 Krad. Vorzugsweise kommen Gamma- oder Röntgenstrahlen in Frage.
Als UV-Strahlen kommen beispielsweise solche mit einer Wellenlänge von 400 bis 30 nm, vorzugsweise von 350 nm in Frage.
Die so bestrahlten Pflanzen beziehungsweise Pflanzenteile werden dann ebenso weiterbehandelt wie nach der Behandlung mit Chemikalien. '
Anwendung hoher und niedriger Temperaturen.
Als hohe Temperaturen kommen beispielsweise Temperaturen zwischen 33 und 5O0C, vorzugsweise 42 bis45°C in Frage. Diesen Temperaturen werden beispielsweise ausgesetzt: gequollene Samen, Keimlinge, Triebspitzen und meristematisches Gewebe.
Dauer der Behandlung: zum Beispiel 1 bis 48, vorzugsweise 12 bis 24 Stunden.
Als niedrige Temperaturen kommen beispielsweise in Frage: 0 bis 5°C, vorzugsweise 0,5 bis 40C, insbesondere 2°C. Diesen Temperaturen werden beispielsweise ausgesetzt: gequollene Samen, Keimlinge, Triebe und meristematisches Gewebe. Dauer der Behandlung: zum Beispiel 1 bis 100, vorzugsweise 20 bis 40 Tage. Die so behandelten Pflanzen beziehungsweise Pflanzenteile werden ebenso weiterbehandelt wie nach der Behandlung mit Chemikalien.
Antherenkultur (Erzeugung von Pflanzen mit einfachem Chromosomensatz aus den Staubbeuteln mit anschließender Tetraploidisierung durch Chemikalien oder Strahlen).
Von blühenden Pflanzen werden geschlossene Röhrenblüten geerntet, deren Antheren (Staubbeutel) sich im Stadium vor der ersten Pollenmitose befinden. Die Antheren werden mittels Mikromanipulator aus den Blütenknospen entnommen und in Petrischalen übertragen, die beispielsweise mit dem Nährmedium nach Nitsch und Nitsch (Tabelle 1) gefüllt sind. Anschließend werden die Petrischalen in einem Kulturraum im 16-Stunden-Tag bei 28°CTag-und 20°C Nachttemperatur aufbewahrt. Nach circa vier Wochen beginnen die Antheren aufzubrechen und Pflänzchen herauszuwachsen. Diese sind bei diploidem Elternteil haploid, bei tetraploidem Eltemteil dihaploid; sie werden nach Ausbildung von Wurzeln beispielsweise in Gartenerde getopft und im Gewächshaus zum Blühen gebracht. Diese (di)haploiden Pflanzen sind steril, können jedoch durch Sproßspitzen-, Wurzel-oder Stengelbehandlung mit Chemikalien, wie zum Beispiel Colchicin polyploidisiert werden, wobei homozygote Pflanzen entstehen, die sich dann über Samen weitervermehren lassen. Weiteres Vorgehen siehe bei der Behandlung mit Chemikalien (zum Beispiel Colchicinbehandlung).
Kulturmedium nach Nitsch und Nitsch (Science, 1969)
mg/l
| KNO3 | 950 |
| NH4NO3 | 720 |
| MgSO4 x 7 H2O | 185 |
| CaCI2 | 166 |
| KH2PO4 | 68 |
| MnSO4 x 4 H2O | 25 |
| H3BO3 | 10 |
| ZnSO4 x 7 H2O | 10 |
| Na2MoO4 x 2 H2O | 0,25 |
| CuSO4XoH2O | 0,025 |
| 5 ml einer Lösung aus 7,45 g | |
| Ethylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz | |
| und 5,57 g FeSO4 x 7 H2O auf 1 000 ml myo-lnosit | 100 |
| Glycin | 2 |
| Nicotinsäure | 5 |
| Pyridoxin-HCI | 0,5 |
| Thiamin-HCL | 0,5 |
| Folsäure | 0,5 |
| Biotin | 0,05 |
| Saccharose | 20 g |
| Fertignährboden (DIFCO-Bacto-Agar) | 8g |
| Indolessigsäure | 0,1 |
| pH des Mediums eingestellt auf 5,5 |
Von den durch Pollengrößenmessung und/oder Chromosomenzählung ausselektierten tetraploiden Kamillenpflanzen, die nach den vorstehend beschriebenen Möglichkeiten erhalten werden können, werden dann die Pflanzen ausselektiert, die einen Mindestgehalt an Chamazulen von 100mg % und einen Mindestgehalt an Bisabolol von 200mg % aufweisen, während der Gehaltan übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxide) unter 50 mg % (bezogen auf die getrockneten Blüten, siehe Beispiel 1) liegen soll.
-b-
Die so ausselektierten Pflanzen werden nach Entfernung aller bereits aufgeblühten Blütenkörbchen im Gewächshaus bei 18—240C Tag- und 12-14°C Nacht-Temperatur und einer Tageslänge von mindestens 14 Stunden abblühen lassen, wobei über einen Zeitraum von 4 Wochen alle Blütenköpfchen die verblüht oder kurz vor dem Zerfallen sind, zur Saatgutgewinnung geerntet werden. Nach Trocknen bei einer Lufttemperatur zwischen 20-35°C erhält man beispielsweise das Vermehrungsgut einer solchen Kamille
Als weitere Kriterien für diese Selektion können zusätzlich noch die folgenden zur Anwendung kommen:
a) ungefähr gleichzeitiges Blühen,
b) eine gleichmäßige, grundständige Verzweigung und eine schmale Blühzone von circa 10, insbesondere 5cm,
c) große Blütenköpfchen mit einem Außendurchmesser von circa 30 mm (20 bis 40 mm), insbesondere 25—35 mm,
Die Anwendung der zusätzlichen Kriterien a), b) und/oder c) führt beispielsweise zu hohen Blüten- und Drogenerträgen und besserer Eignung für die maschinelle Ernte.
Falls man von bereits bekannten tetraploiden Kamillen ausgeht, erfolgt die zuvor beschriebene Selektion sowie gegebenenfalls die weiteren Selektions- und Vermehrungsschritte in gleicher Weise.
Um eine Kamille zu erhalten, die außer einem Gehalt von mindestens 100 mg %Chamazulen und mindestens 200 mg %(-)-α-Bisabolol (bezogen auf die getrockneten Blütenköpfchen) auch noch einen hohen Blütenertrag aufweist und für die maschinelle Ernte besser geeignet ist, empfiehlt sich folgendes Vorgehen: Die ausselektierten Pflanzen (wie oben beschrieben) werden vegetativ durch Stecklinge vermehrt und über 3 bis 5 Generationen ausgelesen, wobei die Auswahl stets nach dem oben angegebenen Kriterium sowie gegebenenfalls den zusätzlichen Kriterien a)-c) erfolgt. Die gemäß diesen Kriterien ausgesuchten Pflanzen werden verklont, aus den verklonten Pflanzen wird Saatgut gewonnen, die hieraus erhaltenen Pflanzen wiederum nach dem oben angegebenen Mindestgehalt an Chamazulen und Bisabolol sowie gegebenenfalls den zusätzlichen Kriterien a)-c) ausselektiert und aus letzteren wieder Saatgut gewonnen.
Die Sequenz Aussaat — Selektion gemäß dem oben angegebenen Mindestgehalt an Chamazulen von 100 mg % und (-)-a-Bisabolol von mindestens 200 mg % (andere Bisaboloide unter 50 mg %) sowie gegebenenfalls den zusätzlichen Kriterien a)-c) — Saatgutgewinnung kann 3-5mal wiederholt werden.
Daran schließt sich nochmals eine Sequenz Aussaat — wie zuvor angegebene Selektion (gegebenenfalls Verklonung) — Saatgutgewinnung an.
Das zuletzt erhaltene Saatgut ist dann das Vermehrungsgut der erfindungsgemäßen Kamille.
Die Stecklingsvermehrung erfolgt dabei auf folgende Weise: Zur Stecklingsvermehrung müssen die Ausgangspflanzen (Klonmutterpflanzen) unter Kurztagbedingungen blütenknospenfreie Kurztriebe ausbilden. Dies erfolgt im Winterhalbjahr im Gewächshaus ohne Zusatzbeleuchtung oder in Klimakammern bei einer Tageslänge von 6 bis 10, vorzugsweise 8 Stunden und Temperaturen von 10 bis 15°C, vorzugsweise 120C. Zur Verklonung beziehungsweise Vermehrung eignen sich Blatt-, Trieb-und insbesondere Kurztrieb-(Seitentrieb-)Stecklinge. Ihre Bewurzelung erfolgt bei 12 bis 18°C, vorzugsweise 15°C und Tageslängen von 12 bis 16, vorzugsweise 14 Stunden in gespannter Atmosphäre (ca. 100% relative Luftfeuchte). Als Substrat kann beispielsweise ein Torf-Sand-Gemisch im Verhältnis 1:1 verwendet werden; es eignen sich aber auch reiner Quarzsand, Steinwolle-Stecklingswürfel, Torf-Stecklingswürfel und ähnliches.
Für die Aussaat kommen hierbei beispielsweise folgende Böden in Betracht: Gartenerde; humose, mittelschwere Lehmböden; lehmige oder humose Sandböden.
Es kann im Gewächshaus oder auch im Freiland ausgesät werden. Die Temperaturen für Keimung und Wachstum der Pflanzen liegen beispielsweise zwischen 12 bis 240C, insbesondere 18bis20°C. Falls im Freiland ausgesät wird, wird vorzugsweise im Herbst (September/Oktober) oder im Frühjahr (März/April) gesät. Diese Termine gelten für sämtliche in Frage kommenden Anbaugebiete (zum Beispiel nördliche Hemisphäre, gemäßigte bis subtropische Klimagebiete).
Besonders günstig ist es, wenn folgende Verfahrensbedingungen zur Anwendung kommen:
Von den tetraploiden Kamillenpflanzen, die einen Mindestgehalt an Chamazulen von 100mg%undan(-)-a-Bisabololvon200mg % aufweisen, während der Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxiden) unter 50 mg % liegt (alle Werte bezogen auf die getrockneten Blütenköpfchen), werden nur diejenigen ausselektiert, welche
— ungefähr gleichzeitig blühen,
— eine gleichmäßige grundständige Verzweigung und eine schmale Blühzone von ca. 10cm sowie
— große Blütenköpfchen mit einem Außendurchmesser von ca. 30 mm aufweisen.
Die ausselektierten Pflanzen werden vegetativ über Stecklinge vermehrt und über 3-5 Generationen ausgelesen, wobei die Auswahl stets nach den oben genannten Kriterien erfolgt. Die ausgesuchten Pflanzen werden vegetativ vermehrt (verklont), man läßt gemeinsam abblühen, und gewinnt hiervon das Saatgut. Die aus dem Saatgut erhaltenen Pflanzen werden wiederum nach den oben angegebenen Kriterien selektiert und die Sequenz Aussaat-Selektion-Saatgutgewinnung-Aussaat wird 3-5mal wiederholt.
Die Kamille, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mittel verwendet wird, gehört zur Kulturpflanzenart der echten Kamille mit der botanischen Bezeichnung Matricaria Chamomilla L. (synonym Chamomilla recutita [L], Rauschert). Das bei einer Temperatur von höchstens 70°C getrocknete Material aus den Blüten dieser Kamille, die in dem Vegetationsstadium geerntet wird, wo 30-100% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind, enthält mindestens 30 mg % Chamazulen, mindestens 100mg % (-)-a-Bisabolol und weniger als 50mg %an übrigen Bisaboloiden.
Falls die Ernte der Kamillenblüten zu einem Zeitpunkt erfolgt, in dem das Blüten-Entwicklungsstadium weiter fortgeschritten ist, das heißt, wo beispielsweise 100% oder bis zu 100% aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind (zum Beispiel Stadium der Vollblüte) und/oder falls die Trocknung der geernteten Blüten bei höhererTemperaturals40°C erfolgt, kann der Gehalt an den Wirkstoffen (-)-a-Bisabolol und Chamazulen niedriger sein, da durch höhere Trockentemperaturen und/oder bei späterer Ernte ein stärkerer Abbau des Azulens und Bisabolols eintreten kann.
Beispielsweise enthalten die im Trockenschrank bei 400C getrockneten Blüten (geerntet wie oben angegeben) der verfahrensgemäßen Kamille zwischen 100 bis 200 mg % Chamazulen, zwischen 200 bis 450 mg % (-)-a-Bisabolol und nur wenig, das heißt zwischen 5 bis 50 mg % andere Bisaboloide bezogen auf die Trockensubstanz (das heißt bezogen auf das absolute Trockengewicht der Blüten). Dieses absolute Trockengewicht wird durch Trocknung einer separaten Probe von Kamillenblüten im Trockenschrank bei 1050C bis zur Gewichtskonstanz (72 bis 96 Stunden) bestimmt. Der Wirkstoffgehalt der bei beispielsweise 35 bis 500C getrockneten Blüten wird dann auf die bei 105°C ermittelte Trockenmasse der Blüten berechnet.
Ein besonders wirkungsvolles Mittel erhält man (mit maximalem Gehalt an den Wirkstoffen Chamazulen und (-)-a-Bisabolol), wenn die Ernte der Kamillenblütenköpfchen in dem Vegetationsstadium erfolgt, wo beispielsweise 30 bis 70%, vorzugsweise 40 bis 60%, das heißt im allgemeinen 50% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Trocknung bei einer Lufttemperatur von höchstens 500C, beispielsweise 35 bis 5O0C, insbesondere 400C erfolgt. Beispielsweise enthalten im Trockenschrank bei 40°C getrocknete Blüten (geerntet, wo 40-60% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind) mindestens 100mg%, zum Beispiel zwischen 100 bis 150mg% Chamazulen, mindestens 200mg%, zum Beispiel zwischen 200 und 300 mg% (-)-a-Bisabolol und nur wenig, das heißt zwischen 5 bis 50 mg% andere Bisaboloide bezogen auf die Trockensubstanz (das heißt bezogen auf das absolute Trockengewicht der Blüten). Dieses absolute Trockengewicht wird durch Trocknung einer separaten Probe von Kamillenblüten im Trockenschrank bei 1050C bis zur Gewichtskonstanz (72 bis 96 Stunden) bestimmt. Der Wirkstoffgehalt der bei beispielsweise 35 bis 500C getrockneten Blüten wird dann auf die bei 1050C ermittelte Trockenmasse der Blüten berechnet.
Die Trocknung der Kamillenblüten kann entweder durch künstliche Luftzufuhr oder auch durch Trocknung im Schatten, gegebenenfalls auch in der Sonne erfolgen, wobei jedoch darauf geachtet werden soll, daß die Wärmezufuhr nicht über das zur vollständigen Trocknung erforderliche Maß hinausgeht. Es ist also vorteilhaft, daß man sich durch Kontrollwägungen von der erreichten Gewichtskonstanz überzeugt. Die Trocknung kann spontan oder künstlich (zum Beispiel mit künstlicher Warmluft) erfolgen. Die Wirkstoffausbeute ist am größten bei spontaner Trocknung unter Ausschluß des Sonnenlichts, vorzugsweise bei 40-600C, insbesondere 40-500C. Der Trocknungsprozeß soll möglichst bald beziehungsweise umgehend nach der Ernte stattfinden. Die Trocknung soll in dünnen Schichten, beispielsweise von 5 bis 20cm, vorzugsweise 10cm Dicke durchgeführt werden. Die Trocknung ist zum Beispiel auch in gut durchlüfteten Hallen bei einer Lufttemperatur zwischen 20-300C möglich. Im allgemeinen soll die Lufttemperatur für die Trocknung nicht höher als 600C sein. Günstig ist zum Beispiel eine Lufttemperatur zwischen 35 und 500C.
Der Wirkstoffgehalt der erfindungsgemäßen Mittel, insbesondere an den Hauptwirkstoffen Chamazulen und (-)-a-Bisabolol, ist abhängig von dem Vegetationsstadium, in dem sich die Kamillenblüten zum Erntezeitpunkt befinden und von der Trocknung der geernteten Blüten. Je höher die Trocknungstemperatur ist, desto stärker ist der Abbau der Wirkstoffe, das heißt desto niedriger der Gehalt der getrockneten Blüten an den Wirkstoffen. Aus dem gleichen Grund hat direktes Sonnenlicht bei der Trocknung einen nachteiligen Einfluß und soll nach Möglichkeit vermieden werden.
Das Vegetationsstadium einer Blüte wird dadurch charakterisiert, wieviel % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens zu einem bestimmten Zeitpunkt (hier dem Zeitpunkt der Ernte) geöffnet sind. Es können also Blüten geerntet werden, wo beispielsweise zwischen 30-50%, 30-70%, 40-60%, 60-100% oder 90-100% der Röhrenblüten eines Köpfchens geöffnet sind; Der Wirkstoffgehalt ist abhängig davon, in welchem Stadium sich die Blüten jeweils befinden und er ist bei der Kamille, die erfindungsgemäß eingesetzt wird, am größten, wenn 40-60% aller Röhrenblüten geöffnet sind und er ist sowohl bei weniger als auch bei mehr geöffneten Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geringer.
Es ist daher gerade ein großer Vorteil dieser Kamille, daß bei ihr das Abblühen der einzelnen Pflanzen gleichmäßig erfolgt, das heißt, daß von einer Aussaat die überwiegende Zahl der Pflanzen jeweils das gleiche Blühstadium aufweisen, das heißt, daß beispielsweise bei den weitaus meisten Pflanzen 40-60% aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens zum gleichen Zeitpunkt geöffnet sind. Dadurch ist eine vollständige Erfassung der Blütenköpfchen zum optimalen Zeitpunkt möglich. Die Kamille, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mittel verwendet wird, ist deshalb besonders geeignet für die mechanische Ernte. Der Zusammenhang des Gehalts an Chamazulen und (-)-a-Bisabolol einerseits mit dem Blühstadium zur Zeit der Ernte und andererseits mit Trocknungstemperatur zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Mittel ist beispielsweise in folgender Tabelle dargestellt (der Gehalt an übrigen Bisaboloiden ist in allen Fällen weniger als 50%).
| Trocknungs temperatur (Lufttemperatur) | Vegetationsstadium der Blüten zum Erntezeitpunkt 30-70% aller Röhrenblüten eines 70-100% aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet Blütenköpfchens geöffnet | Wirkstoffgehalt im getrockneten Material: |
| Wirkstoffgehalt im getrockneten Material: | Chamazulen: mindestens 40 mg% (-)-a-Bisabolol: mindestens 120 mg% | |
| nichthöherals50°C | Chamazulen: mindestens 100 mg% (-)-a-Bisabolol: mindestens 200 mg% | Wirkstoffgehalt im alkoholischen Auszug: |
| Wirkstoffgehalt im alkoholischen Auszug: | Chamazulen: mindestens 2,0 mg% (-)-a-Bisabolol: mindestens 6,0 mg% | |
| nichthöherals50°C | Chamazulen: mindestens 5,0 mg% (-)-a-Bisabolol: mindestens 10,0 mg% | Wirkstoffgehalt im getrockneten Material: |
| Wirkstoffgehalt im getrockneten » Material: |
zwischen 50-70 °C
Chamazulen: mindestens 50 mg% (-)-a-Bisabolol: mindestens 150 mg%
Chamazulen: mindestens30mg% (-)-a-Bisabolol: mindestens 100 mg%
Wirkstoffgehalt im alkoholischen Auszug:
Wirkstoffgehalt im alkoholischen Auszug:
| Trocknungs | Vegetationsstadium der Blüten zum Erntezeitpunkt | 70-100 % aller Röhrenblüten eines |
| temperatur | 30-70 % aller Röhrenblüten eines | Blütenköpfchens geöffnet |
| (Lufttemperatur) | Blütenköpfchens geöffnet | Chamazulen: |
| zwischen 50-700C | Chamazulen: | mindestens 1,5 mg% |
| mindestens 2,5 mg% | (-)-a-Bisabolol: | |
| (-)-a-Bisabolol: | mindestens 10 mg% | |
| mindestens 7,5 mg% |
Hieraus folgt, daß aus der Kamille, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mittel eingesetzt wird, beispielsweise bei einer Ernte, die im Vegetationsstadium stattfindet, wo zwischen 30—100% der Röhrenblüten der Blütenköpfchen geöffnet sind und die Trocknung bei Lufttemperaturen bis zu 7O0C erfolgen kann, ein trockenes Material erhalten wird, dessen Chamazulengehalt in jedem Fall mindestens 30mg% und dessen (-)-a-Bisabololgehalt mindestens 100mg% beträgt, während der Gehalt an übrigen Bisaboloiden stets geringer als 50 mg% ist.
In den alkoholischen Auszügen ist der Gehalt an übrigen Bisaboioiden stets niedriger als 10mg%.
Der Gehalt des ätherischen Öls, welches gemäß den Bedingungen der vorstehend angegebenen Tabelle aus einem getrockneten Material hergestellt wird, an Chamazulen und Bisabolol ist stets mindestens 3,5% Chamazulen, mindestens 10% (-)-a-Bisabolol und weniger als 10% an übrigen Bisaboloiden.
Die Kamille, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mittel verwendet wird, hat einen mittelspäten Erntetermin, eine einheitliche Wuchshöhe mit schmaler Blühzone und große Blütenköpfchen und ist daher besonders für mechanische Ernte geeignet. Hinzu kommt, daß zu gleicher Zeit ausgesäte Pflanzen der neuen tetraploiden Kamille im allgemeinen praktisch zur gleichen Zeit gemeinsam abblühen, so daß auch hierdurch die Ernte sehr vereinfacht und erleichtert wird. Diese neue Kamille erbringt außerdem einen hohen Ertrag. Die erfindungsgemäß aus dieser Kamille hergestellten bisabolol- und chamazulenreichen Mittel mit antiphlogistischer Wirkung werden zum Beispiel in der Diätetik, in der Kosmetik sowie in Form von Tees verwendet. So können aus dem erfindungsgemäß erhaltenen getrockneten Material zum Beispiel durch Extraktion mit Alkoholen beziehungsweise wäßrigen Alkoholmischungen oder durch Extraktion mit überkritischen Gasen Kamillenauszüge beziehungsweise Kamillenextrakte erhalten werden. Für die Herstellung von Extrakten, insbesondere alkoholischen Extrakten, können auch frische Kamillenblüten beziehungsweise eingefrorene Kamillenblüten (falls frische Blüten eingefroren wurden) verwendet werden.
Weiterhin können aus dem getrockneten Material Kamillenöl, (-)-a-Bisabolol, Chamazulen und andere Kamilleninhaltstoffe erhalten werden.
So enthalten alkoholische Auszüge des trockenen Materials gemäß Anspruch 1 mindestens 1,5 mg%, vorzugsweise 5,0 mg% Chamazulen und mindestens 5,0mg%, vorzugsweise mindestens 10,0mg% (-)-a-Bisabolol im alkoholischen Drogenauszug und
weniger als 8mg% an übrigen Bisaboloiden. ,
Die Herstellung solcher Auszüge erfolgt in der hierfür üblichen Weise.
Für die Extraktion können beispielsweise Mischeinrichtungen, zum Beispiel sogenannte Muldenmischmaschinen, Perkolatoren und andere geeignete Extraktionsapparaturen verwendet werden. Die Temperatur während der Extraktion beträgt beispielsweise 10 bis 50°C. Eine Kühlung ist nicht erforderlich.
Als Lösungsmittel kommen insbesondere gerade oder verzweigte aliphatische, ein- oder mehrwertige Alkohole mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen wie zum Beispiel Methanol, Ethanol, Propanol-(2), Butanol, Glycerin, Isopropyliden-glycerol und ähnliche, sowie Gemische dieser Lösungsmittel mit Wasser in Frage.
Es können auch Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden. Die Mindestmenge an Lösungsmitteln beträgt 2 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil des getrockneten Materials. Im allgemeinen verwendet man 2 bis 20 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil des getrockneten Materials, insbesondere 3 bis 10 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil des getrockneten Materials.
Ein aus dem trockenen Material gemäß Anspruch 1 erhaltenes ätherisches Öl enthält mindestens 3,5%, vorzugsweise mindestens 5% Chamazulen und mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 15% (-)-a-Bisabolol und weniger als 10% an übrigen Bisaboloiden.
Die Herstellung des ätherischen Öls erfolgt im allgemeinen dadurch, daß man das getrocknete Material mit Wasser, beispielsweise in Gegenwart von Ascorbinsäure (zum Beispiel als Salz, insbesondere als Natriumsalz) bei einem pH-Wert zwischen 4 und 6, vorzugsweise 5 bis 5,5 zum Sieden erhitzt. Der pH-Wert wird beispielsweise mittels einer Säure, wie Salzsäure, eingestellt. Auf 1 Gewichtsteil des getrockneten Materials werden beispielsweise 10 bis 50 Gewichtsteile Wasser und gegebenenfalls 0,1 bis 1 Gewichtsteil Ascorbinsäure verwendet.
Es wird im allgemeinen 2 bis 8 Stunden erhitzt. Das erhaltene wäßrige Destillat wird mehrmals mit einem niederen aliphatischen, flüssigen Kohlenwasserstoff (zum Beispiel Petrolether [zum Beispiel Kp 35-60 "C], Pentan, Xylol, Decalin) mehrmals ausgeschüttelt, die organische Phase getrocknet (zum Beispiel mittels Natriumsulfat) und das organische Lösungsmittel in schonender Weise entfernt (beispielsweise durch Abdestillieren im Rotationsverdampfer oder durch Destillation bei 40-700C, vorzugsweise bei 50-600C). Bei höhersiedenden Lösungsmitteln wird dieses Abdestillieren unter Vakuum durchgeführt.
Die Bestimmung des Chamazulens erfolgt spektralphotometrisch ähnlich der bei Kamillenextrakten üblichen Weise.
Die Bestimmung des (-)-a-Bisabolols sowie der übrigen Inhaltstoffe des Kamillenöls erfolgt nach der hierfür üblichen gaschromatographischen Methode.
Eine genaue Schilderung der analytischen Bestimmungsmethoden enthält die Anlage A.
Der Wirkstoff Chamazulen liegt in den Kamillenblüten nicht als solcher, sondern in Form des Sesquiterpenlactons Matricin vor.
Das Matricin besitzt eine pharmakologische Wirkung, die derjenigen des Chamazulens ähnlich ist. Aus dieser Vorstufe Matricin entsteht beispielsweise beim Erhitzen (zum Beispiel Wasserdampfdestillation, Teeaufguß) sofort das Chamazulen. Es ist daher üblich, bei der Kamille nicht den Gehalt an Matricin, sondern den Gehalt des sich hieraus bildenden Chamazulens anzugeben.
Werden die Blüten der beschriebenen tetraploiden Kamille in einem Vegetationsstadium geerntet, wo 30-100% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind, und die Blüten bei einer Lufttemperatur bis zu 700C getrocknet, so enthält das so erhaltene Mittel beispielsweise mindenstens30mg%Chamazulen, mindestens 100mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50mg%an übrigen Bisaboloiden und ein hieraus durch Destillation in Gegenwart von Wasser hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5% Chamazulen, mindestens 10% (-)-a-Bisaboiol und weniger als 10 mg% an übrigen Bisaboloiden, und ein durch Extraktion mit niederen Alkoholen hergestellter alkoholischer Auszug mindestens 1,5mg% Chamazulen, mindestens 5,0 mg% (-)-a-Bisabolol und wenigerals 10mg%an übrigen Bisaboloiden. <,
Werden die Blüten der beschriebenen tetraploiden Kamille in dem Vegetationsstadium geemtet, wo 30-70% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind, und die Blüten bei einer Lufttemperatur von nicht höher als 5O0C getrocknet, so enthält das so erhaltene Mittel beispielsweise mindestens 100mg% Chamazulen, mindestens 200mg% (-)-a-Bisabolol und wenigerals 50mg% an übrigen Bisaboloiden, ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5% Chamazulen, mindestens 10% (-)-a-Bisabolol und wenigerals 10% an übrigen Bisaboloiden, und ein alkoholischer Auszug mindestens 5,0 mg% Chamazulen, mindestens 10,0mg% (-)-a-Bisabolol und wenigerals 10,0mg%an übrigen Bisaboloiden. Werden die Blüten der beschriebenen tetraploiden Kamille in dem Vegetationsstadium geemtet, wo 30-70% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur zwischen 50-700C getrocknet, so enthält das so erhaltene Mittel zum Beispiel mindestens 50 mg% Chamazulen, mindestens 150 mg%(-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden, ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5% Chamazulen, mindestens 10% (-)-a-Bisabolol und wenigerals 10% an übrigen Bisaboloiden und ein alkoholischer Auszug mindestens 2,5 mg% Chamazulen, mindestens 7,5 mg% (-)-a-Bisabolol und wenigerals 10,0mg%an übrigen Bisaboloiden.
Werden die Blüten in dem Vegetationsstadium geemtet, wo 70-100% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur von nicht höher als 50°C getrocknet, so enthält das so erhaltene Mittel beispielsweise mindestens 40 mg% Chamazulen, mindestens 120mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50mg% an übrigen Bisaboloiden, ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5% Chamzulen, mindestens 10%(-)-a-Bisabolol und weniger als 10% an übrigen Bisaboloiden und ein alkoholischer Auszug mindestens 2,0mg% Chamazulen, mindestens 6,0mg% (-)-a-Bisabolol undwenigerals 10,0mg%an übrigen Bisaboloiden.
Werden die Blüten der beschriebenen tetraploiden Kamille in dem Vegetationsstadium geerntet, wo 70-100% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur zwischen 50-700C getrocknet, so enthält das so erhaltene Mittel beispielsweise mindestens 30 mg% Chamazulen, mindestens 100mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden, ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5% Chamazulen, mindestens 10% (-)-a-Bisabolol undwenigerals 10% an übrigen Bisaboloiden und ein alkoholischer Auszug mindestens 1,5 mg% Chamazulen, mindestens 10mg% (-)-a-Bisabolol undwenigerals 10,0mg%an übrigen Bisaboloiden.
Gewinnung eines Mittels mit antiphlogistischer Wirkung aus einer tetraploiden Ausgangskamille:
Eine Kamille, die man so erhält wie nachstehend beschrieben ist, wird in üblicher Weise feldmäßig ausgesät. Sobald die Pflanzen sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in dem Vegetationsstadium sind, wo etwa 50% der Röhrenblüten geöffnet sind, werden diese Blütenköpfchen mit einer Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände der Pflückmaschine so eingestellt sind, daß nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten zu 50% offen sind, abgestreift werden. Das Erntegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet.
Anschließend werden die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Gewichtsverlust beträgt etwa 80%. Die Trocknung erfolgt im Schatten an einer gut belüfteten Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10cm.
Nach etwa 2-3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend in Ballen gepreßt.
Analyse
Ätherisches Öl: 960 mg%
Chamazulen: 162mg%
(-)-a-Bisabolol: 330 mg%.
Erfolgt die Trocknung beispielsweise in einer stationären Bandtrockenanlage mittels künstlich erwärmter Luft bei einer Temperatur zwischen 50 und 700C, so ist die Trocknung nach etwa 4-5 Stunden beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend in Ballen gepreßt.
Die Analysenwerte eines solchen Mittels sind zum Beispiel:
Ätherisches Öl: 870 mg%
Chamazulen: 94mg%
(-)-a-Bisabolol: 197mg%.
Die verwendete tetraploide Ausgangskamille wird wie folgt erhalten:
Durch Einzelpflanzenvariabilitätstests von 10000 Pflanzen der tetraploiden Kamillensorte, die von I.Särkäny (Herba Hungar. 4 [1], 125-169 [1965]) beschrieben wurde, wurde gefunden, daß auf etwa 1000 Individuen eine Pflanze kommt, die im ätherischen Öl einen hohen Chamazulengehalt von 20Gew.-% sowie einen hohen (-)-a-Bisabololgehalt von 50Gew.-% aufweist, wobei gleichzeitig der Gehaltan übrigen Bisaboloiden (insbesondere (-)-a-Bisabolonoxid) sehr gering (weniger als 5 Gew.-%) ist. Diese Individuen wurden ausselektiert und folgenden Schritten unterworfen:
Schritt 1:
Von der Nachkommenschaft der (wie oben beschriebenen) ausselektierten tetraploiden Kamillenpflanzen wurden diejenigen Individuen ausgelesen, die
A) etwa gleichzeitig blühen,
B) eine gleichmäßige, grundständige Verzweigung und eine schmale Blühzone von ca. 10 cm, vorzugsweise 5 cm, aufweisen,
C) große Blütenköpfchen mit einem Außendurchmesser von ca. 30 mm, vorzugsweise 25—35 mm aufweisen,
D) einen Mindestgehalt für Chamazulen von 150mg% und Bisabolol von 300 mg% erreichen oder überschreiten und deren Gehaltan übrigen Bisaboloiden*(insbesondere Bisabololoxide) deutlich unter50mg% liegt. (Sämtliche Werte beziehen sich auf Blütenköpfchen, die bei 400C getrocknet wurden und deren Ernte in dem Stadium erfolgte, wo 30-70% aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind.
Diese Pflanzen wurden verklont. Hierzu wurden die Pflanzen (Klonmutterpflanzen) zunächst auf zirka 15cm Sproßlänge zurückgeschnitten, unter 8 bis 10 Stunden Tageslänge und 12 bis 14°Czum Neuaustrieb (kurze Seitentriebe) gebracht. Die Kurztriebe wurden geschnitten und in ein Torf-Sand-Gemisch gesteckt. Bei zirka 100% relativer Luftfeuchte, 15°C Lufttemperatur und einer Tageslänge von 14 Stunden dauerte die Bewurzelung der Stecklinge 7 bis 14 Tage.
Anstelle der angegebenen konventionellen Verklonung (Stecklingsvermehrung) kann auch die in-vitro-Vermehrung teilungsfähige Gewebspartien der Pflanze eingesetzt werden (sogenannte Meristem-Vermehrung). Zur Etablierung einer Kamillen-Kultur eignen sich verschiedene Teile der Pflanze, vorzugsweise die Sproßspitzen oder die Achselknospen.
Nach Abspülen der Pflanzen mt H2O2 werden unter aseptischen Bedingungen im „Laminar Flow" (Hochleistungs-Schwebstoff-Filter mit turbulenzarmer Verdrängungsströmung) Sproßspitzen der Blattachselknospen entnommen und in Reagenzgläser.
übertragen, die mit einem Nährmedium, beispielsweise nach Murashige und Skoog (Physiol.Plant. 15,473-497,1962) gefüllt sind. Die Reagenzgläser werden in einen Klimaraum mit 12-18, vorzugsweise 16 Stunden Tageslänge (erreicht durch Fluoreszenz-Leuchtstoffröhren), einer Lichtintensität von 500 bis lOOOOlux, vorzugsweise 1 000-3000lux und einer Temperatur von 15 bis 300C, vorzugsweise 22-27°C gestellt.
Sobald die Explantate ein gutes Wachstum zeigen, werden sie auf ein obengenanntes Nährmedium, jedoch mit einer höheren Cytokininkonzentration* (zum Beispiel 30 mg/l 6-lsopentenyladenin) und wenig oder gar keinem Auxin (0-0,3 mg/l Indolessigsäure) überführt. In der Folge strecken sich die Achsen und es werden Adventivorgane sowie vermehrt Achselknospen gebildet. Diese können nach der vorerwähnten Weise entnommen und angezogen werden.
Die für die Pflanzenvermehrung in größerer Zahl bestimmten Explantate (der 3. Passage = 3. Vermehrungsgeneration) werden nach Anwachsen und Ausbildung der Blätter auf dem erstgenannten Nährmedium auf einen Nährboden übertragen, welcher 10mg/I Indolessigsäure oder3-lndolbuttersäure oder 0,1-0,3 mg/l -Naphthylessigsäure enthält. Dabei bewurzeln sich die Pflänzchen und können nach etwa 4 Wochen in mit sterilisierter Gartenerde (12 Stunden bei 1200C gedämpft) gefüllte Töpfe gepflanzt und im Gewächshaus (unter Bedingungen wie für die konventionelle Stecklingsvermehrung üblich) weiterkultiviert werden.
Nährmedium nach Murashige & Skoog:
mg/l mg/l
NH4NO3 400 . Indolessigsäure 2,0
Ca(NO3J2 -4H2O 144 Furfuryladenin 0,1
KNO3 80 Thiamih 0,1
KH2PO4 12,5 Nicotinsäure '0,5
MgSO4-7H2O 72 Pyridoxin 0,5
KCI 65 Glycin 2,0
NaFe-EDTA 25 myo-lnosit 100
H3BO3 ' 1,6 Casein-Hydrolys. 1000
MnSO4-4H2O 6,5 Saccarose 2%
ZnSO4 -7H2O 2,7 . gereinigtes
KJ 0,75 Agar-Pulver 1 %
Schritt 2:
Die nach Schritt 1 erhaltenen Pflanzen blühten unter isolierten Bedingungen im Gewächshaus gemeinsam ab. Die Pflanzen standen hierbei in 11-cm-Töpfen, gefüllt mit Gartenerde, bei 18 bis 24°CTag- und 12 bis 14°C Nacht-Temperatur. Die Tageslänge betrug mindestens 14 Stunden und wurde im Winterhalbjahr durch Zusatzbelichtung (200 Watt/m2) erreicht. Die Wasserversorgung erfolgte nach Bedarf.
Von der Gesamtheit der selektierten Individuen wurden über einen Zeitraum von 4 Wochen laufend diejenigen Köpfchen zur Saatgutgewinnung geerntet, die verblüht und kurz vor dem Zerfallen waren. Trocknung erfolgte in einer gut durchlüfteten Halle bei einer Lufttemperatur zwischen 20-300C; anschließend wurde das Saatgut mittels eines Schlitzsiebes (5 χ 0,4mm) abgesiebt und durch einen Steigsichter nachgereinigt.
Schritt 3:
Aus dem nach Schritt 2 erhaltenen Saatgut wurde eine Stichprobe entnommen und hieraus zirka 2000 Nachkommen gezogen (ökologische Bedingungen wie bei Schritt 2) und nach den gleichen Kriterien A) bis D) von Schritt 1 selektiert. Mit den so selektierten Individuen wurde dann gemäß Schritt 2 verfahren.
Schritt 4:
Von dem Saatgut gemäß Schritt 3 wurde ein Teil an zwei verschiedenen Standorten im Herbst ausgesät.
Standort I)
450 m NN, 48,5° N/11,5° O,
750mm Jahresniederschlagssumme,
feucht-gemäßigtes Klima,
Januar-10bisO°C,
Juli +10 bis+200C,
* Cytokinine sind Phytohormone, welche die Zellteilung fördern
Standort II) . '
200m NN, 42° N/1°O,*'
400 mm Jahresniederschlagssumme,
mediterranes Klima,
Januar 0bis+10°C,
Juli +20 bis +3O0C.
Die Aussaat erfolgte an beiden Standorten Ende September/Anfang Oktober.
Die so erhaltenen Feldversuchsbestände wurden hinsichtlich homogenem Wuchs, Blütengröße und Erntetermin überprüft und beurteilt (bonitiert), außerdem wurden Stichproben der Blüten auf die Wirkstoffgehalte untersucht. Aus dem Feldbestand wurden erneut diejenigen Individuen selektiert, die den bei Schritt 1 genannten Parametern entsprechen. Von diesen wird Saatgut entsprechend Schritt 2, letzter Satz, gewonnen.
Schritt 5:
Mit dem Saatgut gemäß Schritt 4 wurden die Schritte 3 und 4 in der angegebenen Reihenfolge und Weise wiederholt.
Schritt 6:
Aus dem nach Schritt 5 gewonnenen Saatgut wurden zirka 1 500 Individuen gezogen (ökologische Bedingungen wie bei Schritt 2) und nach dem gleichen Prinzip, wie bei Schritt 1 angegeben ist, selektiert. Von den so ausselektierten Pflanzen wurden 34 Individuen ausgewählt und gemäß Schritt 1 verklont. Je 10 Pflanzen jedes Klons wurden in zufälliger Verteilung im Abstand 40 χ 30cm im Freiland (Standort I, siehe Schritt 4) an isolierter Stelle aufgepflanzt. Der Boden war Lößlehm, pH 7,0; die Pflanzung erfolgte Anfang Juni, die erste Ernte der Samen Mitte Juli, danach wurden die Pflanzen zurückgeschnitten, blühten nochmals und lieferten Mitte bis August eine zweite Saatguternte.
Die Saatgutgewinnung dieses Materials erfolgte gemäß Schritt 2.
Das nach Schritt 6 erhaltene Saatgut ist das Vermehrungsgut der verfahrensgemäßen Kamille.
Blüten und Pflanzen aus diesem Vermehrungsgut (Aussaat September/Oktober, Ernte Anfang Juni des darauffolgenden Jahres), die zu diesem Zeitpunkt gepflückt werden, wenn 30-70% der Röhrenblüten geöffnet sind, und die sofort anschließend im Trockenschrank bei 4O0C 72 Stunden getrocknet wurden, enthalten, bezogen auf das Gewicht der getrockneten Blüten (Trockensubstanz), beispielsweise mindestens: 150mg%Chamazulen,300mg% (-)-a-Bisabolol und höchstens 50mg% übrige Bisaboloide.
Gewinnung eines Mittels mit antiphlogistischer Wirkung aus einer tetfaploiden Ausgangskamille:
Eine Kamille, die man so erhält wie nachstehend beschrieben ist, wird in üblicher Weise feldmäßig ausgesät. Sobald die Pflanzen sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in dem Vegetationsstadium sind, wo etwa 50% der Röhrenblüten geöffnet sind, werden diese Blütenköpfchen mit einer Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände der Pflückmaschine so eingestellt sind, daß nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten zu 50% offen sind, abgestreift werden. Das Erntegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet.
Anschließend werden die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Gewichtsverlust beträgt etwa 80%. Die Trocknung erfolgt im Schatten an einer gut belüfteten Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10cm.
Nach etwa 2-3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend in Ballen gepreßt.
Analyse
Ätherisches Öl: 940 mg%
Chamazulen: 132mg%
(-)-a-Bisabolol: 243 mg%.
Erfolgt die Trocknung beispielsweise in einer stationären Bandtrockenanlage mittels künstlich erwärmter Luft bei einer Temperatur zwischen 50 und 70°C, so ist die Trocknung nach etwa 4-5 Stunden beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend in Ballen gepreßt.
Die Analysenwerte eines solchen Mittels sind zum Beispiel:
Ätherisches Öl: 775 mg%
Chamazulen: 65mg%
(-)-a-Bisabolol: · 163 mg%.
Die verwendete tetraploide Ausgangskamille wird wie folgt erhalten:
Durch Einzelpflanzenvariabilitätstests von 10000 Pflanzen dertetraploiden Kamillensorte, die von I.Särkäny (Herba Hungar. 4 [1], 125-169 [1965]) beschrieben wurde, wurde gefunden, daß auf etwa 1000 Individuen eine Pflanze kommt, die im ätherischen Öl einen hohen Chamazulengehalt von 20Gew.-% sowie einen hohen (-)-a-Bisabololgehaltvon 50Gew.-% aufweist, wobei gleichzeitig der Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere (-)-a-Bisabolonoxid) sehr gering (wenige als 5Gew.-%) aufweist.
Diese Individuen wurden ausselektiert und folgenden Schritten unterworfen:
Schritt 1:
Von der Nachkommenschaft der wie oben beschriebenen ausselektierten tetraploiden Kamillenpflanzen wurden diejenigen Individuen ausgelesen, die einen Mindestgehalt für Chamazulen von 100mg% undfür(-)-a-Bisabolol von 200 mg% erreichen oder überschreiten und deren Gehaltan übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxiden) unter 50mg% liegt. Sämtliche Werte beziehen sich auf Blütenköpfchen, die bei ca. 4O0C getrocknet wurden und deren Ernte in dem Stadium erfolgte, wenn zirka 30-70% aller Röhrenblüten eines Köpfchens geöffnet sind.
* NN = nördlich Normalnull = Seehöhe 0N = nördliche Breite (ngrad) °0 = östliche Länge (ngrad)
Schritt 2:
Von den nach Schritt 1 erhaltenen Pflanzen wurden alle aufgeblühten Blütenkörbchen entfernt, anschließend kamen die Pflanzen in ein Gewächshaus und blühten unter isolierten Bedingungen gemeinsam ab. Die Pflanzen standen hierbei in 11-cm-Töpfen, gefüllt mit Gartenerde, bei 18 bis 24"C Tag- und 12 bis 14CC Nacht-Temperatur. Die Tageslänge betrug mindestens 14 Stunden und wurde im Winterhalbjahr durch Zusatzbelichtung (200 Watt/m2) erreicht. Die Wasserversorgung erfolgte nach Bedarf.
Von der Gesamtheit der selektierten Individuen wurden über einen Zeitraum von 4 Wochen laufend diejenigen Köpfchen zur Saatgutgewinnung geerntet, die verblüht und kurz vor dem Zerfallen waren. Trocknung erfolgte in einer gut durchlüfteten Halle bei einer Lufttemperatur zwischen 20-30 °C; anschließend wurde das Saatgut mittels eines Schlitzsiebes (5 x 0,4mm) abgesiebt und durch einen Steigsichter nachgereinigt.
Das nach Schritt 2 erhaltene Saatgut ist das Vermehrungssaatgut der verfahrensgemäßen Kamille.
Blüten von Pflanzen aus diesem Vermehrungsgut (Aussaat September/Oktober, Ernte Anfang Juni des darauffolgenden Jahres), die zu dem Zeitpukt gepflückt werden, wenn 30-70% der Röhrenblüten geöffnet sind, und die sofort anschließend im Trockenschrank bei 40°C 72 Stunden getrocknet wurden, enthalten, bezogen auf das Gewicht der getrockneten Blüten, mindestens 100mg% Chamazulen, mindestens 200mg% (-)-a-Bisabolol und höchstens 50mg% übrige Bisaboloide.
Gewinnung eines Mittels mit antiphlogistischer Wirkung aus einer diploiden Ausgangskamille:
Eine Kamille, die man so erhält wie nachstehend beschrieben ist, wird in üblicher Weise feldmäßig ausgesät. Sobald die Pflanzen sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in dem Vegetationsstadium sind, wo etwa 50% der Röhrenblüten ogeöffnet sind, werden diese Blütenköpfchen mit einer Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände der Pflückmaschine so eingestellt sind, daß nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten zu 50% offen sind, abgestreift werden. Das Erntegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet.
Anschließend werden die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Gewichtsverlust beträgt etwa 80%. Die Trocknung erfolgt im Schatten an einer gut belüfteten Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10cm.
Nach etwa 2-3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend in Ballen gepreßt.
Analyse
Ätherisches Öl: 910mg%
Chamazulen: 117mg%
(-)-a-Bisabolol: 252 mg%
Die verwendete diploide Ausgangskamille wird wie folgt erhalten:
Durch Einzelpflanzenvariabilitätstests der diploiden, nur wenig Bisabolol enthaltenen, aber nicht bisabololfreien Kamillen, die in Franz, Ch., J.Hölzl und A.Vömel: Acta Horticulturae73,109-114(1978) beschrieben werden, wurde gefunden, daß maximal bis zu 20% aller Individuen im ätherischen Öl einen Chamazulengehaltvon etwa 20Gew.-% und/oder einen hohen (-)-a-Bisabololgehaltvon öOGew.^/oaufweisen^, wobei gleichzeitig der Gehalt an den ürigen Bisaboloiden (insbesondere (-)-a-Bisabolonoxid) sehr gering ist. Diese Individuen wurden ausselektiert und wie folgt tetraploidisiert:
Samen der so ausselektierten Kamillenpflanzen wurden auf ein mit 0,05%iger wäßriger Colchicinlösung getränktes Filterpapier aufgebracht und bei Raumtemperatur (2O0C) 6 Stunden quellen lassen. Daraufhin wurden sie vom Filterpapier entfernt, mit Wasser mehrmals gespült und in Saatkisten (Gewächshaus) ausgesät: Erde: Torf-Sand-Gemisch 1:1, Temperatur: 18 bis 2O0C, relative Luftfeuchtigkeit: zirka 60%, Tageslänge bei künstlicher Belichtung: 14 Stunden.
Die keimenden Pflanzen wurden bis zur Blüte beobachtet, der Polyploidisierungserfolg wurde durch Vergleichsmessung der Pollen- und Samengröße sowie durch Chromosomenzählung der Pflanzen (FrNachkommenschaft = erste, aus Samen gezogene Nachkommenschaft der als tetraploid bestätigten colchicinierten Pflanzen) festgestellt.
Die Tetraploidisierung kann auch auf folgende Weise erfolgen:
Auf wassergetränktem Filterpapier ausgekeimte, 5 bis 7 Tage alte, gut entwickelte Kamillenkeimlinge wurden bei Raumtemperatur (2O0C) für 4 bis 6 Stunden mit den Keimblättern nach unten in eine 0,05%ige Colchicinlösung gestellt. Die empfindlichen Keimwurzeln wurden dabei geschont; um Trockenschäden an ihnen zu vermeiden, muß die umgebende Atmosphäre nahezu 100% relative Luftfeuchte aufweisen. Nach der Behandlung wurden die Keimlinge mit Wasser mehrmals gespült und in Pflanzenkistchen pikiert. Die weitere Behandlung erfolgte wie bei den Samen.
Die Pollengrößenmessungen werden mit einem Leitz-Binokuiar-Forschungsmikroskop mit Mikrometer-Meßokular und Mikrometer-Objektträger durchgeführt.
Die Chromosomenzählung findet an Wurzelspitzen statt: Von den im Gewächshaus gezogenen Jungpflanzen oder Stecklingspflanzen werden 1 bis 2cm langefrische Wurzelenden gesammelt, 5 Stunden in 0,002 molare Hydroxychinolin-Lösung.
und anschließend 15 Minuten in 1N HCI eingelegt. Zur Untersuchung werden zirka 1 mm der Wurzelspitzen mit 2%iger Orcein-Essigsäure angefärbt und in Ölimmersion mikroskopisch untersucht. Bei den in Mitose befindlichen Zellen kann so der 4fache Chromosomensatz der somatischen Zellen bestimmt werden (4n = 36).
Diejenigen Pflanzen, bei welchen der Pollendurchmesser um zirka 50% größer als derjenige des diploiden Ausgangsmaterials (zirka 30 statt zirka 20 pm) und bei denen der Chromosomensatz der somatischen Zellen auf 36 verdoppelt war (bei dem diploiden Ausgangsmaterial ist die entsprechende Zahl 18) sind tetraploid. Diese wurden ausselektiert. Ungefähr 0,1 bis 0,5% der Samen beziehungsweise der Keimlinge wurden bei der oben angegebenen Methode tetraploidisiert und entwickelten blühfähige, intakte Pflanzen. Es schließen sich nun beispielsweise die Schritte 1 und 2 entsprechend Beispiel 2 an.
Die Blüten der so erhaltenen Kamilje enthalten beispielsweise mindestens 100mg% Chamazulen, 200mg% (-)-a-Bisabolol und höchstens 50mg%an übrigen Bisaboloiden (Ernte zu dem Zeitpunkt, wo 30-70% der Röhrenblüten geöffnet sind und 72stündiges Trocknen im Trockenschrank bei 4O0C).
Gewinnung eines antiphlogistisch wirkenden Mittels aus einer diploiden Ausgangskamille:
Eine Kamille, die man so erhält wie nachstehend beschrieben ist, wird in üblicherweise feldmäßig ausgesät. Sobald die Pflanzen sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in dem Vegetationsstadium sind, wo etwa 50% der Röhrenblüten geöffnet sind, werden diese Blütenköpfchen mit einer Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände der Pflückmaschine so eingestellt sind, daß nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten zu 50% offen sind, abgestreift werden. Das Erntegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet.
Anschließend werden die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Gewichtsverlust beträgt etwa 80%. Die Trocknung erfolgt im Schatten an einer gut belüfteten Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10cm.
Nach etwa 2-3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend in Ballen gepeßt.
Analyse
Ätherisches Öl: 1 020 mg%
Chamazulen: 173 mg%
(-)-a-Bisabplol: 410 mg%.
Die verwendete diploide Ausgangskamille wird wie folgt erhalten:
Durch Einzelpflanzenvariabilitätstests der diploiden, nur wenig Bisabolol enthaltenden, aber nicht bisabololfreien Kamillen, die in Franz, Ch., J.Hölzl und A.Vömel: Acta Horticulturae73,109-114(1978) beschrieben werden, wurde gefunden, daß maximal bis zu 20% aller Individuen im ätherischen Öl einen Chamazulengehalt von etwa 20Gew.-% und/oder einen hohen (-)-a-Bisabololgehaltvon 50Gew.-% aufweisen, wobei gleichzeitig der Gehaltan den übrigen Bisaboloiden (insbesondere (-)-a-Bisabolonoxid) sehr gering ist. Diese Individuen wurden ausselektiert und genau wie in Beispiel 3 angegeben isttetraploidisiert und die tetraploiden Individuen ausselektiert.
Ungefähr 0,1 bis 0,5% der Samen beziehungsweise der Keimlinge wurden tetraploidisiert und entwickelten blühfähige, intakte Pflanzen.
Es schließen sich nun beispielsweise die Schritte 1 bis 6 entsprechend Beispiel 1 an.
Die Blüten der so erhaltenen Kamille enthalten beispielsweise mindestens 150mg% Chamazulen, 300 mg% (-)-a-Bisabolol und höchstens 50mg%an übrigen Bisaboloiden (Ernte zu dem Zeitpunkt, wo 30-70% der Röhrenblüten geöffnet sind und 72stündiges Trocknen im Trockenschrank bei 400C).
Die übrigen Eigenschaften entsprechen denen der nach Beispiel 1 erhaltenen Kamille.
Herstellung eines Extraktes aus Kamillendroge.
Die Kamillenblüten für die eingesetzte Droge werden gemäß Beispiel 1 zu einem Zeitpunkt geerntet, wo 30—70% der Röhrenblüten geöffnet sind und bei einer Lufttemperatur von nicht höher als 500C getrocknet.
400 g der so erhaltenen Kamillendroge mit einem Gehalt von 105mg% Chamazulen und 212mg% (-)-a-Bisabolol werden mit 2100g wäßrigem Ethanol (40Gew.-% Ethanol) in einem Muldenmischer bei einer Drehzahl des Mischwerks von 30 Umdrehungen pro Minute 3 Stunden lang extrahiert. Das Drogengut wird anschließend abgepreßt und der Extrakt filtriert.
Im Extrakt wird der Wirkstoffgehalt in bekannter Weise ermittelt:
Chamazulen: 3,7mg%
(-)-a-Bisabolol: 10,2 mg%
Herstellung eines ätherischen Kamillenöls.
200g gemäß Beispiel 1 erhaltene getrocknete Kamillenblüten (Trocknung erfolgte bei 50°C unter Ausschluß von Sonnenlicht) werden in einem 5-Liter-Rundkolben mit 3,61 Wasser u,nd 2 g Natriumascorbat versetzt; das Gemisch wird mit 1 N HcI auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Nach Zugabe von Siedesteinen wird zum Sieden erhitzt. Innerhalb von ca. 3 Stunden werden ca. 1,21 Destillat aufgefangen.
Nach beendeter Destillation wird das Destillat dreimal mit je 100 ml Petroläther ausgeschüttelt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird filtriert und das Lösungsmittel anschließend im Rotationsverdampfer abdestilliert.
In dem erhaltenen ätherischen Öl wird anschließend der Gehalt an Chamazulen und (-)-a-Bisabolol bestimmt.
Ausbeute: 1,44 g ätherisches Öl
Chamazulen: 3,6%i.ÖI
(-)-a-Bisabolol: 10,2%i.ÖI
Anlage A
Ausgangsmaterial ist ein getrocknetes Material aus einer Kamille, die gemäß der Erfindung zur Herstellung des antiphlogistisch wirksamen Mittels in Frage kommt. Zur Herstellung des Öl werden nur solche Blütenköpfchen verwendet, bei denen 30 bis 70%, insbesondere 40 bis 60% der Röhrenblüten geöffnet sind. Die Trocknung erfolgt in einem Trockenschrank bei 400C während 72 Stunden.
Das ätherische Öl der Kamillenblüten wird wie im folgenden beschrieben durch zweistündige Wasserdampfdestillation des getrockneten Materials gewonnen:
2,0g unzerkleinerte getrocknete Blüten werden in einem Liter-Rundkolben mit 250 ml entsalztem Wasser versetzt und einer zweistündigen Rücklaufdestillation in einer Clevenger-Apparatur (Wasserdampf-Destillations-Rücklauf-Apparatur zur quantitativen Bestimmung kleiner Mengen ätherischer Öle) unterzogen. Als Vorlage dient 1 ml Pentan pro analysi. Die Rücklaufgeschwindigkeit beträgt 40 ± 4 Tropfen/Minute. Nach Beendigung der Destillation wird das in Pentan gelöste ätherische Öl möglichst wasserfrei in Reagenzgläser abgelassen und eventuell restliches in der Appartur anhaftendes ätherisches Öl mit Pentan nachgespült. Zur Entfernung eventueller Wasserreste wird der Lösung eine Spatelspitze getrocknetes Na2SO4 zugesetzt und die Lösung anschließend durch eine Glasfilternutsche der Porosität D3 oder D4 in Rollrandfläschchen abgenutscht. Nach Abdunsten des Pentans bei 40°C im Wasserbad und Nachtrocknen im Exsikkator wird die Ölmenge gravimetrisch bestimmt.
In dem so erhaltenen Öl (ca. 20mg) werden anschließend das Chamazulen und das Bisabolol bestimmt. Spektralphotometrische Bestimmung des Chamazulens Meßlösung: Das gesamte, aus 2 g des getrockneten Materials erhaltene ätherische Öl
(ca. 20 mg) (erhalten wie vorstehend beschrieben) wird in 25 ml n-Hexan
oder Cyclohexan gelöst/
Meßgerät: Filterphotometer (zum Beispiel Eppendorf).
Wellenlänge: 578 nm
Küvette: 1 cm
Spezifische Extinktion von
Chamazulen (1 g/100 ml; 1 cm): 20,8
Kompensationsflüssigkeit: η-Hexan oder Cyclohexan
GefundenerGehaltan Chamazulen
in mg/100 g: 120E678
Steht zur Messung kein Fiiterphotometer zur Verfugung, so kann die Bestimmung auch mit einem Spektralphotometer durchgeführt werden:
Meßgerät: Spektralphotometer (zum Beispiel MPQII/ oder PM Q III „ZEISS")
Wellenlänge: 605 nm
Küvette: 1 cm
Spezifische Extinktion von
Chamazulen (1 g/100 ml; 1 cm): 24,5
Kompensationsflüssigkeit: η-Hexan oder Cyclohexan
Gefundener Gehalt an Chamazulen
in mg/100 g: 102E605
In der Meßlösung wird anschließend das Bisabolol bestimmt. Gaschromatographische Bestimmung des Bisabolols und der übrigen Bisaboloide
Gaschromatograph: Hewlett Packard Modell 5750, Erba Fractovap 2350 oder ähnliches Gerät
Detektor: Flammen-Ionisations-Detektor *
Trägergas: - Helium
Säule: VsZoII; 200cm; Stahl
Säulenfüilung: 3 % Nitrilsilicongummi „XE 60" auf Kieselgur silanisiert
„Chromosorb WAW HP" 125 bis 150 pm als Trägermaterial Temperatur:
Detektor: 3200C
Einspritzblock: . 2200C
Säule: 85-2200C
Temperaturprogrammierung: 4°/Minute
Probenlösung: EswirddieMeßlösungfürdasChamazulen verwandt
Vergleichslösung: Circa 15 mg Standard-Bisabolol werden in Cyclohexan zu 25 ml gelöst
Einspritzmenge: Von Probenlösung und Vergleichslösung je 5 μΙ
Auswertung: Die Auswertung erfolgt durch Peakflächenvergleich
Gehaltan Bisabolol in mg pro 100g getrocknete Blüten: 10 χ Einwaage (Vergleich) [mg] χ
Fläche (Probe)
Fläche (Vergleich) · j
Die Bestimmung der übrigen Bisaboloide kann ebenfalls durch Gaschromatographie, beispielsweise unter folgenden Aufnahmebedingungen erfolgen:
Geräte: Packard, Modell 7721, Serie 800 beziehungsweise Erba Fractovap Serie 2350
Säulen: Glassäulen, 3 m/2 mm im Durchmesser; 2 m/2 mm im Durchmesser
Füllung: 3%Methylphenylsilicongummi „OV1" auf Kieselgur silanisiert
„Gaschrom Q" 125 bis 150 pm als Trägermaterial Trägergas: 30 ml/Minute N2
Temperatur-Programm: 80bis180°C, 2,5(3)°C/Minute
Injektor/Detektor-Temperatur: 2000C
Detektor: Flammen-Ionisations-Detektor
Einspritzmenge: ca 2 μΙ des ca. 1:50 verdünnten ätherischen Öls
Die Auswertung erfolgt teils ohne, teil mit innerem Standard. Als innerer Standard eignen sich Laurinsäuremethylester oder Hexadecan für chamazulenarme beziehungsweise chamazulenfreie Öle. Bei Ölen mit einem Chamazulengehalt über 5% ist dieser als innerer Standard vorzuziehen, wobei die Gehaltsbestimmung photometrisch (bei 578nm) erfolgt.
Claims (6)
- Erfindungsanspruch:1. Verfahren zur Gewinnung von Mitteln mit antiphlogistischer Wirkung aus Matricaria Chamomilla, gekennzeichnet dadurch, daß man aus einertetraploiden Kamille, bei der (-)-a-Bisabolol die Hauptkomponente des ätherischen Öls darstellt, diejenigen Pflanzen ausselektiert, deren bei 40CC getrocknete Blüten mindestens 100 mg %Chamazulen, mindestens 200 mg % (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg % an übrigen Bisaboloiden enthalten, und von den so erhaltenen Pflanzen, gegebenenfalls nach weiteren Selektions- und Vermehrungsschritten, die Blüten in dem Vegetationsstadium, wo 30-100% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens offen sind, erntet und bei einer Temperatur von höchstens 7O0C trocknet, um ein trockenes Material zu erhalten, das mindestens 30 mg % Chamazulen, mindestens 100 mg % (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg % an übrigen Bisaboloiden enthält, und gegebenenfalls aus dem so erhaltenen trockenen Material durch Destillation in Gegenwart von Wasser ein ätherisches Öl herstellt, das mindestens 3,5% Chamazulen, mindestens 10% (-)-a-Bisabolol und weniger als 10% an übrigen Bisaboloiden enthält, oder durch Extraktion mit niederen Alkoholen einen alkoholischen Kamillenauszug herstellt, der mindestens 1,5 mg % Chamazulen, mindestens 5,0 mg % (-)-a-Bisabolol und weniger als 10 mg % an übrigen Bisaboloiden enthält.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die tetraploide Kamille aus einer diploiden Kamille, bei der (-)-a-Bisabolol die Hauptkomponente des ätherischen Öls darstellt, durch Tetraploidisierung mittels Chemikalien bei Temperaturen zwischen 0 und 350C, mittels Gammastrahlen, Röntgenstrahlen oder UV-Strahlen bei Temperaturen zwischen 0 und 350C, mittels hoher Temperaturen von 33 bis 500C oder mittels niedriger Temperaturen von 0 bis 5°C gewonnen wird.
- 3. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß die Blüten in dem Vegetationsstadium geerntet werden, wo 30 bis 70% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur von nicht höher als 50°C getrocknet werden und das so erhaltene getrocknete Material mindestens 100mg % Chamazulen, mindestens 200mg % (-)-a-Bisabolol und weniger als 50mg % an übrigen Bisaboloiden enthält, und ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5% Chamazulen, mindestens 10% (-)-a-Bisabolol und wenigerals 10%an übrigen Bisaboloiden und ein hieraus hergestellter alkoholischer Auszug mindestens 5,0mg % Chamazulen, mindestens 10,0mg % (-)-a-Bisabolol und weniger als 10,0mg % an übrigen Bisaboloiden enthält.
- 4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß die Blüten in dem Vegetationsstadium geerntet werden, wo 30 bis 70% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur zwischen 50 bis 700C getrocknet werden und das so erhaltene getrocknete Material mindestens 50 mg % Chamazulen, mindestens 150 mg % (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg % an übrigen Bisaboloiden enthält, und ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5% Chamazulen, mindestens 10% (-)-a-Bisabolol und wenigerals 10% an übrigen Bisaboloiden und ein hieraus hergestellter alkoholischer Auszug mindestens 2,5 mg % Chamazulen, mindestens 7,5mg % (-)-a-Bisabolol und weniger als 10,0mg %an übrigen Bisaboloiden enthält.
- 5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß die Blüten in dem Vegetationsstadium geerntet werden, wo 70 bis 100% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur von nicht höher als 500C getrocknet werden und das so erhaltene getrocknete Material mindestens 40 mg % Chamazulen, mindestens 120 mg % (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg % an übrigen Bisaboloiden enthält, und ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5% Chamazulen, mindestens 10% (-)-a-Bisabolol und wenigerals 10% an übrigen Bisaboloiden und ein hieraus hergestellter alkoholischer Auszug mindestens 2,0 mg % Chamazulen, mindestens 6,0 mg % (-)-a-Bisabolol und wenigerals 10,0 mg % an übrigen Bisaboloiden enthält.
- 6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß die Blüten in dem Vegetationsstadium geerntet werden, wo 70 bis 100% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und die Blüten bei einer Lufttemperatur zwischen 50-700C getrocknet werden und das so erhaltene getrocknete Material mindestens 30 mg % Chamazulen, mindestens 100 mg % (-)-a-Bisabolol und wenigerals 50 mg %an übrigen Bisaboloiden enthält, und ein gegebenenfalls hieraus hergestelltes ätherisches Öl mindestens 3,5% Chamazulen, mindestens 10% (-)-a-Bisabolol und wenigerals 10% an übrigen Bisaboloiden und ein hieraus hergestellter alkoholischer Auszug mindestens 1,5 mg % Chamazulen, mindestens 10mg % (-)-a-Bisabolol.
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