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Arzneimittel und kosmetische Mittel aus Zubereitungen der Blütenköpfchen der Echten Kamille [Chamomilla recutita (L. ) Rauschert, synonym mit Matricaria chamomilla L.] finden wegen ihrer antiphlogistischen und spasmolytischen Wirkung eine breite Verwendung. Besondere Bedeutung kommt dabei den Wirkstoffen (-)-a-Bisabolol und Chamazulen zu. Ein aus Kamille hergestelltes Mittel sollte deshalb einen möglichst hohen Gehalt an diesen beiden Substanzen aufweisen.
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Mittels mit vorteilhaften Eigenschaften unter Verwendung einer neuen tetraploiden Kamillensorte gefunden.
Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung eines neuen Mittels mit antiphlogistischer Wirkung,
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Die Erfindung betrifft die durch die Patentansprüche definierten Gegenstände bzw. Sachver- halte.
Zur Herstellung des erfindungsgemässen Mittels wird eine Kamille mit der Bezeichnung
Degumill verwendet (es handelt sich hiebei um die im Patentanspruch der DE-PS Nr. 2402802 erwähnte Kamillensorte ; DDR-Sortenschutzrecht Degumill ; IT-PS Nr. 1035096). Diese Kamillensorte
Degumill weist einen gleichzeitig hohen Gehalt an (-)-a-Bisabolol und Chamazulen auf. Der
Chamazulen- und Bisabololgehalt dieser Kamillensorte Degumill ist jedoch nur dann beständig, wenn jegliche Einkreuzung bzw. Fremdbestäubung mit andern Kamillensorten, deren Bisabolol- und Chamazulengehalt erheblich niedriger ist, bzw. mit der überall vorhandenen wirkstoffarmen
Wildkamille, verhindert wird. Diese Einkreuzungsgefahr durch Fremdbestäubung ist fast immer vorhanden, da die Wildkamille praktisch überall vorkommt.
Die Kamillensorte Degumill ist diploid. Durch Tetraploidisierung gemäss den in dem Hauptan- spruch angegebenen Methoden wird aber überraschenderweise erreicht, dass die so erhaltene tetraploide Kamille nicht mehr anfällig gegen die Fremdbestäubung ist, d. h., dass der Chamazulenge- halt und der (-)-a-Bisabololgehalt beständig wird. Durch weitere Selektions- und Vermehrungs- schritte gelingt es dann insbesondere, den Gehalt an (-)-a-Bisabolol und auch an Chamazulen weiter zu erhöhen, während der Gehalt an den übrigen Bisaboloiden abnimmt und unter 50 mg% liegt.
Die so aus der Kamillensorte Degumill erhaltene neue Kamille bezeichnet sich überraschender- weise auch gegenüber den andern bekannten tetraploiden Kamillensorten durch eine Reihe von neuen und vorteilhaften Eigenschaften aus, nämlich durch einen unvergleichlich höheren Gehalt an dem wichtigen Wirkstoff (-)-a-Bisabolol sowie einen sehr geringen Gehalt an den übrigen
Bisaboloiden, sowie durch verbesserte Keimfähigkeit der Samen ; geringeren Anfall von nicht brauchbarer Krautmasse (d. h. höherer Blütenertrag) ; niedrigeren Wassergehalt der Blüten (d. h. bessere Ausbeute an getrockneten Blüten und kürzere Trocknungszeiten) ;
bessere Eignung für die maschinelle Ernte, weil die Blüten weitgehend in einer Ebene lokalisiert sind und die meisten Blüten gleichzeitig blühen (dadurch wird auch ein einheitlicher Erntetermin möglich) ; bessere Haltbarkeit der Droge (geringere Neigung zu Zerfall und Grusbildung) und besonders aromatischen und typischen Kamillegeruch.
Die Tetraploidisierung kann beispielsweise in an sich bekannter Weise durch Behandlung von Pflanzenteilen (Samen, Wurzeln, Sprossspitzen, Keimen, Achselknospen) oder Gewebe der Kamillenpflanze Degumill mit Chemikalien, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder UV-Strahlen erfolgen.
Sie kann weiterhin durch Anwendung von hohen oder auch niedrigen Temperaturen auf die Kamillenpflanze Degumill bzw. Pflanzenteile oder Gewebe der Kamillenpflanze Degumill erfolgen. Es wird hiezu beispielsweise auf das Buch von Werner Gottschalk"Die Bedeutung der Polyploidie für die Evolution der Pflanzen", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1976, insbesondere Seiten 13 bis 22 verwiesen.
Die Tetraploidisierung durch Chemikalien.
Als Chemikalien für die Tetraploidisierung kommen z. B. in Frage : Colchicin, Acenaphthen, Alkaloide wie Atropin, Veratrin, Nicotin, Sanguinarin, Derivate des Benzols, Diphenyls und Phenanthrens, Naphthalin und Naphthalinderivate, Diphenylamin, Tribromanilin, Paradichlorbenzol, Methylnaphthochinon, Methylnaphthohydrochinon, Salicylsäure und verwandte Substanzen, Hexachlor-
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Quecksilberverbindungen wie Äthyl-Quecksilber-Phosphat, Äthyl-Quecksilber-Chlorid, Phenyl- - Quecksilber-Hydroxyd, Phenyl-Quecksilber-Dinaphthylmethandisulfonat, Chloroform, Lachgas (N. O) sowie Gemische dieser Stoffe. Weiterhin kommen auch Ölkuchen, Kompost und Kuhdung in Betracht.
Die Behandlung mit den hier erwähnten Stoffen erfolgt beispielsweise bei Temperaturen zwischen 0 und 35 C, vorzugsweise zwischen 12 und 30 C, insbesondere 15 und 25 C.
Die Applizierung erfolgt beispielsweise durch Behandeln von Samen, Sprossspitzen, Wurzeln (insbesondere Wurzelspitzen oder Wurzeln von Keimlingen), Fruchtknoten, von Schnittflächen an Blättern oder Stengeln, von Zellsuspensionen aus Meristem-Gewebe, von Kalluskulturen oder auch durch Injektion in die basale Stengelregion oder in den Bereich der Achselknospen. Die Chemikalien werden im allgemeinen in Form von Lösungen in Wasser, schwach alkoholischen (Alkoholgehalt in der Regel unter 5%) oder schwach sauren Lösungen angewendet. Der PH-Wert der schwach sauren Lösungen liegt beispielsweise bei 5, 5 bis 6, 5, wobei das Ansäuern beispielsweise mittels niederen organischen aliphatischen Säuren wie Essigsäure erfolgt. Falls man alkoholische Lösungen verwendet, können diese ebenfalls schwach sauer sein.
Die Konzentrationen der Chemikalien in diesen Lösungen kann beispielsweise 0, 01 bis 0, 5%, vorzugsweise 0, 02 bis 0, 2%, insbesondere 0, 05 bis 0, 1% betragen. Gasförmige Stoffe kommen als solche, gegebenenfalls unter Druck (z. B. 1 bis 10 bar) zur Anwendung. Die Behandlungsdauer beträgt beispielsweise 1 bis 36, vorzugsweise 2 bis 12, insbesondere 4 bis 6 h.
Die wirksamsten Konzentrationen sowie die Einwirkungsdauer sollte zweckmässig jeweils in Vorversuchen getestet werden.
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erfolgen, dass Samen der Kamillensorte Degumill in einer 0, 01 bis 0,2%gen, insbesondere 0, 02 bis 0,1%gen, vorzugsweise 0, 05%igen Colchicinlösung zum Quellen gebracht werden oder dass ausgekeimte, 5 bis 7 Tage alte gut entwickelte Keimlinge der Kamillensorte Degumill (mit den
Keimblättern nach unten) in eine 0, 01 bis 0, 2%ige, insbesondere 0, 02 bis 0, l% ige, vorzugsweise 0, 05% ige Colchicinlösung getaucht werden. Bei letzterem Verfahren soll die umgebende Atmosphäre nahezu 100% relative Luftfeuchtigkeit aufweisen. Die Dauer der Colchicin-Behandlung beträgt beispielsweise 3 bis 36 h, insbesondere 4 bis 10 h.
Bei der Verwendung von Keimlingen ist im allgemeinen eine Einwirkungsdauer bis zu 10 h ausreichend. Bei der Verwendung von Samen kann sich die Einwirkungsdauer gegebenenfalls bis zu 36 h erstrecken.
Nach der Behandlung mit den Chemikalien werden die gequellten Samen, Keimlinge, bzw. sonstige Pflanzenteile, mit Wasser mehrmals gespült. Die gequellten Samen werden beispielsweise ausgesät. Die Pflanzen mit behandelten Wurzeln oder sonstige Pflanzenteile oder die behandelten
Keimlinge werden beispielsweise in Pflanzkisten pikiert. Aus den so behandelten Samen bzw.
Keimlingen werden die Pflanzen aufgezogen (z. B. im Gewächshaus : Temperatur zwischen 18 bis 25 C am Tag und 10 bis 160C nachts) und die Pflanzen ausgewählt, deren Pollen etwa 1 1/2mal grösser sind als die Pollen des Ausgangsmaterials bzw. eine Chromosomenzahl der somatischen Zellen von 36 aufweisen. Falls man sonstige Pflanzenteile (ober- oder unterirdische Teile) der Chemikalienbehandlung unterwirft, werden ausschliesslich die aus den behandelten Teilen hervorgegangenen Triebe, Wurzeln oder Blüten/Samen einer späteren Untersuchung auf erfolgter Tetraploidisierung unterzogen. Wenn beispielsweise eine Sprossbehandlung oder eine Achselbehandlung vorgenommen wurde, wie anschliessend nur der aus dieser Achsel bzw. aus diesem Spross entstehende neue Trieb und die auf ihm gebildeten Blüten bzw.
Samen auf Chromosomenzahl untersucht.
Die Pollengrössenmessungen und die Chromosomenzählung können beispielsweise so durchgeführt werden wie in Beispiel 1 angegeben ist.
Die Behandlung mit Chemilien kann auch nach folgender Methode durchgeführt werden :
Von blühenden Pflanzen werden geschlossene Röhrenblüten geerntet, deren Antheren (Staubbeutel) sich im Stadium vor der ersten Pollenmitose befinden. Die Antheren werden mittels Mikromanipulator aus den Blütenknospen entnommen und in Petrischalen übertragen, die beispiels-
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weise mit dem Nährmedium nach Nitsch und Nitsch (Tabelle 1) gefüllt sind. Anschliessend werden die Petrischalen in einem Kulturraum im 16-h-Tag bei 28 C Tag- und 200C Nachttemperatur aufbewahrt. Nach zirka 4 Wochen beginnen die Antheren aufzubrechen und Pflänzchen herauszuwachsen.
Diese sind bei diploidem Elternteil haploid, bei tetraploidem Elternteil dihaploid ; sie werden nach Ausbildung von Wurzeln beispielsweise in Gartenerde getopft und im Gewächshaus zum Blühen gebracht. Diese (di) haploiden Pflanzen sind steril, können jedoch durch Sprossspitzen-, Wurzel- oder Stengelbehandlung mit Chemikalien, wie z. B. Colchicin polyploidisiert werden, wobei homozygote Pflanzen entstehen, die sich dann über Samen weitervermehren lassen. Das weitere Vorgehen erfolgt wie bei der Behandlung mit Chemikalien (z. B. Colchicinbehandlung) beschrieben ist.
Die Tetraploidisierung durch Strahlen.
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Als UV-Strahlen kommen beispielsweise solche mit einer Wellenlänge von 400 bis 30 nm, vorzugsweise von 350 nm in Frage.
Die so bestrahlen Pflanzen bzw. Pflanzenteile werden dann ebenso weiterbehandelt wie nach der Behandlung mit Chemikalien.
Anwendung hoher und niedriger Temperaturen.
Als hohe Temperaturen kommen beispielsweise Temperaturen zwischen 33 und 50 C, vorzugsweise 42 bis 450C in Frage. Diesen Temperaturen werden beispielsweise ausgesetzt : gequollene Samen, Keimlinge, Triebspitzen und meristematisches Gewebe. Dauer der Behandlung : z. B. 1 bis 48, vorzugsweise 12 bis 24 h.
Als niedrige Temperaturen kommen beispielsweise in Frage : 0 bis 5 C, vorzugsweise 0,5 bis 4 C, insbesondere 2 C. Diesen Temperaturen werden beispielsweise ausgesetzt : gequollene Samen, Keimlinge, Triebe und meristematisches Gewebe. Dauer der Behandlung : z. B. 1 bis 100, vorzugsweise 20 bis 40 Tage.
Die so behandelten Pflanzen bzw. Pflanzenteile werden ebenso weiterbehandelt wie nach der Behandlung mit Chemikalien.
Tabelle 1
Kulturmedium nach Nitsch und Nitsch (Science, 1969)
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<tb>
<tb> mg/l
<tb> KNOW <SEP> 950
<tb> NH4N03 <SEP> 720
<tb> MgS04. <SEP> 7H20 <SEP> 185 <SEP>
<tb> CaC12 <SEP> 166
<tb> KH2P04 <SEP> 68 <SEP>
<tb> MnS04. <SEP> 4H20 <SEP> 25
<tb> H3B03 <SEP> 10
<tb> ZnS04. <SEP> 7H20 <SEP> 10 <SEP>
<tb> Na2Mo04. <SEP> 2H20 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> CuS04. <SEP> 5H20 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> 5 <SEP> ml <SEP> einer <SEP> Lösung <SEP> aus <SEP> 7, <SEP> 45 <SEP> g
<tb> Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz
<tb> und <SEP> 5, <SEP> 57 <SEP> g <SEP> FeS04.
<SEP> 7H20 <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> myo-Inosit <SEP> 100
<tb>
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Tabelle 1 (Fortsetzung)
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<tb>
<tb> mg/l
<tb> Glycin <SEP> 2
<tb> Nicotinsäure <SEP> 5
<tb> Pyridoxin-HCl <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Thiamin-HCl <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Folsäure <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Biotin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Fertignährboden <SEP> (DIFCO-Bacto-Agar) <SEP> 8 <SEP> g
<tb> Indolessigsäure <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
PH des Mediums eingestellt auf 5, 5
Von den durch Pollengrössenmessung und/oder Chromosomenzählung ausselektierten tetra- ploiden Kamillenpflanzen, die nach dem vorstehend beschriebenen Möglichkeiten erhalten werden können, werden dann nochmals die Pflanzen ausselektiert, die folgende Bedingungen erfüllen :
a) ungefähr gleichzeitiges Blühen, b) eine gleichmässige, grundständige Verzweigung und eine schmale Blühzone von zirka
5 cm, c) grosse Blütenköpfchen mit einem Aussendurchmesser von zirka 30 mm (25 bis 35 mm), d) Mindestgehalt an Chamazulen von 150 mg% und Bisabolol von 300 mg% und einem Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxyde) unter 50 mg% (bezogen auf die getrockneten Blüten, s. Beispiel).
Die so ausgesuchten Pflanzen werden nun vegetativ durch Stecklinge vermehrt (verklont) und über 3 bis 5 Generationen ausgelesen, wobei die Auswahl stets nach den oben angegebenen
Kriterien a) bis d) erfolgt. Das heisst, die gemäss den Kriterien a) bis d) ausgesuchten Pflanzen werden verklont, aus den verklonten Pflanzen wird Saatgut gewonnen, die hieraus erhaltenen
Pflanzen nach den Kriterien a) bis d) ausselektiert und aus letzteren wieder Saatgut gewonnen.
Die Sequenz Aussaat - Selektion gemäss a) bis d) - Saatgutgewinnung kann 2- bis 4mal wiederholt werden.
Daran schliesst sich nochmals eine Sequenz Aussaat - Selektion gemäss a) bis d) - Verklo- nung - Saatgutgewinnung an.
Das zuletzt erhaltene Saatgut ist dann das Vermehrungsgut der verfahrensgemässen Kamillensorte Manzana.
Die Stecklingsvermehrung erfolgt dabei auf folgende Weise :
Zur Stecklingsvermehrung müssen die Ausgangspflanzen (Klonmutterpflanzen) unter Kurztagbedingungen blütenknospenfreie Kurztriebe ausbilden. Dies erfolgt im Winterhalbjahr im Gewächshaus ohne Zusatzbeleuchtung oder in Klimakammern bei einer Tageslänge von 6 bis 10, vorzugsweise 8 h und Temperaturen von 10 bis 15 C, vorzugsweise 12 C. Zur Verklonung bzw. Vermehrung eignen sich Blatt-, Trieb- und insbesondere Kurztrieb- (Seitentrieb-) Stecklinge. Ihre Bewurzelung erfolgt bei 12 bis 18OC, vorzugsweise 15 C und Tageslängen von 12 bis 16, vorzugsweise 14 h in gespannter Atmosphäre (zirka 100% relative Luftfeuchte).
Als Substrat kann beispielsweise ein Torf-Sand-Gemisch im Verhältnis 1 : 1 verwendet werden ; es eignen sich aber auch reiner Quarzsand, Steinwolle-Stecklingswürfel, Torf-Stecklingswürfel u. ähnl.
Für die Aussaat kommen hiebei beispielsweise folgende Böden in Betracht : Gartenerde ; humose, mittelschwere Lehmböden, lehmige oder humose Sandböden. Es kann im Gewächshaus oder auch im Freiland ausgesät werden. Die Temperaturen für Keimung und Wachstum der Pflanzen
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liegen beispielsweise zwischen 12 bis 24 C, insbesondere 18 bis 20 C. Falls im Freiland ausgesät wird, wird vorzugsweise im Herbst (September/Oktober) oder im Frühjahr (März/April) gesät.
Diese Termine gelten für sämtliche in Frage kommenden Anbaugebiete (z. B. nördliche Hemisphäre, gemässigte bis subtropische Klimagebiete).
Die so erhaltene Kamillensorte gehört zur Kulturpflanzenart der echten Kamille mit der botanischen Bezeichnung Matricaria Chamomilla L. synonym Chamomilla recutita (L. ), Rauschert].
Das bei einer Temperatur von höchstens 60 C getrocknete Material aus den Blüten dieser Kamille, die in dem Vegetationsstadium geerntet werden, wo 30 bis 100% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind, enthält mindestens 120 mg% Chamazulen, mindestens 200 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden. Ein besonders wirkungsvolles Mittel erhält man, wenn solche Blüten getrocknet werden, die in dem Blüten-Entwicklungsstadium geerntet werden, wo erst 30 bis 70%, insbesondere 40 bis 60% (d. h. im allgemeinen 50%) aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind und unter Ausschluss des Sonnenlichts bei einer Lufttemperatur von höchstens 50 C beispielsweise bei 35 bis 50 C, insbesondere 40 C getrocknet werden.
Die Trocknung kann hiebei entweder durch künstliche Luftzufuhr oder auch durch Trocknung im Schatten, gegebenenfalls auch in der Sonne erfolgen, wobei jedoch darauf geachtet werden soll, dass die Wärmezufuhr nicht über das zur vollständigen Trocknung erforderliche Mass hinausgeht. Es ist also vorteilhaft, dass man sich durch jeweilige Kontrollwägungen von der erreichten Gewichtskonstanz überzeugt. Die Trocknung kann spontan oder künstlich (z. B. mit künstlicher Warmluft) erfolgen. Die Wirkstoffausbeute ist am grössten bei spontaner Trocknung unter Ausschluss
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Die Trocknung soll in dünnen Schichten, beispielsweise von 5 bis 20 cm, vorzugsweise 10 cm Dicke durchgeführt werden.
Beispielsweise enthalten im Trockenschrank bei 40 C getrocknete Blüten (geerntet wo 40 bis 60% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffent sind) mindestens 150 mg%, z. B. zwischen
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wird durch Trocknung einer separaten Probe von Kamillenblüten der verfahrensgemässen Kamille (Sortenbezeichnung Manzana) im Trockenschrank bei 1050C bis zur Gewichtskonstanz (72 bis 96 h) bestimmt. Der Wirkstoffgehalt der bei beispielsweise 35 bis 50 C getrockneten Blüten (Droge) wird dann auf die bei 1050C ermittelte Trockenmasse der Blüten berechnet.
Unter der Bezeichnung "übrige Bisaboloide" in dem Anspruch 1 werden insbesondere ver- standen : (-)-ot-Bisabololoxyd A und B, (-)-a-Bisabolonoxyd A.
Weitere Bestandteile des ätherischen Öls der verfahrensgemässen Kamillensorte sind En-In-Dicycloäther, Farnesen, Spathulenol und in geringen Konzentrationen verschiedene leichtflüchtige Terpenkohlenwasserstoffe.
Aus dem erfindungsgemäss erhaltenen getrockneten Material können z. B. in bekannter Weise durch Extraktion mit Äthanol oder Isopropanol bzw. wässerigen Alkoholmischungen oder durch Extraktion mit überkritischen Gasen Kamillenauszüge bzw. Kamillenextrakte erhalten werden.
Die Bestimmung des Chamazulens erfolgt spektralphotometrisch ähnlich der bei Kamillenextrakten üblichen Weise. Die Bestimmung des (-)-a-Bisabolols sowie der übrigen Inhaltsstoffe des Kamillen- öls erfolgt nach der hiefür üblichen gaschromatographischen Methode.
Eine genaue Schilderung der analytischen Bestimmungsmethoden wird weiter unten angegeben.
Der Wirkstoff Chamazulen liegt in den Kamillenblüten nicht als solcher, sondern in Form des Sesquiterpenlactons Matricin vor. Das Matricin besitzt eine Wirkung, die der des Chamazulens entspricht. Aus dieser Vorstufe Matricin entsteht beispielsweise beim Erhitzen (z. B. Wasserdampfdestillation, Teeaufguss) sofort das Chamazulen. Es ist daher üblich, bei der Kamille nicht den Gehalt an Matricin, sondern den analytisch erfassbaren Gehalt des sich hieraus bildenden Chamazulens anzugeben.
Aus dem trockenen Material gemäss Anspruch 1 können z. B. antiphlogistisch wirksame alkoholische Auszüge oder ätherische Kamillenöle hergestellt werden, die ebenfalls gleichzeitig hohe
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Die Herstellung solcher Auszüge erfolgt in der hiefür üblichen Weise.
Für die Extraktion können beispielsweise Mischeinrichtungen, z. B. sogenannte Muldenmischmaschinen, Perkolatoren und andere geeignete Extraktionsapparaturen verwendet werden. Die Temperatur während der Extraktion beträgt beispielsweise 10 bis 50 C. Eine Kühlung ist nicht erforderlich.
Als Lösungsmittel kommen insbesondere gerade oder verzweigte aliphatische, ein- oder mehrwertige Alkohole mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Solketal (2-Dimethyl-4-oxymethyl-1, 3-dioxolan) in Frage, wie z. B. Methanol, Äthanol, Propanol- (2), Butanol, Glycerol u. ähnl., sowie Gemische dieser Lösungsmittel mit Wasser.
Es können auch Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden. Die Mindestmenge an Lösungsmitteln beträgt 2 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil Droge. Im allgemeinen verwendet man 2 bis 20 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil Droge, insbesondere 3 bis 10 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil Droge.
Ein aus dem trockenen Material erhaltenes ätherisches Öl enthält mindestens 5% Chamazulen und mindestens 15% (-)-a-Bisabolol und weniger als 10% an übrigen Bisaboloiden.
Die Herstellung des ätherischen Öls erfolgt im allgemeinen dadurch, dass man die getrockneten Kamillenblüten mit Wasser, beispielsweise in Gegenwart von Ascorbinsäure (z. B. als Salz, insbesondere als Natriumsalz) bei einem PH-Wert zwischen 4 und 6, vorzugsweise 5 bis 5, 5 zum Sieden erhitzt. Der PH-Wert wird beispielsweise mittels einer Säure, wie Salzsäure, eingestellt.
Auf 1 Gew.-Teil getrocknete Kamillenblüten werden beispielsweise 10 bis 50 Gew.-Teile Wasser und gegebenenfalls 0, 1 bis 1 Gew.-Teil Ascorbinsäure verwendet.
Es wird im allgemeinen 2 bis 8 h erhitzt.
Das erhaltene wässerige Destillat wird mehrmals mit einem niederen aliphatischen, flüssigen
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Lösungsmitteln wird dieses Abdestillieren unter Vakuum durchgeführt.
Bestimmung des Gehalts an Chamazulen und (-)-ct-Bisabolol sowie der übrigen Bisaboloide in den Auszügen bzw. im ätherischen Öl erfolgt nach den angegebenen Methoden.
Beispiel 1
Gewinnung des Mittels mit antiphlogistischer Wirkung.
Eine Kamille, die man so erhält wie nachstehend beschrieben ist, wird in üblicher Weise feldmässig ausgesät. Sobald die Pflanzen sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in dem Vegetationsstadium sind, wo etwa 50% der Röhrenblüten geöffnet sind, werden diese Blütenköpfchen mit einer Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände der Pflückmaschine so eingestellt sind, dass nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten zu 50% offen sind, abgestreift werden. Das Erntegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet. Anschliessend werden die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der Gewichtsverlust beträgt etwa 80%.
Die Trocknung erfolgt im Schatten an einer gut belüfteten Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10 cm.
Nach etwa 2 bis 3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschliessend in Ballen gepresst.
Analyse Ätherisches Öl : 950 mg%
Chamazulen : 150 mg% (-)-a-Bisabolol : 300 mg%
Erfolgt die Trocknung beispielsweise in einer stationären Bandtrockenanlage mittels künstlich
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gesiebt und anschliessend in Ballen gepresst.
Die Analysenwerte eines solchen Mittels sind z. B. : Ätherisches Öl : 850 mg%
Chamazulen : 80 mg% (-)-a-Bisabolol : 200 mg%
Die verwendete tetraploide Ausgangskamille wird wie folgt erhalten :
Samen der Kamillensorte Degumill wurden auf ein mit 0, 05%iger wässeriger Colchicinlösung getränktes Filterpapier aufgebracht und bei Raumtemperatur (200C) 6 h quellen lassen. Daraufhin wurden sie vom Filterpapier entfernt, mit Wasser mehrmals gespült und in Saatkisten (Gewächs- haus) ausgesät : Erde : Torf-Sand-Gemisch l : l ; Temperatur : 18 bis 20 C ; relative Luftfeuchtig- keit : zirka 60% ; Tageslänge bei künstlicher Belichtung : 14 h.
Die keimenden Pflanzen wurden bis zur Blüte beobachtet, der Polyploidisierungserfolg wurde durch Vergleichsmessung der Pollen- und Samengrösse sowie durch Chromosomenzählung der Pflanzen (F-Nachkommenschaft = erste, aus Samen gezogene Nachkommenschaft der als tetra- ploid bestätigten colchicinierten Pflanzen) festgestellt.
Die Tetraploidisierung kann auch auf folgende Weise erfolgen :
Auf wassergetränktem Filterpapier ausgekeimte, 5 bis 7 Tage alte, gut entwickelte Kamillenkeimlinge der Sorte Degumill wurden bei Raumtemperatur (20 C) für 4 bis 6 h mit den Keimblättern nach unten in eine 0, 05%ige Colchicinlösung gestellt. Die empfindlichen Keimwurzeln wurden dabei geschont ; um Trockenschäden an ihnen zu vermeiden, muss die umgebende Atmosphäre nahezu 100% relative Luftfeuchte aufweisen. Nach der Behandlung wurden die Keimlinge mit Wasser mehrmals gespült und in Pflanzkistchen pikiert. Die weitere Behandlung erfolgte wie bei den Samen.
Die Pollengrössenmessungen werden mit einem Leitz-Binokular-Forschungsmikroskop mit Mikrometer-Messokular und Mikrometer-Objektträger durchgeführt.
Die Chromosomenzählung findet an Wurzelspitzen statt :
Von den im Gewächshaus gezogenen Jungpflanzen oder Stecklingspflanzen werden 1 bis 2 cm lange frische Wurzelenden gesammelt, 5 h in 0, 002molare Hydroxychinolin-Lösung und anschliessend 15 min in 1N HCl eingelegt. Zur Untersuchung werden zirka 1 mm der Wurzelspitzen mit 2%iger Orcein-Essigsäure angefärbt und in Ölimmersion mikroskopisch untersucht. Bei den in Mitose befindlichen Zellen kann so der 4fache Chromosomensatz der somatischen Zellen bestimmt werden (4n = 36).
Diejenigen Pflanzen, bei welchen der Pollendurchmesser um zirka 50% grösser als derjenige des diploiden Ausgangsmaterials (zirka 30 statt zirka 20 11m) und bei denen der Chromosomensatz der somatischen Zellen auf 36 verdoppelt war (bei dem diploiden Ausgangsmaterial ist die entsprechende Zahl 18) sind tetraploid. Diese wurden ausselektiert. Ungefähr 0, 1 bis 0, 5% der Samen bzw. der Keimlinge wurden bei der oben angegebenen Methode tetraploidisiert und entwickelten blühfähige, intakte Pflanzen.
Es schliessen sich nun folgende Schritte an :
Schritt 1 :
Von den (wie oben beschriebenen) ausselektierten tetraploiden Kamillenpflanzen wurden diejenigen Individuen ausgelesen, die a) etwa gleichzeitig blühen, b) eine gleichmässige, grundständige Verzweigung und eine schmale Blühzone von zirka
5 cm aufweisen, c) grosse Blütenköpfchen mit einem Aussendurchmesser von zirka 30 mm aufweisen, d) einen Mindestgehalt für Chamazulen von 150 mg% und Bisabolol von 300 mg% erreichen oder überschreiten und deren Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabolol- oxyde) deutlich unter 50 mg% liegt. [Sämtliche Werte beziehen sich auf Blütenköpfchen, die bei 40 C getrocknet wurden und deren Ernte in dem Stadium erfolgte, wo erst zirka
50% (40 bis 60%) der Röhrenblüten eines Köpfchens aufgeblüht waren.
]
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Diese Pflanzen wurden verklont. Hiezu wurden die Pflanzen (Klonmutterpflanzen) zunächst auf zirka 15 cm Sprosslänge zurückgeschnitten, unter 8 bis 10 h Tageslänge und 12 bis 14 C zum Neuaustrieb (kurze Seitentriebe) gebracht. Die Kurztriebe wurden geschnitten und in ein Torf-Sand-Gemisch gesteckt. Bei zirka 100% relativer Luftfeuchte, 150C Lufttemperatur und einer Tageslänge von 14 h dauerte die Bewurzelung der Stecklinge 7 bis 14 Tage.
An Stelle der angegebenen konventionellen Verklonung (Stecklingsvermehrung) kann auch die in-vitro-Vermehrung teilungsfähiger Gewebspartien der Pflanze eingesetzt werden (sogenannte Meristem-Vermehrung). Zur Etablierung einer Kamillen-Kultur eignen sich verschiedene Teile der Pflanze, vorzugsweise die Sprossspitzen oder die Achselknospen.
Nach Abspülen der Pflanzen mit H202 werden unter aseptischen Bedingungen im "Laminar Flow" (Hochleistungs-Schwebstoff-Filter mit turbulenzarmer Verdrängungsströmung) Sprossspitzen der Blattachselknospen entnommen und in Reagenzgläser übertragen, die mit einem Nährmedium, beispielsweise nach Murashige und Skoog (Physiol. Plant. 15,473-497, 1962) gefüllt sind. Die Reagenzgläser werden in einen Klimaraum mit 12 bis 18, vorzugsweise 16 h Tageslänge (erreicht durch Fluoreszenz-Leuchtstoffröhren), einer Lichtintensität von 500 bis 10000 lux, vorzugsweise 1000 bis 3000 lux und einer Temperatur von 15 bis 30 C, vorzugsweise 22 bis 27 C gestellt.
Sobald die Explantate ein gutes Wachstum zeigen, werden sie auf ein obengenanntes Nährmedium, jedoch mit einer höheren Cytokininkonzentration (30 mg/l N-Isopentenyladenin) und wenig oder gar keinem Auxin (0 bis 0, 3 mg/l Indolessigsäure) überführt. In der Folge strecken sich die Achsen und es werden Adventivorgane sowie vermehrt Achselknospen gebildet. Diese können nach der vorerwähnten Weise entnommen und angezogen werden.
Die für die Pflanzenvermehrung in grösserer Zahl bestimmten Explantate (der 3. Passage = 3. Vermehrungsgeneration) werden nach Anwachsen und Ausbildung der Blätter auf dem erstgenannten Nährmedium auf einen Nährboden übertragen, welcher 10 mg/l Indolessigsäure oder 3-Indolbuttersäure oder 0, 1 bis 0,3 mg/l α-Naphthylessigsäure enthält. Dabei bewurzeln sich die Pflänzchen und können nach etwa 4 Wochen in mit sterilisierter Gartenerde (12 h bei 120 C gedämpft) gefüllte Töpfe gepflanzt und im Gewächshaus (unter Bedingungen wie für die konventionelle Stecklingsvermehrung üblich) weiterkultiviert werden.
Nährmedium nach Murashige & Skoog :
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<tb>
<tb> mgll
<tb> NHNOg <SEP> 400
<tb> Ca <SEP> (N0. <SEP> 4H20 <SEP> 144
<tb> KN03 <SEP> 80
<tb> KH2P04 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Mgs04 <SEP> <SEP> 7H20 <SEP> 72 <SEP>
<tb> KCI <SEP> 65
<tb> NaFe-EDTA <SEP> 25
<tb> H3B03 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> MnS04. <SEP> 4H20 <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP>
<tb> ZnS0. <SEP> 7H <SEP> O <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP>
<tb> KJ <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP>
<tb> Indolessigsäure <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Furfuryladenin <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Thiamin <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Nicotinsäure <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Pyridoxin <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
Fortsetzung :
EMI9.1
<tb>
<tb> mg/l
<tb> Glycin <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> myo-Inosit <SEP> 100
<tb> Casein-Hydrolys. <SEP> 1000
<tb> Saccarose <SEP> 2%
<tb> gereinigtes <SEP> Agar-Pulver <SEP> 1%
<tb>
EMI9.2
<Desc/Clms Page number 10>
und Weise wiederholt.
Schritt 6 :
Aus dem nach Schritt 5 gewonnenen Saatgut wurden zirka 1500 Individuen gezogen (ökologi- sche Bedingungen wie bei Schritt 2) und nach dem gleichen Prinzip, wie bei Schritt 1 angegeben ist, selektiert. Von den so ausselektierten Pflanzen wurden 34 Individuen ausgewählt und gemäss
Schritt 1 verklont. Je 10 Pflanzen jedes Klons wurden in zufälliger Verteilung im Abstand
40 x 30 cm im Freiland (Standort A, s. Schritt 4) an isolierter Stelle aufgepflanzt. Der Boden war Lösslehm, PH 7, 0 ; die Pflanzung erfolgte Anfang Juni, die erste Ernte der Samen Mitte Juli, danach wurden die Pflanzen zurückgeschnitten, blühten nochmals und lieferten Mitte bis Ende
August eine zweite Saatguternte.
Die Saatgutgewinnung dieses Materials erfolgte gemäss Schritt 2.
Das nach Schritt 6 erhaltene Saatgut ist das Vermehrungsgut.
Beispiel 2
Herstellung eines ätherischen Öls
200 g getrocknete Kamillenblüten gemäss Beispiel 1 werden in einem 5-1-Rundkolben mit 3, 6 I Wasser und 2 g Natrium-Ascorbat versetzt und mit IN HCI auf einen PH-Wert von 5, 0 eingestellt. Nach Zugabe von Siedesteinen wird zum Sieden erhitzt. Innerhalb von zirka 3 h werden zirka 1, 2 I Destillat aufgefangen.
Nach beendeter Destillation wird das Destillat dreimal mit je 100 ml Petroläther ausgeschüttelt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird filtriert und das Lösungsmittel anschliessend im Rotationsverdampfer abdestilliert. Die Ausbeute beträgt 1, 44 g ätherisches Öl.
In dem erhaltenen ätherischen Öl wird anschliessend der Gehalt an Chamazulen und (-)-a-Bisabolol bestimmt.
Gewinnung des ätherischen Öls
Ausgangsmaterial ist eine Droge aus der Kamillensorte Manzana. Zur Herstellung der Droge werden nur solche Blütenköpfchen verwendet, bei denen 30 bis 70%, insbesondere 40 bis 60% der Röhrenblüten geöffnet sind. Die Trocknung erfolgt in einem Trockenschrank bei 40 C während 72 h.
Das ätherische Öl der Kamillenblüten wird wie im folgenden beschrieben durch 2stündige Wasserdampfdestillation der Droge gewonnen :
2, 0 g unzerkleinerte Droge wird in 1-1-Rundkolben mit 250 ml entsalztem Wasser versetzt und einer 2stündigen Rücklaufdestillation in einer Clevenger-Apparatur (Wasserdampf-Destillations- - Rücklauf-Apparatur zur gravimetrischen Bestimmung kleiner Mengen ätherischer Öle) unterzogen.
Als Vorlage dient 1 ml Pentan pro analysi. Die Rücklaufgeschwindigkeit beträgt 40 4 Tropfen/min.
Nach Beendigung der Destillation wird das in Pentan gelöste ätherische Öl möglichst wasserfrei in Reagenzgläser abgelassen und eventuell restliches in der Apparatur anhaftendes ätherisches Öl mit Pentan nachgespült. Zur Entfernung eventueller Wasserreste wird der Lösung eine Spatelspitze getrocknetes Na2 S04 zugesetzt und die Lösung anschliessend durch eine Glasfilternutsche der Porosität D3 oder D4 in Rollrandfläschchen abgenutscht. Nach Abdunsten des Pentans bei 40 C im Wasserbad und Nachtrocknen im Exsikkator wird die Ölmenge gravimetrisch bestimmt.
In dem so erhaltenen Öl (zirka 20 mg) werden anschliessend das Chamazulen und das Bisabolol bestimmt.
Spektralphotometrische Bestimmung des Chamazulens
EMI10.1
<tb>
<tb> Messlösung <SEP> : <SEP> Das <SEP> gesamte, <SEP> aus <SEP> 2 <SEP> g <SEP> Droge <SEP> erhaltene <SEP> ätherische <SEP> Öl
<tb> (zirka <SEP> 20 <SEP> mg) <SEP> (erhalten <SEP> wie <SEP> vorstehend <SEP> beschrieben)
<tb> wird <SEP> in <SEP> 25 <SEP> ml <SEP> n-Hexan <SEP> oder <SEP> Cyclohexan <SEP> gelöst.
<tb>
Messgerät <SEP> : <SEP> Filterphotometer <SEP> (z. <SEP> B. <SEP> Eppendorf).
<tb>
Wellenlänge <SEP> : <SEP> 578 <SEP> nm
<tb> Küvette <SEP> : <SEP> 1 <SEP> cm
<tb> Spezifische <SEP> Extinktion <SEP> von
<tb> Chamazulen <SEP> (1 <SEP> g/100 <SEP> ml <SEP> ; <SEP> 1 <SEP> cm) <SEP> : <SEP> 20, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
<tb> Kompensationsflüssigkeit <SEP> : <SEP> n-Hexan <SEP> oder <SEP> Cyclohexan
<tb> Gefundener <SEP> Gehalt <SEP> an <SEP> Chamazulen
<tb> in <SEP> mg/100 <SEP> g <SEP> : <SEP> 120. <SEP> Egg
<tb>
EMI11.2
EMI11.3
<tb>
<tb> :Messgerät <SEP> : <SEP> Spektralphotometer <SEP> (z. <SEP> B. <SEP>
<tb>
PM <SEP> Q <SEP> II/oder <SEP> PM <SEP> Q <SEP> III"ZEISS").
<tb>
Wellenlänge <SEP> : <SEP> 605 <SEP> nm
<tb> Küvette <SEP> : <SEP> 1 <SEP> cm
<tb> Spezifische <SEP> Extinktion <SEP> von
<tb> Chamazulen <SEP> (1 <SEP> g/100 <SEP> ml <SEP> ; <SEP> 1 <SEP> cm) <SEP> : <SEP> 24, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Kompensationsflüssigkeit <SEP> : <SEP> n-Hexan <SEP> oder <SEP> Cyclohexan
<tb> Gefundener <SEP> Gehalt <SEP> an <SEP> Chamazulen
<tb> in <SEP> mg/100 <SEP> g <SEP> : <SEP> 102. <SEP> E <SEP> 605 <SEP>
<tb>
EMI11.4
EMI11.5
EMI11.6
EMI11.7
<tb>
<tb> :Geräte <SEP> : <SEP> Packard, <SEP> Modell <SEP> 7721, <SEP> Serie <SEP> 800 <SEP> bzw.
<tb>
Erba <SEP> Fractovap <SEP> Serie <SEP> 2350.
<tb>
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EMI12.1
<tb>
<tb>
Säulen <SEP> : <SEP> Glassäulen, <SEP> 3 <SEP> m/2 <SEP> mm <SEP> im <SEP> Durchmesser <SEP> ; <SEP>
<tb> 2 <SEP> m/2 <SEP> mm <SEP> im <SEP> Durchmesser.
<tb>
Füllung <SEP> : <SEP> 3% <SEP> Methylphenylsilicongummi <SEP> "OV <SEP> 1" <SEP> auf <SEP>
<tb> Kieselgur <SEP> silanisiert
<tb> "Gaschrom <SEP> Q" <SEP> 125 <SEP> bis <SEP> 150 <SEP> 11m <SEP> als <SEP> Trägermaterial.
<tb>
Trägergas <SEP> : <SEP> 30 <SEP> ml/min <SEP> N.,
<tb> Temperatur-Programm <SEP> : <SEP> 80 <SEP> bis <SEP> 180 C, <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> (3) <SEP> C/min. <SEP>
<tb>
Injektor/Detektor-Temperatur <SEP> : <SEP> 200 C <SEP>
<tb> Detektor <SEP> : <SEP> Flammen-Ionisations-Detektor <SEP>
<tb> Einspritzmenge <SEP> : <SEP> zirka <SEP> 2 <SEP> 111 <SEP> des <SEP> zirka <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 50 <SEP> verdünnten <SEP> ätherischen
<tb> Öls.
<tb>
Die Auswertung erfolgt teils ohne, teils mit innerem Standard. Als innerer Standard eignen sich Laurinsäuremethylester oder Hexadecan für chamazulenarme bzw. chamazulenfreie Öle. Bei Ölen mit einem Chamazulengehalt über 5% ist dieser als innerer Standard vorzuziehen, wobei die Gehaltsbestimmung photometrisch (bei 578 nm) erfolgt.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von Mitteln mit antiphlogistischer Wirkung aus Matricaria Chamomilla, dadurch gekennzeichnet, dass die diploide Kamillensorte Degumill tetraploidisiert wird, dass tetraploidisierte Pflanzen ausgewählt und weitervermehrt werden, und dass die Blüten im Vegetationsstadium, wo 30 bis 100% der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens offen sind, geerntet und bei einer Temperatur von höchstens 60 C getrocknet werden, um ein trockenes Material zu erhalten, das mindestens 120 mg% Chamazulen, mindestens 200 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden enthält, und gegebenenfalls aus dem so erhaltenen Material durch Extraktion mit Alkoholen alkoholische Kamillenauszüge hergestellt werden,
die mindestens 5 mg% Chamazulen und mindestens 15 mg% (-)-a-Bisabolol und weniger als 8 mg% an übrigen Bisaboloiden enthalten, oder durch Destillation in Gegenwart von Wasser ein ätherisches Öl hergestellt wird, das mindestens 5% Chamazulen und mindestens 15% (-)-a-Bisabolol und weniger als 10% an übrigen Bisaboloiden enthält.