CH643591A5

CH643591A5 - Antibiotikum bl580 zeta und verfahren zu seiner herstellung.

Info

Publication number: CH643591A5
Application number: CH658978A
Authority: CH
Inventors: Martin Roy Hertz; John Henry Edward James Martin
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1977-06-20
Filing date: 1978-06-16
Publication date: 1984-06-15
Also published as: CA1113874A; IL54681A; ZA782808B; AU3607678A; IE47098B1; AT357670B; DE2824860A1; GR69878B; SE7807007L; FR2395276B1; IT7849923A0; ES470959A1; AU520412B2; ATA439578A; GB1561370A; BE868236A; NZ187277A; NL7806494A; AR218065A1; PT68148A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibiotikum, das als BL580 ZETA bezeichnet wird, und auf ein Verfahren zu seiner fermentativen Erzeugung und zu seiner Gewinnung. Im Rahmen der Erfindung liegt auch das Antibiotikum BL580 ZETA in verdünnter Form, als Rohkonzentrat und in reiner kristalliner Form. Aufgrund seiner Wirksamkeit als an-ticoccidielles Mittel und seiner chemischen und physikalischen Eigenschaften unterscheidet sich dieses neue Antibiotikum von früher beschriebenen Antibiotika.

Das erfindungsgemässe neue Antibiotikum ist eine organische Säure und deshalb zur Bildung von Salzen mit Alkaliionen befähigt. Durch Vermischen des Antibiotikums als freie Säure mit stöchiometrischen Mengen an Alkaliionen, zweckmässigerweise in einem neutralen Lösungsmittel, werden Salze mit beispielsweise Natrium-, Kalium- und Ammoni-umionen und ähnlichen Kationen gebildet. Die Alkalisalze von BL580 ZETA sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, die in Wasser verhältnismässig unlöslich, aber in den meisten üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethyl-acetat, Aceton, Chloroform, Heptan, Ether und Benzol, löslich sind.

Das neue, als BL580 ZETA bezeichnete Antibiotikum wird bei der Züchtung eines neuen Mutantenstamms von Streptomyces hygroscopicus gebildet, der durch Behandlung eines aus natürlicher Selektion hervorgegangenen Einzelkolo-nieisolats von S. hygroscopicus NRRL 5647 mit N-Methyl-N'-nitro-N"-nitrosoguanidin erhalten wird. Eine lebensfähige Kultur des neuen Mutantenstamms ist am 25. März 1977 bei dem Culture Collection Laboratory, Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 (USA) hinterlegt und unter der Zugänglichkeitsnummer NRRL 511108 in die zeitlich unbegrenzte Sammlung dieses Instituts aufgenommen worden.

Die Art des Wachstums und die physiologischen und morphologischen Merkmale von NRRL 11108 sind weitgehend die gleichen wie die von NRRL 5647 (bestimmt von Dr. io H.D. Tresner, Lederle Laboratories Division, American Cy-anamid Company, Pearl River, New York) mit der Ausnahme, dass NRRL 11108 auf den meisten Medien nur wenig oder keine Sporen bildet. Eine allgemeine Beschreibung von NRRL 5647 findet sich in US-PS 3 812 249.

« Es sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass zum Zwecke der Erzeugung von BL580 ETA die Erfindung nicht auf diesen bestimmten Mikroorganismus oder auf andere Mikroorganismen beschränkt ist, die den Wachstumseigenschaften und mikroskopischen Kennzeichen von NRRL 11108 voll 2o entsprechen. Vielmehr ist beabsichtigt, die Verwendung von Mutanten einzuschliessen, die aus NRRL 11108 durch die verschiedenen üblichen Mittel, wie Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung oder Behandlung mit Stickstofflost, Senföl, Phagen und dergleichen erzeugt worden sind. 25 Das Antibiotikum BL580 ZETA ist ein wirksames Mittel gegen Coccidien, was durch die folgenden in-vivo-Tests nachgewiesen worden ist, bei welchen die im folgenden beschriebene Geflügelnahrung verwendet wird.

Vitamin-Aminosäure-Vormischung

0,5%

Spurenmineralien

0,1%

Natriumchlorid

0,3%

Dicalciumphosphat

1,2%

Kalkmehl

0,5%

stabilisiertes Fett

4,0%

dehydratisierte Alfalfa (17% Protein)

2,0%

Mais-Gluten-Mehl (41% Protein)

5,0%

Menhaden-Fischmehl (60% Protein)

5,0%

Sojabohnenöl, getrocknet (44% Protein)

30,0%

feingemahlener gelber Mais, ad

100 %

Die Vitamin-Aminosäure-Vormischung der obigen Geflügelnahrung wird aus folgender Zubereitung hergestellt. Die Mengenangaben beziehen sich auf Einheiten je Kilo-5 gramm der Geflügelnahrung:

butyliertes Hydroxytoluol 125 mg dl-Methionin 500 mg

Vitamin A 3300 I.U.

:° Vitamin D3 1100 I.C.U.

Riboflavin 4,4 mg

Vitamin E 2,2 I.U.

Niacin 27,5 mg

Pantothensäure 8,8 mg

'5 Cholinchlorid 500 mg

Folsäure 1,43 mg

Menadion-Natriumbisulfat 1,1 mg

Vitamin B12 11 mcg s feingemahlener gelber Mais ad 5 g

Ein Mischinokulum aus 5000 sporulierten Oocysten von Eimeria acervulina und Oocysten von Eimeria tenella, das zur Erzielung einer Mortalität von 85 bis 100% im Vergleich zu 6s unbehandelten Kontrollen ausreicht, wird durch direkte Inokulation an Gruppen von 7 Tage alten Küken verabreicht. Die Küken haben während der gesamten Testdauer freien Zugang zu der Geflügelnahrung und zu Wasser. 2 Tage nach der Inokulierung wird den verschiedenen Gruppen von Küken

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medizinhaltiges Futter aus der Geflügelnahrung und BL580 ZETA in unterschiedlichen Mengen gegeben. 10 Tage nach dem Inokulieren werden die Tests beendet. Die Küken werden gewogen und getötet, und ihre Intestinaltrakte werden auf Schäden untersucht. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle I wiedergegeben. Diese Ergebnisse lassen erkennen,

dass 80% der infizierten Küken überleben, wenn sie 60 ppm BL580 ZETA in ihrem Futter erhalten. Diese Ergebnisse zeigen ferner eine signifikante Unterdrückung von Schäden durch Eimeria tenella und Eimeria acervulina, wenn 30 oder ; 60 ppm BL580 ZETA den infizierten Küken in ihrer Nahrung verabreicht werden.

Tabelle I

Konzentration von BL580 ZETA in der Nahrung, ppm

0 60 30

Anzahl der Tiere zu Beginn

40 10 10

Überlebende, Prozent

15 80 50

Prozentsatz der Tiere mit verminderten Schäden

Eimeria tenella Eimeria acervulina

0 80 10

0 90 50

Die Züchtung des Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus NRRL 11108 kann in einer grossen Zahl verschiedener flüssiger Kulturmedien durchgeführt werden. Zu Medien, die sich für die Erzeugung des Antibiotikums BL580 ZETA eignen, gehören solche mit folgenden Bestandteilen: assimilierbare, Kohlenstoff enthaltende Stoffe, wie Stärke, Zucker, Melasse und Glycerin, assimilierbare stickstoffhaltige Stoffe, wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Maisquellwasser, und anorganische Kationen und Anionen, wie Kalium, Natrium, Calcium, Sulfat, Phosphat und Chlorid. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän und Kupfer, werden als Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums eingeführt. In Tanks und Flaschen wird die Belüftung durch Eindrücken von steriler Luft in das Fermentationsmedium oder auf seine Oberfläche bewirkt. In Tanks wird für weitere Bewegung durch einen mechanischen Rührer gesorgt. Schaumverhütungsmittel, zum Beispiel 1 % Octade-canol in Specköl, können nach Bedarf zugesetzt werden.

Ein Schüttelkolbeninokulum von Streptomyces hygros-kopikus NRRL 11108 kann durch Beimpfen von 100 ml Anteilen sterilen flüssigen Mediums in 500 ml Kolben mit Abschabungen oder Abwaschungen von Sporen einer Agar-Schräge der Kultur hergestellt werden. Üblicherweise wird folgendes Medium verwendet:

CaC03 Wasser, auf

0,1% 100 %

20

Sojamehl Glucose

Maisquellwasser CaC03 Wasser, auf

1,0% 2,0% 0,5% 0,3% 100 %

Die Inkubation der Kolben erfolgt mit Vorteil bei einer Temperatur von 25 bis 29 °C, vorzugsweise bei 28 °C, und unter kräftiger Bewegung auf einer Rundschüttelvorrichtung während 48 bis 96 Stunden. Beispielsweise werden dann zwei Anteile von je 100 ml dieses Inokulums zum Beimpfen von 121 des gleichen sterilen Mediums in einer 201-Flasche verwendet. Dieses Inokulum wird mit Vorteil unter Rühren und Belüftung mit steriler Luft 36 bis 64 Stunden bei 25 bis 29 °C, vorzugsweise bei 28 °C, inkubiert. Dann kann es zum Beimpfen von 3001 des gleichen sterilen Mediums in einem Fermentationstank verwendet werden. Anschliessend kann unter Bewegung und Belüftung mit steriler Luft z.B. 36 bis 64 Stunden bei 25 bis 29 °C, vorzugsweise bei 28 °C, inkubiert werden. Das so erhaltene Inokulum kann zum Beimpfen von 30001 eines sterilen Mediums in einem 40001 fassenden Fermentationstank verwendet werden. Dieses Medium kann beispielsweise folgende Zusammensetzung haben:

Maisquellwasser

Sojamehl

Maisstärke

0,5% 1,0% 4,0%

Dieses Medium wird im allgemeinen 100 bis 200 Stunden bei einer Temperatur von 27 bis 32° unter Bewegung durch einen Rührer und Belüftung bei einem Verhältnis von 0,4 bis 0,81 Luft je 1 Medium und Minute fermentiert. Üblicherweise wird ein Entschäumungsmittel, wie Hodag(R) FD82, in 25 einem Verhältnis von etwa 3,5 Liter je 1000 Liter Medium zugegeben.

Die Isolierung des gebildeten Antibiotikums aus dem Fermentationsmedium kann mit Vorteil wie folgt durchgeführt werden:

30 Nach dem Ende der Fermentation wird die erhaltene Maische, die das Antibiotikum BL580 ZETA enthält, mit etwa der Hälfte ihres Volumens Ethylacetat versetzt und 2 bis 3 Stunden gerührt. Nach Zugabe von etwa 8% Diatomeenerde wird die Mischung durch eine Filterpresse mit Platte und 35 Rahmen filtriert. Der Rückstand wird auf der Presse mit Ethylacetat gewaschen. Die Ethylacetatextrakte werden vereinigt und in einer Destillationsvorrichtung bis zu einem Sirup eingeengt. Dieser Sirup wird mit dem doppelten seines Volumens an n-Heptan gerührt und über Nacht bei 4 °C auf-40 bewahrt. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und bis zu einem gummiartigen Konzentrat eingeengt, das mit 101 Methanol behandelt und mehrere Stunden mit Hilfe von Trockeneis gekühlt wird. Die Mischung wird durch Sinterglas mit einer Diatomeenerdeschicht filtriert und mit kaltem 45 Methanol gewaschen. Die Methanollösung wird im Vakuum bis zu einem sirupartigen Rückstand eingeengt.

Es wird eine chromatographische Säule mit Aktivkohle in einem Verhältnis von etwa 11 Kohle je 50 g Beschickung hergestellt. Der getrocknete Rückstand wird in Methylenchlorid 50 in einem Verhältnis von 40 g/1 gelöst und auf die Säule aufgebracht. Das Methylenchlorideluat wird als eine Fraktion aufgefangen und bis zu einem Sirup eingeenget. Der Rückstand wird mit Methanol vermischt und 15 Minuten in einem Kühlraum mit Trockeneis zur Verminderung der Temperatur auf —10 °C belassen. Danach wird das verfestigte Öl abfiltriert, und die Methanollösung wird im Vakuum eingeengt, wodurch ein Öl erhalten wird. Dieses Öl wird in der kleinstmög-lichen Menge an Methylenchlorid gelöst, mit Kieselgel versetzt, vom Lösungsmittel befreit und auf eine trockene Kieselgelsäule aufgebracht. Die Säule wird mit Ethylacetat:Benzol (1:1) entwickelt. Dann lässt man sie abtropfen. Der Säulenabschnitt, der das Material mit einem Rf-Wert von 0,10 bis 0,45 enthält, wird herausgeschnitten und in Ethylacetat:-Methylenchlorid:Methanol (2:2:1, Vol.) aufgeschlämmt.

Diese Mischung wird filtriert, mit weiterem Lösungsmittelgemisch gewaschen und im Vakuum zur Trockne eingedampft.

Aus n-Heptan:Methanol:Ethylacetat: Wasser (3000:1500:20:40, Vol.) wird ein zweiphasiges System herge-

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stellt. Diatomeenerde, Celatom(R) (Eagle-Picher Industries, Cincinnati, Ohio) wird mit der unteren Phase dieses Systems in einem Verhältnis von etwa 2000 g/1650 ml vermischt und in Anteilen in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 7,5 cm eingefüllt. Die Beschickung wird als Mischung von Diatomeenerde und unterer Phase mit lyophilisiertem Produkt aufgebracht. Die beschickte Säule wird mit der oberen Phase entwickelt, und es werden Fraktionen aufgefangen. Die Aktivität wird durch Dünnschichtchromatographie von ausgewählten Fraktionen unter Verwendung einer Gelplatte und Chloroform: Ethylacetat (1:1) als Entwicklungsmittel mit H2S04 ermittelt. Die Fraktionen 123 bis 186 (Ende) werden vereinigt und eingeengt, wodurch das Antibiotikum BL580 ZETA erhalten wird.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1 a) Inokulumherstellung

Zur Züchtung des Primärinokulums wird folgendes Medium hergestellt:

10

Sojamehl Glucose

Maisquellwasser CaC03 Wasser, auf

1,0 g 2,0 g 0,5 g 0,3 g 100 ml

Die abgewaschenen oder abgeschabten Sporen einer Agarschräge von Streptomyces hygroskopicus NRLL11108 werden zum Beimpfen von 2 Kolben von jeweils 500 ml Fassungsvermögen, die jeweils 100 ml des oben angegebenen Mediums in sterilisiertem Zustand enthalten, verwendet. Die Kolben werden auf eine Drehschüttelvorrichtung aufgebracht und bei 28 °C 72 Stunden lang kräftig bewegt. Das so erhaltene Kolbeninokulum wird in eine Glasflasche mit einem Fassungsvermögen von etwa 201 überführt, die 121 des gleichen sterilisierten Mediums enthält. Das Sekundärinokulum wird mit steriler Luft belüftet, während die Züchtung 48 Stunden bei 28 °C geführt wird. Das erhaltene Sekundärinokulum wird in einen Tank mit einem Fassungsvermögen von etwa 3801 übergeführt, der 3001 des gleichen sterilen Mediums enthält. Dieses tertiäre Inokulum wird mit steriler Luft in einem Verhältnis von 11 Luft je 1 Medium und Minute belüftet und mit Hilfe eines mit 173 Umdrehungen/Minute betriebenen Rührers bewegt. Die Züchtung wird 48 Stunden bei 28 °C geführt. Der pH-Wert zu diesem Zeitpunkt beträgt 6,9 bis 7,0.

b) Fermentation

Ein Fermentationsmedium wird folgendermassen hergestellt:

35

45

50

Maisquellwasser Sojamehl Maisstärke CaC03 Wasser, auf

0,5 g 1,0 g 4,0 g 0,1g 100 ml

55

30001 Fermentationsmedium der vorstehend angegebenen Zusammensetzung werden in einem Tank mit einem Fassungsvermögen von 4000160 Minuten bei 120 °C sterilisiert. Der pH-Wert des Mediums beträgt nach der Sterilisation 6,4 bis 6,5. Dieses Medium wird mit 300 Liter des wie in Beispiel 1 beschrieben hergesteil ten tertiären Inokulums beimpft. Die Fermentation wird unter Verwendung von 11,01 Hodag(R) FD82 als Entschäumungsmittel bei 28 bis 29 °C geführt. Die Belüftung erfolgt in einem Verhältnis von 0,61 steriler Luft je Liter Maische und Minute. Die Maische wird mit Hilfe eines

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Rührers bewegt, der mit 150 Umdrehungen/Minute betrieben wird. Nach der Fermentationsdauer von 138 Stunden wird die Maische abgeerntet.

> c) Isolierung und Reinigung

26001 der wie in Abschnitt b beschrieben hergestellten fermentierten Maische mit einem pH-Wert von 7,3 werden mit 13001 Ethylacetat versetzt und lji Stunde gerührt. Nach Zugabe von 8 Gewichtsprozent Diatomeenerde wird die Mischung unter Rühren in mehreren Anteilen durch ein Paar von Rahmenpressen filtriert. Die wässrigen Ethylacetatfil-trate werden vereinigt, wodurch 33001 Flüssigkeit erhalten werden, die man sich trennen lässt.

Dadurch werden 11001 Ethylacetatextrakt erhalten. Nach dem Filtrieren jedes einzelnen Anteils von Maische/Ethylace-tat/Diatomeenerde durch eine Presse wird das Kissen auf der Presse mit Ethylacetat gewaschen. Die Ethylacetatwaschflüs-sigkeiten werden vereinigt und ergeben nach der Abtrennung 6001 Ethylacetatwaschflüssigkeiten. Die 11001 an Ethylace-tatextrakten und die 6001 an Ethylacetatwaschflüssigkeiten werden vereinigt und in einer Destillationsvorrichtung mit einem Fassungsvermögen von etwa 15001 auf etwa 1001 eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat wird in einer Destillationsvorrichtung mit einem Fassungsvermögen von etwa 2001 auf ein Volumen von etwa 201 weiter eingeengt. Diese 201 werden in einer Glasdestillierapparatur bis zu einem Sirup eingeengt.

Der Sirup wird 48 Stunden bei 4 °C stehengelassen und dann mit dem Doppelten seines Volumens an n-Heptan verrührt. Die Mischung wird über Nacht bei 4 °C stehengelassen. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Dekantieren gewonnen und bis zu einem gummiartigen Rückstand eingeengt. Nach Zugabe von 101 Methanol zu diesem Rückstand wird die Mischung mehrere Stunden mit Trockeneis gekühlt. Dann wird sie durch Sinterglas mit einer Diatomeenerdenschicht filtriert und mit kaltem Methanol gewaschen. Das mit den Waschflüssigkeiten vereinigte Filtrat wird im Vakuum bis zu einem Sirup eingedampft, wodurch 1124 g Rückstand erhalten werden. Dieser Rückstand wird in einem Verhältnis von 33 g/1 in Methylenchlorid gelöst. Es wird eine chromatographischen Säule unter Verwendung von 271 körniger Kohle (840 x 420 Mikron, 20 x 40 mesh) hergestellt. Durch diese Säule wird der Rückstand in Methylenchlorid mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 400 ml/Minute geleitet. Das Methylenchlorideluat wird als eine Fraktion aufgefangen und bis zu einem Sirup eingeengt. Der Rückstand wird gründlich mit Methanol vermischt. Die Mischung wird in einem Kühlraum mit Hilfe von Trockeneis auf —10 °C gekühlt und 15 Minuten bei dieser Temperatur belassen. Etwa verfestigtes Öl wird abfiltriert, und das Methanolfiltrat wird im Vakuum bis zu einem Sirup eingeengt, wodurch 363,8 g Substanz als Öl erhalten werden.

4 kg Kieselgel werden trocken in eine Kunststoffsäule mit einem Umfang von 54 cm eingeführt. 200 g des wie oben beschrieben erhaltenen Öls werden in der kleinstmögüchen Menge Methylenchlorid gelöst. Nach Zugabe von 300 g Kieselgel wird gründlich gemischt, und die Mischung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Die getrocknete Mischung wird auf die Säule aufgegeben, worauf auf das obere Ende der Säule etwas Seesand gegeben wird, damit das Bett während der Elution nicht aufgewühlt wird. Die Kunststoffsäule wird mit einem Glasmantel gestützt. Sie wird mit 9,41 einer Mischung aus gleichen Teilen Ethylacetat und Benzol eluiert. Es werden Fraktionen aufgefangen, und die Säule wird vollständig abtropfen gelassen. Der Abschnitt der Säule der einen Rf-Wert von 0,10 bis 0,45 zeigt, wird herausgenommen und in Ethylacetat:Methylenchlorid:Methanol (2:2:1) aufge-schlämmt. Die Mischung wird filtriert, mit dem gleichen Lö-

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sungsmittelgemisch gewaschen und im Vakuum zur Trockne schrieben behandelt, wodurch eine zweite Ausbeute erhalten eingedampft, wodurch 22 g Rückstand erhalten werden. wird. Das zweite Filtrat wird wiederum eingedampft und wie

Durch Vermischen von n-Heptan, Methanol, Ethylacetat oben beschrieben behandelt, wodurch eine dritte Ausbeute er-

und Wasser im Verhältnis von 3000:1500:20:40 (Volumen) halten wird. Die erste und die dritte Ausbeute werden verei-

wird ein zweiphasiges System erhalten. Mit 1650 ml der unte- 5 nigt, wodurch 445 mg des Natriumsalzes von BL580 ZETA

ren Phase dieses Lösungsmittelsystems werden 2000 g säure- erhalten werden.

gewaschener Diatomeenerde vermischt und in Anteilen in Dieses Natriumsalz von BL580 ZETA hat einen Schmelzeine Glassäule mit einem Innendurchmesser von 7,5 cm ein- , . , „ „ u r i i. 120 gefüllt. 22 g Rückstand werden in der unteren Phase gelöst Punkt von 162 C'eine sPezifische Drehung D = und filtriert, und das Filtrat wird mit Diatomeenerde ver- io — 3° ± 2° (C=0,94 in Methanol) und folgende Anlaysenwerte: mischt und auf die Säule aufgegeben. Die Entwicklung der C 60,97, H 8,69, Na 2,70% . Das Natriumsalz von BL580 Säule erfolgt mit der oberen Phase des Lösungsmittelsystems, ZETA zeigt folgende Infrarotabsorptionswerte: 2,93 n, und mit Hilfe eines Fraktionssammlers werden Fraktionen 3,43 n, 6,12 (i, 7,27 |x, 8,63 (x, 9,07 (i, 9,57 (i, 10,05 (i und aufgefangen. Die Lage der gewünschten Verbindung wird 10,45 p. Die beigefügte Figur 1 zeigt das Infrarotabsorptions-durch Dünnschichtchromatographie von Fraktionsproben " spektrum von BL580 ZETA-Natriumsalz. Die beigefügte Fi-ermittelt. Die Fraktionen 123 bis 186 (Ende) werden verei- gur 2 zeigt ein 13C magnetisches Kernresonanzspektrum von nigt, im Vakuum bis zu einen Rückstand eingeengt, in t-Bu- BL580 ZETA-Natriumsalz. Die beigefügte Figur 3 zeigt ein tylalkohol gelöst und gefriergetrocknet, wodurch 4,2 g des ge- magnetisches Protonenresonanzspektrum von BL580 ZETA-bildeten BL580 ZETA erhalten werden. Natriumsalz.

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Beispiel 3

Herstellung der freien Säure von BL580 ZETA Beispiel 2 125 mg des Natriumsalzes von BL580 ZETA werden in

Herstellung des Natriumsalzes von BL580 ZETA 100 ml Diethylether gelöst. Nach Zugabe von 100 ml Wasser

900 mg BL580 ZETA werden in einer Mischung aus 25 wird der pH-Wert mit 1 n HCl unter Rühren auf 2,0 einge-30 ml Diethylether und 70 ml niedrig siedenden Petrolethers stellt. Die etherische Schicht wird abgetrennt und mit fri-gelöst. Diese Lösung wird mit einem gleichen Volumen Was- schem Wasser gewaschen. Dann wird sie im Vakuum einge-ser verrührt, und die Mischung wird unter Rühren mit 1 n engt. Der Rückstand wird in t-Butanol gelöst und gefrierge-HC1 auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Die wässrige trocknet, wodurch 106 mg der freien Säure von BL580 ZETA

Phase wird verworfen. Nach Zugabe frischen Wassers wird 30 erhalten werden.

das zweiphasige System gerührt und mit 0,1 n NaOH auf ei- Diese freie Säure von BL580 ZETA hat einen Schmelz-

nen pH-Wert von 10,0 eingestellt. Die gebildete Emulsion punkt von 105 bis 107 °C, eine spezifische Drehung wird zentrifugiert. Die obere Phase wird im Vakuum einge- r i u t 20 „0 , fr^ „ n, c , ,

engt und ergibt einen weissen Rückstand. Dieser Rückstand [alPha]D = 7 ±2 (C=0,9 in Methanol) und folgende wird in 15 ml Diethylether und 30 ml niedrig siedenden Pe- 35 Analysenwerte: C 63,99, H 9,43 %. Die freie Säure von BL580 trolethers gelöst. Die Lösung wird durch 18-stündiges Stehen- ZETA zeigt im Infraroten Absorptionen bei folgenden Wellassen in einem Kühlraum bei 4 °C auf etwa die Hälfte ihres lenlängen: 2,87 n, 3,40 n, 3,80 p., 5,87 fi, 8,62 ji, 9,02 n, Volumens eingeengt. Die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert 9,45 |x, 9,57 ja., 10,04 |x und 10,43 |i. Ein Infrarotabsorptionsund mit Petrolether gewaschen, wodurch ein weisser Feststoff spektrum der freien Säure von BL580 ZETA ist in der beigeerhalten wird. Das Filtrat wird eingedampft und wie oben be-40 fügten Figur 4 wiedergegeben.

C

4 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Antibiotikum BL580 ZETA, freie Säure, gekennzeichnet durch

(a) anticoccidielle Wirksamkeit und praktisch reine kristalline Form,

(b) einen Schmelzpunkt von 105 bis 107 °C,

(c) folgende Elementaranalysenwerte: C 63,99, H 9,43%

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(d) eine optische Drehung [alpha] ^ = + 7° ±2° (C=0,9 in Methanol),

(e) das in Figur 4 dargestellte charakteristische Infrarotabsorptionsspektrum.

2. Antibiotikum BL580 ZETA, Natriumsalz, gekennzeichnet durch

(a) anticoccidielle Wirksamkeit und praktisch reine kristalline Form,

(b) einen Schmelzpunkt von 162 °C,

(c) folgende Elementaranalysenwerte: C 60,97, H 8,69, Na 2,70%,

(d) eine optische Drehung [alpha] p = -3° ±2° (c=0,94 in Methanol),

(e) das in Figur 1 dargestellte charakteristische Infrarotabsorptionsspektrum,

(f) das in Figur 2 dargestellte charakteristische 13C magnetische Kernresonanzspektrum,

(g) das in Figur 3 dargestellte charakteristische magnetische Protonenresonanzspektrum.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BL580 ZETA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Strep-tomyces hygroscopicus NRRL11 108 in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare, Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter sub-mersen aeroben Bedingungen gezüchtet werden, bis das Medium eine beträchtliche Aktivität zeigt, und das Antibiotikum BL580 ZETA aus dem Medium gewonnen wird.