AT205665B
AT205665B - Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums

Info

Publication number: AT205665B
Application number: AT580957A
Authority: AT
Inventors: Hamao Umezawa; Masahiro Ueda; Kenji Maeda
Original assignee: Hamao Umezawa; Masahiro Ueda; Kenji Maeda
Priority date: 1956-09-05
Filing date: 1957-09-05
Publication date: 1959-10-10
Description


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  Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums 
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums und insbesondere ein Verfahren zu dessen Herstellung durch Fermentation, sowie Verfahren zur Gewinnung und Reinigung des Antibiotikums als solches oder in Form von Säureadditionssalzen. 



   Es ist bereits bekannt, neue Antibiotika durch aerobe Züchtung neuer Streptomyces-Stämme in geeigneten (flüssigen) Nährmedien herzustellen und die antibiotisch wirksamen Substanzen aus dem Kulturfiltrat zu isolieren. Die neuen Antibiotika werden dann im allgemeinen weiter gereinigt und gegebenenfalls in kristallisierte Salze übergeführt. 



   Das neue, gemäss der Erfindung hergestellte Antibiotikum wird Kanamycin genannt und ist geeignet, das Wachstum von gram-positiven, gram-negativen und säurebeständigen Bakterien, wie Mycobakterium tuberculosis, zu hemmen. 



   Gemäss der Erfindung wird zur Gewinnung des Kanamycins ein Stamm von Streptomyces-kanamycetikum nov. spec. in einer wässerigen Kohlehydratlösung, die einen stickstoffhältigen Nährstoff enthält, unter aeroben Bedingungen gezüchtet, bis eine wesentliche antibakterielle Aktivität in der Lösung erreicht ist, worauf das Antibiotikum gewonnen und falls notwendig gereinigt wird. 



   Der Mikroorganismus, der erfindungsgemäss zur Herstellung des neuen Antibiotikums verwendet wird, wurde aus Erde, die in Nagano Prefecture, Japan, gesammelt wurde, isoliert und stellt eine neue Art der Streptomyceten dar, die mit Streptomyces kanamyceticus bezeichnet worden ist. Für den im Rahmen des   erfiridungsgemässen Verfahrens   verwendeten Stamm des Streptomyces nov. spec. wurde die Kurzbezeich-   nung "K2-J" gewählt.   Dieser wurde in der American Type Culture Collection unter Nr. 12853 hinterlegt. 



   Der Streptomyces kanamyceticus zeigt die folgenden Merkmale :
1) Mikroskopische Beobachtung : Das Substratmycel ist etwa   111   breit und verzweigt. Das Luftmycel, das sich aus submersem Mycel entwickelt, verzweigt sich und trägt die Sporenträger an den Enden. Spiralen und Quirln werden im allgemeinen nicht beobachtet. 



   2) Glycerin-Czapek Agar (270C) : Die Kultur ist zuerst farblos, später zitronengelb. Die Rückseite ist heufarben. Das Luftmycel ist weiss bis gelb und zeigt gelegentlich eine grünliche oder matt rosa Farbe. 



  Manchmal bildet sich ein mattbraunes lösliches Pigment. 



   3) Krainsky   Glukose- Asparagin- Agar (270C) : Die Kultur ist farblos bis   gelb und die Rückseite ist weiss, matt rosaweiss, gelb oder heufarben. Das Luftmycel ist kärglich, entwickelt sich üblicherweise vom Mittelpunkt der Kolonie aus und ist von weisser, matt rosa-weisser, matt grünlich gelber oder gelber Farbe. 



  Es wird im allgemeinen kein lösliches Pigment gefunden. 



   4)   Calziummalat-Agar (270C) :   Gleiche Erscheinungen wie bei Krainsky Glukose-Asparagin-Agar, aber die Kultur ist lichter. Gelegentlich zeigt sich kein Wachstum. 



   5) Stärkeplatte   (270C) :   Meist die gleichenErscheinungen wie Krainsky Glukose Asparagin Agar, aber die Kultur ist eingeschränkt und es zeigt sich kein Luftmycel. Stärke wird hydrolysiert. 



   6) Kartoffelstück   (27toc):   Die Kultur ist runzelig, körnige Oberfläche, blass gelblich braun bis gelb. 



  Die Stückunterseite ist gelegentlich dunkel. 



   7) Mohrrübenstück   (2''OC) : Im   allgemeinen nur spärliche Kultur. Wenn Wachstum auftritt, zeigen sich meist die gleichen Erscheinungen wie beim Kartoffelstück. 

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   8) Peptonwasser mit 0, 2% Natriumnitrat   (270C) : Die   kreisförmige Oberflächenkultur ist   farblcs   bis weisslich gelb ; am Boden bildet sich eine weisse Kultur. Weisses Luftmycel bildet sich gelegentlich. Aus Nitrat wird Nitrit gebildet, es entsteht kein lösliches Pigment. 



   9) Pepton-Fleischextrakt Agar (370C) : Die Kultur ist runzelig weiss bis gelb. Es bildet sich kein Luftmycef oder lösliches Pigment. 



   10) Blut-Agar (370C) : Die Kultur ist runzelig, rötlichbraun mit grauer Farbe. Es bildet sich kein Luftmycel oder lösliches Pigment. 



   11) Milch (370C) : Es tritt keine Veränderung auf urd an der Oberfläche wird im allgemeinen keine Kultur beobachtet. 



   12) Koaguliertes Serum nach Loeffler (370C) : Die Kultur ist gehemmt, weiss bis zitronengelb. Es bildet sich kein Luftmycel oder lösliches Pigment. 



   13) Ei-Medium (370C) : Die Kultur ist runzelig. Es bildet sich kein Luftmycel. 



   14) Gelatine : Verflüssigung, kein lösliches Pigment. 



   15) Verbrauch von Kohlenstoffquellen : Die folgenden Kohlenstoffquellen werden auf Czapek SalzGrundmedium verbraucht : Arabinose, Dextrin, Fructose, Galactose, Glukose, Glyzerin, Maltose, Mannit, Mannose, Raffinose, Stärke, Saccharose, Succinat. 



   Nicht verbrauchte Kohlenstoffquellen : Inositol, Inulin, Lactose, Rhamnose, Sorbose, Xylose, Acetat. 



  In geringem Masse verbrauchte   Kohlenstoffquellen : Aesculin, Salicin, Sorbit,   Citrat. 



   16) Erzeugung des Antibiotikums Kanamycin. 



   Die oben angegebenen Merkmale ermöglichen die Unterscheidung des Mikroorganismus von den bisher beschriebenen Arten der Streptomyceten und zeigen, dass der Stamm K2-J einer neuen Art angehört. 



  Variationen und Mutationen des oben angegebenen Organismus sind natürlich zu erwarten, da dies eine allgemeine Eigenschaft des Organismus der Streptomyceten darstellt. 



   Die Merkmale dieser Art können wie folgt zusammengefasst werden : Die Kultur der Kolonie ist farblos bis gelb, gelegentlich tritt grünliche oder rosa Farbe auf. Auf synthetischem Agar ist die Rückseite der Kultur farblos, weiss, schwach rosaweiss, weiss-gelb oder heufarben. Das Luftmycel ist weiss bis gelb ; Spiralen oder Quirl werden nicht gebildet. Gelegentlich wird ein matt braunes, lösliches Pigment gebildet. Gelatine wird verflüssigt und Stärke wird hydrolysiert. Streptomyces kanamyceticus umfasst den typischen Stamm Nr. K2-J sowie alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten desselben. 



   Erzeugung von Kanamycin durch Fermentation :
Streptomyces   kanamyceticum   (K2-J) wurde zuerst in   Schüttelflaschzn   in den folgenden Medien gezüchtet : a)   0, 75% Fleischextrak :, 0, 75%   Pepton,   0, 3% Kochsalz   sowie   1. 0% Stärke, Dextrin.   Maltose, Glu-   kose,   Lactose, Saccharose oder Glyzerin. b) 2,   Wo   Sojabohnenmehl, 0,05%   KCI,   0, 05%   MgSO. 7 H2O, 0, 5% NaCl, 0, 2% NaNO sowie   1,   0%   Stärke, Dextrin, Maltose, Glukose, Lactose, Saccharose oder Glyzerin. 



   Der pH-Wert dieser Medien wurde zu Beginn auf 7, 0 eingestellt. Nach   24   bis 48 Stunden Schütteln sank in einigen Fällen der pH-Wert auf etwa 6, 0 bis 6,8 ab, während er nach 72 bis 120 Stunden anstieg und etwa 7,5 bis 8,6 betrug. 



   In dem oben angegebenen Medium b), welches 2% Stärke enthält, stieg der pH-Wert nach 3 Tagen Schüttelkultur auf 8,2 an und es wurden 250 y/ml Kanamycin produziert. Bei der Tankkultur mit einem 
 EMI2.1 
 schwach erniedrigt (6, 6) und stieg dann nach 43 Stunden auf 8, 0 an. Nach   78   Stunden wu. den 273 y/ml Kanamycin erhalten. 



   Als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Kanamycin werden Fermentationskulturen oder Rohprodukte, wie sie bei der Behandlung der Fermentationskulturen erhalten werden, angewendet. 



   Kanamycin wird vorzugsweise in Medien hergestellt, welche organische Stickstoffquellen, wie Soia-   bohnenmehl,   Baumwollsamenmenl,   Lrdnussmenl,   Fleischextrakt,   Pepton,"cornsteep-liquor"oderHefe-   extrakt enthalten. Kohlenstoffquellen, welche verwendet werden können, umfassen Stärke, Dextrin, Maltose, Glukose, Saccharose, Lactose und Glycerin. Die gemeinsame Anwendung von Stärke und   Sojaboh-   nenmehl stellt, wie gefunden wurde, eine der besten Mischungen dar und wird bevorzugt ; der Zusatz von "corn steep-liquor", Pepton, Pefeextrakt oder Nitrat zu dieser Mischung beschleunigt die Bildung von Kanamycin. Der Zusatz von Magnesiumsulfat, Manganchlorid oder Zinksulfat wirkt beschleunigend. Die höchste Ausbeute wurde erhalten, wenn der pH-Wert des Kulturmediums schwach alkalisch gemacht wurde.

   Die Züchtungstemperatur kann innerhalb eines weiten Bereiches variieren, z. B. zwischen 25 und 35 C, 

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 wobei der Organismus wachsen kann. Temperaturen von 27 bis   320C   werden jedoch bevorzugt angewsndet. Im allgemeinen wird die Züchtung solange fortgesetzt, bis eine wesentliche Menge von Kanamycin im Medium gebildet ist. Dies erfordert bei aerober Tiefenkultur im allgemeinen 2 bis 7 Tage, wobei die maximale Produktion im allgemeinen nach 3 bis 5 Tagen erfolgt. Das Kanamycin findet sich im flüssigen Anteil des Fermentationsmediums. 



   Experimentelle Methoden : 
Schüttelkultur : 150 ml des Mediums wurden in einen Kolben von 500 ml Inhalt gebracht und sterilsiert. Das Medium wurde mit den Mycelien und Sporen des Kanamycin-erzeugenden Organismus von einem Agar-Medium oder mit einem Mycel, das nach 48 Stunden aus einer Schüttelkultur erhalten wurde, beimpft und dann auf einer hin-und hergehenden Schüttelmaschine bei 27 - 290C weiter kultiviert (120 Schläge pro Minute mit 8 cm Amplitude). 



   Tankkultur : Es wurde einFermenter aus Edelstahl mit   4001   Fassungsraum verwendet. 180   l   oder 200 1 des Mediums wurden in den Fermenter eingelassen, worauf bei 1200C   20 - 30   Minuten sterilisiert wurde. 



    Die Belüftungsgeschwindigkeit   betrug 2001 Luft pro Minute ; die Drehzahl des Rührers war 200 U/min. Als Antischaummittel wurde Silikon, Sojabohnenöl oder flüssiges Paraffin verwendet. 



   Extraktion und Reinigung von Kanamycin : Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Extraktion kann das in der flüssigen Phase der Fermentationskultur enthaltene Kanamycin mit Butanol in Gegenwart eines Trägers, wie Laurinsäure oder Stearinsäure, extrahiert werden. Das Antibiotikum wird dadurch in das Butanol bei einem pH-Wert von 6 bis 8 überführt und aus diesem Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 2 bis 4 in eine wässerige Phase gebracht. In Abwesenheit eines Trägers wird das Kanamycin nicht in nennenswertem Ausmass von Butanol, Äthylacetat, Butylacetat, Benzol usw. aufgenommen.   Demgemäss   kann die Extraktion mit diesen Lösungsmitteln zum Extrahieren anderer gleichzeitig vorliegender Stoffe und Verunreinigungen benutzt werden. 



   Nach einem andern Verfahren zur Gewinnung von Kanamycin aus einer Fermentationskultur wird die Kultur im Vakuum durch Verdampfen oder Sprühtrocknung konzentriert. Das Kanamycin kann aus dem Rückstand mit Wasser, Methanol, Äthanol oder Aceton extrahiert werden ; durch Ansäuern mit Chlorwasserstoffsäure wird das Lösungsvermögen verbessert. Das Antibiotikum kann mittels Aktivkohle von neutralen oder alkalischen wässerigen Lösungen adsorbiert und anschliessend in trockenem oder wässerigem Alkohol bzw. wässerigem, mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,0 angesäuertem Aceton, desorbiert werden. 



  Kanamycin wird ferner bei einem pH-Wert von etwa 6, 0 bis 9, 0 durch Kationenaustauschharze, vorzugsweise solchen mit Carboxylgruppen, wie Copolymere von Methacrylsäure und Divinylbenzol, adsorbiert. 



  Bei Adsorption an einem Kationenaustauschharz kann das Antibiotikum mit wässeriger Chlorwasserstoffsäure, wässeriger Schwefelsäure oder   wässerigen organischen Lösungsmitteln (beispielsweise InHCl-lO iges   wässeriges Aceton) eluiert werden. Kanamycin kann ferner mit Ammoniumhydroxyd eluiert werden. 



   Das so erhaltene Eluat kann durch Eindampfen im Vakuum oder durch Gefriertrocknen konzentriert und das Kanamycin kann anschliessend aus der konzentrierten Lösung durch Zusatz eines Lösungsmittels, in dem Kanamycin oder dessen Salz im wesentlichen unslöslich ist, ausgefällt werden. 



   Nach einem weiteren Reinigungsverfahren kann eine Chromatographierkolonne, die mit Aluminiumoxyd oder Aktivkohle beschickt ist, benutzt werden. Beispielsweise kann eine wässerige Lösung von Kanamycin (pH 8,0), die wiederholt mit Kationenaustauschern behandelt worden ist, durch eine Kolonne mit Aktivkohle geleitet werden, worauf nach Waschen der Kolonne mit destilliertem Wasser eine Eluierung mit 0,5 n Schwefelsäure erfolgt. Die Fraktion des Eluats mit der höchsten Aktivität wird zu Methanol gegossen, wodurch kristallisiertes Kanamycinsulfat ausgefällt wird. 



   Beschreibung des Kanamycins : 
 EMI3.1 
 beispielsweisehydroxyd, erhalten werden. Kanamycinhydrochlorid ist in Wasser und Methanol leicht löslich, in Äthanol geringer   löslich und in Aceton,   Äthylacetat, Butylacetat, Benzol,   Äther oder Petroläther unlöslich.   Kanamycinsulfat ist in Wasser löslich und in Methanol,   Äthanol,   Aceton, Äthylacetat und Benzol unlöslich. Die Kanamycinbase ist in Wasser löslich und im wesentlichen unlöslich in n-Butanol, Äthylacetat, Butylacetat, Äther, Chloroform und Benzol. Kanamycin gibt nach Auflösen in Pyridin positive Ninhydrinreaktion, Tests nach Tollens, Sakaguchi, Fehling. Molisch und Elson-Morgan (Glukosamin) verlaufen negativ. Der Glukosamin-Test ist selbst nach Hydrolyse negativ.

   Bei der Papierchromatographie wird ein Rf-Wert des Kanamycins von 0,21 bis 0, 26 (mit Toyo-Filterpapier Nr. 50 und 0,   21o     p-Toluolsulfonsäure-   Butanol, gesättigt mit Wasser) erhalten. 

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 EMI4.1 
 
 EMI4.2 
 
<tb> 
<tb> ige <SEP> wässerige <SEP> Losung <SEP> von <SEP> gereinigtem <SEP> Khnamycinhy-C <SEP> H <SEP> N <SEP> 0
<tb> C14H29N3O11 <SEP> Ber.: <SEP> 40,48% <SEP> 7,04% <SEP> 10,12% <SEP> 42,37%
<tb> Gef.: <SEP> 43,17% <SEP> 6,95% <SEP> 9, <SEP> 82%
<tb> Analytische <SEP> Daten <SEP> des <SEP> H <SEP> drochlorids <SEP> : <SEP> 
<tb> C <SEP> H <SEP> N <SEP> Cl <SEP> 0
<tb> C14H29N3O11#3HCl <SEP> Ber.: <SEP> 32,04% <SEP> 6,15% <SEP> 8,01% <SEP> 20,27% <SEP> 33,54%
<tb> Gef.:

   <SEP> 31,31% <SEP> 6,07% <SEP> 8,21% <SEP> 18,03%
<tb> Analytische <SEP> Daten <SEP> für <SEP> Kanamycinsulfat <SEP> (amorph):
<tb> C <SEP> H <SEP> N <SEP> S <SEP> 0
<tb> C14H29N3O11# <SEP> Ber.: <SEP> 29, <SEP> 891o <SEP> 5, <SEP> 73% <SEP> 7, <SEP> 47% <SEP> 8, <SEP> 57% <SEP> 48, <SEP> 35%
<tb> 3/2 <SEP> H2SO4 <SEP> Gef.: <SEP> 30,20% <SEP> 5,88% <SEP> 7,43%
<tb> Analytische <SEP> Daten <SEP> für <SEP> N-Acetyl-Kanamycin <SEP> : <SEP> 
<tb> C <SEP> H <SEP> N <SEP> 0
<tb> C14H29N3O11# <SEP> Ber.: <SEP> 44,36% <SEP> 6,51% <SEP> 7,76% <SEP> 41,36%
<tb> 3CH3CO <SEP> Gef.: <SEP> 44,39% <SEP> 6, <SEP> 01% <SEP> 7, <SEP> 49%
<tb> Analytische <SEP> Daten <SEP> für <SEP> das <SEP> Kanamycinreinekat <SEP> : <SEP> 
<tb> C <SEP> H <SEP> N <SEP> S <SEP> Cr <SEP> 0
<tb> C14H29N3O11# <SEP> Ber.:

   <SEP> 22, <SEP> 68% <SEP> 3, <SEP> 88% <SEP> 21, <SEP> ze <SEP> 27, <SEP> 95% <SEP> 11, <SEP> 330/17 <SEP> 12, <SEP> 78%
<tb> 3 <SEP> (C4H3N6S4 <SEP> Cr) <SEP> Gef.: <SEP> 21,44% <SEP> 4,31% <SEP> 19, <SEP> 93% <SEP> 11, <SEP> 400/17 <SEP> 
<tb> (Cr <SEP> aus <SEP> dem <SEP> Aschegehalt)
<tb> Analytische <SEP> Daten <SEP> für <SEP> das <SEP> kristallisierte <SEP> Kanamycinsulfat <SEP> : <SEP> 
<tb> C <SEP> H <SEP> N <SEP> S <SEP> 0
<tb> C14H29N3O11# <SEP> Ber.: <SEP> 36,21% <SEP> 6,51% <SEP> 9,05% <SEP> 3,44% <SEP> 44,79%
<tb> 1/2 <SEP> H2SO4 <SEP> Gef.: <SEP> 35,97% <SEP> 6,51% <SEP> 9,13% <SEP> 3,47%
<tb> 
 
 EMI4.3 
 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 
Neben andern Antibiotika haben Neomycin B und C, Neamin und Catenulin einige Merkmale mit dem Kanamycin gemeinsam. Aber in den folgenden Merkmalen unterscheidet sich Kanamycin eindeutig von den genannten Antibiotika.

   Der Glukosamintest für Neomycin ist, wie er in dem   Buch"Assay   Methods of Antibiotics" von D. C. Grove und W. A. Randall (Medical Encyclopedia Inc. New York) beschrieben   ist. für Kanamycin negativ. Diese Reaktion ist   für Neomycin und Catenulin positiv. Bei der Papierchromatographie mit   2, Obigem   p-Toluolsulfonsäure-Butanol, welches mit Wasser gesättigt ist, unterscheidet sich Kanamycin von Neamin. Wird ein Toyo-Papierfilter Nr. 50 verwendet, so liegt der Rf-Wert des Kanamycins bei 0.   21-0, 26   und jener von Neamin bei   0,     75-0, 85.

   Nach   der Kulturverdünnungsmethode hemmt Kanamycin die Kultur von Klebsiella pneumoniae bei 3   y/ml,   Neamin bei   25 y/ml,   Neomycin B bei 3   y/ml und   Catenulin bei   l,   5   y/n-, l.   Nach dem Zylinderplatten-Verfahren mit B. subtilis werden zur Erreichung von 20 mm Hemmungsdurchmesser 30 y/ml Kanamycin   benötigt,   während für den gleichen Effekt 25   y/ml Neamin, 170 y/ml   Neomycin B, 250 y/ml Neomycin C bzw. 18   y/ml   Catenulin erforderlich sind. Diese Merkmale sowie die Eigenschaft der niedrigen Toxizität und schliesslich die ermittelte empirische   Formel bestätigen,da#Kanamycin   von den Neomycinen, von Neamin sowie Catenulin verschieden ist und ein neues Antibiotikum darstellt. 



   Aktivität von Kanamycin : Kanamycin ergibt bei der Prüfung nach der Agar-Verdünnungsmethode das folgende antibakterielle Spektrum : 
 EMI5.1 
 
<tb> 
<tb> Mikroorganismen <SEP> Minimale <SEP> Konzentration <SEP> für <SEP> vollständige
<tb> Hemmung <SEP> in <SEP> y/ml.
<tb> 



  S. <SEP> lutea <SEP> PCI-1001 <SEP> 1. <SEP> 8 <SEP> 
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 209-P <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> Terajima <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 9, <SEP> 0
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> PCI-219 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> NRRL-558 <SEP> 4,5
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> Tracy <SEP> 9, <SEP> 0
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> S. <SEP> dysenteriae <SEP> 1,6
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 6.

   <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Mycobacterium <SEP> 607 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 2,2 <SEP> 
<tb> Saccharomyces <SEP> sake <SEP> 300
<tb> Saccharomyces <SEP> 300
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 300
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 300
<tb> 
 
In Kirchner's Medium tritt Hemmung des Mycobacterium tuberculosis Stamm    H   bei 2 y/ml ein. 



  Der   Streptomycinresistente   E. coli und das Streptomycin-feste Mycobacterium tuberculosis hominis ist gegenüber Kanamycin empfindlich. 



   Mäuse ertrugen intravenöse Injektionen von 150   mg/kg,   die   L. D.   50 nach intravenöser Verabreichung bei Mäusen, Ratten und Kaninchen betrug 150 - 250 mg/kg. Mäuse ertrugen tägliche subkutane Injektionen von 200 mg/kg durch 30 Tage. Bei täglichen Injektionen von 100 bis 200 mg/kg Kanamycin werden bei Hunden innerhalb von 30 Tagen keine Nebenreaktionen beobachtet. Intraperitoneale Injektionen von mehr als   50y/Maus inAbständen von 4 Stunden schützen   Mäuse, die mit 10000 MLD von Diplococcus pneumoniae oder 1000 MLD   von Salmonella typhosa   infiziert waren. Tägliche subkutane Injektionen 

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 von 100 mg/kg Kanamycin ergaben einen Hemmeffekt bei Mäusen, die mit Mycobakterium tuberculosis (Ravenel-Stamm) infiziert waren. 



   Beispiel   l : Glukose,   Glyzerin, Lactose, Maltose, Saccharose, Stärke oder Dextrin wurden in einer Menge von 2, 0% zu einem Grundmedium, welches 0,75% Fleischextrak:,0,75% Pepton und 0,3% Natriumchlorid enthielt, zugesetzt, worauf sterilisiert und nach der Sterilisierung der ph-Wert auf 7, 0 eingestellt wurde. Das Medium wurde mittels einer Öse mit   Glyzerin-Czapek-Schräg-Agar   von Strepto-   my : : es   Kanamycetikus inokuliert, worauf in einer Schüttelkultur bei   27-290C gezüchtet   wurde.

   Die Bildung von Kanamycin wurde nach der Zylinderplatten-Methode mit   Mycobakterium 907 bestimmt, wo-   bei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden : 
 EMI6.1 
 
<tb> 
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> Maximale <SEP> Bildung <SEP> von <SEP> End-pH-Wert <SEP> und <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> Tage
<tb> Kanamycin <SEP> y/ml <SEP> der <SEP> Schüttelkultur <SEP> zur <SEP> Erreichung
<tb> der <SEP> maximalen <SEP> Bildung
<tb> Stärke <SEP> 250 <SEP> 7,8 <SEP> 5 <SEP> Tage
<tb> Dextrin <SEP> 200 <SEP> 8,0 <SEP> 5 <SEP> Tage
<tb> Maltose <SEP> 130 <SEP> I <SEP> 7, <SEP> 8 <SEP> 4 <SEP> Tage
<tb> Glukose, <SEP> 200 <SEP> R, <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> Tage <SEP> 
<tb> Lactose <SEP> 100 <SEP> 8,6 <SEP> 4 <SEP> Tage
<tb> t
<tb> Saccharose <SEP> 100 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> Tage
<tb> Glycerin <SEP> 100 <SEP> 8,

   <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> Tage <SEP> 
<tb> 
 
Wenn eines der vorstehend angegebenen Kohlehydrate zu dem   Grundmedium, welches 1, 0%   Sojabohnenmehl, 0,   051o   Kaliumchlorid, 0,05% MgSO7H2O und 0,3% NaCl enthält, zugesetzt wurde, wurden die folgenden Ergebnisse erhalten. 
 EMI6.2 
 
<tb> 
<tb> 



  Kohlenstoifquelle <SEP> Maximale <SEP> Bildung <SEP> von <SEP> End-pH-Wert <SEP> und <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> Tage
<tb> Kanamycin <SEP> &gamma;/ml <SEP> der <SEP> Schuttelkultur <SEP> zur <SEP> [rreichung
<tb> der <SEP> maximalen <SEP> Bildung
<tb> Stärke <SEP> 250 <SEP> 7,6 <SEP> 4 <SEP> Tage
<tb> Dextrin <SEP> 250 <SEP> 8,0 <SEP> 4 <SEP> Tage
<tb> Maltose <SEP> 130 <SEP> 7,8 <SEP> 4 <SEP> Tage
<tb> Glukose <SEP> 100 <SEP> 8,2 <SEP> 4 <SEP> Tage
<tb> Saccharose <SEP> 150 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> Tage
<tb> i
<tb> Lactose <SEP> 100 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> Tage
<tb> Glyzerin <SEP> 70 <SEP> 8, <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> Tage
<tb> 
 
 EMI6.3 
 
2 : Ein2,0%Stärke, 1,2% Sojabohnenmehl, 0,05%Kaliumchlorid,0,05%MgSO4. 7H,O,K2-J) auf Glyzerin-Czapek-Agar beimpft und die Kultur gezüchtet.

   Nach 4 Tagen Schüttelkultur betrug der pH-Wert 8, 2 und bei Tests nach der Zylinderplatten-Methode wurde sowohl mit Bakterium subtilis als auch Mycobakterium 607 eine Kanamycin-Menge von   550'Y   y/mg bestimmt. 



   Beispiel 3 : 1801 eines 2,0% Stärke, 1,0% Glukose, 1,2% Sojabohnenmehl, 0,3% NaCl, 0,05%   KCI,     0,05% MgSO4#7H2O, 0,1% K2HPO4, 0,2% CaCO3, 0,3% Natriumnitrat, 0,002%MnSO4.   7   HZO   und 0,   002%     ZnSO. 7 HO   enthaltenden Mediums wurden in einen Fermenter mit einem Fassungsraum von 4001 eingebracht, auf einen pH-Wert von 7, 4 eingestellt, 30 Min. bei   120 C   sterilisiert und mit
1000 ml eines Stammes vonS. Kanamyceticus (ausgewählte Unterkultur von Stamm K2-J) aus einer Schüt- telkultur (40 Stunden) beimpft und nach dem Tankverfahren bei 27 - 290C behandelt. Als Antischaum- ;mittel wurden 0, 04% Sojabohnenöl und 0,   04%   Silikon zugesetzt.

   Die Ergebnisse waren die folgenden : 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 
 EMI7.1 
 
<tb> 
<tb> Stunden <SEP> pH-Wert <SEP> Kanamycin <SEP> Verringerung <SEP> des <SEP> Zuckers <SEP> NH-Stickstoff <SEP> in <SEP> der
<tb> y/ml <SEP> in. <SEP> der <SEP> Flüssigkeit <SEP> in <SEP> % <SEP> Flüssigkeit <SEP> in <SEP> % <SEP> 
<tb> 0 <SEP> 6, <SEP> 6-2, <SEP> 20 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> 24 <SEP> 6, <SEP> 9-1, <SEP> 50 <SEP> 10, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 36 <SEP> 7. <SEP> 6 <SEP> 150 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> 48 <SEP> 7, <SEP> 6 <SEP> 200 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> 60 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 220 <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> 6,0
<tb> 72 <SEP> 8, <SEP> 2 <SEP> 210 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 12, <SEP> 0 <SEP> 
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 der Sterilisierung betrug der pH-Wert 7, 0. Die weitere Behandlung erfolgte gemäss Beispiel 3.

   Die Kultur enthielt nach 48 Stunden 250   y ml   Kanamycin. In der weiteren Folge änderte sich die Konzentration des
Kanamycins in der Kultur nicht wesentlich. Nach 65 Stunden der Fermentierung wurden 160 1 Kulturfiltrat erhalten, welches 150 y/ml Kanamycin enthielt und einen pH-Wert von 8, 2 aufwies. Das Filtrat wurde durch eine mit Kationenaustauscherharz beschickte Kolonne geführt. Die Kolonne hatte einen Durchmes- ser von 15 cm und enthielt 6 l des Harzes IRC-50 in Form des Natriumsalzes (d. h. mit Natriumhydroxyd regeneriert) bei einem pH-Wert von 8, 0. Amberlite IRC-50 ist   ein handelsübliches Kationenaustauscl1er-   harz der Carbonsäuretype. Es stellt ein Copolymer von Methacrylsäure und Divinylbenzol dar. Das Filtrat wird durch die Kolonne mit einer Geschwindigkeit von 16   1/Std.   geleitet.

   In der ablaufenden Flüs- sigkeit konnte nach der Zylinderplatten-Methode keine antibakterielle Aktivität gegen Mycobakterium
607 festgestellt werden. Die Kolonne wurde dann mit etwa 10 Liter destilliertem Wasser gewaschen, wel- ches durch die Kolonne mit der gleichen Geschwindigkeit wie das   Kulturfiltrat     hindurchging. Anschlie-   ssend wurde   ln-Salzsäure   mit einer Geschwindigkeit von 0, 8 1/Std. durch die Kolonne geschickt. Das
Eluat wurde in Mengen von 2 l (Teilmenge) gesammelt. Nach der siebenten Teilmenge wurde das Eluat sauer und das Kanamycin wurde in der   7. - 10.   Teilmenge gefunden.

   Die Kanamycin enthaltenden Teil- mengen wurden vereinigt und die Lösung (8 1) wurde mit   l Obiger Natronlauge   auf pH 6, 0 eingestellt und (durch Einengen im Vakuum bei etwa 500C) auf 3000 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen.   Dabei wurde einbräunlich   weisses Pulver (500 g) erhalten, das 8 g Ka- namycin enthielt. Es wurde in 2 l Methanol aufgelöst. Nachdem der unlösliche Anteil abgetrennt worden war, wurden   20 I   Aceton zugesetzt, worauf 80 g des bräunlich weissen Pulvers erhalten wurden. Dieses
Pulver enthielt 8 g Kanamycin. 20 g dieses Pulvers wurden in 40 ml destilliertem Wasser aufgelöst und es wurde eine gesättigte wässerige Lösung von Ammoniumreinekat zugesetzt. Das zuerst anfallende, schwach rosa gefärbte Fällungsprodukt,wilches 50 mg wog, wurde abgetrennt.

   Dann wurde weiteres Am-   moniumreinekat zugesetzt,   bis sich keine Fällung mehr bildete. Das rosa gefärbte Fällungsprodukt wur- de abfiltriert und aus destilliertem Wasser umkristallisiert, wobei 300 mg kristallisiertes, rosa gefärbtes 
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 - 1930C2130C. Das schwach rosa gefärbte Fällungsprodukt, welches zuerst erhalten wurde, enthielt ebenfalls Kanamycin. 



   Beispiel 5 : Ein Medium von 200 l, welches sich in einem   4001   Fermenter aus Edelstahl befand, wurde mit S. kanamyceticus (eine ausgewählte Unterkultur des Stammes K2-J) beimpft und fermentiert. 
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 pH-Wert des Mediums betrug nach der Sterilisierung 7, 0. Zu dem Medium wurde als Antischaummittel Sojabohnenöl in einer Menge von   0, 1%   zugesetzt. Nach 65 Stunden unter Belüftung durchgeführter Tiefenkultur enthielt die Kultur 220   y/ml   Kanamycin. Der pH-Wert betrug 8, 0. Es wurde abfiltriert, wobei 1701 Filtrat erhalten wurden (210   y/ml).   Das Filtrat wurde durch einen Turm geschickt, der mit Kat- 
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 lkeit von 30   l/Std.   durch den mit Harz beschickten Turm geleitet.

   Das von dem Harz absorbierte Kana- mycin wurde mit   ln-Salzsäure   bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 3, 0 1/Std. eluiert. Das erste Eluat 

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    5 1)lomiger   Natronlauge auf pH 7, 5 eingestellt. Es wurde dann auf 80   l   verdünnt. Die Ausbeute aus dem   Kul-   turfiltrat betrug   83%.   Die verdünnte Lösung wurde erneut durch eine mit Harz beschickte Kolonne geleitet. Die Kolonne enthielt   2   1 IRC-50-Harz in Form des Natriumsalzes bei pH ;,5. Der Durchmesser der Kolonne betrug 5 cm, die Durchflussgeschwindigkeit   10 1/Std.   Die Kolonne wurde mit 20 l Wasser bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 10 1/Std. gewaschen. Das adsorbierte Kanamycin wurde dann mit   ln-Salzsäure   eluiert.

   Die Durchflussgeschwindigkeit betrug   3, 0 1/Std. ;   wie bei den vorhergehenden Elutionen trat das Kanamycin im Eluat auf, dessen pH-Wert höher als 2, 0 war. Das aktive Eluat   (4. 51)   wurde unter Zusatz des   Anionenaustauscherharzes   IR-4 B, das in Hydroxylform vorlag, auf pH 6, 0 eingestellt. 
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 trat wurde im Vakuum bei etwa 400C auf 250 ml eingedampft und zur konzentrierten Lösung wurden   2, 5 l  
Aceton zugesetzt, wobei 65 g Kanamycin als schwach bräunliches Pulver erhalten wurden. Die   Aktivität   dieses Pulver betrug 350   &gamma;/mg.   



   Beispiel 6 : Das bräunlich-weisse Kanamycin (5 g), welches nach Beispiel 5 erhalten wurde, wur- de in 50   ml     60%obigem   wässerigem Methanol aufgelöst. Der unlösliche Anteil wurde abgetrennt, worauf zu dem Filtrat 40 ml 60%iges wässeriges Methanol, das 2000 mg Ammoniumsulfat enthielt, zugesetzt wur- den. Das gefällte Kanamycinsulfat wurde abfiltriert, mit 50 ml80%igem wässerigem Methanol gewa- schen und getrocknet. Es wurden 4,5 g Kanamycinsulfat als   hellbraunes   Pulver erhalten. Die Aktivität be- trug 370   r /mg.   



   Beispiel 7: 10 g festes Kanamycinhydrochlorid mit einer Aktivität von 535 y/mg wurden in
100 ml   90% gem   wässerigem Methanol aufgelöst und durch eine mit Aluminiumoxyd beschickte Kolonne geleitet. Die Kolonne enthielt 140 g   Aluminiumoxyd, das mit Schwefelsäure behandelt   worden war. Die
Kolonne hatte einen Durchmesser von 1, 5 cm. Es wurde mit Methanol entwickelt. Das erste Eluat von 200 ml enthielt kein Kanamycin. Das zweite Eluat (128 ml) zeigte antibakterielle Wirksamkeit und wurde im
Vakuum eingedampft, wobei 4, 681 g Kanamycinhydrochlorid in Form eines weissen Pulvers erhalten wur- den. Die Aktivität des Pulvers betrug 560   y/mg.   Nach derselben Verfahrensweise wurden aus dem dritten
Eluat (115 ml) 2, 205 g festes,   weisses   Kanamycinhydrochlorid erhalten.

   Die Aktivität betrug 615 y/mg. 



   Bei dieser Verfahrensweise wurde das gelbe Pigment in der Kolonne adsorbiert und das Kanamycinhydro- chlorid wurde als farbloses Pulver erhalten. Das gelbe Pigment, das in der Kolonne adsorbiert war, wurde durch eine weitere Eluierung mit   50%obigem   wässerigem Methanol und destilliertem   Wasser herausgelöst.   



   Beispiel 8 : 4 g des festen Kanamycinhydrechlorids mit einer Aktivität   non 500) /mg   wurden in
200 ml Methanol aufgelöst und nach Eindampfen auf 80 ml wurde es durch eine 5 g Aktivkohle und 25 g
Zellulosepulver enthaltende Kolonne geführt. Die Kolonne wurde mit Methanol entwickelt. Das erste
Eluat (50 ml) enthielt kein Kanamycin. Das zweite Eluat (60 ml) wurde eingedampft, wobei 364 mg Ka- namycinhydrochlorid erhalten werden. Die Aktivität dieses Pulvers betrug 720 y/mg. Das dritte Eluat (46 ml) lieferte 381 mg Kanamycinhydrochlorid in Pulverform.

   Die Aktivität dieses Pulvers betrug   616&gamma;/mg.   Aus dem vierten Eluat (55 ml) wurden 1, 873 mg weisses Kanamycinhydrochlorid mit einer Ak- tivität von 483   y/mg"rhalten.   Das fünfte Eluat (55 ml) ergab 956, 6 mg als weisses Pulver mit einer Ak- tivität von   410 y/mg. Alle   hiebei erhaltenen Feststoffe   wäre ?   farblos. 



   Beispiel 9: S.kanamyceticus wurde in einem Medium, welches 1.   eo     Stärke, l, 5%   Sojabohnen- mehl und   0. 30/0 Natriumchlorid   (der Anfangs-pH-Wert betrug 7,0) bei   2SoC4   Tage einer Schüttelkultur i unterworfen. Die in 25 Kolben gezüchteten Kulturen wurden vereinigt und filtriert. Der pH-Wert des
Piltrats betrug 8, 2 und das Filtrat enthielt 400 y Kanamycin/ml. Das Filtrat (3100 ml) wurde durch eine mit IRC-50 Harz beschickte Kolonne geführt. Die Kolonne enthielt 100 ml des Harzes in Form des Na- triumsalzes bei pH 8, 0. Nach der Absorption wurde die Kolonne mit 500 ml Wasser gewaschen und das adsorbierte Kanamycin wurde mit   In-HCl   eluiert, wobei das ausfliessende Medium in Mengen zu je 20 ml aufgefangen wurde. Die wirksamen Anteile waren in der   4. - 9.

   Teilmenge enthalten.   Diese Teilen- gen wurden vereinigt und der pH-Wert wurde auf 6, 0 eingestellt. Die Lösung wurde durch Eindampfen im
Vakuum auf 12 ml konzentriert und die unlöslichen Verunreinigungen wurden abfiltriert. Dieser Lösung wurde eine gesättigte Lösung von Ammoniumreinekat zugesetzt. Die Fällung, welche sich zuerst abschied und eine schwach rosa Farbe aufwies, wog 50 mg, enthielt Kanamycin und wurde abgetrennt. Zu der ver- ; bleibenden Flüssigkeit wurde die restliche   Ammoniumreinekat-Lösung   solange zugesetzt, bis sich keine
Fällung mehr bildete. Die rosa Fällung wurde abgetrennt, getrocknet und ergab 544 mg Kanamycinrein- 

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 ekat.

   Etwa 30% der Aktivität verblieben in der überstehenden   Lösung.   Diese Fällung wurde zu destilliertem Wasser (12 ml) gegeben, worauf auf   600C   erwärmt und filtriert wurde. Das Filtratwurde abgekühlt und Kristalle des Kanamycinreinekat wurden abgetrennt. Zu der   Mutterlauge wurde Kanamycinreiuekat,   das sich   nichtaufgelösthatte, zugesetztundworauf   wieder auf   600C   erwärmt wurde. Nach Abkühlung wurde ein zweiter Anteil von kristallisiertem Kanamycinreinekat abgetrennt. Diese Verfahrensweise wurde noch 3 mal wiederholt. Auf diese Weise wurden 300 mg Kanamycinreinekat isoliert.

   Das kristallisierte Reinekat   (140mg) wurdezu 105 ml destilliertem Wasser zugesetzt, worauf2, 5   n Salzsäure in Pyridin tropfenweise solange zugesetztwurde. bis sich keine Fällung mehr bildete. Die Fällung wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, einer Gefriertrocknung unterworfen und mit Aceton gewaschen. Dabei wurden 60 mg Kanamycinhydrochlorid als hygroskopischer weisser Festkörper erhalten. 



     Beispiel 0 : l gKanamycinhydrochlorid   mit   einer Aktivität   von 450 y/mg, welche nach einem Verfahren gemäss Beispiel 5 erhalten worden waren, wurden in 11 destilliertem Wasser aufgelöst, worauf der pH-Wert auf 6, 4 eingestellt wurde. Die Lösung wurde über eine Kolonne mit 75 ml IRC-50 Harz in der Natriumsalzform bei pH 6, 4 und einer Fliessgeschwindigkeit von 10   ml/Min.   geleitet. Nachdem die Kolonne mit 50 ml Wasser gewaschen worden war, wurde das adsorbierte Kanamycin mit   5% igem   Ammoniumhydroxyd eluiert. Das erste Eluat (80 ml) zeigte keine Aktivität und das weitere Eluat (130 ml) enthielt Kanamycin. Der pH-Wert dieses Eluats war höher als 10,0. Es wurde im Vakuum bei etwa   40 C   auf 22 ml eingedampft.

   Die Ausbeute betrug in dieser konzentrierten Lösung 97,   8%.   Diese konzentrierte Lösung wurde über eine Kolonne geleitet, die 20 g Aktivkohle   (100 - 250   Maschen) enthielt. Der Durchmesser der Kolonne betrug 2 cm. Die Kolonne wurde mit 160 ml destilliertem Wasser gewaschen und chromatographisch mit 0, 5   nHSO entwickelt.   Die abfliessende Flüssigkeit wurde in Teilmengen zu je etwa 20 ml aufgefangen. Das Kanamycinsulfat trat von der 5. Teilmenge an auf. Die ersten vier Teilmengen zeigten einen pH-Wert von   6, 2   bis 6, 4 und enthielten kein Kanamycin. Praktisch alles Kanamycin war in den Teilmengen   5-8 enthalten u. zw. :   Teilmenge 5 umfasste 22, 0 ml, zeigte ein pH   von 8, 2 und   eine Aktivität von 16, 9 mg/ml.

   Die sechste Teilmenge betrug 23, 0 ml, wies einen pH-Wert von 8, 6 und eine Aktivität von   65, 3 mg/ml auf.   Die siebente Teilmenge umfasste 20 ml vom pH 8, 6 bei einer Aktivität von 55, 0 mg/ml. Die achte Teilmenge wies einen pH von 4, 6 auf, stellte 22,0 ml dar und hatte eine Aktivität von   47, 5 mg/ml.   Die neunte Teilmenge zeigte ein pH = 1, 0, eine Aktivität von 4, 2 mg/ml und umfasste 22,0 ml. Zur sechsten Teilmenge wurden 23 ml Methanol zugesetzt, wobei kristallisiertes Kanamycinsulfat gefällt wurde. Nach Abfiltrieren und Trocknen wurden   1. 39   g des kristallisierten Sulfates erhalten. 1, 2 g dieses kristallisierten Sulfates wurden in 8 ml Wasser gelöst und auf   450C   erwärmt, worauf 6. 5 ml Methanol unter Rühren und Kühlen zugesetzt wurden.

   Dann wurden 1, 07 g Kanamycin gefällt und in kristallisierter Form erhalten. Unter dem Mikroskop zeigten sich farblose flache Kristalle. 
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Falls es für spezielle Zwecke gewünscht werden sollte und pharmazeutische Verträglichkeit gegeben ist, können die nach dem Verfahren gemäss der Erfindung hergestellten Verbindungen mit andern Arzneistoffen, wie Antihistaminen, Sulfonamiden, Stimulantien, Lokalanästhetika, Analgetika, Laxativa, Sedativa. Penicillinsalzen und andere antibiotische Stoffe, wie einem Streptomycin- oder Tetracyklin-Antibiotikum, Vitaminen, Hormonen und Pilzbekämpfungsmitteln vermischt werden. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Kanamycin, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Streptomyces kanamyceticus   110V.   spec. ATCC 12853 unter submersen, aeroben Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium, vorzugsweise 3 bis 5 Tage bei einer Temperatur im Bereich zwischen etwa 27 bis   32 C,   züchtet und das Antibiotikum aus der Kulturflüssigkeit isoliert.
Claims

2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Stärke und Sojabohnenmehl enthaltendes Nährmedium, vorzugsweise mit einem Gehalt von etwa 2% Stärke und etwa 1, 2% Sojabohnenmehl, verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum aus der Kulturflüssigkeit durch Extraktion mit Butanol in Gegenwart eines Trägers, wie Laurin-oder Stearinsäure, isoliert. <Desc/Clms Page number 10>

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum aus der Kulturflüssigkeit durch Adsorption an einem Kationenaustauscherharz, vorzugsweise einem Harz vom Karbonsäuretyp, wie einem Copolymer aus Methacrylsäure und Divinylbenzol, isoliert.