DE1108381B - Herstellung und Gewinnung von Glumamycin - Google Patents

Description

• Herstellung und Gewinnung von Glumamycin Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines neuen Antibiotikums, dem die Bezeichnung »Glumamycin« gegeben wurde, durch Fermentation von geeigneten Mikroorganismen.
• Es wurde festgestellt, daß die Mikroorganismen, die das Antibiotikum aerob fermentativ zu erzeugen vermögen, zu einer Art der Gattung Streptomyces gehören.
• Das im Nährmedium angereicherte Antibiotikum kann unter Ausnutzung seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften aus der Fermentationsflüssigkeit abgetrennt werden.
• Das Antibiotikum hat eine starke antibakterielle Wirkung gegen pathogene grampositive Bakterien. Die Stämme, die sich für das Verfahren gemäß der Erfindung eignen, d. h. Glumamycin zu erzeugen vermögen, gehören ebenfalls zur Gattung Streptomyces. Beispielsweise kann vorteilhaft der als Stamm Nr. 7548 bezeichnete Mikroorganismus (oder ein ähnlicher Stamm oder seine Mutanten oder Varianten) verwendet werden, der von den Erfindern aus dem Erdboden im Bezirk Mishima, Osaka (Japan), isoliert wurde und folgende mikrobische Merkmale aufweist: A. Morphologische Merkmale Luftmycel: Gerade sporentragende Hyphen, gelegentlich blütenförmig.
• Conidien 1,2 bis 1,8 - 1,0 bis 0,8 #t.
• B. Eigenschaften der Kulturen Bei den nachstehenden Merkmalen liegt den mit »Rdg.« gekennzeichneten Farbbezeichnungen die Ridgways Color Standard and Nomenclature zugrunde.

  1. Czapek-Glukose-Agar

  Wachstum .......... cremefarbig, gefalten

  Luftmycel . . . .. . . . . . weiß bis rauchgrau

  (Rdg. XLVI-21 "", d)

  Lösliches Pigment ... cremefarbig

  (Rdg. XVI-19', f)

  2. Czapek-Glycerin-Agar

  Wachstum .......... cremefarbig,gefalten,dick

  Luftmycel . . . . . . . . . . weiß, später hellgräulich-

  oliv (Rdg. XLVI-21"", b)

  Lösliches Pigment ... cremefarbig

  (Rdg. XVI-19', f)

  bis hellgrüngelb

  (Rdg. V-29, d)

  3. Czapek-Agar

  Wachstum . . . . . . . . . . dünn, gefalten

  Luftmycel .......... nicht vorhanden oder

  spärlich, weiß

  Lösliches Pigment ... nicht vorhanden

  4. Hefeextrakt-Agar

  Wachstum ... .. .. .. . bräunlich, runzelig

  Luftmycel .......... spärlich, weiß bis rauch-

  grau (Rdg. XVI-21"", d)

  Lösliches Pigment. ... braun

  5. Gelatine . . . . . . . . . . . . Langsame Verflüssigung

  6. Stärke-Agar

  Wachstum . . . . . . . . . . farblos, dringt tief in das

  Medium ein

  Luftmycel .......... weiß

  Lösliches Pigment ... nicht vorhanden

  7. Caleiummalat-Agar

  Wachstum .......... farblos, flechtenartig

  Luftmycel .......... weiß

  Lösliches Pigment ... nicht vorhanden

  B. Tyrosinat-Agar

  Wachstum .......... farblos, dünn

  Luftmycel . . . . . . . . . . nicht vorhanden

  Lösliches Pigment .... nicht vorhanden

  9. Kartoffelbrei

  Wachstum .......... cremefarbig

  Luftmycel .......... weiß bis rauchgrau

  (Rdg. XLVI-21"", d)

  Lösliches Pigment ... rings um das Wachstum

  bräunlich-schwarz

  10. Möhrenbrei

  Wachstum .. .. . . .... farblose Kolonien

  Luftmycel . . . . . . . . . . nicht vorhanden oder

  spärlich, rauchgrau

  (Rdg. XLVI-21 "", d)

  Lösliches Pigment ... keine Pigmentierung

  11. Milch

  Wachstum . . .. . .. . . . bräunlich, ringförmig

  Milch ....... . ...... langsame Peptonisierung,

  keine Koagulierung

  12. Ei

  Wachstum .......... rings um das Wachstum

  dunkelbraun

  Luftmycel .......... hellgräulicholiv

  (Rdg. XLVI-21 "", b)

  13. Glukose-Asparagin-Agar

  Wachstum .......... farblos

  Luftmycel .......... weiß, mit »Tilleul«-haut-

  farbigen Flecken

  (Rdg. XL-17"', f)

  Lösliches Pigment ... nicht vorhanden

  Rückseite ........... cremefarbig

  14. Nähr-Agar

  Wachstum .......... farblos

  Luftmycel .......... weiß

  Lösliches Pigment ... schwachbraun

  15. Glycerin-Nähragar

  Wachstum .......... farblos, faltig

  Luftmycel . . . . . . . .. . spärlich, weiß

  Lösliches Pigment ... braun

  16. Glukose-Nähragar

  Wachstum . . . . . . . . . . farblos bis hellhautfarbig

  (Rdg. XV-1T, f)

  Luftmycel . .. . .. . .. . spärlich, weiß

  Lösliches Pigment ... braun

  17. Nitratreduktion ..... Reduktion

  18. Cellulose ........... kein Wachstum

  19. Stärketeller ......... Hydrolyse, 32mm/12mm

  C. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen, festgestellt nach der Pridhamschen Methode

  D-Glukose ..... -@- D-Xylose ....... -f-

  Rhamnose ..... i-- L-Arabinose .... -

  D-Fructose ..... - D-Galactose .... -f-

  Saccharose ..... - Maltose ....... -!-

  Lactose . . . . . . . . ;- Laffinose ..... . -

  Inulin . . . . . . . . . D-Mannit .... . . -

  D-Sorbit ....... - Dulcit . ... ..... -

  Inosit ......... - Salicin . ... ... .. -f-

  Natriumacetat .. -f- Natriumcitrat .. -1-

  Natriumsuccinat -I- Kontrolle ...... -

  Bemerkungen: -f- = Wachstum,

  - = kein Wachstum.

  Nach Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage (1957), ergibt sich aus der Betrachtung der vorstehend genannten Eigenschaften, daß der Stamm Nr. 7548 mesophil ist, ein braunes bis blaßbraunes lösliches Pigment auf organischen Medien erzeugt, sein Luftmycel grau ist und gerade Sporophoren hat, so daß der Stamm Nr. 7548 verhältnismäßig nahe Ähnlichkeit mit Streptomyces tanashiensis zu haben scheint. Der Stamm Nr.7548 hat jedoch gerades oder blütenförmiges Luftmycel, bildet einen bräunlichen Ring auf Milch und reduziert Nitrate im Gegensatz zu Streptomyces tanashiensis, der fast gerades Hyphae und leicht offene Spiralen hat, einen gelblichen Ring auf Milch bildet und Nitrate nicht reduziert. Das durch den Stamm Nr.7548 erzeugte Antibiotikum Glumamycin scheint dem Amphomycin und Zaomycin zu ähneln, die bekannte Antibiotika sind. Der Stamm Nr. 7548 unterscheidet sich jedoch vom Amphomycin erzeugenden Stamm, der eine Spirale aufweist, nicht nur durch das Fehlen der Spiralform, sondern auch in einigen Wachstumseigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien. Es besteht kein Unterschied in den morphologischen Eigenschaften zwischen Stamm Nr. 7548 und dem Zaomycin erzeugenden Streptomyces zaomyceticus. Der erstere scheint mit dem letzteren insgesamt in den Zucht-und Wachstumseigenschaften auf Kulturmedien übereinzustimmen, außer daß dem ersteren die Fähigkeit der Koagulierung von Milch und der Bildung von goldgelbem löslichem Pigment fehlt.
• Unter Berücksichtigung der vorgenannten Eigenschaften des Stamms Nr.7548 und der zwischen ihren Mikroorganismen festgestellten Unterschiede wird angenommen, daß der Stamm Nr.7548 eine Variante von Streptomyces zaomyceticus ist.
• Es kann natürlich gesagt werden, daß die Eigenschaften von Mikroorganismen, die zu Actinomycetes, insbesondere zu genus Streptomyces gehören, auf Zuchtmedien weder feststehen noch unveränderlich sind. Die das Glumamycin erzeugenden Stämme sind keine Ausnahme. Beispielsweise ist es möglich, daß ein Glumamycin erzeugender Stamm, z. B. Stamm Nr. 7548, sein Aussehen auf Zuchtmedien als Folge natürlicher oder künstlicher Variation oder Mutation, hervorgerufen beispielsweise durch Röntgenbestrahlung oder UV-Bestrahlung oder Einwirkung von chemischen Reagenzien, verändert. Es ist somit selbstverständlich, daß die Variante oder der Mutant vom Stamm Nr. 7548 im Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden kann, solange er die Fähigkeit zur Bildung von Glumamycin behält.
• Im Verfahren gemäß der Erfindung wird ein Glumamycin erzeugender Stamm, der zu genus Streptomyces gehört, auf oder in einem wäßrigen Medium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und digerierbare Stickstoffquellen enthält, bebrütet. Als Kohlenstoffquellen können Stärke, Glukose, Lactose, Maltose usw. verwendet werden. Als Stickstoffquellen eignen sich Pepton, Fleischextrakte, Weizenkleie, Reiskleie, Sojabohnenpulver, Mais-Extraktionsflüssigkeit, Kasein, Hefe, Aminosäuren, Ammoniumsalze, Harnstoff usw. Ferner können übliche anorganische Salze, z. B. Natriumchlorid, Phosphate, Salze von Calcium, Zink, Mangan, Magnesium usw., und/oder Wachstumsbeschleuniger dem Medium in geringer Menge zugesetzt werden. Gegebenenfalls können auch andere übliche Nährstoffe oder deren Vorstufen zugegeben werden. Das Inkubationsmedium kann flüssig oder fest sein, jedoch ist für industrielle Zwecke ein flüssiges Medium besser geeignet. Mit am vorteilhaftesten ist die submerse Kultur.
• Unter aeroben Bedingungen in submerser Kultur wird die Inkubation vorzugsweise 2 bis 5 Tage bei 25 bis 35' C vorgenommen, wobei der pH-Wert des Mediums auf 6 bis 8 eingestellt wird, jedoch können diese Bedingungen natürlich in Abhängigkeit von den anderen Bedingungen oder der jeweiligen Art des verwendeten Mikroorganismus gewählt werden. Am zweckmäßigsten liegt der pH-Wert im neutralen Bereich, die Temperatur bei etwa 28 bis 30' C und die Inkubationsdauer bei 2 bis 5 Tagen. Diese Bedingungen sind jedoch nicht endgültig und so zu wählen oder einzustellen, daß die besten Resultate erzielt werden.
• Glumamycin gehört zu den Antibiotika vom Peptid-Typ, die in zwei Gruppen eingeteilt werden können: Antibiotika, die nur aus Aminosäuren bestehen, und solche, die aus Aminosäuren und anderen Bestandteilen bestehen. Glumamycin, eine saure Substanz, gehört zu der letztgenannten Gruppe, die Antibiotika vom Peptid-Typ, wie Actinomycin, Ethiomycin, Etamycin usw., umfaßt, die durch Mikroorganismen der Gattung Actinomycetes erzeugt werden.
• Glumamycin kann aus seiner wäßrigen Lösung in eine alkoholische Lösung, z. B. in n-Butanol, sekundärem Butanol, Isoamylalkohol usw., bei einem pH im sauren Bereich übergeführt und bei einem pH-Wert im neutralen oder alkalischen Bereich wieder in die wäßrige Lösung zurückgebracht werden. Es kann aus der Brühe bei einem pH-Wert von etwa 2 bis 4 durch Schütteln mit einem der genannten Alkohole abgetrennt und bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 9 in eine wäßrige Lösung übergeführt werden.
• Da Glumamycin eine ziemlich hochmolekulare Verbindung ist, kann es nach Methoden gereinigt werden, die allgemein zur Trennung einer hochmolekularen Verbindung von Verunreinigungen angewendet werden. Beispielsweise kann es durch Sättigung mit einem anorganischen Salz, wie Ammoniumsulfat, aus seiner wäßrigen Lösung ausgefällt werden. Da Glumamycin aus seiner wäßrigen Lösung auch beim isoelektrischen Punkt ausfällt, läßt es sich durch Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf etwa 3,0 bis 3,5, dem isoelektrischen Punkt, von der Lösung abtrennen. Da Glumamycin eine halbdurchlässige Scheidewand, wie regenerierte Cellulose oder eine Harnblase, nicht durchdringt, können niedrigmolekulare Verunreinigungen in einem Glumamycin enthaltenden wäßrigen Gemisch durch Dialyse in laufendem Wasser unter Verwendung einer halbdurchlässigen Scheidewand entfernt werden. Elektrolytische Dialyse unter Verwendung von Ionenaustauschmembranen kann ebenfalls zur Entfernung der Ionen von anorganischen Verunreinigungen aus einer Lösung von rohem Glumamycin angewendet werden. Glumamycin läßt sich von seinen Verunreinigungen, wie Farbstoffen, mit Hilfe der Adsorptionschromatographie wirksam trennen, wobei der Unterschied in der Adsorbierbarkeit an Adsorbenzien zwischen Glumamycin und den Verunreinigungen ausgenutzt wird. Bei dieser Behandlung können Silicate und Aktivkohle als Adsorbenzien verwendet werden, während die Verunreinigungen durch Eluieren mit Alkoholen, z. B. Butanol, Äthanol, Methanol usw., aus den Adsorbenzien entfernt werden können. Diese Alkohole sind zur Eluierung besonders geeignet, wenn sie etwas Wasser enthalten. Ionisierte Verunreinigungen, die in rohem Glumamycin oder in einer Glumamycin enthaltenden wäßrigen Mischung vorhanden sind, können durch Verwendung von Ionenaustauschern entfernt werden. Das wäßrige Gemisch, das Glumamycin und die Verunreinigungen enthält, wird mit einem sauren Ionenaustauscher und einem basischen Ionenaustauscher in Berührung gebracht, d. h., man läßt die Mischung durch eine Säule oder eine Schicht jedes der Ionenaustauscher laufen oder rührt sie zusammen mit den Ionenaustauschern. Hierbei kann es zweckmäßig sein, Ionenaustauscher von verhältnismäßig großer Teilchengröße (etwa 150 bis 420 ,u) und ziemlich hohem Adsorptionsvermögen zu verwenden. Für die Zwecke der Erfindung geeignete handelsübliche Ionenaustauscher sind die zur Carbonsäurereihe gehörenden Harze vom schwach sauren Typ, z. B. »Amberlite IRC-50«, und die zur quaternären Ammoniumreihe gehörenden stark basischen Harze, wie »Amberlite IR-400«.
• Glumamycin kann als Adduktverbindung durch Zusatz eines Schwermetallsalzes, wie Bleiacatat, aus seiner wäßrigen Lösung ausgefällt werden. Es kann also von Verunreinigungen getrennt werden, indem eine wäßrige Lösung eines solchen Schwermetallsalzes zu einer wäßrigen Lösung des Glumamycins gegeben wird, wobei das Salz des Glumamycins ausfällt, und dann das Schwermetall aus dem Salz entfernt wird, wobei praktisch reines Glumamycin erhalten wird. Hierbei wird der Niederschlag des Schwermetallsalzes von Glumamycin mit Wasser gewaschen und dann in Wasser suspendiert, Schwefelwasserstoff in die Suspension eingeführt, um das Schwermetall auszufällen, der Niederschlag durch Filtration gewonnen und mit einer wäßrigen Lösung eines schwachen Alkalis, wie Natriumcarbonat, gewaschen, worauf aus der Waschflüssigkeit und dem Filtrat das Glumamycin mit einem organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol, sekundärem Butanol usw., extrahiert wird.
• Das auf diese Weise erhaltene blaßgelbe Pulver stellt rohes Glumamycin dar, das noch einige Verunreinigungen enthält.
• Das Pulver kann beispielsweise durch Gegenstromverteilung wirksam gereinigt werden, insbesondere durch Verteilung zwischen zwei Schichten, die gebildet werden durch Zusatz von Wasser, einer verdünnten Mineralsäure oder einer Pufferlösung zu einer Mischung eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels, wie n-Butanol, sekundärem Butanol, Äthylacetat, Benzol, Chloroform usw., mit einem Lösungsmittel, das leicht mit Wasser mischbar ist und Glumamycin zu lösen vermag, wie Methanol, Äthanol usw. Günstig zur Verteilung des rohen Glumamycins ist beispielsweise das Lösungsmittelsystem (2:2:1) oder sekundärem Butanol-Äthylacetat-Methanol-'/"ö n-Salzsäure (2: 8 : 3 : 7). Das auf diese Weise aus dem die theoretische Kurve zeigenden Teil erhaltene Glumamycin ist fast rein. In Fig. 2 ist als Beispiel ein Gegenstromverteilungsdiagramm von Glumamycin dargestellt, das erhalten wurde, indem 5 g Glumamycin in eine Gegenstromverteilungsapparatur gegeben wurden, die mit 300 Stufen von Rohren versehen war, und bei der die obere und untere Schicht eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform, Methanol und '/SO n-Salzsäure im Volumenverhältnis 2: 2: 1 verwendet wurde.
• Das auf diese Weise isolierte Glumamycin ist ein farbloses kristallines Pulver 'und stellt ein saures Peptid dar, dessen isoelektrischer Punkt bei einem pH-Wert von etwa 3,0 bis 3,5 liegt. Sowohl die freie Säure als auch das Natriumsalz sind positiv bei der Ninhydrin-Reaktion und negativ in der Sakaguchi-und Molish-Reaktion.
• Glumamycin zerfällt bei 230° C und hat eine spezifische Drehung [x]ö -- -f- 8,0° (c = 2% in Äthanol) und maximale Absorptionen bei Wellenlängen von 3,0, 3,4, 5,7, 6,0, 6,5, 6,9, 7,2 und 8,2 ,u. Das Infrarotspektrum (in der Kaliumbromidscheibe) ist in Fig. 1 dargestellt. Glumamycin besteht aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Sauerstoff= und Stickstoffatomen. Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C = 54,61%, H = 7,25 0/0, N = 13,60 0/0. Glumamycin ist in Wasser nicht leicht löslich, aber in alkalischem Wasser, niederen Alkoholen, wie Methanol, Äthanol usw., mittleren Alkoholen, wie n-Butanol, Isoamylalkohol usw., leicht löslich, wenn sie Wasser enthalten, schwerlöslich in Aceton und unlöslich in Alkylacetaten, Chloroform, Benzol usw.
• Zu einem Teil Glumamycin wird die 3fache Gewichtsmenge an 6normaler wäßriger Salzsäure gegeben. Die Mischung wird 24 Stunden bei 110° C gehalten, wobei sich ein öliges Material abscheidet, das mit Äther extrahiert wird. Das extrahierte ölige Material ist eine saure Substanz, die einen charakteristischen Geruch hat und bei 139° C/1 mm Hg siedet. Ihre Elementaranalysenwerte sind 73,59 % C, 11,39 % H. Das ölige Material wird mit S-Benzylthiuroniumchlorid behandelt, wobei sein S-Benzylthiuroniumsalz in Form von farblosen Plättchen mit Schmelzpunkt 131' C entsteht. Die Elementaranalyse dieses S-Benzylthuironiumsalzes ergibt folgende Werte: C = 66,370/0 H = 8,940/0 N = 7,130/0, S = 8,610/0. Diese Werte stimmen gut mit der Formel C"H"N@SOz überein, so daß gefolgert wird, daß das ölige Material eine ungesättigte aliphatische Säure ist, die eine Doppelbindung enthält und die Bruttoformel C13$2402 hat. Durch Oxydation mit Ozon wird die Säure als 3-Isotridecensäure erkannt. In der Mutterlauge der Ätherextraktion verbleiben Aminosäure, die einen Teil des Glumamycins bilden. Bei der Papierteilungschromatographie ergaben sich Flecke von Asparaginsäure, Prolin, Glycin, Valin, ß-Methylasparaginsäure, D-Pipecolinsäure und a,ß-Diaminobutylsäure. Die x,ß-Diaminobutylsäure wurde gereinigt und hatte einen Zersetzungspunkt von 202° C und folgende Elementaranalysenwerte: C = 31,390/0 H = 7,300/0,N = 17,640/0 Das antibakterielle Spektrum von Streptomyces zaomyceticus Nr. 7548 auf Medien, wie Bouillon-Agar, Glycerin-Agar, nach der Querstreifenmethode zeigt, daß der Mikroorganismus gegen grampositive Bakterien wirksam ist. Eine Prüfung der antimikrobischen Wirksamkeit auf Scheiben von Bouillon-Agar- und Glycerin-Agar-Kulturen bei pH-Werten von 6,0 und 8,0 zeigt, daß der Stamm bei einem pH-Wert von 8 wirksamer ist als bei einem pH-Wert von 6. In Zusammenfassung dieser Feststellungen kann gesagt werden, daß Glumamycin physiologisch eine basische Substanz ist, die hauptsächlich gegen grampositive Bakterien wirksam ist.
• In der folgenden Tabelle 1 sind die Werte des antimikrobischen Spektrums für jede Bakterie als Breite der Wachstumshemmungszone an den Kulturen in Millimetern angegeben.

  Tabelle 1

  Bakterien Kulturmedium

  I Bouillon-Agar I Glycerin-Agar

  Escherichia coli . . . . . . . . 0 0 0 0

  Proteus vulgaris . . . . . . . . . 0 0 0 i 0

  Staphylococcus aureus ... 0 0 14 i 15

  Bacillus cereus . . . . . . . . . 22 20 25 26

  Bacillus subtilis . . . . . . . . 0 0 23 23

  Pseudomonas aerginosa .. 9 10 - -

  Serratia marcescens ...... 0 : 0 - -

  Mycobacterium ATCC-607 - - 0 0

  Mycobacterium avium 0 , 0

  Das antibakterielle Spektrum von Glumamycin ist in Tabelle 2 angegeben. Es ist festzustellen, daß Glumamycin das Wachstum von grampositiven Bakterien verhindert, aber das Wachstum von gramnegativen Bakterien, säurefesten Bakterien, Fungi und Hefen kaum verhindert.

  Tabelle 2

  Mindestkonzentration

  zur Hemmung des

  Wachstums,

  Mikrogramm

  je Kubikzentimeter

  Escherichia coli .................. >100

  Proteus vulgaris .................. >l00

  Staphylococcus aureus 209 P ....... 1,0

  Bacillus subtilis PCI 219 ... . . . . .. . . 0,5

  Bacillus cereus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0

  Micrococcus flavus . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5

  Mycobacterium avium, resistent

  gegen Streptomycin ............. > 100

  Mycobacterium avium . . . . . . . . . . . . . >l00

  Mycobacterium 607 . . . . . . . . . . . . . . . >l00

  Aspergillus niger . . . . . . . . . . . . . . . . . . > 100

  Penicillium notatum . . . . . . . . . . . . . . . > 100

  Candida albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . > 100

  Sowohl freies Glumamycin als auch sein Magnesiumsalz zeigen etwa 1000 bis 1500 Einheiten je Milligramm gegen Staphylococcus aureus nach der Waksmanschen Verdünnungsmethode.
• Die Toxizität von Glumamycin ist LDSO = 500 mg/kg für Mäuse bei intraperitonealer Injektion.
• Auf Grund der obengenannten Eigenschaften von Glumamycin können Amphomycin und Zaomycin als die bekannten Antibiotika angesehen werden, die dem Glumamycin ähnlich sind. Die bekannten Mittel sind beide saure Antibiotika vom Peptid-Typ, ohne daß jedoch ihre chemische Struktur geklärt ist. Da jedoch deutlich die nachstehend angegebenen Unterschiede zwischen Glumamycin und den beiden bekannten Antibiotika festgestellt werden, ist zu folgern, daß Glumamycin ein neues Antibiotikum ist, das sich von allen bekannten Antibiotika unterscheidet.
• 1. Die Methode des zusammengefaßten Papierchromatogramms, beschrieben von Kuroya und Mitarbeitern in Journal of Antibiotics, Series A, 7, S. 134 bis 136, wurde auf Glumamycin und Zaomycin unter den gleichen Bedingungen angewandt. Das Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt, wo die Buchstaben A bis H die folgenden Entwickler bedeuten: A =Mit Wasser gesättigtes n-Butanol.
• B = 20%ige wäßrige Ammoniumchloridlösung. C = 50%ige wäßrige Phenollösung.
• D = 50%ige wäßrige Acetonlösung.
• E = Mischung aus 40 Volumteilen n-Butanol, 10 Volumteilen Methanol, 20 Volumteilen Wasser und 1,5 Gewichtsteilen Methylorange.
• F = Mischung aus n-Butanol, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis 4: 1 : 2.
• G = Mischung von Benzol und Methanol, Volumenverhältnis 4: 1.
• H = Destilliertes Wasser.
• 1 bedeutet das Chromatogramm des Zaomycins und 2 das des Glumamycins.
• Bei Verwendung der Entwickler A, B und D sind deutliche Unterschiede zwischen Glumamycin und Zaomycin festzustellen.
• 2. Es wurde berichtet, daß Zaomycin bei der Ninhydrin-Reaktion positiv ist und Amphomycin bei der Ninhydrin-Reaktion negativ ist. Glumamycin wird hingegen bei der Ninhydrin-Reaktion nur schwach gefärbt, wenn die Probe rein ist. Dies kann ein Merkmal sein, nach dem Glumamycin von Amphomycin zu unterscheiden ist.
• 3. B. H e i n e m a n n und Mitarbeiter berichteten (Antibiotics and Chemotherapy, 3, S. 1239 [1953]), daß das Natriumsalz von Amphomycin mit Calciumchlorid in Wasser reagiert, wobei das Calciumsalz von Amphomycin, das wasserlöslich ist, gebildet wird. Dagegen bildet Glumamycin mit Calciumchlorid kein wasserlösliches Calciumsalz.
• 4. Giovanni Giolitti und Mitarbeiter berichteten nach der Untersuchung eines Antibiotikums vom Polypeptid-Typ, das durch einen zu genus Streptomyces gehörenden Stamm erzeugt wurde (Giornaly di Microbiologia, 3, S. 70 bis 80 [1957]), daß das Antibiotikum als Amphomycin selbst angesehen wird und aus Asparaginsäure, Glycin, Valin, Prolin und einer unbekannten Aminosäure besteht. Dagegen besteht Glumamycin, wie bereits obenerwähnt, aus Asparaginsäure, Glycin, Valin, Prolin, ß-Methylasparaginsäure, D-Pipecolinsäure, ca,ß-Diaminobutylsäure und der vorstehend erwähnten 3-Isotridecensäure. Glumamycin unterscheidet sich also von dem von Giolitti erhaltenen Antibiotikum vom Polypeptid-Typ.
• Aus den Ergebnissen des obigen Vergleichs geht klar hervor, daß Glumamycin ein neues Antibiotikum ist, das sich von allen bekannten sauren Antibiotika vom Polypeptid-Typ, die dem Glumamycin ähneln, wie Zaomycin und Amphomycin, unterscheidet.
• Wie bereits erwähnt, hemmt Glumamycin sehr stark das Wachstum von grampositiven Bakterien. Nachstehend wird ein Versuch zur Ermittlung der Wirksamkeit von Glumamycin in vivo beschrieben. Als Versuchstiere dienten Mäuse und als Testmikroorganismus Pneumococcus, Typ I.
• Die verwendeten Mäuse wogen 16 bis 19 g. Eine frische Kultur von Pneumococcus wurde 8 Stunden bei 37°C in Glukose-Bouillon weiterbebrütet und dann mit Bouillon auf das 10fache, 100fache usw. verdünnt. Den Mäusen wurden je 0,25 cm3 der auf 10-5/fache Verdünnung gebrachten Kultur intraperitoneal injiziert (0,25 cm3 dieser Verdünnung entsprechen 10000MLD). Eine Stunde später wurde den Mäusen Glumamycin subkutan injiziert. Die Mäuse wurden eine Woche beobachtet. Das Herzblut der während dieser Woche eingegangenen Mäuse wurde inkubiert, um zu bestätigen, daß der Tod durch Pneumococcus, Typ I, verursacht worden war.

  Tabelle 3

  Injizierte Zahl der

  Inoculum-Größe Glumamycinmenge überlebenden/Zahl Prozentsatz der

  mg/Maus der verwendeten überlebenden Mäuse

  Mäuse

  0,8 5/5 100

  0,4 4/5 80

  10-5 0,2 0/5 0

  0,1 0/5 0

  0 0/5 0

  10-0 0 0/3 0

  Kontrolle zur Bestätigung 10-7 0 0/3 0

  der Wirksamkeit der Bakterien 10-8 0 0/3 0

  10-8 0 1/3 33

  Das Ergebnis des beschriebenen Versuchs zeigt, daß Glumamycin eine hohe antibakterielle Virulenz in vivo hat.
• In den folgenden Beispielen werden einige zur Zeit bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung beschrieben. Die genannten Einheiten der antimikrobischen Stoffe sind Verdünnungseinheiten, gemessen nach der Waksmanschen Verdünnungsmethode. Als Versuchsbakterien wurde Staphylococcus aureus verwendet.
• Beispiel 1 Ein Medium wird hergestellt, indem in einem Tank 5001 einer wäßrigen Mischung, bestehend aus 5,001, Stärke, 2,0% Reiskleie, 0,5% Pepton, 0,1% Soja bohnenöl und Wasser, durch Erhitzen sterilisiert werden. Dieses Medium wird mit einer Saatkultur von Streptomyces zaomyceticus Nr. 7548 geimpft und dann 90 Stunden bei 28'C bebrütet, um Glumamycin zu erzeugen. Die antimikrobische Wirksamkeit der Brühe entspricht etwa 350 Einheiten pro Kubikzentimeter.
• Die Brühe wird filtriert, wobei etwa 3301 Filtrat erhalten werden, in dem fast das gesamte gebildete Glumamycin enthalten ist.
• Kulturen von Streptomyces zaomyceticus Nr.7548 wurden dem Institute for Fermentation, Osaka, Japan (Eingangs-Nr.IFO-3856) und dem American Type Culture Collection, Washington, D. C. (Eingangs-Nr. ATCC-13876), zugestellt.
• Beispiel 2 Ein durch Zugabe von 0,20/0 Calciumcarbonat zu Stärke-Bouillon hergestelltes Medium wird mit Streptomyces zaomyceticus Nr.7548 geimpft und dann 6 Tage bei 28'C bebrütet, um Glumamycin in der Brühe anzureichern. Die antimikrobische Wirksamkeit der Brühe beträgt 350 Einheiten pro Kubikzentimeter. Beispiel 3 Ein Medium, das hergestellt wurde, indem die nachstehend angegebene Menge K2 H P O4 einer wäßrigen Mischung aus 3,0010 Stärke, 2,00/, Reiskleie, 1,00/, Pepton, 0,30/, Sojabohnenöl und Wasser zugegeben wurde, wird mit Streptomyces zaomyceticus Nr. 7548 geimpft und dann 6 Tage bei 28'C bebrütet, um Glumamycin in der Brühe anzureichern. Die Wechselbeziehung zwischen der Menge des zugesetzten K,HP04 und der antimikrobischen Wirksamkeit der Brühe ist folgende:

  K,HPO;-Menge Antimikrobische Wirksamkeit

  010 Einheiten pro Kubikzentimeter

  0 400

  0,2 1000

  0,3 800

  0,5 750

  Beispiel 4 Ein wäßriges Medium, das 5,001, Stärke, 0,30/0 Ammoniumchlorid, 0,3 % Ammoniumsulfat, 0,2 % Dikaliumphosphat, 0,2 % Natriumchlorid,1,0 % Calciumcarbonat, 0,20/, Sojaöl, 0,05 °/o Magnesiumphosphat, 0,0005°/o Zinksulfat, 0,0005°/o Mangansulfat, 0,001 % Ferrosulfat und 0,10/0 Glutaminsäure enthält, wird mit Streptomyces zaomyceticus Nr. 7548 geimpft und dann 5 Tage bei 28°C bebrütet, um Glumamycin in der Brühe zu sammeln. Die antimikrobische Wirksamkeit der Brühe entspricht 650 Einheiten je Kubikzentimeter.
• Wenn auf die gleiche Weise gearbeitet wird, jedoch unter Weglassen der Glutaminsäure, beträgt die antimikrobische Wirksamkeit der Zuchtbrühe 350 Einheiten je Kubikzentimeter.
• Beispiel 5 Streptomyces zaomyceticus Nr.7548 wird wie im Beispiel 1 bebrütet. Durch eine Filterpresse, die vorher mit 5 kg einer Filterhilfe überzogen worden war, werden 3501 der Brühe in Gegenwart von 10 kg der Filterhilfe gegeben, wobei 3001 Filtrat erhalten werden. Das Filtrat wird mit Salzsäure auf p$ 2,0 eingestellt und zweimal mit je 751 Isoamylalkohol extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird mit Wasser in einer Menge von einem Zehntel seines Volumens gewaschen und zuerst mit 151 einer wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat und dann zweimal mit je 41 einer 1°/oigen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird erneut mit Salzsäure auf einen pg 2,0 eingestellt und dann zweimal mit je 81 Isoamylalkohol extrahiert. Der vereinigte Isoamylalkoholauszug hat eine antimikrobische Wirksamkeit entsprechend 7500 Einheiten je Kubikzentimeter. Hieraus geht hervor, daß Glumamycin fast quantitativ aus der Brühe extrahiert worden war. Anschließend wird die Isoamylalkohollösung mit 21 einer wäßrigen gesättigten Natriumbicarbonatlösung und dann zweimal mit je 1,21 einer 1°/oigen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung extrahiert, wobei 5,51 eines schwärzlichbraunen Natriumbicarbonatauszuges erhalten werden, dessen antimikrobische Wirksamkeit 35000 Einheiten je Kubikzentimeter entspricht.
• 21 des auf diese Weise erhaltenen Extraktes werden auf ein p$ 2,0 eingestellt und zweimal mit je 300 cm3 n-Butanol extrahiert. Der Extrakt wird sorgfältig mit Wasser bis zu einem pH-Wert von 2,8 bis 3,0 gewaschen und dann mit einer Geschwindigkeit von 2 bis 3 cm/Std. durch eine mit Kohlepulver gefüllte Säule von 5 cm Durchmesser und 10 bis 15 cm Höhe gegeben. Die an der Kohle adsorbierten Stoffe werden mit n-Butanol eluiert. Das farblose bis blaßgelbe Eluat, das eine positive Biuret-Reaktion zeigt, wird aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Kondensat wird Äthylacetat zugegeben, wobei sich 32 g rohes Glumamycin als blaßgelber Niederschlag ausscheiden. Die Ausbeute beträgt 60 °/o, bezogen auf den schwärzlichbraunen Natriumbicarbonatextrakt, dessen Wirksamkeit 35000 Einheiten je Kubikzentimeter entspricht. Beispiel 6 11 eines schwärzlichbraunen Natriumbicarbonatauszuges, wie er im ersten Teil des im Beispiel s beschriebenen Versuches erhalten wurde, wird mit Salzsäure auf ein pg 2,0 eingestellt und dann zweimal mit je 300 cm3 Isoamylalkohol extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird mit Wasser chlorfrei gewaschen. Den gewaschenen Extrakt läßt man durch eine Säule laufen, die mit etwa 700 cm3 Magnesiumsilicat gefüllt ist (149 bis 297,u), um Farbstoffe zu entfernen. Anschließend wird mit Äthanol und Methanol eluiert.
• Das blaßgelbe Methanoleluat enthält etwa 70 bis 80 % Glumamycin, bezogen auf den Ausgangsextrakt, und wird unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Kondensat wird unter Rühren Äthylacetat zugegeben, wobei 10 g rohes Glumamycin als weißer Niederschlag erhalten werden, dessen antimikrobische Wirksamkeit 750 bis 1000 Einheiten entspricht. Die Ausbeute beträgt 30 bis 400/" bezogen auf Ausgangsextrakt.
• Beispiel 7 In 20 cm3 Methanol werden 5 g des gemäß Beispiel 5 erhaltenen blaßgelben rohen Glumamycins gelöst. Der Lösung werden 40 cm3 Äthylacetat zugegeben. Die Mischung wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei sich ein weißer kristalliner Niederschlag abscheidet.
• Der Niederschlag wird mit Äthylacetat und Aceton gewaschen und getrocknet, wobei 3,5 g gereinigtes Glumamycin als weißes kristallines Pulver anfallen, dessen antimikrobische Wirksamkeit 1000 bis 1500Einheiten entspricht. Die Ausbeute beträgt etwa 80 °/o, bezogen auf das blaßgelbe rohe Glumamycin.
• Beispiel 8 100 cm3 eines Isoamylalkoholauszuges (7500 Einheiten je Kubikzentimeter), erhalten im ersten Teil des im Beispiel s beschriebenen Versuchs, werden mit 200 cm3 Wasser geschüttelt, das mit Natriumhydroxyd auf p$ 8,4 bis 8,6 eingestellt ist, um die wirksame Substanz in die wäßrige Phase zu überführen. Man läßt die wäßrige Schicht durch je 30 cm3 »Amberlite IRC-50« und »Amberlite IR-400« laufen. Der Ablauf wird weiter durch »Amberlite IRC-50«c gegeben und auf ein p$ 6,0 eingestellt. Er wird dann unter vermindertem Druck auf etwa 10 cm3 eingeengt. Dem Konzentrat werden 50 cm3 Methanol zugegeben. Die Mischung läßt man durch eine Aktivkohlesäule von 1,5 cm Durchmesser und 15 cm Höhe laufen. Im Lebendversuch wirksame Fraktionen wurden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Erhalten werden 150 mg rohes Glumamycin als blaßgelbes Pulver, dessen Wirksamkeit 750 bis 1000 Einheiten je Milligramm entspricht. Die Ausbeute beträgt etwa 300/" bezogen auf den Isoamylalkoholauszug. Beispiel 9 Zu 500 cm3 eines schwärzlichbraunen Natriumbicarbonatextraktes wird langsam unter Rühren eine gesättigte wäßrige Bleiacetatlösung gegeben, bis sich kein Niederschlag mehr abscheidet. Der gelbe Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, gut mit Wasser gewaschen und dann in 500 cm' Wasser suspendiert. In die Suspension wird Schwefelwasserstoff geleitet, um das Blei als Bleisulfid niederzuschlagen. Die Lösung wird dann mit Natriumhydroxyd auf ein pH 9,0 eingestellt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und mit Wasser vom px 9,0 gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden mit dem Filtrat vereinigt. Die vereinigte Lösung wird mit Salzsäure auf pg 2,0 eingestellt und dann mit n-Butanol extrahiert, wobei eine blaßgelbe Lösung von Glumamycin in n-Butanol erhalten wird. Die Ausbeute beträgt 50 bis 70 °/o, bezogen auf den Ausgangsextrakt. Beispiel 10 100 cm3 einesNatriumbicarbonatextraktes (7500Einheiten je Kubikzentimeter), erhalten im ersten Teil des in Beispiel s beschriebenen Versuchs, werden mit Ammoniumsulfat gesättigt, wobei sich eine harzige Substanz niederschlägt. Der Niederschlag wird abfiltriert und der Dialyse durch eine Cellophanmembran in laufendem Wasser unterworfen. Die erhaltene Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 1 g rohes Glumamycin als braunes Pulver (500 Einheiten je Milligramm) erhalten wird. Die Ausbeute beträgt 66 °/o, bezogen auf den Ausgangsextrakt. Beispiel 11 1,5 g rohesGlumamycin(750 Einheiten jeMilligramm), erhalten auf die im Beispie15 beschriebene Weise, werden der Gegenstromverteilung mit 30 Stufen unterworfen, wobei je 10 cm3 eines Lösungsmittelsystems aus 2 Volumteilen sekundärem Butanol, 8 Teilen Äthylacetat, 3 Teilen Methanol und 2 Teilen Wasser als obere und untere Schicht verwendet wurden. Als Ergebnis der Bestimmung an jeder Stufe wird der Maximalwert bei der 20. Stufe festgestellt, von der 190 mg gereinigtes Glumamycin als amorphes weißes Pulver erhalten werden, dessen Wirksamkeit 750 Einheiten je Milligramm entspricht. Die Ausbeute beträgt etwa 40 °/o, bezogen auf das rohe Ausgangsmaterial. Beispiel 12 Zu 20 cm-' eines schwärzlichbraunen Isoamylalkoholauszuges (35000 Einheiten je Kubikzentimeter), erhalten im ersten Teil des im Beispiel 5 beschriebenen Versuchs, werden 0,2 g Aktivkohle gegeben. Die Mischung wird unter Rühren gefiltert. Dem hierbei erhaltenen braunen Filtrat werden 5 cm3 Wasser zugegeben. Die Mischung wird mit Natriumbicarbonat unter Rühren versetzt, bis der pH-Wert 7,0 beträgt. Die wäßrige Schicht wird von der Lösungsmittelschicht abgetrennt und die letztere mit 5 cm3 Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeit wird mit der obengenannten wäßrigen Schicht vereinigt und die Lösung mit Salzsäure auf pH 3,2 bis 3,4 eingestellt, wobei sich eine braune Substanz niederschlägt.
• Die oben stehende Lösung wird dekantiert und der Rest unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 0,9 g rohes Glumamycin als braunes Pulver erhalten wird, dessen antimikrobische Wirksamkeit 350 Einheiten je Milligramm entspricht. Die Ausbeute beträgt etwa 40 °/o, bezogen auf den eingesetzten Isoamylalkoholauszug. Beispiel 13 Zu 20 cm3 eines schwärzlichbraunen Isoamylalkoholauszuges (35000 Einheiten je Kubikzentimeter), erhalten im ersten Teil des in Beispiel 5 beschriebenen Versuchs, werden 0,2 g Aktivkohle gegeben. Die Mischung wird unter Rühren filtriert. Dem hierbei erhaltenen braunen Filtrat werden 5 cm3 Wasser zugegeben. Die Mischung wird unter Rühren mit Natriumbicarbonat versetzt, bis der pH-Wert 7,0 beträgt. Die wäßrige Schicht wird von der Lösungsmittelschicht abgetrennt und die Lösungsmittelschicht mit einer geringen Wassermenge gewaschen.
• Die Waschflüssigkeit wird mit der obengenannten wäßrigen Schicht vereinigt. Die erhaltene wäßrige Lösung wird der Dialyse durch eine Cellophanmembran in laufendem Wasser unterworfen. Durch die Dialyse werden dialysierbare niedrigmolekulare Substanzen entfernt, während hochmolekulare Substanzen, z. B. Peptide,sich niederschlagen.Dieerhaltene Mischung wird mit etwas Wasser versetzt und mit Salzsäure auf ein p$ 2,0 eingestellt, um den Niederschlag aufzulösen. Durch Gefriertrocknen werden aus der Lösung 0,5 g rohes Glumamycin als braunes Pulver erhalten, dessen Wirksamkeit 750 Einheiten je Milligramm entspricht. Die Ausbeute beträgt etwa 5001, bezogen auf den eingesetzten Extrakt.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verwendung von Streptomyceszaomyceticus (ATCC-13876 und hinterlegt beim Institut für Fermentation, Osaka, Japan) oder seiner natürlichen oder induzierten Mutanten oder Varianten zur Herstellung des Antibiotikums Glumamycin auf biologischem Wege unter den üblichen Bedingungen, vorzugsweise im submersen Verfahren, und Gewinnung des Antibiotikums durch bekannte Verfahren.