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Herstellung und Gewinnung von Zygomycinen Die Erfindung bezieht sich
auf die Herstellung von neuen antibiotisch wirksamen Verbindungen, und zwar einer
Gruppe von Antibiotika, denen die Bezeichnung Zygomycin A, Zygomycin B, Zygomycin
C und Zygomycin D gegeben wurde und die nachstehend unter der Bezeichnung »Zygomycine«
zusammengefaßt werden. Diese neuen Antibiotika wurden von den Erfindern aus einer
Kultur eines Mikroorganismus isoliert, der erstmalig von einer in Fukuchiyama City,
Japan, genommenen Bodenprobe abgetrennt und vorläufig als »Stamm Nr. 45 449« bezeichnet
wurde. Von diesem Stamm wurden die verschiedensten Mutanten abgeleitet, die die
Fähigkeit haben, die genannten Antibiotika zu erzeugen. Aus der taxonomischen Untersuchung
der Erfinder wurde gefolgert, daß es keine Gattung gibt, unter die dieser Stamm
fällt, obwohl er offensichtlich zum Genus Streptomyces gehört.
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Eines der neuen Antibiotika, Zygomycin A, wurde eingehend auf seine
physikalischen und chemischen Eigenschaften untersucht, obwohl seine chemische Struktur
noch nicht vollständig geklärt wurde. Ein zweites, Zygomycin B, wurde als Verbindung
erkannt, die dem Streptomycin ähnelt. Die Untersuchung der physikalischen und chemischen
Eigenschaften der anderen neuen Antibiotika, Zygomycin C und Zygomycin D, ist noch
nicht abgeschlossen.
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Die antibakteriellen Spektren von Zygomycin A, B, C und D lassen erkennen,
daß sie gegen die verschiedensten Mikroorganismen antibiotisch wirksam sind. Ferner
wurde festgestellt, daß diese Antibiotika auch im lebenden Körper gegen die in den
antibakteriellen Spektren aufgeführten Mikroorganismen stark wirksam sind. Da ihre
Toxizität sehr niedrig ist, könnten sie zur Behandlung der durch diese Mikroorganismen
verursachten Krankheiten verwendet werden.
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Die morphologischen Merkmale und Zuchtmerkmale von Stamm Nr. 45 449
sind nachstehend angegeben. Den mit »Rdg.« gekennzeichneten Farbbezeichnungen liegen
die Angaben von »Ridgway's Colour Standards and Nomenclature« zugrunde. a) Morphologische
Merkmale Vegetatives Wachstum. . Gelb.
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Luftmycel ... ziemlich reichlich, weiß, wird gelblichgrau. Sporophoren
erzeugen Spiralen. Sporen ellipsoidal bis zylindrisch, 0,6 bis 0,8 @, 0,8 bis 1,6
#t. b) Kulturmerkmale Czapek-Agar: Wachstum ... Farblos, wird blaß orangegelb (Rdg.
111, 17-f), dünn, sich ausbreitend.
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Luftmycel ... Pulverförmig, weiß, später nach blaßmausgrau übergehend
(Rdg. LI, 15""'-f) bis hellmausgrau (Rdg. LI, 15""'-b).
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Lösliches Pigment . . . Nicht vorhanden.
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Rückseite .... Farblos bis kräftig hautfarbig (Rdg. XV, 17'-d).
Glukose-Asparagin-Agar:
Wachstum ... Glatt, dünn, ausgebreitet, zinkorange (Rdg. XV, 13'-o). Luftmycel
... Ziemlich reichlich, weiß, wird später blaßgrau (Rdg. XLVI, 17""-d) bis
gelblichgrau (Rdg. XLVI, 17""-b). Lösliches Pigment ... Zimtfarbig, (Rdg. XXIX,
15"). Rückseite .... Zinkorange (Rdg. XV, l3'-o). Bouillon-Agar: Wachstum
... Farblos, sich ausbreitend, faltig. Luftmycel ... Nicht vorhanden oder
sehr spärlich, weiß, später gelblichgrau (Rdg.XLV I, 17""-d).
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Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden. Rückseite .... Farblos.
Bouillonbrühe: Medium klar, Farbe des Mediums unverändert. Farbloses Wachstum, sinkt
zu Boden. Glukose-Bouillon-Agar: Wachstum ... Farblos, reichlich, faltig.
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Luftmycel ... Reichlich, weiß, später gelblichgrau (Rdg. XLVI,
17""-d).
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Lösliches Pigment ... Braun (Rdg. XV, 15'-m). Rückseite
.... Mumienbraun (Rdg. XV, 17'-m). Glukose-Bouillonbrühe: Medium klar, zimtlederfarbig
(Rdg. XXIX, 17"-b). Farbloses Wachstum sinkt nach unten. Czapek-Glukose-Agar: Wie
bei Czapeck-Agar. Czapeck-Glycerin-Agar Wie bei Czapeck-Agar.
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Glycerin-Bouillon-Agar Wachstum ... Faltig, hirschhornbraun (Rdg.
XV, 17'-i).
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Luftmycel ... Nicht vorhanden oder spärlich, weiß. Lösliches
Pigment ... Braun. Ei-Medium Wachstum ... Farblos, später haarbraun (Rdg.
XLVI, 17""-i). Luftmycel ... Nicht vorhanden. Hefeextrakt-Agar: Wachstum
... Faltig, chamois (Rdg. XXX, 19"-b) bis hirschhornbraun (Rdg. XV, 17'-i).
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Luftmycel ... Spärlich, leichtgräulicholiv (Rdg. XLVI, 21""-b).
Löffersches Serum-Medium: Wachstum ... Farblos. Luftmycel ... Nicht vorhanden.
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Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden. Tyrosinat-Agar Wachstum
... Farblos bis schwachbraun. Luftmycel ... Hellgräulicholiv (Rdg.
XLVI, 21""-b). Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden. Stärke-Hydrolyse: Wachstum:
Hydrolyse = 26 mm : 68 = 25m°' : 65 n'm Hydrolyse/Wachstum = 2,6 bis 2,62. Stärke-Agar:
Wachstum ... Farblos, dünn, sich ausbreitend. Luftmycel ... Spärlich, staubig,
blaßgelblichgrau (Rdg. XLVI, 17""-f).
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Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden. Rückseite
.... Farblos.
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Calciummalat-Agar: Wachstum ... Dünn, verstreut, farblos, später
blaßorangegelb (Rdg. 11I, 17-f).
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Luftmycel ... Spärlich, weiß, später blaßgelbgräulich (Rdg.
XLVI, 17""-f).
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Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden.
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Rückseite .... Farblos, wird später blaßorangegelb (Rdg. 11I,
17-f).
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Gelatine Starke Verflüssigung. Verflüssigter Teil färbt sich gelblichbraun.
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Cellulose ...... Kein Wachstum.
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Milch ......... Starke Peptonisierung ohne Koagulierung.
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Kartoffelbrei: Wachstum ... Faltig, flechtenartig, blaßorangegelb
(Rdg. III, 17-f), wird später zinkorange (Rdg. XV, 13'-o).
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Luftmycel ... Sehr reichlich, weiß, wird später gelblichgrau (Rdg.
XLVI, 17""-d). Breifarbe braun, wird später schwärzlichbraun. Möhrenbrei Wachstum
... Ziemlich reichlich, faltig, farblos, später zinkorange (Rdg. XV, l3'-o). Luftmycel
... Ziemlich reichlich, weiß, später gelblichgrau (Rdg. XLVI, 17""-d). Breifarbe
ist später dunkelorange.
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Nitratreduktion: Starke Nitritbildung aus Nitrat.
c)
Kohlenstoff-Ausnutzung, festgestellt nach der Pridhamschen Methode L-Arabinose ±
Inosit ........ Rhamnose .. +-i-+ Salicin ....... +++ D-Fructose . . + Natriumacetat
D-Galactose ++ Natriumcitrat ++ Saccharose -!- Natriumsuccinat +++ Maltose ....
++++ Erythrit ....
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Lactose .... ++ Mannose ..... Raffinose ... +++ D-Xylose ..... ++
Inulin ...... + Esculin ....... ++ D-Mannit ... ± Dextrin
...... +++ D-Sorbit .... + Kontrolle Dulcit ...... Erläuterung: ++++
= sehr gutes Wachstum; +++ = gutes Wachstum; --;- = ziemlich gutes Wachstum; = Wachstum;
± = Wachstum zweifelhaft; - = kein Wachstum.
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Nach der Beschreibung in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,
7. Auflage, herausgegeben durch Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md., USA.
(1957), scheint Stamm Nr. 45 449 zu einer Art zu gehören, die Streptomyces flavogriseus
(Duch6) Waksman ähnelt. Letzter hat jedoch lange gerade Hyphen mit einigen gekräuselten
Spitzen, während Stamm Nr. 45 449, spiralförmige Hyphen hat. Als Antibiotikum, das
Ähnlichkeit mit Zygomycin A hat, ist Hydroxymycin bekannt, das durch Streptomyces
paucisporogenes erzeugt wird (Annales Pharmaceutiques Frangaises, 16, S.586 [1958]).
Der Mikroorganismus hat jedoch keine spiralförmige Hyphen, koaguliert Milch unter
Peptonisierung und reduziert Nitrat nicht zu Nitrit, während Stamm Nr. 45 449 spiralförmige
Hyphen hat, Milch ohne Koagulierung peptonisiert und Nitrat stark zu Nitrit reduziert.
Diese Unterschiede zwischen Stamm Nr. 45 449 und den obengenannten ähnlichen Mikroorganismen
zeigen eindeutig, daß Stamm Nr. 45 449 zu einer neuen Spezies gehört. Die Erfinder
haben somit eine neue Art entdeckt und bezeichneten sie als Streptomyces pulveraceus
nov. sp.
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Stamm Nr. 45 449 mutiert wie viele andere Mikroorganismen, die zu
Streptomyces gehören, seine morphologischen Merkmale oder Zuchtmerkmale. Diese Mutation
kann natürlich oder künstlich hervorgerufen werden, z. B. durch Ultraviolett- oder
Röntgenbestrahlung und Monosporenabtrennung. Beispielsweise hat ein gelber Mutant,
der durch Ultraviolettbestrahlung von Stamm Nr. 45 449 entstand, die nachstehenden
morphologischen Merkmale und Kulturmerkmale: a) Morphologische Merkmale Zahlreiche
Spiralen Conidien kugelförmig bis ellipsoidal. b) Kulturmerkmale Czapeck-Agar: Wachstum
... Farblos bis ockerlachsfarbig (Rdg. XV, 13'-d), dringt in das Medium ein.
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Luftmycel ... Pulverförmig, hell hautfarbig (Rdg. XV, 17'-f).
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Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden. Czapeck-Glukose-Agar:
Wachstum ... Farblos bis hellockerlachsfarbig (Rdg. XV, 13'-d), dringt in
das Medium ein.
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Luftmycel ... Pulverförmig, »Tilleul«-hautfarbig (Rdg. XL, 17"'-f)
bis hellhautfarbig (Rdg. XV, 17'-f).
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Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden. Czapeck-Glycerin-Agar:
Wachstum ... Farblos bis hellockerlachsfarbig (Rdg. XV, 13'-d), dringt in
das Medium ein.
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Luftmycel ... Pulverförmig, hellhautfarbig (Rdg. XV, 17'-f)
bis ledergelb (Rdg. IV, 19-d). Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden.
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Glukose-Asparagin-Agar Wachstum ... Ockerorange (Rdg. XV, 15'),
dringt in das Medium ein.
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Luftmycel ... Pulverartig, blaßgelborange (Rdg. 111, 15-f).
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Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden, wird später schwach braun.
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Nähr-Agar Wachstum ... Farblos. Luftmycel ... Nicht vorhanden.
Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden. Glukose-Nähr-Agar: Wachstum
... Farblos, faltig. Luftmycel ... Nicht vorhanden. Lösliches Pigment
... Nicht vorhanden oder schwach braun. Glycerin-Nähr-Agar: Wachstum ... Ockerhautfarbig
(Rdg. XV, 15'-b). Luftmycel ... Nicht vorhanden.
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Lösliches Pigment ... Braun (Rdg. XV, 17'-i). Glukosebrühe:
Wachstum ... Farblose Ablagerung. Luftmycel ... Nicht vorhanden. Lösliches
Pigment ... Nicht vorhanden. Stärke-Agar: Wachstum ... Schwach, farblos.
Luftmycel ... Nicht vorhanden. Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden.
Ei: Wachstum ... Farblos, faltig. Luftmycel ... Nicht vorhanden. Lösliches
Pigment ... Nicht vorhanden.
Hefeextrakt-Agar: Wachstum
... Orange (Rdg. 11I, 15), faltig, dringt in das Medium ein.
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Luftmycel ... Spärlich, weiß bis hellhautfarbig. (Rdg. XV, 17'-f).
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Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden. Kartoffelbrei Wachstum
... Orange (Rdg. 1I1, 15).
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Luftmycel ... Weiß bis hellhautfarbig (Rdg. XV, 17'-f), Brei
ist geschwärzt. Möhrenbrei Wachstum ... Farblose Kolonien.
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Luftmycel ... Weiß bis hellhautfarbig (Rdg. XV, 17'-f), Brei
ist schwach braun. Milchmedium Wachstum ... Farbloser Ring. Keine Koagulierung.
Peptonisierung.
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Lösliches Pigment ... Gelblich braun. Gelatine: Wachstum ...
Farblos, Verflüssigung (8 bis 9 -- : 45 m@). Lösliches Pigment
... Nicht vorhanden. Nitratreduktion Starke Reduktion. Serum Wachstum ...
Farblos. Luftmycel ... Nicht vorhanden. Lösliches Pigment ... Nicht
vorhanden. Cellulose ...... Kein Wachstum. Calciummalat-Agar: Wachstum ...
Aprikosengelb (Rdg. IV, 19-b), dringt in das Medium ein. Luftmycel ... Weiß.
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Lösliches Pigment ... Nicht vorhanden. Tyrosinat-Agar Wachstum
... Aprikosenhautfarbig (Rdg. XIV, 11'-b), schwach.
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Luftmycel ... Spärlich, weiß. Lösliches Pigment . . . Nicht vorhanden.
Stärke-Hydrolyse: Wachstum: Hydrolyse = 12 - -.34 .
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c) Kohlenstoffausnutzung Ebenso wie beim ursprünglichen Stamm Nr.
45 449. Auch andere Mutanten oder Varianten von Streptomyces pulveraceus nov. sp.
sind für die Zwecke der Erfindung brauchbar, solange sie eines oder mehrere der
Antibiotika Zygomycin A, B, C und D erzeugen.
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Das antibakterielle Spektrum von Stamm Nr. 45 449 wurde nach der Querstreifenmethode
gemessen. Folgendes Resultat wurde erhalten:
| Hemmungslänge |
| in mm |
| Testmikroorganismus Glycerin- |
| Bouillon- I Bouillon- |
| Agar Agar |
| Escherichia coli .............. 28 18 |
| Proteus vulgaris .............. 25 17 |
| Micrococcus pyogenes var. |
| aureus .................... 28 20 |
| Bacillus subtilis .............. 50 30 |
| Bacillus cereus ............... 24 20 |
| Mycobacterium ATCC-607 .... 28 i 21 |
| Mycobacterium tuberculosis var. ' |
| avium ..................... 28 21 |
| Mycobacterium tuberculosis var. |
| avium (gegen Streptomycin re- |
| sistenter Stamm) ........... 30 20 |
Muster des Stamms Nr. 45 449 und seines gelben Mutanten wurden beim Institute for
Fermentation, Osaka, Japan, sowie bei der American Type Culture Collection, Washington,
D. C., USA., hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist im ersteren Fall IFO-3855 und
ATCC-13 875 und im letzteren Fall IFO-3857 und ATCC-13 877.
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Zur Kultur eines Stammes von Streptomyces pulveraceus wird vorzugsweise
ein flüssiges Medium verwendet, das u. a. assimilierbare Kohlenstoffquellen und
digerierbare Stickstoffquellen enthält. Als Kohlenstoffquellen dienen beispielsweise
Stärke, Glukose, Lactose, Maltose, Dextrin, Glycerin und Hirsebrei. Als Stickstoffquellen
kommen beispielsweise Pepton, Sojabohnenmehl, Mais-Extraktionsflüssigkeit, Fleischextrakt,
Reiskleie, Weizenkleie, Harnstoff und Ammoniumsalze in Frage. Ferner können einige
anorganische Salze, wie Kochsalz, Phosphate, Calciumsalze, Zinksalze, Mangansalze
und Eisensalze, dem Medium zugesetzt werden. Gegebenenfalls können ein Spurenelement
oder Spurenelemente als Wachstumsbeschleuniger und ein tierisches, pflanzliches
oder mineralisches Öl als Schaumunterdrückungsmittel zugegeben werden.
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Das Kulturmedium kann fest oder flüssig sein, jedoch ist ein flüssiges
Medium für die industrielle Herstellung von Zygomycinen besser geeignet.
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Die Kultur von Streptomyces pulveraceus in einem flüssigen Medium,
das die genannten Nährstoffquellen enthält, erfolgt vorzugsweise unter Rühren und
Belüften sowie gegebenenfalls unter Schütteln. Die Bedingungen werden so gewählt,
daß sie zum Züchten des jeweiligen Mikroorganismus am günstigsten sind und daß eine
möglichst hohe Ausbeute des gewünschten Antibiotikums bzw. der gewünschten Antibiotika
erhalten wird. Wenn Stamm Nr. 45 449 oder sein gelber Mutant als Mikroorganismus
zur Herstellung von Zygomycin verwendet wird (Zygomycin A und Zygomycin B werden
nachstehend mit dem Sammelnamen >»Zygomycin [basische Komponenten]« bezeichnet,
falls nicht ausdrücklich anders erwähnt), wird der Stamm vorzugsweise in der sogenannten
Submerskultur beispielsweise bei etwa 26 bis 30°C und etwa neutralem pg für ungefähr
2 bis 5 Tage bebrütet.
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Die erhaltene Fermentationsflüssigkeit enthält mehrere Antibiotika.
Diese Antibiotika sind basische, neutrale und saure Substanzen. Die basische Substanz
kann in wenigstens zwei Gruppen geteilt werden, die
sich in den
Eigenschaften voneinander unterscheiden. In ihr sind Zygomycin A und Zygomycin B
enthalten. Da Zygomycin A und Zygomycin B basisch sind, können sie Salze mit anorganischen
und organischen Säuren bilden. Zygomycin (basische Komponenten) läßt sich unter
Ausnutzung seiner physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften im freien Zustand
oder in Form von Salzen aus der Fermentationsflüssigkeit abtrennen. Da der größere
Teil der basischen Antibiotika im flüssigen Teil enthalten ist, geht sehr wenig
von ihnen verloren, auch wenn Zygomycin (basische Komponenten) nur vom Filtrat gewonnen
wird. Zygomycin (basische Komponenten) kann daher von der Flüssigkeit oder ihrem
Filtrat unter Ausnutzung des Unterschiedes in der Adsorbierbarkeit zwischen Zygomycin
(basische Komponenten) und Verunreinigungen abgetrennt werden. Beispielsweise wird
das flüssige Material, das Zygomycin (basische Komponenten) enthält, durch eine
Adsorptionsmittelschicht geleitet oder mit einem Adsorptionsmittel gerührt, um Zygomycin
(basische Komponenten) zu adsorbieren. Das am Adsorbens adsorbierte Zygomycin kann
mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert werden. Am besten geeignet für diesen
Zweck ist Aktivkohle als Adsorptionsmittel und ein wäßriger niederer Fettalkohol
als Lösungsmittel. Die Adsorption von Zygomycin (basische Komponenten) an Aktivkohle
kann leicht im alkalischen pg-Bereich durchgeführt werden, während die Eluierung
vorzugsweise im sauren pH-Bereich erfolgt. Die Reinigung von Zygomycin (basische
Komponenten) kann mit einem lonenaustauschharz erfolgen, z. B. mit Hilfe der Ammonium-
oder AlkalisaWorm eines schwach sauren Harzes, dessen Ionenaustauschrest Carbonsäure
ist. Ein solches Harz ist beispielsweise unter der Handelsbezeichnung »Amberlite
IRC-50« bekannt. Es handelt sich um ein Acrylpolymer in Perlform, bei dem die Carboxylgruppe
den Austauschrest bildet. Die Eluierung von Zygomycin (basische Komponenten) aus
diesem Adsorbens erfolgt vorzugsweise mit einem wäßrigen Lösungsmittel.
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Eine andere Möglichkeit der Reinigung von Zygomycin (basische Komponenten)
besteht darin, daß eine wäßrige Lösung, die die Komponenten und ein stark saures
oberflächenaktives Mittel enthält, mit einem organischen Lösungsmittel, das die
Komponenten leicht löst, extrahiert wird. Geeignete oberflächenaktive Mittel sind
beispielsweise 7-Äthyl-2-methyl-4-hendecanolsulfat (Natriumsalz), das Triäthanolaminsalz
von Tetradecylsulfonsäure, 3,9-Diäthyltridecyl-6-sulfat, das Natriumsalz eines sulfonierten
Erdölkohlenwasserstoffs (Clo) oder Natriumdioctylsulfosuccinat. Als organisches
Lösungsmittel eignen sich beispielsweise Amylalkohol oder Butylalkohol. Das im Extrakt
enthaltene Salz von Zygomycin (basische Komponenten) mit dem oberflächenaktiven
Mittel kann durch Neutralisation freigesetzt- werden.
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Da das Salz von Zygomycin (basische Komponenten) mit einem oberflächenaktiven
Mittel gewöhnlich in Wasser kaum löslich ist, kann es aus einer stark konzentrierten
wäßrigen Lösung von Zygomycin (basische Komponenten) durch Zusatz des oberflächenaktiven
Mittels ausgefällt werden. Aus dieser Fällung können die gewünschten Antibiotika
abgetrennt werden.
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Nach einer weiteren Reinigungsmethode wird ein mit Wasser mischbares
organisches Lösungsmittel einer wäßrigen Lösung eines Anlagerungssalzes von Zygomycin
mit einer anorganischen Säure zugesetzt, um das Salz niederzuschlagen. Anlagerungssalze
von Zygomycin (basische Komponenten) mit organischen Säuren sind gewöhnlich in organischen
Lösungsmitteln löslich, so daß diese Reinigung auf Anlagerungssalze mit organischen
Säuren nicht anwendbar ist.
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Natürlich können auch alle anderen geeigneten Verfahren, nach denen
basische Antibiotika aus einer Fermentationsflüssigkeit eines Mikroorganismus abtrennbar
sind, im vorliegenden Fall angewendet werden. Diese Reinigungsverfahren können getrennt
oder in Kombination oder wiederholt angewendet werden.
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Nach den obengenannten Verfahren erhaltenes Zygomycin (basische Komponenten)
besteht hauptsächlich aus Zygomycin A und Zygomycin B, enthält jedoch einige Verunreinigungen.
Zur Trennung von Zygomycin (basische Komponenten) in Zygomycin A und Zygomycin B
können Verfahren, wie Adsorption oder Verteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie
oder Gegenstromverteilung angewendet werden. Als Adsorptionsmittel bzw. Mittel in
der Chromatographie eignen sich beispielsweise Aktivkohle, aktiviertes Aluminiumoxyd,
Magnesiumsilicat, Kieselsäuregel usw. Als Entwickler in der Adsorptionschromatographie
werden vorzugsweise Wasser oder wäßriges Methanol verwendet. Wenn Aktivkohle als
Adsorptionsmittel verwendet wird, ist Wasser am vorteilhaftesten als Entwickler,
während bei Verwendung von aktiviertem Aluminiumoxyd 80 °/Qiges wäßriges Methanol
am geeignetsten ist. Als Entwickler für die Teilungschromatographie wird vorzugsweise
eine Mischung aus Phenol und Wasser oder aus Essigsäure, n-Butanol und Wasser verwendet.
Das Verhältnis der Komponenten des letztgenannten Gemisches kann beispielsweise
2:1:2 betragen. Auch die obere Schicht einer solchen Mischung, in der das Verhältnis
beispielsweise 4:1: 5 beträgt, kann zu guten Ergebnissen führen.
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Bei der vorstehend beschriebenen Reinigung von rohem Zygomycin (basische
Komponenten) entstehen wenigstens zwei Arten von basischen Antibiotika oder ihre
Salze. Eines von ihnen hat Querresistenz mit Neomycin, das andere mit Streptomycin.
Das erstere wird Zygomycin A, das letztere Zygomycin B genannt.
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Das Mengenverhältnis von Zygomycin A zu Zygomycin B ist verschieden
je nach der Art des verwendeten Mikroorganismus, den Komponenten des für die Kultur
verwendeten Mediums, den Fermentationsbedingungen usw. Wird beispielsweise Stamm
Nr.45449 in einem Medium bebrütet, das Glukose (2 °/Q), Lactose (111/0), Sojabohnenmehl
(3 °/o), Polypepton (0,5 °/o) und Calciumcarbonat (0,5 °/o) enthält, wird hauptsächlich
Zygomycin A gebildet, während die Bildung von Zygomycin B unterdrückt wird. Werden
jedoch 0,3 bis 0,5 % Natriumchlorid dem genannten Medium zugesetzt, steigt
die Bildung von Zygomycin B erheblich.
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Zygomycin (basische Komponenten) ist eine farblose, pulverförmige
basische Substanz, deren Hydrochlorid oder Sulfat ein leicht hygroskopisches Pulver
und leicht in Wasser löslich ist. Das Hydrochlorid ist in Methanol löslich und in
nichtpolaren Lösungsmitteln, wie Aceton, schwerlöslich.
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Zygomycin A ist positiv in der Ninhydrin-Reaktion, jedoch negativ
in den Sakaguchi-, Elson-Morgan-, Benzidin- und Maltol-Reaktionen. Es reduziert
Fehlingsche Lösung nicht. Die spezifische Rotation von
Zygomycin
A ist [x ]ö = -I-83° (c = 2, H20). Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von
Zygomycin A-Hydrochlorid hat keine charakteristische Absorption zwischen 220 und
340 mp.. Die Infrarotabsorptionsspektren des Hydrochlorids von Zygomycin A und seines
N-Benzoats, aufgenommen mit einem Spektrophotometer mit Na CI-Prisma und KBr-Scheibe,
haben die nachstehend genannten Absorptionsbanden (Fig. 1 bzw. 2): Hydrochlorid
von Zygomycin A: 2,95, 3,2 bis 3,45, 4,25, 5,00, 5,95, 6,25, 6,65, 7,25, 8,80, 9,85,
10,55 bis 10,80, 13,00 ;... Zygomycin A-N-Benzoat: 2,95, 3,42, 6,08, 6,54,
6,72, 7,65, 9,65 Das N-Benzoat von Zygomycin A ist eine kristalline Substanz, die
bei 206'C unter Zersetzung schmilzt. Seine Elementaranalyse ergab die nachstehenden
Werte (die Analyse wurde fünfmal wiederholt): 1. C 58,14 0/0, H 6,04 %, N 5,710/"
2. C 58,58 0/0, H 5,97 %, N 5,510/" 3. C 58,96 0/6, H 6,00 0/6, N
5,910/" 4. C 59,02 0/a, H 5,89 0/6, N 5,58 %, 5. C 58,30 0/0, H 6,13 %, N 5,73 6/0.
Die qualitative Analyse des N-Benzoats zeigt, daß keinerlei Schwefel, Phosphor und
Halogen darin enthalten ist. Als Bruttoformel des N-Benzoats ist somit anzunehmen
C23H40N5014(C6H5C0)5' 3H20. Ziemlich reines Zygomycin B kann das Hydrochlorid bilden.
Das Hydrochlorid ist bei der Ninhydrin-Reaktion negativ und bei der Sakaguchi-Reaktion
positiv. Die spezifische Drehung von Zygomycin B, das mit einer geringen Menge Zygomycin
A verunreinigt ist, ist [x]ö D = -I-2' (c = 1, H20)-B kann als das Sulfat weiter
gereinigt werden. Das gereinigte Sulfat von Zygomycin B ist positiv bei der Sakaguchi-Reaktion
und negativ bei der Elson-Morgan und Maltol-Reaktion. Die spezifische Drehung von
Zygomycin-B-Sulfat ist [x]ö = -94° (c = 1,0, H20). Das Ultraviolettabsorptionsspektrum
des Sulfats hat keine charakteristische Absorption. Das Infrarotabsorptionsspektrum,
aufgenommen mit einem Spektrophotometer mit Na Cl-Prisma und K Br-Scheibe, hat die
nachstehend genannten Banden (s. Fig.3): 3,00, 6,05, 6,15, 6,85, 7,40, 9,25, 10,10,
10,30, 11,50 Das kristalline Zygomycin-B-Sulfat hat keinen scharfen Schmelzpunkt
und zeigt bei der Elementaranalyse folgende Werte: C 34,29 0/0, H 6,3 0/0, N 12,06
0/0.
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Nach dem Infrarotspektrum seines Sulfats wird vermutet, daß Zygomycin
ein Antibiotikum ist, das zur gleichen Reihe wie Streptomycin gehört, da das Spektrum
fast den gleichen Charakter hat wie das des Streptomycinsulfats. Jedoch unterscheiden
sich Streptomycin und Hydroxystreptomycin von Zygomycin B in der Farbreaktion. Dihydrodesoxystreptomycin
unterscheidet sich ferner von Zygomycin B in der Mischschmelzpunktbestimmung dadurch,
daß das Sulfat des ersteren nicht kristallisierbar ist. Außerdem besteht ein Unterschied
im Röntgenstrahlenbeugungsbild ihrer freien Basen und des nach der gleichen Methode
gereinigten Sulfats. Es ist somit offensichtlich, daß Zygomycin B ein neues Antibiotikum
ist, das eine starke Ähnlichkeit mit Streptomycin, Dihydrodesoxystreptomycin, Hydroxystreptomycin
und Dihydrostreptomycin hat.
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Die Papierteilungschromatographie von Zygomycinhydrochlorid (Zygomycin-A-Hydrochlorid
plus Zygomycin-B-Hydrochlorid) wird mit einem Filterpapierstreifen (Toyo-Roshi Nr.
131) nach der absteigenden Methode durchgeführt, wobei 44 Stunden mit 50 °/jgem
wäßrigem Phenol entwickelt wird. Das chromatographische Verteilungsbild wird aus
der Bioautographie, der Ninhydrin- und Sakaguchi-Reaktion bestimmt. Zygomycin A
ist positiv bei der Ninhydrin-Reaktion und zeigt eine Wachstumshemmung gegen Bacillus
subtilis im Umkreis von 4 cm. Zygomycin B andererseits ist positiv bei der Sakaguchi-Reaktion
und zeigt eine Wachstumshemmung gegen Bacillus subtilis im Umkreis von etwa 14 cm.
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Das antimikrobische Spektrum von Zygomycin-A-Sulfat wurde mit dem
von Zygomycin-B-Sulfat verglichen. Gleichzeitig wurde das antimikrobische Spektrum
von Zygomycin-B-Sulfat mit dem der Sulfate von Kanamycin, Neomycin und Streptomycin,
die als dem Zygomycin B ähnliche Antibiotika angesehen werden, nach der Agar-Verdünnungsmethode
verglichen. Es wurde die Mindestkonzentration zur Hemmung des Wachstums von Testmikroorganismen
in Millionstel Gramm pro Kubikzentimeter ermittelt.
| Mindestkonzentration für Wachstumshemmung |
| Testmikroorganismus Zygomycin- ( Zygomycin- Strepto- ' Kanamycin-
Neomycin- |
| A-Sulfat B-Sulfat I mycmsulfat sulfat Sulfat |
| Escherichia coli ........................... 10 5 bis
10 5 5 5 |
| Proteus vulgaris ........................... 20 50 5 10 10 |
| Pseudomonas aeruginosa ................... >
100 100 10 I >l00 ' > 100 |
| Micrococcus pyogenes var. aureus ........... 5 ' 5 1
5 5 |
| Bacillus subtilis ........................... 0,5 1
0,2 bis 0,5 0,25 0,2 |
| Bacillus cereus ............................ 2,5 2 1-2 1,7
1 |
| Bacillus brevis ............................ 50 100
- 25 5 |
| Micrococcusfiavus ........................ 100 2 2 17 i 5 |
| Sarcina lutea .............................. 25 5 - 25 10 |
| Serratia marcescens ........................ 5 5 - 5 5 |
| Mycobacterium tuberculosis var. avium |
| (sensitiv) ............................... 2 1-2 1 i
1,1 2 |
| desgl. (resistent gegen Streptomycin) ......... 2 >
100 > 100 1,25 2 |
| desgl. (resistent gegen Neomycin) ............ > 100
1 - 2 1 >l00 f >l00 |
| Mycobacterium ATCC-607 ................. 2 1 -2 1 1,1
2 |
| Mycobacterium phlei ...................... 2,5 1 - 2
- 12,5 1 |
| Mycobacterium smegmatis .................. 2,5 1 -2
I - 2,5 1 |
Aus dieser Tabelle ist offensichtlich, daB die Spektren von Zygomycin
A und Zygomycin B von den Spektren des Kanamycins, Neomycins und Streptomycins verschieden
sind. Nach der Agar-Verdünnungsmethode wurden für Zygomycin A folgende Mindestkonzentrationen
zur Hemmung des Wachstums verschiedener pathogener Mikroorganismen ermittelt:
| Mindest- |
| konzentration |
| Nr. des zur Hemmung |
| Mikroorganismus des Wachstums |
| Stamms in Millionstel |
| Gramm pro |
| Kubikzentimeter |
| Mierococcus pyogenes var. |
| aureus ............... 3 2,0 bis 8,0 |
| Streptococcus haemoly- |
| ticus ................. 5 12,5 bis 25,0 |
| Streptococcus viridans ... 1 50,0 |
| Diplococcus pneumoniae 3 25,0 bis 50,0 |
| Salmonella typhi ........ 4 4,0 bis 8,0 |
| Salmonella paratyphi .... 4 2,0 bis 16,0 |
| Salmonella enteritidis .... 1 16,0 |
| Salmonella Senftenberg .. 1 8,0 |
| Shigella dysenteriae ...... 1 16,0 |
| Shigella flexneri ......... 3 16,0 |
| Shigella sonnei ......... 1 16,0 |
| Klebsiella pneumoniae ... 1 2,0 |
| Cerynebacterium diph- |
| theriae ............... 1 2,0 |
| Microbacterium tubercu- |
| losis var. hominis |
| (H 37 Rv) ............ 1 2,5 bis 10,0* |
| * 10,0 Millionstel Gramm pro Kubikzentimeter auf Kirchner- |
| schem Medium und 2,5 Millionstel Gramm pro Kubik- |
| zentimeter auf Dubosschem Medium. |
| Fortsetzung |
| Mindest- |
| konzentration |
| Nr. des zur Hemmung |
| Mikroorganismus Stamms des Wachstums |
| in Millionstel |
| Gramm pro |
| Kubikzentimeter |
| Vibrio cholerae ......... 5 16,0 bis 32,0 |
| Neisseria gonorrhoeae ... 1 32,0 |
| Micrococcus pyogenes var. |
| aureus (gegen Penicillin, |
| Streptomycin, Chloram- |
| phenicol und Tetracyclin |
| resistenter Stamm) ..... 1 16,0 |
| desgl. (gegen Penicillin, |
| Chloramphenicol und |
| Tetracyclin resistenter |
| Stamm) .............. 1 8,0 |
| desgl. (gegen Penicillin, |
| Streptomycin und Tetra- |
| cyclin resistenter Stamm) 1 8,0 |
| Streptomycin-, chloram- |
| phenicol- und tetracyc- |
| linresistente Arten ..... 4 16,0 |
Wenn Zygomycin-A-Hydrochlorid zusammen mit Normalsalzsäure 4 Stunden erhitzt wird,
wird es gegen Bacillus subtilis und Mycrococcus pyogenes var. aureus unwirksam,
wie sich aus dem nach der »Bechermethodeu erhaltenen antibiotischen Spektrum ergibt.
Die jeweiligen Stabilitäten von Zygomycin-A-Hydrochlorid unter sauren, neutralen
und alkalischen Bedingungen wurden ermittelt, wobei die nachstehenden Ergebnisse
erhalten wurden:
| PH 2,0 PH 7,0 PH 9,0 |
| C P I S I B |
| C I P I S I B |
| C I P I S I B |
| I |
| Kontrolle ................. 50 35 I 50 500 , |
| 100°C, 30 Minuten ........ 35 15 35 500 50 35 75 500
50 35 I 50 ! 500 |
| 100'C, 60 Minuten . .... . .. 50 15 50 ; 500 35 , 15 35 500
50 35 I 50 ; 500 |
| C = Escherichia coli. S = Mycrococcus pyogenes 11r. aureus. |
| P = Proteus vulgaris. B = Bacillus subtilis. |
Die in der vorstehenden Tabelle angegebenen Einheiten gegen jeden Testorganismus
wurden nach der Verdünnungsmethode berechnet. Aus den Werten ist ersichtlich, daB
Zygomycin zumindest unter den vorstehend genannten Bedingungen sehr stabil ist.
-
Die antibakterielle Wirksamkeit von Zygomycin A gegen pathogene Mikroorganismen
in vivo ergab, daB die Lebensdauer von Mäusen, die mit Mycobacterium tuberculosis
var. hominis infiziert sind, durch subkutane Injektionen von 0,4 mg Zygomycin-A-Hydrochlorid
pro Tag pro Tier stark verlängert wird und daB Mäuse, die mit einer tödlichen Dosis
eines gegen Penicillin, Streptomycin und Tetracyclin resistenten Stammes infiziert
sind, bei subkutaner Injektion von Zygomycin-A-Hydrochlorid überleben.
-
Die jeweiligen Toxizitäten von Zygomycin-A-Hydrochlorid und Zygomycin-B-Sulfat
wurden an 4 Wochen alten männlichen Mäusen (Stamm dd) durch intravenöse Injektion
ermittelt.
-
Zygomycin-A-Hydrochlorid LD5o = 230 mg/kg Zygomycin-B-Sulfat LD,5o
= 330 mg/kg Eine etwa verzögerte Toxizität wurde bei keinem der Tiere festgestellt.
Ferner wurde eine Zunahme des Körpergewichts von Mäusen, jedoch keine Toxikose beobachtet,
wenn 21 Tage 100 mg Zygomycin-A-Hydrochlorid pro Tag pro Kilogramm subkutan injiziert
wurden. Hieraus ergibt sich, daB Zygomycin-A-Hydrochlorid keinerlei subakute Toxizität
aufweist.
-
Zygomycin A kann als Antibiotikum angesehen werden, das folgenden
Antibiotika ähnelt: Neomycin (Science, 109, S. 305 [305]), Kanamycin (Journal of
Antibiotics, Japan, Series A, 10, S. 107 [l957]), Hydromycin (Annales pharmaceutiques
frangaises, 16, S. 585 [1958]), Paromomycin (Japanische Patentveröffentlichung 6649/1958,
belgisches Patent 547 976, USA.-Patent 2 916 485) und Framycetin (Annales pharmaceutiques
frangaises, 11, S. 44 [1953]). Hiervon ähneln Hydroxymycin und Paromomycin dem Zygomycin
A in vieler Hinsicht sehr stark. Das antimikrobische Spektrum von Zygomycin ist
jedoch von dem des Hydroxymycins stark verschieden, wie aus nachstehender Tabelle
ersichtlich ist.
| Mindestkonzentration zur |
| Hemmung des Wachstums |
| in Mikrogramm pro |
| Mikroorganismus Kubikzentimeter |
| Hydroxy-@ |
| mycin Zygomycin A |
| Micrococcus pyogenes var. |
| aureus*1 ............. 0,4 5 |
| Bacillus subtilis |
| ATCC-6633 .......... 0,2 0,5 |
| Bacillus ceureus *2 ....... 1,2 2 |
| Bacillus mycoides *3 ..... 1,5 1 |
| Sarcinalutea *4 ......... 1,6 25 |
| Aerobacter aerogenes *5 3,5 10 bis 20 |
| Eschericia coli ATCC 9637 4 20 |
| Pseudomonas aeruginosa*6 30 200 bis 1000 |
| Serratia marcescens ATCC |
| 9986 ................ 3,5 20 |
| * Das antibakterielle Spektrum wurde an anderen Stämmen |
| als für Hydroxymycin festgestellt. Verwendet wurden fol- |
| gende Stämme: |
| Hydroxymycin Zygomycin A |
| (1) Oxford 209 P |
| (2) NRRL - B 569 ATCC - 10702 |
| (3) (keine Kennzeichnung) IFO - 3015 |
| (4) ATCC - 9341 WO - 3232 |
| (5) (keine Kennzeichnung) (Mittelwert von 11 Stämmen) |
| (6) (keine Kennzeichnung) (Mittelwert von 15 Stämmen) |
Aus der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß Zygomycin A ein anderes antimikrobisches
Spektrum hat als Hydroxymycin, besonders an Micrococcus pyogenes var. aureus, Sarcina
lutea, Eschericia coli, Serratia marcescens und Pseudomonas aerurinosa. Zwar haben
Zygomycin A und Hydroxymycin ähnliche Farbreaktionen (positiv in der Ninhydrin-Reaktion
und negativ in der Elson-Morgan-Reaktion), jedoch sind ihre Molekularformeln, Rf-Werte
auf dem Papierchromatogramm usw. ganz verschieden, wie aus folgender Tabelle ersichtlich
ist.
| Zygomycin A Hydroxymycin |
| Molekularformel ............................... C23H45014N5
C25H47015N5 |
| Rf-Wert auf dem Papierchromatogramm. Entwickler: |
| n-Butanol-Essigsäure-Wasser |
| 2 : 1 : 2 ................................ 0,33 0,01 |
| 4:1:5 ................................ 0,01 - |
| p-(p'-Hydroxyphenylazo)-benzolsulfonat. |
| Schmelzpunkt ................................ Bei 190°C
dunkel 220''C (Zersetzung) |
| geworden. Auch bei |
| 300°C nicht zersetzt. |
| [x]. ................................... +34° -t-37' |
| N-Pentabenzoat. Schmelzpunkt .................. 206°C
(Zersetzung) 232' C (Zersetzung) |
| [x]D ................................... -t-36° 36` - 2` |
| i:,nax ................................... 228
mf,t (Ei#lm 460) 227 ml. (Ei@, 459) |
Hieraus folgt, daß Zygomycin A ein neues Antibiotikum ist, das trotz erheblicher
Ähnlichkeit von Hydroxymycin verschieden ist.
-
An Hand der Beschreibung der chemischen Struktur von Paromycin (Journal
of the American Chemical Society. 81, S. 3480 bis 3483 [1959]) wurde außerdem geklärt,
daß Zygomycin A eine andere chemische Struktur hat als Paromomycin. Die nachstehend
gegebenen Angaben über die physikalischen Konstanten usw. von Paromomycin und seine
Derivate oder deren Zersetzungsprodukte sind sämtlich dieser Literaturstelle entnommen.
-
Auf die gleiche Weise, in der Paromamin aus Paromomycin hergestellt
wird (J. Am. Chem. Soc.), kann ein Zersetzungsprodukt von Zygomycin A mit folgenden
Eigenschaften erhalten werden: Schmelzpunkt 232C (Zersetzung) [x]ä = -'- s3' (c
= 0,5 H20) Analyse für C12 H25 N307 - 3HC1 - H20: Berechnet ... C 31,97°/0,
H 6,710/" N 9,32°/0; gefunden ... C 32,15 "/o, H 6,65 °/o, N 9,28
°/o. Die freie Base des obigen Produkts hat folgende Kennzahlen Schmelzpunkt 250
bis 251'C (Zersetzung) [x]ö = -f-124° (c = 1, H20) Analyse für C12
112,5 N307 - 1/2 H20: °/a; Berechnet ... C 43,36 °/6, H 9,88 °Jo,
N 12,64 gefunden ... C 43,69 °/o, H 8,13 °/a, N 12,93 °/6. Ein Vergleich
dieser Werte mit der Beschreibung des Zersetzungsprodukts von Paromomycin läßt annehmen,
daß dieses Produkt das gleiche ist wie das aus Paromomycin erhaltene Paromamin.
-
Zwei Arten von Kristallen scheiden sich von einem Produkt ab, das
durch Zersetzung der obigen Verbindung (C12 H25 Na 07 - 1/2 H20) durch Kochen mit
6 n-Salzsäure erhalten wird. Die eine Art wird als 1,3-Diamino-4,5,6-trihydroxycyclohexanhydrochlorid
(Schmelzpunkt 315°C [Zersetzung], farblose Kristalle) festgestellt. Die anderen,
ebenfalls farblosen Kristalle schmelzen bei 288 bis 289°C (Zersetzung) und werden
als D-Glucosamin identifiziert. Auf Grund der vorstehenden
Resultate
sowie auf Grund der Untersuchung des durch Behandlung mit Perjodsäure erhaltenen
Oxydationsprodukts der Verbindung C12H25N307 * 1/2 HBO wird C12H25N307 als
das in der obengenannten Literaturstelle (J. Am. Chem. Soc.) beschriebene Paromamin
identifiziert.
-
Zu der Mutterlauge, die bei der Herstellung von Paromamin aus Zygomycin
A anfällt, wird Äther zugesetzt, um einen Niederschlag zu erhalten. Eine Lösung
dieses Niederschlages in einer Mischung von Methanol und Äther (2:1) wird durch
eine mit Aluminiumoxyd gefüllte Kolonne geleitet. Die adsorbierte Substanz wird
dann mit Methanol-Äther (5:2) eluiert. Nach Einengen des Eluats wird Äther zugegeben,
worauf ein hygroskopisches farbloses Pulver ausfällt. [a]ö = -f-29° (c = 1, H20).
Nach dem Bild des Papierchromatogramms ist dieses Pulver eine Verbindung der Bruttoformel
C11 H22 N208(OCH3), eine Art Methylglycosid. Diesem Methylglycosid wird die vorläufige
Bezeichnung Methylzygobiosaminid gegeben. Nach dem Papierchromatogramm des Hydrolysats
von Methylzygobiosaminid sind die Komponenten dieser Verbindung Ribose und ein Aminozucker.
-
Eine Lösung von Methylzygobiosaminid in 6 n-Salzsäure wird 1,5 Stunden
unter dem Rückflußkühler erhitzt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
Der Rückstand wird durch Chromatographie an sulfoniertem Polystyrolharz in Perlform
gereinigt, wobei ein sehr hygroskopisches Pulver erhalten wird. Das Produkt wird
durch Chromatographie an Aktivkohle weiter gereinigt, wobei ein stark hygroskopisches
kristallines Pulver anfällt. [x]' = -I-24° (c = 1, H20). Das Picrat des Produkts
hat die Form von Kristallen, die bei 126 bis 127'C unter Zersetzung schmelzen. [a]ö
= -I-9,4° (c = 0,5, H20). Andererseits hat das diesem Produkt entsprechende Picrat
eines Zersetzungsprodukts von Paromomycin (Paromosepicrat) die Form von Kristallen,
die bei 126 bis 128'C unter Zersetzung schmelzen und einen Wert von [a]ö = -f-22°
(c = -f-0,5, H20) haben. Auf Grund der Analysenwerte von N,N'-Diacetyldihydrozygose,
die später genannt werden, wird dieses Produkt als eine Diaminohexose angesehen
und vorläufig als Zygose bezeichnet.
-
Die auf diese Weise erhaltene Zygose wird nach der in J. Am. Chem.
Soc., 76, S.301 (1954), und 81, S.3481 (1959), beschriebenen Methode acetyliert,
wobei N,N'-Diacetylzygose entsteht. p-Nitrophenylhydrazon von Zygose schmilzt bei
215 bis 217°C unter Zersetzung und zeigt [a] ö = 1--92' (c = 0,4, 50 °/oiges Methanol),
während auf die gleiche Weise aus Paromose erhaltene NN'-Diacetylparomose bei 229
bis 231°C unter Zersetzung schmilzt und [a]1 = -f-5,9° (c = 0,4, feuchtes Methanol)
aufweist.
-
N,N'-Diacetylzygose wird nach einer ähnlichen Methode, wie sie in
J. Am. Chem. Soc., 73, S. 4691 (1951); 76, S.4887 (1954), und 81, S.3481 (1959),
beschrieben ist, reduziert, wobei ein farbloses Pulver erhalten wird. Das Pulver
wird aus einem Methanol-Aceton-Gemisch kristallisiert. Das Produkt, das die Form
farbloser Nadeln hat, wird bei 210 bis 230°C schwarz und zersetzt sich bei 260°C
unter Schäumen. Analyse für C1o H2o O s N2: Berechnet ... C 45,45 °/o, H
7,63 °/o, N 10,60 °/a; gefunden ... I. C 45,79 °/o, H 7,51 °/p, N 10,20 °/o,
II. C 45,88 °/o, H 7,56 °/o.
-
[a]ö = --f-49° (c = 1, H20); -f-48° (c = 1, 0,2Mol Acetatpuffer pg
4,4).
-
Das auf die gleiche Weise aus Paromomycin erhaltene Reduktionsprodukt
von N,N'-Diacetylparomose zeigt folgende Kennzahlen: [x]ö = -17,8° (c = 4,0, 0,2
Mol Essigsäurepuffer pA 4,5, Schmelzpunkt 150,5
bis 154,5°. Hieraus geht deutlich
hervor, daß Zygose eine Diaminohexose ist, die von der bekannten Paromose verschieden
ist.
-
Wie bereits erwähnt, wurde auf das Vorhandensein von Ribose im Hydrolysat
von Zygomycin A auf Grund der Papierchromatographie geschlossen. Nun zeigte sich,
daß die Ribose tatsächlich herstellbar ist. Zu diesem Zweck wird rohes Methylzygobiosaminid
N-acetyliert und dann mit verdünnter Schwefelsäure gekocht. Nach der Entfernung
der Schwefelsäure wird das Produkt nacheinander durch ein schwach basisches Anionenaustauschharz
(OH--Typ) und ein carbonsaures Kationenaustauschharz (H+-Typ) geleitet. Das ablaufende
Produkt wird an Aktivkohle chromatographiert, und das hierbei erhaltene Eluat wird
zur Trockene eingedampft, wobei eine farblose harzige Substanz erhalten wird. Das
Produkt kristallisiert, wenn man es in Äthanol löst und die Lösung über Nacht in
einem Kühlschrank stehenläßt. Das Infrarot-Absorptionsspektrum dieses Produkts stimmt
gut mit dem von Ribose überein. Die spezifische Rotation bewegt sich von -14 bis
-17' in 24 Stunden. Hiermit bestätigt sich das Produkt als Ribose.
-
Zygomycin A läßt sich auf die beschriebene Weise durch Methanolyse
leicht in Paromamin und Methylzygobiosaminid umwandeln, und das letztere kann leicht
mit einer verdünnten Säure in das Zygobiosamin, das ein freies Disaccharid darstellt,
umgewandelt werden. Es wird daher angenommen, daß Zygobiosamin die Diaminohexosylribose
ist, und für Zygomycin A wird f olgende planare Struktur angenommen
Damit ist klargestellt, daß Zygomycin (basische Komponenten) und
seine beiden Komponenten (Zygomycin A und Zygomycin B) sich in den Eigenschaften
und/oder in der chemischen Struktur von bekannten Antibiotika unterscheiden. Sie
eignen sich zur klinischen Behandlung von mikrobischen Infektionen und sind als
neue und wertvolle Antibiotika anzusehen.
-
In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentangaben auf das
Gewicht, falls nicht anders angegeben. Die Temperaturen sind sämtlich unkorrigiert.
Beispiel 1 Verwendet wird ein wäßriges Medium (pa 7,0), das 2,00/, Glucose, 1,00/,
Lactose, 2,00/, Sojabohnenmehl, 0,5 °/a Polypepton, 0,3 °/a Natriumchlorid und 0,5
°/o Calciumcarbonat enthält.
-
Ein Stamm Streptomyces pulveraceus (117O-3855) Nvird in 50 cm3 des
Mediums in einem 200-cm3-Kolben 2 Tage bei 28 @ C unter Verwendung einer rotierenden
Schüttelvorrichtung inkubiert. Von dieser Kultur werden dann 10 cm3 auf 500 cm3
des Mediums in 2-1-Flaschen geimpft und 2 Tage bei 28'C unter Verwendung einer hin-
und hergehenden Schüttelvorrichtung bebrütet. 301 des Mediums in einem 50-1-Tank
werden mit dieser Kultur geimpft, worauf 24 Stunden bei 28'C bebrütet wird, um eine
Saatkultur zu erhalten.
-
Auf 10001 des Mediums in einem 2000-1-Tank wird die Saatkultur geimpft.
Nach Zugabe von Siliconöl (Schaumunterdrückungsmittel) wird die aerobe Bebrütung
unter Rühren (170 UpM) durchgeführt. Die Belüftung wird für die ersten 35 Stunden
vom Beginn der Bebrütung auf 50 Volumprozent und danach auf 100 Volumprozent eingestellt.
-
Der p$-Wert der Flüssigkeit und die Verdünnungseinheit gegen Bacillus
subtilis nach den angegebenen Bebrütungszeiten sind nachstehend aufgeführt.
| Bebrütungszeit Verdünnungseinheit |
| pH-Wert (Einheiten pro |
| (Stunden) Kubikzentimeter) |
| 0 7,38 0 |
| 17 7,92 10 |
| 30 8,02 75 |
| 41 8,25 150 |
| 54 8,12 350 |
| 65 7,84 350 |
| 78 8,28 750 |
| 89 8,32 750 |
Beispiel 2 Die gemäß Beispiel l erhaltene Kulturflüssigkeit (Bebrütungszeit 78 Stunden)
wird gefiltert. Das Filtrat hemmt in 75facher Verdünnung das Wachstum von Bacillus
subtilis. Zu 700 cm3 des auf px 8,0 bis 8,5 eingestellten Filtrats wird etwa 1
% (bezogen auf das Volumen) Aktivkohle gegeben. Die Mischung wird 30 Minuten
gerührt. Zu diesem Zeitpunkt sind die aktiven Substanzen zum größten Teil an der
Kohle adsorbiert. Die Aktivkohle wird mit etwas Wasser gewaschen und dann in 140
cm3 80°/oigem wäßrigem Methanol suspendiert. Die Suspension wird nach Einstellung
auf pg 2,0 20 Minuten gerührt, um die Wirkstoffe zu eluieren. Die methanolische
Lösung (140 cm3) enthält etwa 160 Mikrogramm wirksame Substanzen pro Kubikzentimeter.
Der gleichen Behandlung wird die restliche Aktivkohle unterworfen, wobei 140 cm3
methanolische Lösung erhalten werden, in welcher der Gehalt an wirksamen Substanzen
31 Mikrogramm pro Kubikzentimeter beträgt. Beispiel 3 Zu 10001 Fermentationsflüssigkeit,
die auf die im Beispiel l beschriebene Weise erhalten wurde (etwa 80 Stunden bebrütet),
werden 8 kg Diatomeenerde als Filterhilfe gegeben. Die Flüssigkeit wird gefiltert,
wobei etwa 7001 Filtrat erhalten werden, die in 150facher Verdünnung das Wachstum
von Bacillus subtilis hemmt. Im Filtrat anwesende Calciumionen werden durch Zusatz
von 4 kg Oxalsäure niedergeschlagen. Die Mischung wird mit 5 kg Diatomeenerde gerührt
und gefiltert. Der pH-Wert des Filtrats (etwa 2) wird mit 10°/aiger wäßriger Natriumhydroxydlösung
auf 8,0 eingestellt. Nach Zugabe von 100 g Natriumäthylendiamintetraacetat wird
das Gemisch in einer Menge von 300 cm3 pro Minute durch eine Säule von 10 cm Durchmesser
und 80 cm Höhe gegeben, die mit 51 eines Kationenaustauschharzes gefüllt ist (Carbonsäure-Typ,
Acrylpolymer in Perlform, wie »Amberlite IRC-50), das vorher zur Adsorption der
wirksamen Substanzen mit Natriumhydroxyd in die Natriumform übergeführt worden war.
Nach Waschen mit Wasser wird das Harz mit 0,5n-Salzsäure in einer Menge von 33 cm,3
pro Minute eluiert, wobei etwa 12 1 eines Eluats erhalten werden, das die wirksamen
Komponenten enthält. Das Eluat wird mit 10°/oiger wäßriger Natriumhydroxydlösung
neutralisiert und zur Entfernung des gebildeten Niederschlages filtriert. Das Filtrat
wird unter vermindertem Druck zu einer Lösung eingeengt, die pro Kubikzentimeter
12,5 mg der wirksamen Komponenten enthält. Beispiel 4 Anorganische Stoffe, die sich
in dem gemäß Beispiel 3 erhaltenen Filtrat abgelagert hatten, werden durch Filtration
entfernt. Das Filtrat wird auf etwa 450 cm3 eingeengt. Die erhaltene Lösung enthält
pro Kubikzentimeter 50 mg aktive Komponenten. Nach Einstellen des pH-Wertes des
Konzentrats auf 5,0 bis 6,5 wird es in einer Menge von 700 cm3 pro Stunde durch
eine Säule von 6,5 cm Durchmesser und 75 cm Höhe geleitet, die mit Aktivkohle, die
vorher mit destilliertem Wasser gewaschen worden war, gefüllt ist. Die an der Säule
adsorbierten wirksamen Komponenten werden mit destilliertem Wasser, das in der gleichen
Menge durch die Säule gegeben wird, eluiert, wobei die Verunreinigungen abgetrennt
werden. Die ersten 2350 cm' des Eluats enthalten hauptsächlich anorganische Substanzen.
Anschließend werden zuerst Zygomycin A und dann Zygomycin B eluiert.
-
Das Merkmal des Eluats wird an jeder 350-cm3-Fraktion von Beginn an
festgestellt. Die Resultate sind folgende:
| Fraktion Volumen, Wirk- Bemerkungen |
| cm' samkeit |
| 1 2350 - Anorganische |
| Substanz |
| 2 350 - |
| 3 350 + Zygomycin A |
| 4 350 + Zygomycin A |
| 5 350 ++ Zygomycin A |
| 6 350 ++ Zygomycin A |
| 7 350 + Zygomycin A |
| 8 350 -+- Zygomycin A |
| 9 350 + Zygomycin A |
| 10 350 - |
| 11 350 - |
| 12 350 + Zygomycin B |
| 13 350 Zygomycin B |
| 14 350 + Zygomycin B |
| 15 350 + Zygomycin B |
| 16 350 + Zygomycin B |
| 17 350 + Zygomycin B |
| 18 350 -;- Zygomycin B |
| 19 350 - |
| 20 350 - |
Die wirksame Komponente in den Fraktionen 3 bis 9 wird als Zygomycin A angenommen,
da sie in der Sakaguchi-Reaktion negativ ist, während die wirksame Komponente in
den Fraktionen 12 bis 18 als Zygomycin B angesehen wird, weil sie in der Sakaguchi-Reaktion
positiv ist.
-
Die das Zygomycin A enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und eingeengt.
Dann wird Aceton zugegeben, um rohes Zygomycin A auszufällen, dessen Ausbeute nach
dem Trocknen 18,0 g beträgt.
-
Aus den das Zygomycin B enthaltenden Fraktionen wird auf die gleiche
Weise 6,75 g rohes Zygomycin B isoliert. Beispiel 5 Auf den Kopf einer mit 60 g
Cellulosepulver gefüllten Säule (3 cm Durchmesser, 28 cm Länge) werden 100 mg des
gemäß Beispiel 4 erhaltenen rohen Zygomycins B gegeben. Dann wird Teilungschromatographie
mit einem Lösungsmittelsystem Phenol-Wasser (1 :1) durchgeführt. Zu je 30 cm3 des
ablaufenden Produkts wird Äther und etwas Wasser gegeben. Die Mischung wird geschüttelt,
um das in der wäßrigen Schicht bleibende Phenol in die Ätherschicht zu überführen.
Die antimikrobische Wirksamkeit jeder wäßrigen Schicht wird mit Hilfe von drei Stämmen
von Mycobacterium tuberculosis var. avium geprüft. Einer dieser Stämme ist resistent
gegen Streptomycin, der zweite ist resistent gegen Neomycin, und der dritte ist
sensitiv gegenüber Streptomycin und Neomycin. Folgende Ergebnisse werden erhalten:
| Durchmesser der Hemmungszone in Millimeter |
| Gegenüber |
| Fraktion Gegen GegenNeomycin Streptomycin |
| Streptomycin resistenter und Neomycin |
| resistenter Stamm empfindlicher |
| Stamm i Stamm |
| 1 bis 3 - - - |
| 4 - 33,0 31,5 |
| 5 - 35,0 30,5 |
| 6 - ! 32,0 30,0 |
| 7 - 30,0 30,0 |
| 8 - 29,0 27,0 |
| 9 - 29,0 27,0 |
| 10 - 29,0 27,0 |
| 11 - 27,0 25,5 |
| 12 - 25,0 25,0 |
| 13 - 20,0 20,0 |
| 14 - 18,5 18,0 |
| 15 - 16,5 17,0 |
| 16 - 17,0 15,0 |
| 17 - 15,0 15,0 |
| 18 - 15,0 14,2 |
| 19 - 15,0 14,0 |
| 20 - 11,5 11,2 |
| 21 13,0 - 11,2 |
| 22 16,0 - 13,0 |
| 23 23,0 - 17,5 |
| 24 17,0 - 11,5 |
| 25 bis 30 - - - |
Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, daß rohes Zygomycin zwei Komponenten enthält,
die beide gegen streptomycinresistente und neomycinresistente Stämme von Mycobacterium
tuberculosis var. avium unwirksam sind. Die gegen den ersteren Stamm unwirksamen
Fraktionen enthalten Zygomycin A, weil sie bei der Ninhydrin-Reaktion positiv sind.
Die gegen den letzteren Stamm unwirksamen Fraktionen enthalten Zygomycin B, weil
sie in der Sakaguchi-Reaktion positiv sind. Das gemäß Beispiel 4 erhaltene rohe
Zygomycin B enthält noch einen geringen Anteil Zygomycin A.
-
Beispiel 6 Eine wäßrige Lösung des rohen Zygomycins B, das auf die
im Beispiel 4 beschriebene Weise erhalten wurde und noch einen geringen Anteil Zygomycin
A enthält, wird durch eine Säule geleitet, die die Natriumform (oder Ammoniumform)
eines schwach sauren Kationenaustauschharzes enthält (Carboxyl-Typ von perlförmigem
Acrylpolymerisat, wie »Amberlite IRC-50«). Nach Waschen mit Wasser wird das Harz
mit 3- bis 5°/oigem wäßrigem Ammoniak eluiert, um allein Zygomycin A zu eluieren.
Das Harz wird erneut mit Wasser gewaschen und mit 0,5n-Salzsäure eluiert, um Zygomycin
B abzutrennen. Das hierbei erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt
und auf die im Beispiel 4 beschriebene Weise chromatographiert, wobei Zygomycin
in Form eines weißen Pulvers erhalten wird.
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Beispiel 7 1001 einer auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise erhaltenen
gefilterten Brühe, die frei von Calciumionen ist, wird mit der Ammoniumform eines
schwach sauren Kationenaustauschharzes in Berührung gebracht (perlförmiges Acrylpolymerisat,
Carboxyl-Typ,
wie Amberlite IRC). Nach Waschen mit Wasser wird
das Harz mit 5°/jgem wäßrigem Ammoniak eluiert, um allein Zygomycin A abzutrennen.
Das Eluat wird mit Salzsäure auf pH 5,0 bis 6,5 eingestellt und an Aktivkohle auf
die im Beispiel 4 beschriebene Weise chromatographiert, wobei Zygomycin-A-Hydrochlorid
erhalten wird. Das Ionenaustauschharz wird weiter mit wäßrigem Ammoniak und anschließend
mit 0,5n-Salzsäure eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und
an Aktivkohle chromatographiert, wobei Zygomycin-B-Hydrochlorid als weißes Pulver
anfällt. Beispiel 8 Einer Lösung von 2,6g Zygomycin-B-Hydrochlorid wird Magnesiumsulfat
zugegeben. Unter Rühren wird bei 50 bis 60°C Methanol langsam zur Mischung gegeben,
um Zygomycin-B-Sulfat abzuscheiden. Diese Abscheidung kann durch Impfen mit einem
kleinen Kristall von Zygomycin-B-Sulfat glatt erfolgen. Um diese Abscheidung zu
vollenden, wird weiteres Methanol zugesetzt. Nach Stehenlassen für mehrere Stunden
bei Raumtemperatur werden die Kristalle mit Methanol gewaschen und getrocknet. Das
Produkt ist kristallines Zygomycin-B-Sulfat, zu dessen Herstellung auch ein wasserlösliches
anorganisches oder organisches Sulfat, wie Zinksulfat und Dimethylaminsulfat, an
Stelle von Magnesiumsulfat verwendet werden kann. Beispiel 9 Auf die im Beispiel
1 beschriebene Weise wird ein anderer Stamm von Streptomyces pulveraceus (IFO-3857)
eingesetzt. Die Bebrütung wird etwa 80 Stunden durchgeführt, wobei eine Brühe erhalten
wird, deren gegen Bacillus subtilis wirksame Verdünnung fast die gleiche ist wie
bei der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Brühe. Aus der hierbei erhaltenen Brühe kann
Zygomycin A und Zygomycin B auf die im Beispiel 2 bis 8 beschriebene Weise isoliert
werden.
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Aus der Bebrütungsbrühe eines Stammes von Streptomyces pulveraceus
werden zwei weitere Arten von antibiotisch wirksamen Substanzen abgetrennt. Die
eine ist im Mycel des bebrüteten Mikroorganismus vorhanden und wird Zygomycin C
genannt. Die andere ist ebenfalls im Mycel sowie auch in der gefilterten Brühe anwesend
und wird Zygomycin D genannt.
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Zygomycin C läßt sich aus dem Mycel durch Extraktion mit einem niederen
Fettalkohol, wie Methanol, abtrennen, weil es in einem solchen Lösungsmittel leicht
löslich ist. In einem wäßrigen Medium kann Zygomycin D in Essigsäureester übergeführt
werden, während andere Zygomycine nicht in diese Ester übergehen. Zygomycin D kann
daher von der gefilterten Bebrütungsbrühe von Streptomyces pulveraceus durch Extraktion
mit Lösungsmitteln, wie Äthylacetat und Butylacetat, abgetrennt werden. Die Reinigung
dieser Komponenten kann chromatographisch an Aktivkohle erfolgen, wobei das Kulturfiltrat
durch eine Aktivkohlesäule geleitet und die Säule dann mit einem organischen Lösungsmittel,
wie Aceton, eluiert wird.
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Die Eigenschaften von Zygomycin C und Zygomycin D unterscheiden sich
stark von denen des Zygomycins A und Zygomycins B. Da Zygomycin C im sauren pH-Bereich
gegen Mikroorganismen wirksam ist, wird es als physiologisch saures Antibiotikum
angesehen. Zygomycin D ist in Wasser oder in organischen Lösungsmitteln leicht löslich.
Es ist ein im sauren oder neutralen p$-Bereich neutrales Antibiotikum, jedoch im
alkalischen pH-Bereich sehr instabil.
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Das antibakterielle Spektrum von Zygomycin, ermittelt nach der Agar-Verdünnungsmethode,
ist wie folgt:
| Mindest- |
| konzentration |
| zur Hemmung |
| Mikroorganismus des Wachstums, |
| Millionstel |
| Gramm pro |
| Kubikzentimeter |
| Escherichia coli ................. 1000 |
| Proteus vulgaris ................ 1000 |
| Mycrococcus pyogenes var. aureus 50 |
| Bacillus subtilis ................. 20 |
| Bacillus cereus .................. 20 |
| Mycobacterium tuberculosis |
| var. avium ................... 1000 |
| desgl. (streptomycinresistenter |
| Stamm) .................. 1000 |
| desgl. (neomycinresistenter Stamm) 1000 |
Zwar wurde dieses Spektrum mit rohem Zygomycin C bestimmt, jedoch geht eindeutig
daraus hervor, daß dieses Antibiotikum gegen grampositive Bakterien wirksam ist.
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Das antibakterielle Spektrum von Zygomycin D wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode
bestimmt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
| Mindest- |
| konzentration |
| zur Wachstums- |
| Mikroorganismus hemmung, |
| Millionstel |
| Gramm pro |
| Kubikzentimeter |
| Saccharomyces cerevisiae ........ 0,06 |
| Aspergillus niger ................ 20 |
| Penicillium crysogenum .... . . . . . . 2 |
| Candida albicans ..... . ......... 100 |
Obwohl die Bestimmung mit rohem Zygomycin D vorgenommen wurde, geht daraus eindeutig
hervor, daß Zygomycin D gegen Hefen wirksam ist. Beispiel 10 8001 der ablaufenden
Flüssigkeit aus Beispie13, von der Zygomycin A und Zygomycin B durch Kationenaustauschharz
abgetrennt wurden, werden auf pH 8,0 eingestellt. Die ablaufende Flüssigkeit wird
dann dreimal mit Äthylacetat extrahiert, und zwar zuerst mit einem Drittel, dann
mit einem Sechstel und nochmals mit einem Sechstel ihres Volumens. Nach Entwässerung
über wasserfreiem Natriumsulfat wird der vereinigte Extrakt unter vermindertem Druck
bei niedriger Temperatur eingeengt, wobei 116 g einer Zygomycin D enthaltenden,
tiefbraunen harzigen Substanz erhalten werden, die das Wachstum von Saccharomyces
cerevisiae bei einer Konzentration von 0,3 Mikrogramm pro Kubikzentimeter hemmt.
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Eine Suspension der harzigen Substanz in 21 20°/oigem Aceton wird
durch eine mit Aktivkohle
gefüllte Säule von 4 cm Durchmesser und
45 cm Höhe geleitet. Die Säule wird dann mit 80°/oigem wäßrigem Aceton behandelt,
wobei Fraktionen aufgefangen werden, die das Wachstum von Hefen hemmen. Die vereinigten
Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 50 g rohes Zygomycin
D als gelbe harzige Substanz erhalten werden. Diese Substanz hemmt das Wachstum
von Hefen bei einer Konzentration von 0,06 Mikrogramm pro Kubikzentimeter. Beispiel
11 Ein methanolischer Extrakt von 150g der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Zuchtbrühe
(Bebrütungszeit 80 Stunden) wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 1,43g
Zygomycin C erhalten werden, das in einer Konzentration von 20 Mikrogramm pro Kubikzentimeter
das Wachstum von Bacillus subtilis hemmt.