DE60101904T2 - Verfahren zur Herstellung von Pravastatin und Lovastatin - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Pravastatin. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Fermentations-Verfahren zur Herstellung von exozellulärem Pravastatin direkt in einem Fermentationsmedium durch Kultivieren von Mikroorganismen der Monascus-Arten.
  • Statine sind sekundäre Pilz-Metaboliten, die Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A (HMG-CoA)-Reduktase (EC 1.1.1.34) als erstes geschwindigkeitsbestimmendes ("committed") Enzym der Cholesterin-Biosynthese inhibieren (Alberts et al., Am. J. Cardiol., 62: 10J–15J, 1988). Statine werden daher als Cholesterin-senkende Arzneimittel verwendet. Alle Statine besitzen eine gemeinsame Struktur, ein Hexahydronaphthalin-System und ein β-Hydroxylacton; ihre Unterschiede beruhen auf Seitenketten und Methylgruppen um den Ring herum. Lovastatin besitzt eine Methylbutyryl-Seitenkette an der Position 8-α und eine Methylgruppe an der Position 6-α des Naphthalinrings; Mevastatin fehlt die Methylgruppe; Pravastatin ist das 6-Hydroxy-Natriumsalz-Analogon von Mevastatin; Monacolin J fehlt die Lovastatin-Methylbutyryl-Seitenkette.
  • Figure 00010001
  • Lovastatin-(a), Mevastatin-(b), Pravastatin-(c) und Monacolin J-(d) Strukturen.
  • Endo et al. (J. Antibiot. 29: 1346–1348, 1976 und FEBS 72: 323–326, 1976) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Mevastatin aus Penicillin citrinum (NRRL 8082). Nach diesem erhält man Lovastatin aus einer Reihe von Kulturen von Monascus ruber (Negishi et al., Hakko Kogaku Kaishi, 64: 509–512, 1986) und 1989 wurde ein industrielles Verfahren für dessen Herstellung unter Verwendung von Aspergillus terreus (ATCC 20542) eingerichtet, welches einen Ertrag von nahezu 180 mg Lovastatin/1 erbrachte, wobei Glycerin in einer Rücklaufkultur/Fed-Batch-Kultur die Kohlenstoffquelle war (Buckland et al. in: "Novel microbial product for Medicine and Agriculture" von A. L. Demain et al., 161–169, Elsevier, 1989).
  • Manzoni et al. (Biotechnology Techniques 12: 7, 529–532, 1998) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von Statinen mit Aspergillus terreus (MIM A1- und A2-Stämme, industrielle mikrobiologische Sammlung der Universität von Mailand, Italien), bei dem diese Metaboliten zum Teil im Kulturmedium vorlagen. Wiederum Manzoni et al. (Biotechnology Letters, 21: 253–257, 1999) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von Lovastatin, Pravastatin und Monacolin J mit Monascus paxii AM12M (Industrielle mikrobiologische Sammlung der Universität von Mailand, Italien), einer spontanen Mutante, bei der 64% des Lovastatins und 53% des Pravastatins im Medium vorlagen. Entsprechend Manzoni et al. in letzterem Artikel waren die Gesamtherstellungserträge der Stämme, die sie auswählten wie in Tabelle 1: Tabelle 1. – Lovastatin- und Pravastatin-Erträge (mg/l) und Gewinnung aus A. terreus (BST-Stamm, industrielle mikrobiologische Sammlung der Universität von Mailand, Italien) und M. paxii (AM12M)-Kulturen.
    Figure 00030001
  • Obwohl diese Verfahren schon eine Verbesserung für die Herstellung von Pravastatin und Lovastatin darstellen, sind ihre Herstellungserträge relativ gering. Daher stellen höhere Erträge und niedrigere Kosten immer noch eine wichtige Notwendigkeit zur Herstellung von sowohl Pravastatin als auch Lovastatin dar.
  • In unseren Laboratorien wurde ein mutierter Stamm des Mikroorganismus Monascus ruber ATCC 22080 isoliert und in unserer Stammsammlung als GN/33 identifiziert, der am 19. Juni 2000 bei der DSMZ mit der Identifikationsnummer DSM 13554 hinterlegt wurde.
  • Eigenschaften von Monascus ruber DSM 13554
  • Ein mutierter Stamm von Monascus ruber RTCC 22080 wurde aus einer Kultur auf Agar als Sektormutante einer Kolonie iso liert, die sich makromorphologisch vom Anfangsstamm unterschied.
  • 1 zeigt eine Kolonie von Monascus ruber ATCC 22080, bei der ein morphologisch andersartiger Sektor auftaucht; der Sektor wurde dann isoliert und stabilisiert, um Regression zu vermeiden. Im Hinblick auf Monascus ruber ATCC 22080 zeigte der isolierte Monascus ruber eine andersartige Pigmentierung während der Sporenbildungsphase, während bei der Strukturmorphologie bei mikroskopischer Betrachtung keine Unterschiede nachgewiesen wurden.
  • Herstellung von Pravastatin
  • Entsprechend einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung fand man heraus, dass Pravastatin mittels eines Fermentationsprozesses hergestellt werden kann, welcher die Schritte umfasst:
    • a) Vorfermentieren vom Monascus ruber-Stamm DSM 13554 (GN/33) unter aeroben Bedingungen in einem ersten wässrigen Nährmedium, das mindestens eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff enthält;
    • b) Fermentieren des vorfermentierten Stammes unter aeroben Bedingungen in einem zweiten wässrigen Nährmedium, das mindestens eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff umfasst, und
    • c) Gewinnen von Pravastatin.
  • Insbesondere umfasst mindestens eines der obigen Medien ein Mineralsalz und die Schritte a) und b) werden für 2 bis 4 Tage, bevorzugt 3 Tage bzw. 4 bis 12 Tage, bevorzugt 9 Tage, durchgeführt, beide bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 35°C, bevorzugt 22 bis 28°C, und in einem pH-Bereich von 4 bis 8, bevorzugt von 5 bis 7.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann außerdem vorteilhaft durchgeführt werden, indem mindestens eine der Vorfermentierungs- und Fermentierungs-Stufen entweder mit Luft oder Sauerstoffgas und/oder einem Gemisch daraus begast wird.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, exozelluläres Pravastatin entweder in Zell-assoziierter Form oder in die Kulturnährlösung freisetzbar direkt als sekundäres Metabolit in einem Fermentations-Kulturmedium mit Herstellungserträgen auf einem sehr hohen Niveau, d. h. 1 bis 4,0 g/l, zu erhalten, und zwar unter Verwendung von Monascus ruber DSM 13554 (GN/33).
  • Die oben erwähnten ersten und zweiten wässrigen Nährmedien müssen sich voneinander unterscheiden. Die oben erwähnten zwei Mikroorganismen werden in Kulturmedien kultiviert, das mindestens eine einfache und/oder komplexe Kohlenstoffquelle und mindestens eine organische und/oder anorganische Stickstoffquelle umfassen; bevorzugt wird mindestens ein Mineralsalz zu mindestens einem der Medien hinzugegeben.
  • Die einfachen und komplexen Kohlenstoffquellen können zum Beispiel von landwirtschaftlichen und/oder industriellen Abfällen stammen; insbesondere können sie mindestens eine der folgenden Substanzen umfassen: Zucker, wie beispielsweise Dextrose, Dextrin, Glucose, Lactose, Fructose, Saccharose, Manitol, Mannose; organische Säuren; Alkohole; Aldehyde; Glycerin; Stärken wie zum Beispiel Mais- und Kartoffelstärke; Fette; Öle; Kohlenwasserstoffe und Molke und Ähnliches.
  • Die organischen und anorganischen Stickstoffquellen können zum Beispiel mindestens eine der folgenden Substanzen umfassen: Malzextrakt, Maisquellwasser, enzymatisches Caseinhydrolysat, Sojamehle, Baumwollmehle, Arachismehle, trockene Hefeextrakte, Peptone wie zum Beispiel Sojapepton, Fleischextrak te, Nitrate, Aminosäuren, Casein, Ammoniumsalze wie Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniak und Ähnliche.
  • Die im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt verwendeten Mineralsalze können abhängig vom Kulturmedium variieren; die löslichen anorganischen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Magnesium-, Kalzium-, Kupfer-, Sulfat-, Chlorid-, Nitrat-, Carbonat-Ionen liefern, können verwendet werden. Solche Salze könne zum Beispiel Natriumnitrat, Kupfersulfat, Ammoniumnitrat, einbasisches und zweibasisches Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, einbasisches Kaliumsulfat, Natriumnitrat, Kalziumcarbonat sein.
  • Außerdem kann das Medium mindestens eine Aminosäure-(z. B. Cystein, Methionin, Glutamat, Glutamin, Glycin, Leucin, etc.) und/oder eine Phosphorquelle (z. B. Kaliumphosphat, etc.) und/oder einen Alkohol (z. B. Methanol, Ethanol, etc.) umfassen.
  • Sowohl die Vorfermentierungs- als auch die Fermentierungsschritte werden entweder in Flaschen oder in einem Fermenter entsprechend den traditionellen Verfahren durchgeführt, und zwar über eine Zeitspanne, die von dem Mikroorganismus abhängt, entsprechend dem, was oben dargestellt ist, und wie der Fachmann sehr einfach verstehen würde, über den Übergang von Schrägkultur zur Vorimpf-, Impf- und Fermenter-Kultur.
  • Die Herstellung von Pravastatin wurde über analytische Assays während des Verlaufs der Fermentation verfolgt.
  • Analytische Verfahren
    • HPLC-Chromatographie
    • Instrument: Merck Hitachi
    • L-7100-Pumpe; L-7400-Detektor; L-7200-Autosampler
    • Injektionsvolumen: 20 Mikroliter
    • Säule Merck Lichrospher 60 RP Auswahl B (5 Mikroliter), Raumtemperatur
    • Mobile Phase: Acetonitril/Wasser, angesäuert mit Trifluoressigsäure (0,05% V/V) (40 : 60), Fließgeschwindigkeit 0,8 ml/min–1
    • Detektor: UV 230 nm; Extinktionssensitivität 0,050.
  • Probenherstellung:
  • Nach Zentrifugation (5 min. bei 10.000 Upm) des Mycels, wie es ist und/oder gewaschen, wurde die klare obere Phase (100 Mikroliter) adäquat verdünnt und in das HPLC-System injiziert.
  • Quantifizierung:
  • Eine Standardmenge Pravastatin wurde in Methanol mit einer Konzentration von 300 mg/l gelöst. Die Proben wurden mit verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 50 bis 300 mg/l getestet.
  • Der Rückgewinnungsschritt [Schritt c] wird entsprechend traditionellen Verfahren durchgeführt, wie der Fachmann es einfach versteht, zum Beispiel mittels Filtration des Mycels und Extraktion des Rohproduktes am Ende der Fermentation aus der alleinigen oberen Phase mit einem organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Ethylacetat, Methylenchlorid, Chloroform, Acetonitril, Aceton, Petrolether und Ähnlichen.
  • Die Reinigung des extrahierten Fermentationsproduktes kann mittels Chromatographie an Ionentauscherharzen und/oder Absorptionsharzen wie beispielsweise RELITE 2AS und SEPABEADS SP 207 durchgeführt werden.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie einzuschränken.
  • Beispiel 1
  • Der Stamm Monascus ruber GN/33 – DSM 13554 wurde in Agar-Schrägkultur bestehend aus PDA gelagert und für 10 Tage bei 25°C inkubiert.
  • Es wurden 250 ml-Flaschen verwendet, die jeweils 50 ml des Vorkultivierungs-Mediums mit der folgenden Zusammensetzung (g/l) in 1000 ml Leitungswasser enthielten:
    Figure 00080001
  • Die Sterilisierung wurde für 20 min. bei 121°C durchgeführt, jedoch wurde Glucose getrennt sterilisiert und später unter sterilen Bedingungen zum Kulturmedium hinzugegeben; der daraus hervorgehende pH-Wert von 4,4 wurde mit 1 N NaOH auf 6,2 eingestellt.
  • Jede Flasche wurde mit 1,5 ml einer Standardsuspension in steril destilliertem H2O angeimpft, das 0,5% Tween und Sporen (Extinktion 0,1 bei 580 nm) enthielt, die man von einer Kultur in PDA erhielt, die bei 25°C für zwei Tage inkubiert worden war. Die Flaschen wurden zur Inkubation bei 28°C auf einen Wechselschüttler (60 Hübe/min, 5 cm Hub) platziert.
  • Es wurden 1000 ml-Schikaneflaschen verwendet, die jeweils 100 ml Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung (g/l) in 1000 ml Leitungswasser enthielten:
    Figure 00090001
  • Die Sterilisierung wurde für 30 min. bei 121°C durchgeführt, jedoch wurde Glucose getrennt sterilisiert und unter sterilen Bedingungen später zum Kulturmedium hinzugegeben; der daraus hervorgehende pH-Wert von 5,9 wurde mit 1 N HCl auf 5,8 eingestellt.
  • Jede Flasche wurde mit 10% der zweitägigen Vorkultur angeimpft. Die Flaschen wurden zur Inkubation bei 25°C für 144 Stunden auf einen Wechselschüttler (60 Hübe/min, 5 cm Hub) platziert. Am Ende der Fermentierung wurde das Kulturmedium analysiert, mit folgendem Ergebnis: Herstellung von 1435 mg/l Pravastatin.
  • Beispiel 2
  • Das in Beispiel 1 dargestellte Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurden die Flaschen mit einer 48-stündigen Nährkultur angeimpft (10%), die unter Verwendung desselben Kulturmediums und unter denselben Fermentationsbedingungen wie jenen, die in Beispiel 1 angegeben sind, erhalten wurde.
  • Am Ende der Fermentation (120 Stunden) wurde die Kultur analysiert, mit folgendem Ergebnis: Herstellung von 1025 mg/l Pravastatin.
  • Beispiel 3
  • Die Sporen von Monascus ruber DSM 13554 wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, geerntet und in 750 ml Schikaneflaschen angeimpft, die 100 ml Kulturmedium enthielten, das die folgende Zusammensetzung (g/l) in 1000 ml Leitungswasser besaß:
    Figure 00100001
  • Die Sterilisierung wurde bei 121°C über 30 min. durchgeführt, jedoch wurde Glucose getrennt sterilisiert und später unter sterilen Bedingungen zum Kulturmedium hinzugefügt; der daraus hervorgehende pH-Wert von 5,7 wurde mit 1 N NaOH auf 5,8 eingestellt.
  • Die Flaschen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben angeimpft und für 72 Stunden inkubiert.
  • Es wurde ein Fermenter mit einem Nutzvolumen von 5 1 präpariert, der das Kulturmedium mit der folgenden Zusammensetzung (g/l) in 1000 ml Leitungswasser enthielt:
    Figure 00100002
  • Die Sterilisierung wurde über 45 min. bei 121°C durchgeführt, jedoch wurde Glucose getrennt sterilisiert und später unter sterilen Bedingungen zum Kulturmedium hinzugegeben; der daraus hervorgehende pH-Wert von 5,8 wurde mit 1 N HCl auf 5,5 eingestellt.
  • Der Fermenter wurde mit der 72 Stunden lang vorfermentierten Nährkultur von 5 Flaschen angeimpft, wie oben beschrieben (Impfmaterial 10%).
  • Die Fermentierung wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Temperatur 25°C, Rühren mit 300 Upm, Begasung 1,5 vvm, Zugabe von 8 ml Entschäumer (Polypropylenglycol 2000, Aldrich).
  • Am Ende der Fermentation (96 Stunden) wurde die Kultur analysiert, mit folgendem Ergebnis: Herstellung von 3065 mg/l Pravastatin.
  • Die Isolierung von Pravastatin wurde mittels Filtration des Mycels und Extraktion der alleinigen oberen Phase mit Lösungsmitteln durchgeführt. Die gefilterte Kulturmasse wurde mit Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 1,5 angesäuert, wobei die Temperatur zwischen 0° und 5°C gehalten wurde. Die Extraktion wurde unter Verwendung eines gleichen Volumens Ethylacetat durchgeführt und die Extraktion wurde zweimal durchgeführt. Die zwei extrahierten Volumina wurden geerntet, mit wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert, gefiltert und unter Vakuum auf konzentriert, wodurch ein Gesamtextraktionsertrag von 85% erzielt wurde (2605 mg/l, Rohprodukt).
  • Die Rohmasse wurde mit H2O behandelt und an dem stark anionischen Harz RELITE 2A S (Resindion S.R.L.-Mitsubishi Chemical Corporation) absorbiert; die Elution wurde mit Natriumacetat durchgeführt.
  • Eine zweite Absorption wurde am Absorptionsharz SEPBEADS SP 207 (Resindion S.R.L.-Mitsubishi Chemical Corporation) durchgeführt; die Masse wird mit H2O eluiert und lyophilisiert (Ertrag: 1302,5 mg/l).
  • Beispiel 4
  • Das in Beispiel 3 dargestellte Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurde Methylenchlorid als Lösungsmittel verwendet, um die Extraktion durchzuführen. Es wurde ein Extraktionsertrag von 65% (1992 mg/l rohes Pravastatin) der Fermentation erzielt.
  • Beispiel 5
  • Das in Beispiel 3 dargestellte Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurde das Mycel nach der Filtration mit angesäuertem H2O gewaschen und dann wie in Beispiel 3 angegeben, extrahiert, und so ein Pravastatin-Ertrag von 1700 mg/l erzielt.
  • Beispiel 6
  • Das in Beispiel 3 dargestellte Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurde das geerntete Medium mikrofiltriert und mit angesäuertem Wasser gewaschen. Der Filterkuchen wurde wie in Beispiel 3 beschrieben, extrahiert, und es wurden so 4183 mg/l rohes Pravastatin erhalten.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00130001
  • Figure 00140001

Claims (10)

  1. Fermentations-Verfahren zur Herstellung von Pravastatin, umfassend: a) Vorfermentieren vom Monascus ruber-Stamm DSM 13554 (GN/33) unter aeroben Bedingungen in einem ersten wässrigen Nährmedium, das mindestens eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff enthält; b) Fermentieren des vorfermentierten Stammes unter aeroben Bedingungen in einem zweiten wässrigen Nährmedium, das mindestens eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff umfasst, und c) Gewinnen von Pravastatin.
  2. Fermentations-Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens ein Medium ein Mineralsalz umfasst.
  3. Fermentations-Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritte a) und b) über 2 bis 4 bzw. 4 bis 12 Tage bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 35°C und einem pH im Bereich von 4 bis 8 durchgeführt werden.
  4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritte a) und b) über 3 bzw. 9 Tage bei einer Temperatur im Bereich von 22 bis 28°C und einem pH im Bereich von 5 bis 7 durchgeführt werden.
  5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Kohlenstoff-Quelle mindestens eine der folgenden Substan zen umfasst: Zucker, organische Säuren, Alkohole, Aldehyde, Glycerin, Stärken, Fette, Öle, Kohlenwasserstoffe und Molke.
  6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Kohlenstoff-Quelle mindestens eine der folgenden Substanzen umfasst: Dextrose, Dextrin, Glukose, Laktose, Fruktose, Saccharose, Manitol, Mannose, Maisstärke und Kartoffelstärke.
  7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Stickstoffquelle mindestens eine der folgenden Substanzen umfasst: Malzextrakt, Maisquellwasser, enzymatisches Casein-Hydrolysat, Sojamehle, Baumwollmehle, Arachismehle, trockene Hefeextrakte, Peptone, Fleischextrakte, Nitrate, Aminosäuren, Casein, Ammoniumsalze, Harnstoff, Ammoniak.
  8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Medium ein lösliches anorganisches Mineralsalz umfasst, welches Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Magnesium-, Calcium-, Kupfer-, Sulfat-, Chlorid-, Nitrat-, Carbonat- Ionen bereitstellt.
  9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Medium mindestens eines der folgenden Salze umfasst: Natriumnitrat, Kupfersulfat, Ammoniumnitrat, einbasisches und zweibasisches Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, einbasisches Kaliumsulfat, Natriumnitrat, Calciumcarbonat.
  10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritt a) und/oder Schritt b) unter Begasung entweder mit Luft oder Sauerstoff-Gas und/oder einem Gemisch daraus durchgeführt werden.
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