ES2314076T3 - Bacterias corineformes que producen los compuestos quimicos ii. - Google Patents
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Abstract
Bacterias corineformes con alta estabilidad que producen un L-aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de L-lisina, L-metionina, L-treonina y L-valina donde estas bacterias comprenden al menos dos copias de un gen donde dichas copias están presentes en el sitio natural en dicha bacteria en rearreglo tandem y pertenecen a los genes requeridos para la producción de dichos L-aminoácidos y donde dichos genes son seleccionados del grupo que consiste de: a) para la producción de L-lisina: uno o más de los genes seleccionados a partir del grupo que consiste de (Ver secuencia) b) para la producción de L-metionina: uno o más de los genes seleccionados a partir del grupo que consiste de (Ver secuencia) c) para la producción de L-treonina: uno o más de los genes seleccionados a partir del grupo que consiste de (Ver secuencia) d) para la producción de L-valina: uno o más de los genes seleccionados a partir del grupo que consiste de (Ver secuencia) donde dichas bacterias son obtenidas por transformación usando vectores que no se replican en bacterias corineformes y que portan dos copias de dichos genes en rearreglo tandem, y donde de 0 a 24 residuos de nucleótidos de secuencias del vector usado permanecen en los flancos de dichos genes.
Description
Bacterias corineformes que producen los
compuestos químicos II.
Los compuestos químicos, los cuales significan,
en particular, L-aminoácidos, vitaminas, nucleósidos
y nucleótidos y D-aminoácidos, son usados en la
medicina humana, en la industria farmacéutica, en cosméticos, en la
industria de productos alimenticios y en la nutrición animal.
Numerosos L-aminoácidos son
preparados por fermentación a partir de cepas de bacterias
corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum.
Debido a su gran importancia, se emprenden trabajos constantemente
para mejorar los procesos de preparación. Las mejoras a los
procesos pueden relacionarse con las medidas de fermentación, tales
como, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o la
composición de los medios de nutrición, tales como, por ejemplo, la
concentración de azúcar durante la fermentación, o la preparación de
la forma de producto, por ejemplo, por cromatografía de intercambio
iónico, o las propiedades de rendimiento intrínsecas del
propio
microorganismo.
microorganismo.
Los métodos de mutagénesis, selección y
selección de mutantes son usados para mejorar las propiedades de
rendimientos de estos microorganismos. Cepas que son resistentes a
los antimetabolitos o son autotróficas para metabolitos de
importancia regulatoria y que producen compuestos particulares son
obtenidas de esta manera.
Los métodos de la técnica de ADN recombinante
han sido empleados por algunos años para mejorar la cepa de las
cepas de Corynebacterium, amplificando los genes de biosíntesis
individual e investigando el efecto en la
producción.
producción.
Un método común comprende la amplificación de
ciertos genes de biosíntesis en el microorganismo particular por
medio de plásmidos replicándose episomalmente. Este procedimiento
tiene la desventaja de que durante la fermentación, que en los
procesos industrial está en general asociada con numerosas
generaciones, los plásmidos se pierden espontáneamente
(inestabilidad segregacional).
Schlegel: "Allgemeine Mikrobiologie" 1981,
Thieme Verlag, Stuttgart, es un extracto de un libro de texto, que
divulga métodos de selección y métodos para detectar diferentes
tipos de mutaciones.
Günter Kahl: "The dictionary of gen
technology" 2001, Wiley-VCH, Weinheim,
proporciona una definición de direccionamiento génico y
direccionamiento génico dirigido al sitio.
Otro método comprende duplicar ciertos genes de
biosíntesis por medio de plásmidos que no se replican en el
microorganismo particular. En este método, el plásmido, que incluye
el gen de biosíntesis clonado, es integrado dentro del gen de
biosínteis cromosomal del microorganismo (Reinscheid y otros.,
Applied and Environmental Microbiology 60(1),
126-132 (1994); Jetten y otros., Applied
Microbiology and Biotechnology 43 (1):76-82
(1995).
Reinsched divulga un vector y un método para
introducir el operon hom-1-thrB de
Corynebacterium glutamicum, que codifica una homoserina
dehidrogenasa resistente a la inhibición de retroalimentación por
L-treonina y homoserina quinasa. Se muestra que
algunas copias de dicho operón pueden integrarse en el cromosoma y
que con el aumento del número de copias la producción de treonina
aumenta. Además, se muestra que el C. glutamicum
recombinante es estable para más de 70 generaciones cuando crece en
un medio sin kanamicina.
Una desventaja de este método es que la
secuencia nucleotídica del plásmido y del gen de resistencia al
antibiótico necesario para la selección permanece en el
microorganismo. Esto es una desventaja, por ejemplo, para la
disposición y utilización de la biomasa. Además, el experto espera
que tales cepas sean inestables como resultado de la desintegración
por "entrecruzamiento tipo Campbell" en un correspondiente
número de generaciones tales como son usuales en las fermentaciones
industriales.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores tenían el objeto de proveer
nuevas medidas para la preparación fermentativa mejorada de
L-aminoácidos seleccionados a partir del grupo que
consiste de L-lisina, L-metionina,
L-treonina y L-valina usando
bacterias corineformes.
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción proporciona bacterias
corineformes, en particular del género Corynebacterium, que producen
uno o más compuestos químicos deseados, caracterizados porque
\newpage
- a)
- en lugar de una copia singular de un marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo naturalmente presente en el sitio particular deseado (locus), éstos tienen al menos dos copias de dicho marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo, preferiblemente en rearreglo tandem, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en el sitio particular, y porque éstos
- b)
- opcionalmente tienen al menos una tercera copia de un marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo en cuestión en un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presentes en un sitio de gen adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona microorganismos como es
descrito en las reivindicaciones de 1 a 13.
La descripción también proporciona procesos para
la preparación de uno o más compuestos químicos, que comprende los
siguientes pasos:
- a)
- fermentación de bacterias corineformes, en particular del género Corinebacterium, que
- i)
- en lugar de una copia singular de un marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo naturalmente presente en el sitio particular deseado (locus), tienen al menos dos copias de dicho marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo, preferiblemente en reareglo tandem, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en el sitio particular, y porque éstas
- ii)
- opcionalmente tienen al menos una tercera copia de un marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo en un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presentes en el sitio de gen adicional,
- \quad
- bajo condiciones que permiten la expresión de dichos marcos de lectura abiertos (ORFs), genes o alelos,
- b)
- concentración del compuesto(s) químico(s) en el caldo de fermentación y/o en las células de la bacteria,
- c)
- aislamiento del compuesto(s) químico(s), opcionalmente
- d)
- con constituyentes a partir del caldo de fermentación y/o la biomasa a la extensión de > (mayor que) 0 a 100%.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona un proceso para la
preparación de L-aminoácidos, seleccionados a partir
del grupo que consiste de L-lisina,
L-metionina, L-treonina y
L-valina como es descrito en las reivindicaciones 14
a 16.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos químicos son entendidos, como una
definición de aminoácido. Las rutas de biosíntesis de estos
compuestos son conocidos y están disponibles en el arte
anterior.
Aminoácidos define
L-aminoácidos, seleccionados a partir del grupo que
consiste de L-treonina, L-valina,
L-metionina, L-lisina, y sales de
los mismos. L-Lisina es muy particularmente
preferida.
Aminoácidos proteinogénicos son entendidos como
una definición de los aminoácidos que tienen lugar en las proteínas
naturales, es decir en las proteínas de microorganismos, plantas,
animales y humanos.
Las bacterias corineformes son, en particular,
aquellas del género Corynebacterium. Del género Corynebacterium,
son preferidas las especies Corynebacterium glutamicum,
Corynebacterium ammoniagenes y Corynebacterium
thermoaminogenes. La información en la clasificación taxonómica
de las cepas de este grupo de bacterias será encontrada, entre
otros, en Kämpfer y Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology
42, 989-1005 (1996)) y en
US-A-5, 250,434.
\newpage
Las cepas apropiadas de las especies
Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) son, en
particular, las conocidas cepas tipo-salvaje
y mutantes o cepas, tal como son
conocidas a partir del arte anterior, producidas más adelante que
producen dichos
aminoácidos.
Cepas apropiadas de las especies
Corynebacterium ammoniagenes (C. ammoniagenes) son, en
particular, las conocidas cepas tipo-salvajes
y mutantes o cepas, tal como son
conocidas a partir del arte anterior, producidas más adelante que
producen dichos
aminoácidos.
Cepas apropiadas de las especies
Corynebacterium thermoaminogenes (C. thermoaminogenes)
son, en particular, las conocidas cepas
tipo-salvajes
y mutantes o cepas, tal como son
conocidas a partir del arte anterior, producidas más adelante que
producen dichos
aminoácidos.
Cepas con la designación "ATCC" pueden ser
obtenidas a partir de la Colección Americana de Cultivo Celular
(Manassas, VA, USA). Cepas con la designación "FERM" pueden ser
obtenidas del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial
Avanzada (AIST Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki,
Japón). Las cepas de Corynebacterium thermoaminogenes
mencionadas (FERM BP-1539, FERM
BP-1540, FERM BP-1541 y FERM
BP-1542) son descritas en US-A
5,250,434.
Marco de lectura abierto (ORF) describe una
sección de una secuencia nucleotídica que codifica o puede codificar
para una proteína o polipéptido o ácido ribonucleico para el que
ninguna función puede ser asignada de acuerdo al arte anterior.
Después de la asignación de una función a la
secuencia nucleotídica en cuestión, esta es en general denominada un
gen.
Los alelos son en general entendidos que
significan formas alternativas de un gen dado. Las formas son
distinguidas por diferencias en la secuencia nucleotídica.
En el contexto de la presente invención,
endógeno, es decir especie-característica, los genes
son preferiblemente usados. Estos se entienden como una definición
de los genes o secuencias nucleotídicas de los mismos presentes en
la población de una especie, tal como, por ejemplo,
Corynebacterium glutamicum.
Una "copia singular de un marco de lectura
abierto (ORF), gen o alelo naturalmente presente en un sitio
particular deseado (locus)" se entiende como una definición de
las circunstancias en que en un gen en general naturalmente tiene
lugar una (1) copia en la forma de su secuencia nucleotídica en su
sitio o sitio de gen en el correspondiente organismo
tipo-salvaje o correspondiente organismo parental u
organismo de partida. Este sitio es preferiblemente en el
cromosoma.
De esta manera, por ejemplo, el gen lysC o un
alelo lysC^{FBR} que codifica para una aspartato kinasa resistente
a la "retroalimentación" está presente en una copia en el
sitio lysC o locus lysC o sitio de gen lysC y está flanqueado por
el marco de lectura abierto orfX y el leuA en un lado y por el gen
asd en el otro lado.
Aspartatoquinasas resistentes a la
"retroalimentación" son entendidas como que significan
aspartato quinasas que, comparadas con la forma
tipo-salvaje, tienen una baja sensibilidad para la
inhibición por mezclas de lisina y treonina o mezclas de AEC
(aminoetilcisteína) y treonina o lisina solo o AEC solo. Las cepas
que producen L-lisina típicamente contienen tales
aspartatoquinasas resistentes o desensibilizadas a la
"retroalimentación".
La secuencia nucleotídica del cromosoma de
Corynebacterium glutamicum es conocido y puede ser encontrado
en la solicitud de patentes
EP-A-1108790 y Número de Acceso
(Acceso No.) AX114121 del banco de datos de secuencias
nucleotídicas de los European Molecular Biologies Laboratories
(EMBL, Heildelberg, Alemania y Cambridge, UK). La secuencia
nucleotídica de orfX, el gen leuA y el gen asd tienen los Números de
Acceso AX120364 (orfX), AX123517 (leuA) y AX123519 (asd).
Bancos de datos adicionales, pueden también ser
usados tales como, por ejemplo, aquel del National Center for
Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) aquel del Swiss
Institute of Bioinformatics (Swissprot, Ginebra, Suiza) o aquel de
la Proteins Information Resource Database (PIR, Washington, DC,
USA).
"Rearreglos tandem" de dos o más copias de
un marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo se refiere a si
estos son rearreglados en una fila directamente adyacente en la
misma orientación.
"Un sitio de gen adicional" se entiende que
significa un segundo sitio de gen, de la secuencia nucleotídica que
es diferente de la secuencia de ORF, gen o alelo que ha sido al
menos duplicado en el sitio natural. Este sitio de gen adicional, o
la secuencia nucleotídica presente en el sitio de gen adicional,
está preferiblemente en el cromosoma y es en general no esencial
para el crecimiento y para la producción de los compuestos
químicos
deseados.
deseados.
Los mencionados "sitios de gen adicional"
incluyen, por supuesto, no solamente las regiones codificantes de
los marcos de lectura abiertos o genes mencionados, sino también las
regiones o secuencias nucleotídicas que quedan upstream que son
responsables para la expresión y regulación, tales como, por ejemplo
sitios de unión de ribosoma, promotores, sitios de unión para
proteínas reguladoras, sitios de unión para ácidos ribonucleicos
reguladores y atenuadores. Estas regiones en general quedan en el
rango de 1-800, 1-600,
1-400, 1-200, 1-100
ó 1-50 nucleótidos upstream de la región
codificante. De la misma manera, las regiones que quedan downstream,
tales como, por ejemplo terminadores de transcripción, son también
incluidas. Estas regiones en general quedan en el rango de
1-400, 1-200, 1-100,
1-50 ó 1-25 nucleótidos downstream
de la región codificante.
Las regiones intergénicas en el cromosoma, es
decir secuencias nucleotídicas sin una función codificante, pueden
además ser usadas. Finalmente, profagos o fagos defectuosos
contenidos en el cromosoma pueden ser usados para esto.
Un profago se entiende que significa un
bacteriófago, en particular el genoma del mismo, donde éste es
replicado junto con el genoma del huésped y la formación de
partículas infecciosas no tiene lugar. Un fago defectuoso se
entiende que significa un profago, en particular el genoma del
mismo, que, como resultado de varias mutaciones, ha perdido la
habilidad para formar las llamadas partículas infecciosas. Fagos
defectuosos son también llamados crípticos. Los profagos y fagos
defectuosos están frecuentemente presentes en forma integrada en el
cromosoma de su huésped. Además existen detalles en el arte
anterior, por ejemplo en el libro de texto por Edward A. Birge
(Bacterial and Bacteriophage Genetics 3^{rd} ed.,
Springer-Verlag, New York, USA, 1994) o en el libro
de texto de S. Klaus y otros. (Bakterienviren, Gustav Fischer
Verlag, Jena, Alemania, 1992).
Para producir la bacteria corineforme de acuerdo
a la invención, la secuencia nucleotídica del gen deseado o alelo,
preferiblemente incluyendo la expresión y/o señales de regulación,
es aislada, al menos dos copias son rearregladas en una fila,
preferiblemente en rearreglo tandem, estas son entonces transferidas
en la bacterium corineforme deseada, preferiblemente con la ayuda de
vectores que no se replican o se replican solamente en una
extensión limitada en la bacteria corineforme, y aquellas bacterias
en que dos copias del ORF, genes o alelos son incorporados en un
sitio particular deseado en lugar de una copia singular
originalmente presente son aisladas, ninguna secuencia nucleotídica
que es capaz de/posibilita replicación episomal en microorganismos,
ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la
transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte
resistencia a los antibióticos permaneciendo en un sitio natural
particular (locus).
La expresión y/o señales de regulación
mencionadas, tales como, por ejemplo, sitios de unión de ribosoma,
promotores, sitios de unión para proteínas reguladoras, sitios de
unión para ácidos ribonucleicos reguladores y atenuadores que
quedan upstream de la región codificante del ORF, gen o alelo, están
en general en un rango de 1-800,
1-600, 1-400, 1-200,
1-100 ó 1-50 nucleótidos upstream de
la región codificante. La expresión y/o señales de regulación
mencionadas, tales como por ejemplo terminadores de transcripción,
que quedan downstream de la región codificante del ORF, gen o
alelo, están en general en el rango de 1-400,
1-200, 1-100, 1-50 o
1-25 nucleótidos downstream de la región
codificante.
Preferiblemente, también, ningún residuo de
secuencia de los vectores usados o ADN
especie-foránea, tales como, por ejemplo, sitios de
corte de restricción, permanece en los flancos de los ORFs, genes o
alelos amplificados de acuerdo a la invención. En cada caso un
máximo de 24, preferiblemente un máximo de 12, particularmente
preferiblemente un máximo de 6 nucleótidos de tal ADN opcionalmente
permanece en los flancos.
Al menos una tercera copia de un marco de
lectura abierto (ORF), gen o alelo en cuestión es opcionalmente
insertado en un sitio de gen adicional, o algunos sitios de genes
adicionales, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz
de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna
secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición
y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los
antibióticos estando presente en un sitio de gen adicional.
Ningún residuo de secuencias de los vectores
usados o ADN especie-foránea, tales como, por
ejemplo, sitios de cortes de restricción, permanece en un sitio de
gen adicional. Un máximo de 24, preferiblemente un máximo de 12,
particularmente preferiblemente un máximo de 6 nucleótidos de tal
ADN upstream o downstream del ORF, gen o alelo incorporado
opcionalmente permanece en un sitio de gen adicional.
De acuerdo con la descripción también se
proporciona un proceso para la producción de bacterias corineformes
que producen uno o más compuestos químicos, caracterizados
porque
- a)
- la secuencia nucleotídica de un ORF deseado, gen o alelo, preferiblemente que incluye la expresión y/o señales de regulación, es aislado
- b)
- al menos dos copias de la secuencia nucleotídica del ORF, gen o alelo son rearreglados en una fila preferiblemente en rearreglo tandem
- c)
- la secuencia nucleotídica obtenida de acuerdo a b) es incorporada en un vector que no se replica o se replica solamente en una extensión limitada en la bacteria corineforme,
- d)
- la secuencia nucleotídica de acuerdo a b) ó c) es transferida en la bacteria coreniforme, y
- e)
- son aislados bacterias coreniformes que tienen al menos dos copias de un ORF deseado, gen o alelo en el sitio natural particular deseado en lugar de una copia singular de ORF, gen o alelo originalmente presente, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos permaneciendo en el sitio natural particular (locus), y
- f)
- al menos una tercera copia de un marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo en cuestión es opcionalmente introducido en un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos permaneciendo en un sitio de gen adicional.
La invención proporciona un proceso descrito en
las reivindicaciones 12 a 16.
Por las medidas de acuerdo a la invención, la
productividad de la bacteria corineforme o de los procesos
fermentativos para la preparación de compuestos químicos es mejorada
con respecto de una o más de las características seleccionadas del
grupo consistente de concentración (L-aminoácidos
formados, basado en la unidad de volumen), rendimiento
(L-aminoácidos formados, basado en la fuente de
carbono consumido) y la velocidad de formación de producto
(L-aminoácidos formados basados en el tiempo) por al
menos 0.5-1% o al menos 1 a 1.5% o al menos
1.5-2.0%.
Las instrucciones sobre los métodos de
ingeniería genética convencionales tales como, por ejemplo,
aislamiento de ADN cromosomal, ADN plasmídico, manipulación de
enzimas de restricción etc., son encontradas en Sambrook y otros
(Molecular Cloning- A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor
Laboratory Press). Las instrucciones sobre la transformación y
conjungación en bacterias corineformes son encontradas entre otros,
en Thierbach y otros (Applied Microbiology and Biotechnology
29,356-362 (1988)), en Schäfer y otros (Journal of
Bacteriology 172, 1663-1666(1990) y Gene
145, 69-73 (1994)) y en Schwarzer y Pühler
(Bio/Technology 9, 84-87.
(1991)).
(1991)).
Los vectores que se replican solamente en una
extensión limitada son entendidos como que significan vectores
plasmídicos que, como una función de las condiciones bajo las que el
hospedero o portador es cultivado, se replica o no se replica. De
esta manera, ha sido descrito por Nakamura y otros
(US-A-6,303,383) un plásmido
sensible a la temperatura para bacterias corineformes que pueden
replicarse solamente a temperaturas por debajo de
31ºC.
31ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción también proporciona bacterias
corineformes, en particular del género Corynebacterium, que producen
L-lisina, caracterizadas porque
- a)
- en lugar de una copia singular de un marco de lectura abierto (ORF), un gen o alelo de producción de lisina naturalmente presente en un sitio particular deseado (locus), estas tienen al menos dos copias de dicho marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo, preferiblemente en rearreglo tandem, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en un sitio particular, y en eso estos
- b)
- opcionalmente tiene al menos una tercera copia de dicho marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de producción de L-lisina en un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en un sitio de gen adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción también proporciona además un
proceso para la preparación de L-lisina, que
comprende los siguientes pasos:
- a)
- fermentación de bacterias corineformes, en particular del género Corynebacterium, que
- i)
- en lugar de una copia singular de un marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de producción de lisina presente en un sitio particular deseado (locus), tiene al menos dos copias del marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo en cuestión, preferiblemente en rearreglo tandem, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en un sitio particular, y en eso estos
- ii)
- opcionalmente tiene al menos una tercera copia de dicho marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de producción de L-lisina en cuestión en un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en un sitio de gen adicional.
- \quad
- bajo condiciones que permiten la expresión de dicho marco de lectura abierto (ORFs), genes o alelos,
- b)
- concentración de L-lisina en el caldo de fermentación,
- c)
- aislamiento de la L-lisina a partir del caldo de fermentación, opcionalmente
- d)
- con constituyentes a partir del caldo de fermentación y/o la biomasa a la extensión de > (mayor que) 0 a 100%.
\vskip1.000000\baselineskip
Una "copia de un marco de lectura abierto
(ORF), gen o alelo de la producción de L-lisina"
será entendido que significa todos los, preferiblemente endógenos,
marcos de lectura abiertos, genes o alelos en los que el
aumento/sobre-expresión puede tener el efecto de
mejorar la producción de L-lisina. El aumento se
entiende que significa un aumento en la concentración intracelular
o actividad del producto de gen particular, proteína o enzima.
\newpage
Estos incluyen, entre otros, los siguientes
genes:
4
Estos son resumidos y
explicados en la Tabla 1.
Estos incluyen, en particular, los alelos
lysC^{FBR} que codifican para una aspartato quinasa resistente a
la "retroalimentación". Varios alelos lysC^{FBR} son
resumidos y son explicados en la Tabla 2.
Los siguientes alelos lysC^{FBR} son
preferidos: lysC A279T (reemplazamiento de alanina en la posición
279 de la proteína codificada aspartato quinasa, de acuerdo a SEQ
ID NO: 2, por treonina), lysC A279V (reemplazamiento de alanina en
la posición 279 de la proteína codificada aspartato quinasa, de
acuerdo a SEQ ID NO:2 por valina), lysC S301F (reemplazamiento de
serina en la posición 301 de la proteína codificada aspartato
quinasa, de acuerdo a SEQ ID NO:2 por fenilalanina), lysC T308I
(reemplazamiento de treonina en la posición 308 de la proteína
codificada aspartato quinasa, de acuerdo a SEQ ID NO:2 por
isoleucina), lysC S301Y (reemplazamiento de serina en la posición
308 de la proteína codificada aspartato quinasa, de acuerdo a SEQ ID
NO:2 por tirosina),lysC G345D (reemplazamiento de glicina en la
posición 345 de la proteína codificada aspartato quinasa, de acuerdo
a SEQ ID NO:2 por ácido aspártico), lysC R320G (reemplazamiento de
arginina en la posición 320 de la proteína codificada aspartato
quinasa, de acuerdo a SEQ ID NO:2 por glicina), lysC T311I
(reemplazamiento de treonina en la posición 311 de la proteína
codificada aspartato quinasa, de acuerdo a SEQ ID NO:2 por
isoleucina), lysC S381F (reemplazamiento de serina en la posición
381 de la proteína codificada aspartato quinasa, de acuerdo a SEQ
ID NO:2 por
fenilalanina).
fenilalanina).
El alelo lysC^{FBR} lysC T311I
(reemplazamiento de treonina en la posición 311 de la proteína
codificada aspartato quinasa, de acuerdo a SEQ ID NO: 2 por
isoleucina), la secuencia nucleotídica que se muestra como SEQ ID
NO:3, es particularmente preferida; la secuencia de aminoácidos de
la proteína codificada aspartato quinasa codificada se muestra como
SEQ ID NO:4.
Los siguientes marcos de lectura abiertos, genes
o secuencias nucleotídicas, entre otros, pueden ser usados como el
"sitio de gen adicional" que no es esencial para el crecimiento
o producción de lisina: aecD, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, fda,
gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, mqo,
pck, pgi, poxB, y zwa2, en particular los genes aecD, gluA, gluB,
gluC, gluD y pck. Estos son resumidos y explicados en la Tabla 3.
Regiones intergénicas en el cromosoma, es decir secuencias
nucleotídicas sin una función codificante, pueden además ser
usadas. Finalmente, profagos o fagos defectuosos contenidos en el
cromosoma pueden ser usados.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La descripción como consecuencia también
proporciona un proceso para la producción de bacterias corineformes
que producen L-lisina, caracterizado porque
- a)
- la secuencia nucleotídica de un deseado ORF, gen o alelo de producción de lisina, opcionalmente que incluye la expresión y/o regulación de señales, es aislado
- b)
- al menos dos copias de la secuencia nucleotídica del ORF, gen o alelo de producción de lisina son rearreglados en una fila, preferiblemente en rearreglo tandem
- c)
- la secuencia nucleotídica obtenida de acuerdo a b) es incorporada en un vector que no se replica o se replica solamente en una extensión limitada en bacterias corineformes,
- d)
- la secuencia nucleotídica de acuerdo a b) ó c) es transferrida en bacterias corineformes, y
- e)
- son aisladas bacterias corineformes que tienen al menos dos copias del ORF deseado, gen o alelo de producción de lisina en el sitio natural deseado particular en lugar de la copia singular del ORF, gen o alelo originalmente presente, ninguna secuencia nucleotítica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismo, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos que permanecen en el sitio natural particular (locus), y opcionalmente
- f)
- al menos una tercera copia de un marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de producción de lisina en cuestión es introducido a un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos permaneciendo en un sitio de gen adicional.
La descripción también proporciona bacterias
corineformes, en particular del género Corynebacterium, que producen
L-metionina y/o L-treonina,
caracterizadas porque
- a)
- en lugar de la copia singular de un marco de lectura abierto (ORF), el gen o alelo de producción de metionina o producción de treonina naturalmente presente en el sitio particular deseado (locus), estas tienen al menos dos copias de dicho marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo, preferiblemente en rearreglo tandem, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismo, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presentes en un sitio particular, y en que esos
- b)
- opcionalmente tiene al menos una tercera copia de un marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de producción de metionina o producción de treonina mencionada en un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en un sitio de gen adicional.
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La descripción además también proporciona un
proceso para la preparación de L-metionina y/o
treonina, que comprende los siguientes pasos:
- a)
- fermentación de bacterias corineformes, en particular del género Corynebacterium, que
- i)
- en lugar de la copia singular de un marco de lectura abierto (ORF), el gen o alelo de producción de metionina o producción de treonina presente en el sitio particular deseado (locus), tiene al menos dos copias del marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo en cuestión, preferiblemente en reareglo tandem, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en el sitio particular, y
- ii)
- opcionalmente tiene al menos una tercera copia del marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de producción de metionina o producción de treonina en cuestión en un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en un sitio de gen adicional.
- \quad
- bajo condiciones que permiten la expresión de dicho marco de lectura abierto (ORFs), genes o alelos,
- b)
- concentración de L-metionina y/o L-treonina en el caldo de fermentación,
- c)
- aislamiento de L-metionina y/o L-treonina a partir del caldo de fermentación, opcionalmente
- d)
- con constituyentes a partir del caldo de fermentación y/o la biomasa a la extensión de > (mayor que) 0 a 100%.
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Una "copia de un marco de lectura abierto
(ORF), gen o alelo de la producción de metionina" será entendido
como que significa todos los, preferiblemente endógenos, marcos de
lectura abiertos, genes o alelos en los que el
aumento/sobre-expresión puede tener el efecto de
mejorar la producción de metionina.
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Estos incluye, entre otros, los siguientes
genes:
16
160 Estos
son resumidos y explicados en la Tabla 4. Estos incluyen, en
particular, los alelos lysC^{FBR} que codifican para una
aspartato quinasa resistente a la "retroalimentación" (ver
Tabla 2) y los alelos hom^{FER} que codifican para una
dehidrogenasa homoserina resistente a la
"retroalimentación".
\newpage
Al menos la tercera, opcionalmente cuarta o
quinta copia del marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de
producción de metionina en cuestión puede ser integrado en un sitio
adicional. Los siguientes genes, entre otros, pueden ser usados
para esto: 161
17
170 Estos son resumidos y explicados en la Tabla 5.
Regiones intergénicas en el cromosoma, es decir secuencias
nucleotídicas sin una función codificante, pueden además ser usadas.
Finalmente, profagos o fagos defectuosos contenidos en el cromosoma
pueden ser usados para esto.
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Una "copia de gen o alelo de producción de
treonina" será entendido como que significa todos los,
preferiblemente endógenos, genes o alelos en los que el
aumento/sobre-expresión puede tener el efecto de
mejorar la producción de treonina.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos incluyen, entre otros, los siguientes
genes:
25
250 Estos
son resumidos y explicados en la Tabla 6. Estos incluyen, en
particular, los alelos lysC^{FBR} que codifican para una
aspartato quinasa resistente a la "retroalimentación" (ver
Tabla 2) y los alelos hom^{FBR} que codifican para una homoserina
dehidrogenasa resistente a la "retroalimentación".
\vskip1.000000\baselineskip
Al menos la tercera, opcionalmente cuarta o
quinta copia del gen de producción de treonina en cuestión puede
ser integrada en un sitio. Los siguientes marcos de lectura
abiertos, genes o secuencia nucleotídicas, entre otras, pueden ser
usadas para esto: 26
260
261 Estas son resumidas y
explicadas en la Tabla 7. Regiones intergénicas en el cromosoma, es
decir secuencias nucleotídicas sin una función codificante, pueden
además ser usadas. Finalmente, profagos y fagos defectuosos
contenidos en el cromosoma pueden ser usados para esto.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La descripción como consecuencia también
proporciona un proceso para la producción de bacterias corineformes
que producen L-metionina y/o
L-treonina, caracterizado porque
- a)
- la secuencia nucleotídica de un deseado ORF, gen o alelo de producción de metionina o producción de treonina, opcionalmente que incluye la expresión y/o regulación de señales, es aislada
- b)
- al menos dos copias de una secuencia nucleotídica del ORF, gen o alelo de producción de metionina o producción de treonina son rearreglados en fila, preferiblemente en rearreglo tandem
- c)
- la secuencia nucleotídica obtenida de acuerdo a b) es incorporada en un vector que no se replica o se replica solamente en una extensión limitada en bacterias corineformes,
- d)
- la secuencia nucleotídica de acuerdo a b) ó c) es transferida a las bacterias corineformes, y
- e)
- son aisladas bacterias corineformes que tienen al menos dos copias del ORF deseado, gen o alelo de la producción de treonina en el sitio natural deseado particular en lugar de la copia singular del ORF, gen o alelo originalmente presente, ninguna secuencia nucleotítica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos permaneciendo en el sitio natural particular (locus), y opcionalmente
- f)
- al menos una tercera copia de un marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de producción de metionina o producción de treonina en cuestión es introducido en un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos permaneciendo en un sitio de gen adicional.
La descripción también proporciona bacterias
corineformes, en particular del género Corynebacterium, que
producen L-valina, caracterizadas porque
- a)
- en lugar de la copia singular de un marco de lectura abierto (ORF), el gen o alelo de producción de valina naturalmente presente en el sitio particular deseado (locus), estos tienen al menos dos copias de dicho marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo en cuestión, preferiblemente en reareglo tandem, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en el sitio particular, y porque estas
- b)
- opcionalmente tienen al menos una tercera copia del marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de producción de valina mencionado en un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en un sitio de gen adicional.
La descripción además también proporciona un
proceso para la preparación de L-valina, que
comprende los siguientes pasos:
- a)
- fermentación de bacterias corineformes, en particular del género Corynebacterium, que
- i)
- en lugar de la copia singular de un marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de producción de valina presente en el sitio particular deseado (locus), tiene al menos dos copias del marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo en cuestión, preferiblemente en reareglo tandem, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en el sitio particular, y
- ii)
- opcionalmente tiene al menos una tercera copia del marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de producción de valina en cuestión en un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos estando presente en un sitio de gen adicional,
- \quad
- bajo condiciones que permiten la expresión de dicho marcos de lectura abiertos (ORFs), genes o alelos,
- b)
- concentración de la L-valina en el caldo de fermentación,
- c)
- aislamiento de L-valina a partir del caldo de fermentación, opcionalmente
- d)
- con constituyentes a partir del caldo de fermentación y/o la biomasa a la extensión de > (mayor que) 0 a 100%.
Una "copia de gen de producción de valina"
será entendido como que significa todos los, preferiblemente
endógenos, genes o alelos en los que el
aumento/sobre-expresión puede tener el efecto de
mejorar la producción de valina.
Estos incluyen, entre otros, los siguientes
genes:
35
350 Estos
son resumidos y explicados en la Tabla 8. Estos incluyen, en
particular, los alelos ilvBN de acetolactato sintasa que codifica
para una valina-resistente.
Al menos la tercera, opcionalmente cuarta o
quinta copia del gen de producción de valina en cuestión puede ser
integrada en el sitio adicional. Los siguientes genes, entre otros,
pueden ser usados para esto: 36
360 Estos son resumidos y explicados en la Tabla 9.
Regiones intergénicas en el cromosoma, es decir secuencias
nucleotídicas sin una función codificante, pueden además ser usadas.
Finalmente, profagos o fagos defectuosos contenidos en el cromosoma
pueden ser usados para esto.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción como consecuencia también
proporciona un proceso para la producción de bacterias corineformes
que producen L-valina, caracterizado porque
- a)
- la secuencia nucleotídica de un deseado ORF, gen o alelo de producción de valina, opcionalmente que incluye la expresión y/o regulación de señales, es aislada
- b)
- al menos dos copias de una secuencia nucleotídica del ORF, gen o alelo de producción de valina son rearreglados en fila, preferiblemente en rearreglo tandem
- c)
- la secuencia nucleotídica obtenida de acuerdo a b) es incorporada en un vector que no se replica o se replica solamente en una extensión limitada en bacterias corineformes,
- d)
- la secuencia nucleotídica de acuerdo a b) ó c) es transferida a las bacterias corineformes, y
- e)
- son aisladas bacterias corineformes que tienen al menos dos copias del ORF deseado, gen o alelo de la producción de valina en el sitio natural deseado particular en lugar de la copia singular del ORF, gen o alelo originalmente presente, ninguna secuencia nucleotítica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos permaneciendo en el sitio natural particular (locus), y opcionalmente
- f)
- al menos una tercera copia del marco de lectura abierto (ORF), gen o alelo de producción de valina en cuestión es introducido en un sitio de gen adicional, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los antibióticos permaneciendo en un sitio de gen adicional.
Durante el trabajo en la presente invención, fue
posible incorporar dos copias, rearregladas en tandem, de un alelo
lysC^{FBR} en el sitio del gen LysC de Corynebacterium
glutamicum de manera que ninguna secuencia nucleotídica que es
capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos,
ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la
transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte
resistencia a los antibióticos permanece en el sitio del gen
lysC.
Una cepa tal es, por ejemplo, la cepa DMS13992
lysC^{FBR}::lysC^{FBR}.
El plásmido pK18mobsacB2xlysCSma2/1, con la
ayuda del cual dos copias de un alelo lysC^{FBR} pueden ser
incorporadas en el sitio del gen lysC de Corynebacterium
glutamicum, se muestra en la Figura 1.
Durante el trabajo en la presente invención, fue
posible incorporar dos copias, rearregladas en tandem, del gen lysE
en el sitio del gen LysE de Corynebacterium glutamicum de
manera que ninguna secuencia nucleotídica que es capaz
de/posibilita la replicación episomal en microorganismos, ninguna
secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la transposición
y ninguna secuencia nucleotídica que imparte resistencia a los
antibióticos permaneció en el sitio del gen lysE.
Una cepa tal es, por ejemplo, la cepa
ATCC21513_17lysE::lysE.
Un plásmido con la ayuda del cual dos copias de
un gen lysE pueden ser incorporadas en el sitio del gen lysE de
Corynebacterium glutamicum, se muestra en la Figura 2. Este
lleva el nombre pk18mobsacB2xlysESma1/1.
Durante el trabajo en la presente invención,
finalmente, fue posible incorporar dos copias, rearregladas en
tandem, del gen zwa1 en el sitio del gen zwa1 de Corynebacterium
glutamicum de manera que ninguna secuencia nucleotídica que es
capaz de/posibilita la replicación episomal en microorganismos,
ninguna secuencia nucleotídica que es capaz de/posibilita la
transposición y ninguna secuencia nucleotídica que imparte
resistencia a los antibióticos permaneció en el sitio de gen
zwa1.
Una cepa tal es, por ejemplo, la cepa
ATCC21513_17zwa1::zwa1.
Un plásmido con la ayuda del cual dos copias de
un gen zwa1 pueden ser incorporadas en el sitio del gen zwa1 de
Corynebacterium glutamicum, se muestra en la Figura 3. Este
lleva el nombre pk18mobsacBzwa1zwa1.
Las bacterias corineformes producidas de acuerdo
a la invención pueden ser cultivadas continuamente o
discontinuamente en el proceso batch (cultivo batch) o en el fed
batch (proceso de alimentación) o repetidos procesos fed batch
(repetitivos procesos de alimentación) para el propósito de
producción de compuestos químicos. Un resumen de métodos de cultivo
conocidos es descrito en el libro de texto de Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de
Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a ser usado debe reunir los
requisitos de las cepas particulares de una manera apropiada. Las
descripciones de los medios de los medios de cultivo para varios
microorganismos son contenidas en el manual "Manual of Methods
for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology
(Washington D. C., USA, 1981).
Azúcares y carbohidratos, tales como por ejemplo
glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y
celulosa, aceites y grasas, tales por ejemplo aceite de soya, aceite
de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos,
tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido
linoleico, alcoholes tales como glicerol y etanol, y ácidos
orgánicos tales como ácido acético o ácido láctico, pueden ser
usados como la fuente de carbono. Estas sustancias pueden ser
usadas individualmente o como una mezcla.
Compuestos que contienen nitrógeno orgánico,
tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne,
extracto de malta, licor de maíz escarpado, harina de frijol de soya
y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio,
cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato
de amonio, pueden ser usado como la fuente de nitrógeno. Las
fuentes de nitrógeno pueden ser usadas individualmente o como una
mezcla.
Ácido fosfórico, dihidrógeno fosfato de potasio
o hidrógeno fosfato de dipotasio o las correspondientes sales que
contienen-sodio pueden ser usadas como fuentes de
fósforo. El medio de cultivo debe además comprender sales de
metales, tales como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de
hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente,
sustancias esenciales para el crecimiento, tales como aminoácidos y
vitaminas, pueden ser empleadas además de las sustancias
anteriormente mencionadas. Precursores apropiados pueden además ser
añadidos al medio de cultivo. Las sustancias de partida mencionadas
pueden ser añadidas al cultivo en forma de un simple batch, o
pueden ser alimentadas durante el cultivo de una manera
apropiada.
Compuestos básicos, tales como hidróxido de
sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o amoníaco acuoso, o
compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico,
pueden ser empleados en una manera apropiada para el control de pH
del cultivo. Antiespumantes, tales como por ejemplo ésteres de
poliglicol de ácidos grasos, pueden ser empleados para el control
del desarrollo de espuma. Sustancias apropiadas que tienen una
acción selectiva, tales como por ejemplo antibióticos, pueden ser
añadidas al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos.
Para mantener las condiciones aeróbicas, oxígeno o mezclas de gases
que contienen oxígeno, tales como por ejemplo aire, son
introducidos en el cultivo. La temperatura del cultivo es usualmente
20ºC a 45ºC, y preferiblemente 25ºC a 40ºC. El cultivo es
continuado hasta que un máximo del compuesto químico deseado se ha
formado. Este objetivo es usualmente alcanzado dentro de 10 horas a
160 horas.
Se ha encontrado que las bacterias corineformes
de acuerdo a la invención, en particular las bacterias corineformes
que producen L-lisina, tienen una inesperada alta
estabilidad. Estas fueron estables por al menos
10-20, 20-30,
30-40, 40-50, preferiblemente al
menos 50-60, 60-70,
70-80 y 80-90 generaciones o ciclos
de división celular.
Los siguientes microorganismos han sido
depositados:
La cepa de Corynebacterium glutamicum
DSM13992lysC^{FBR}::lysC^{FBR} fue depositada en forma de un
cultivo puro el 5 de Junio de 2002 bajo el número DSM15036 en el
Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,
Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest.
El plásmido pK18mobsacB2xlysCSma2/1 fue
depositado en forma de un cultivo puro de la cepa E. Coli
DH5\alphamcr/
pk18mobsacB2xlysCSma2/1 (= DH5alphamcr/pk18mobsacB2xlysCSma2/1) el 20 de Abril de 2001 bajo el número DSM14244 en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania)de acuerdo con el Tratado de Budapest.
pk18mobsacB2xlysCSma2/1 (= DH5alphamcr/pk18mobsacB2xlysCSma2/1) el 20 de Abril de 2001 bajo el número DSM14244 en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania)de acuerdo con el Tratado de Budapest.
La cepa de Corynebacterium glutamicum
ATCC21513_17lysE::lysE fue depositada en forma de un cultivo puro el
5 de Junio de 2002 bajo el número DSM15037 en el Deutsche Sammlung
für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Alemania)de acuerdo con el Tratado de Budapest.
La cepa de Corynebacterium glutamicum
ATCC21513_17zwa1::zwa1 fue depositada en forma de un cultivo puro el
5 de Junio de 2002 bajo el número DSM15038 en el Deutsche Sammlung
für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Alemania)de acuerdo con el Tratado de Budapest.
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Ejemplo
1
A partir de la cepa DSM13994 de
Corynebacterium glutamicum, el ADN cromosomal es aislado por
los métodos convencionales (Eikmanns y otros, Microbiology
140:1817-1828 (1994)).
La cepa DSM13994 fue producida por mutagénesis
no-dirigida múltiple, selección y selección de
mutantes de C. glutamicum ATCC13032. La cepa es resistente
al análogo de lisina
S-(2-aminoetil)-L-cisteína
y tiene una aspartato quinasa resistente a la retroalimentación que
es insensible a la inhibición por una mezcla de lisina y treonina
(en cada caso 25 mM). La secuencia nucleotídica del alelo
lysC^{FBR} se muestra como SEQ ID NO:3. Esto también es llamado
lysC T311I en lo siguiente. La secuencia de aminoácido de la
proteína aspartato quinasa codificada se muestra como SEQ ID NO:4.
Un cultivo puro de esta cepa fue depositado el 16 de Enero de 2001
en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,
Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de
Budapest.
Budapest.
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Con la ayuda de la reacción en cadena de la
polimerasa, una sección de ADN que lleva el gen o alelo de lysC es
amplificado. En base a la secuencia del gen de lysC conocido por
C. glutamicum (Kalinowski y otros, Molecular Microbiology, 5
(5), 1197-1204 (1991); Número de asentamiento
X57226), los siguientes oligonucleótidos cebadores fueron
seleccionados para el PCR:
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Los cebadores mostrados son sintetizados por MWG
Biotech y la reacción de PCR es llevada a cabo por un método
estándar de PCR de Innis y otros (PCR Protocols. A Guide to Methods
and Applications, 1990, Academic Press). Los cebadores permiten la
amplificación de una sección de ADN de aprox. 1.7 kb en longitud, la
que lleva el gen o alelo lysC. Los cebadores además contienen la
secuencia para un sitio de corte de la endonucleasa de restricción
BamHI, que es marcada por paréntesis en la secuencia nucleotídica
mostrada anteriormente.
El fragmento de ADN amplificado de aprox. 1.7 kb
en longitud que lleva el alelo lysC^{FBR} lysC T311I de la cepa
DSM13994 es identificado por electroforesis en un gel de agarosa
0.8%, aislado a partir del gel y purificado por métodos
convencionales (Kit de extracción de gel QIAquick, Quiagen,
Hilden).
La ligazón del fragmento es entonces llevada a
cabo por medio del Kit de Clonación Topo TA (Invitrogen, Leek,
Países Bajos Cat. Number K4600-01) en el vector
pCRII-TOPO. El lote de ligazón es transformado en la
cepa de E. Coli TOP10 (Invitrogen, Leek, Países Bajos). La
selección de células que portan plásmidos es hecha colocando en
placas el lote de transformación en agar LB que contiene kanamicina
(50 mg/l) con X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil
\beta-D-galactopiranosido, 64
mg/l).
El plásmido es chequeado por medio de cortes de
restricción, después del aislamiento del ADN, e identificado en el
gel agarosa. El plásmido resultante es llamado pCRIITOPOlysC.
La secuencia nucleotídica del fragmento de ADN
amplificado o producto de PCR es determinada por el método de
terminación de cadena dideoxy de Sanger y otros (Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, 74:5463-5467
(1977)) usando el aparato de secuenciación "ABI Prism 377" de
PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania). La secuencia de la
región codificante del producto de PCR se muestra en SEQ ID NO: 3.
La secuencia de aminoácido de la proteína aspartato quinasa
asociada se muestra en SEQ ID NO: 4.
La base timina se encuentra en la posición 932
de la secuencia nucleotídica de la región codificante del alelo
lysC^{FBR} de la cepa DSM13994 (SEQ ID NO: 3). La base citosina se
encuentra en la posición correspondiente del gen
tipo-salvaje (SEQ ID NO: 1).
El aminoácido isoleucina se encuentra en la
posición 311 de la secuencia de aminoácido de la proteína aspartato
quinasa de la cepa DSM13994 (SEQ ID NO: 4). El aminoácido treonina
se encuentra en la correspondiente posición de la proteína
tipo-salvaje (SEQ ID NO:2).
El alelo lysC, que contiene la base timina en la
posición 932 de la región codificante y en consecuencia codifica
para una proteína aspartato quinasa que contiene el aminoácido
isoleucina en la posición 311 de la secuencia de aminoácido, es
llamado el alelo lysC^{FBR} lysC T311I en lo siguiente.
El plásmido pCRIITOPOlysC, que lleva el alelo
lysC^{FBR} lysC T311I, fue depositado en forma de un cultivo puro
de la cepa E. Coli TOP 10/pCRIITOPOlysC, bajo el número
DSM14242 el 20 de Abril de 2001 en el Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ= Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos celulares, Braunschweig, Alemania) de
acuerdo con el Tratado de Budapest.
El ADN plasmídico fue aislado a partir de la
cepa DSM14242, que porta el plásmido pCRIITOPOlysC, y se cortó con
la enzima de restricción BamHI (Amersham-Pharmacia,
Freiburg, Alemania), después de la separación en un gel de agarosa
(0.8%) el fragmento de ADN que contiene lysC^{FBR} de aprox 1.7 kb
de largo es aislado a partir del gel de agarosa con la ayuda del
kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania), y los
terminales que cuelgan son completados con polimerasa Klenow
(Boehringer Mannheim) y empleado para la ligazón con el vector de
clonación mobilizable pk18mobsacB descrito por Schäfer y otros, Gene
14,69-73 (1994). Este es cortado de antemano con la
enzima de restricción SmaI y desfosforilado con fosfatasa alcalina
(Fosfatasa Alcalina, Boehringer Mannheim), mezclado con el
fragmento que contiene lysC^{FBR} de aprox. 1.7 kb y la mezcla es
tratada con T4 ADN Ligasa (Amersham-Pharmacia,
Freiburg, Alemania).
La cepa E. Coli DH5\alpha (Grant y
otros; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87
(1990) 4645-4649) es entonces transformada con el
lote de ligazón (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach.
Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York,
1989). La selección de las células que
llevan-plásmidos es hecha colocando en placas del
lote de transformación en agar LB (Sambrook y otros, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. 2^{nd} Ed., Cold Spring Harbor, New
York, 1989), que fue suplementado con 25 mg/l de kanamicina.
El ADN plasmídico es aislado a partir de un
transformante con la ayuda del Kit Miniprep Spin QIAprep de Qiagen
y chequeado por cortes de restricción con la enzima HindIII y
sucesiva electroforesis en gel de agarosa. El plásmido es llamado
pk18mobsacB1xlysCSma2.
En un segundo paso, el plásmido
pCRII-TOPOlysC es a su vez cortado con la enzima de
restricción BamHI (Amersham-Pharmacia, Freiburg,
Alemania), después de la separación en un gel de agarosa (0.8%) el
fragmento que contiene lysC^{FBR} de aprox. 1.7 kb fue aislado a
partir del gel de agarosa con la ayuda del Kit de extracción de gel
QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania) y empleado para la ligazón con
el vector pK18mobsacB1xlysCSma2 descrito en este Ejemplo. Esto es
cortado de antemano con la enzima de restricción BamHI y
desfoforilado con fosfatasa alcalina (Fosfatasa alcalina,
Boehringer Mannheim), mezclado con el fragmento que contiene
lysC^{FBR} de aprox. 1.7kb y la mezcla es tratada con T4 ADN
ligasa (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemania).
La cepa de E. Coli DH5\alpha (Grant y
otros; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87
(1990) 4645-4649) es entonces transformada con el
lote de ligazón (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach.
Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York,
1989). La selección de las células que portan plásmidos es hecha
colocando en placas el lote de transformación en agar LB (Sambrook y
otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^{nd} Ed., Cold
Spring Harbor, New York, 1989), que fue suplementado con 25 mg/l de
kanamicina.
El ADN plasmídico es aislado a partir de un
transformante con la ayuda del Kit Miniprep Spin QIAprep de Qiagen
y chequeado por cortes de restricción con la enzima HindIII y
sucesiva electroforesis en gel de agarosa. El plásmido es llamado
pk18mobsacB2xlysCSma2/1. Un mapa del plásmido se muestra en la
Figura 1.
El plásmido pk18mobsacB2xlysCSma2/1 fue
depositado en forma de un cultivo puro de la cepa de E. Coli
DH5\alphamcr/pk18mobsacB2xlysCSma2/1
(=DH5alphamcr/pk18mobsacB2xlysCSma2/1 el 20 de Abril de 2001 bajo el
número DSM14244 en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania)de acuerdo con el
Tratado de Budapest.
El vector pk18mobsacB2xlysCSma2/1 mencionado en
el Ejemplo 1.1 es transferido por un protocolo modificado de
Schäfer y otros, (1990 Journal of Microbiology 172:
1663-1666) a la cepa DSM13992 de C.
glutamicum
La cepa DSM13992 de Corynebacterium
glutamicum fue producida por mutagénesis
no-dirigida, múltiple, selección y selección de
mutantes de C. glutamicum ATCC13032. La cepa es resistente al
antibiótico streptomicina y fenotípicamente resistente al análogo
de lisina
S-(2-aminoetil)-L-cisteína.
Sin embargo, la cepa tiene una aspartato quinasa
tipo-salvaje (ver SEQ ID NO: 1 y 2), que es sensible
a la inhibición por una mezcla de lisina y treonina (en cada caso
25 mM). Un cultivo puro de esta cepa fue depositado el 16 de Enero
de 2001 en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania)de acuerdo con el
Tratado de
Budapest.
Budapest.
El vector pk18mobsacB2xlysCSma2/1 no se puede
replicar independientemente en DSM13992 y es retenido en la célula
solamente si éste se ha integrado en el cromosoma.
La selección de clones con
pk18mobsacB2xlysCSma2/1 integrado es llevada a cabo colocando en
placas el lote de conjugación en agar LB (Sambrook y otros,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^{nd} Ed. Cold Spring
Harbor, New York, 1989), que fue suplementado con 15 mg/l de
kanamicina y 50 mg/l de ácido nalidíxico. Los clones que han
crecido son colocados en placas de agar LB con 25 mg/l kanamicina e
incubadas durante 16 horas a 33ºC. Para lograr el corte del
plásmido con solamente una copia del gen de lysC, los clones son
cultivados en agar LB con 10% de sucrosa, después de la incubación
durante 16 horas en medio LB líquido. El plásmido pk18mobsacB
contiene una copia del gen sacB, el cual convierte la sucrosa en
levan sucrasa, que es tóxica al C. glutamicum.
Solamente aquellos clones en que el
pk18mobsacB2xlysCSma2/1 integrado ha sido cortado de nuevo crece por
lo tanto en agar LB con sucrosa. Aproximadamente de 40 a 50
colonias son evaluadas para el fenotipo "crecimiento en presencia
de sucrosa" y "no crecimiento en presencia de kanamicina".
Durante el corte, las dos copias del gen lysc o solamente una puede
ser cortada junto con el plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar que las dos copias de gen lysC
han permanecido en el cromosoma, aproximadamente 20 colonias que
muestran el fenotipo "crecimiento en la presencia de sucrosa" y
"no crecimiento en la presencia de kanamicina" son
investigados con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa
por el método estándar de PCR de Innis y otros (PCR Protocols. A
Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press). Un
fragmento de ADN que porta el gen lysC y regiones que lo rodean es
amplificado aquí a partir del ADN cromosomal de las colonias. Los
siguientes oligonucleótidos cebadores son seleccionados para la
PCR.
Los cebadores permiten la amplificación de un
fragmento de ADN de aprox. 1.9 kb en tamaño en los clones control
con el locus lysC original. En los clones con una segunda copia del
gen lysC en el cromosoma en el locus lysC, son amplificados
fragmentos de ADN con un tamaño de aprox. 3.6 kb.
Los fragmentos de ADN amplificados son
identificados por medio de electroforesis en un gel de agarosa 0.8%.
En base de la longitud del fragmento amplificado, una distinción
fue hecha entre los clones con una copia de gen lysC cromosomal y
clones con dos copias de gen lysC cromosomal.
10 clones con dos copias completas del gen lysC
en el cromosoma son investigados con la ayuda del LightCycler de
Roche Diagnostic (Mannhein, Alemania) para demostrar si las dos
copias son alelos lysC^{FBR} con la mutación lysC T311I o si el
lysC original tipo-salvaje está presente junto a un
alelo lysC^{FBR} lysC T311I. El LightCycler es un aparato
combinado de Termocycler y fluorímetro.
\vskip1.000000\baselineskip
Una sección de ADN de aprox. 500 bp en longitud
que contiene el sitio de mutación es amplificado en la primera fase
por medio de un PCR (Innis y otros PCR Protocols. A Guide to Methods
and Applications, 1990, Academic Press) usando los siguientes
oligonucleótidos cebadores.
\newpage
En la segunda fase, con dos oligonucleótidos
adicionales de diferentes longitudes y marcados con diferentes
tintes fluorescentes (Lighter (LC)-Red640 y
fluoresceína), que hibridiza en la región del sitio de mutación, la
presencia de la mutación es detectada con la ayuda del método de
"Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente" (FRET)
usando un análisis de curva de fundición (Lay y otros, Clinical
Chemistry, 43:2262-2267) (1997)).
Los cebadores mostrados para la PCR son
sintetizados por MWG Biotech y los oligonucleótidos mostrados para
la hibridización son sintetizados por TIB MOLBIOL (Berlín,
Alemania).
Un clon que contiene la base timina en la
posición 932 de la región codificante de las dos copias de lysC y
así tiene dos alelos lysC^{FBR} lysC T311I fue identificado de
esta manera.
La cepa fue llamada C. glutamicum
DSM13992lysC^{FBR}:: lysC^{FBR}.
La cepa fue depositada como C. glutamicum
DSM13992lysC^{FBR}::lysC^{FBR} el 5 de Junio de 2002 bajo el
número DSM15036 en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el
Tratado de Budapest.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El ADN plasmídico fue aislado a partir de la
cepa de Escherichia coli DSM12871
(EP-A-1067193), que porta el
plásmido pEC7lysE.
El plásmido contiene el gen lysE que codifica
para el exportador de lisina. Un cultivo puro de esta cepa fue
depositado el 10 de Junio de 1999 en el Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) de
acuerdo con el Tratado de Budapest.
El plásmido pEC71lysE es cortado con la enzima
de restricción BamHI (Amersham-Pharmacia, Freiburg,
Alemania, después de la separación en un gel de agarosa (0.8%) el
fragmento que contiene lysE de aprox. 1.1 kb es aislado a partir
del gel de agarosa con la ayuda del Kit de Extracción de Gel
QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania) y los terminales que cuelgan
son completados con polimerasa Klenow (Boehringer Mannheim) y
empleado para la ligazón con el vector de clonación mobilizable
pK18mobsacB descrito por Schäfer y otros, Gene 14,
69-73 (1994). Este es cortado de antemano con la
enzima de restricción SmaI y desfoforilado con fosfatasa alcalina
(Fosfatasa alcalina, Boehringer Mannheim), mezclado con el
fragmento que contiene lysE de aprox. 1.1 kb y la mezcla es tratada
con T4 ADN ligasa (Amersham-Pharmacia, Freiburg,
Alemania).
La cepa de E. Coli DH5\alpha (Grant y
otros; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87
(1990) 4645-4649) es entonces transformada con el
lote de ligazón (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach.
Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York,
1989). La selección de las células que portan plásmidos es hecha
colocando en placas el lote de transformación en agar LB (Sambrook y
otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^{nd} Ed., Cold
Spring Harbor, New York, 1989), que fue suplementado con 25 mg/l de
kanamicina.
El ADN plasmídico es aislado a partir de un
transformante con la ayuda del Kit Miniprep Spin QIAprep de Qiagen
y chequeado por cortes de restricción con las enzimas BamHI y EcoRI
y sucesiva electroforesis en gel de agarosa. El plásmido es llamado
pk18mobsacB1xlysESma1.
En un segundo paso, el plásmido pEC7lysE es a su
vez cortado con la enzima de restricción BamHI
(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemania), después
de la separación en un gel de agarosa (0.8%) el fragmento lysE de
aprox. 1.1 kb fue aislado a partir del gel de agarosa con la ayuda
del Kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania) y
empleado para la ligazón con el vector pK18mobsacB1xlysESma1
descrito en este Ejemplo. Este es cortado de antemano con la enzima
de restricción BamHI y desfoforilado con fosfatasa alcalina
(Fosfatasa alcalina, Boehringer Mannheim), mezclado con el
fragmento lysE de aprox. 1.1 kb y la mezcla es tratada con T4 ADN
ligasa (Amersham-Pharmacia, Freiburg,
Alemania).
La cepa de E. Coli DH5\alpha (Grant y
otros; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87
(1990) 4645-4649) es entonces transformada con el
lote de ligazón (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach.
Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York,
1989). La selección de las células que portan plásmidos es hecha
colocando en placas el lote de transformación en agar LB (Sambrook y
otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^{nd} Ed., Cold
Spring Harbor, New York, 1989), que fue suplementado con 25 mg/l de
kanamicina.
El ADN plasmídico es aislado a partir de un
transformante con la ayuda del Kit Miniprep Spin QIAprep de Qiagen
y chequeado por cortes de restricción con las enzimas EcoRI y SalI o
ScaI y sucesiva electroforesis en gel de agarosa. El plásmido es
llamado pk18mobsacB2xlysESma1/1. Un mapa del plásmido se muestra en
la Figura 2.
El vector pk18mobsacB2xlysESma1/1 mencionado en
el Ejemplo 2.1 es transferido por un protocolo modificado de
Schäfer y otros,(1990 Journal of Microbiology 172:
1663-1666) en la cepa ATCC21513_17 de C.
glutamicum.
La cepa ATCC21513_17 de Corynebacterium
glutamicum fue producida por mutagénesis
no-dirigida, múltiple, selección y selección de
mutantes de C. glutamicum ATCC21513. La cepa es resistente al
análogo de lisina
S-(2-aminoetil)-L-cisteína
y prototrófica a ambas leucina y homoserina.
El vector no se puede replicar
independientemente en ATCC21513_17 y es retenido en la célula
solamente si este se ha integrado en el cromosoma.
La selección de clones con
pk18mobsacB2xlysESma1/1 integrado es llevada a cabo colocando en
placas el lote de conjugación en agar LB (Sambrook y otros,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^{nd} Ed. Cold Spring
Harbor, New York, 1989), que fue suplementado con 15 mg/l de
kanamicina y 50 mg/l ácido nalidíxico. Clones que han crecido son
colocados en placas de agar LB con 25 mg/l kanamicina e incubadas
durante 16 horas a 33ºC. Para lograr corte del plásmido con
solamente una copia del gen de lysE, los clones son cultivados en
agar LB con 10% de sucrosa, después de la incubación durante 16
horas en medio LB líquido. El plásmido pk18mobsacB contiene una
copia del gen sacB, el cual convierte sucrosa en levan sucrasa, que
es tóxica a C. glutamicum.
Solamente aquellos clones en que el
pk18mobsacB2xlysESma1/1 integrado ha sido cortado de nuevo crece por
lo tanto en agar LB con sucrosa. Aproximadamente de 40 a 50
colonias son evaluadas para el fenotipo "crecimiento en presencia
de sucrosa" y "no crecimiento en presencia de kanamicina".
Durante el corte, las dos copias del gen lysE o solamente uno puede
ser cortado junto con el plásmido.
Para demostrar que las dos copias del gen lysE
han permanecido en el cromosoma, aproximadamente 20 colonias que
muestran el fenotipo "crecimiento en la presencia de sucrosa" y
"no crecimiento en la presencia de kanamicina" son
investigados con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa
por el método estándar de PCR de Innis y otros (PCR Protocols. A
Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press). Un
fragmento de ADN que lleva el gen lysE y regiones que lo rodean es
amplificado aquí a partir del ADN cromosomal de las colonias. Los
siguientes oligonucleótidos cebadores son seleccionados para la
PCR.
Los cebadores permiten la amplificación de un
fragmento de ADN de aprox. 1.2 kb en tamaño en los clones control
con el locus original lysE. En los clones con una segunda copia del
gen lysC en el cromosoma en el locus lysE, son amplificados
fragmentos de ADN con un tamaño de aprox. 2.3 kb.
Los fragmentos de ADN amplificados son
identificados por medio de electroforesis en un gel de agarosa 0.8%.
En base a la longitud del fragmento amplificado, una distinción fue
hecha entre los clones con una copia de gen lysE cromosomal y
clones con dos copias de gen lysE cromosomal. Podría de esta manera
ser demostrado que la cepa ATCC21513_17 lleva dos copias completas
del gen lysE en el cromosoma.
La cepa fue llamada C. glutamicum
ATCC21513_17lysE::lysE.
La cepa fue depositada como C. glutamicum
ATCC21513_17lysE::lysE el 5 de Junio de 2002 bajo el número DSM15037
en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,
Braunschweig, Alemania)de acuerdo con el Tratado de
Budapest.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El ADN plasmídico fue aislado a partir de la
cepa de Escherichia coli DSM13115
(EP-A-1111062), que lleva el
plásmido pCR2.1zwa1exp.
El plásmido contiene el gen zwa1 que codifica
para factor 1 de crecimiento celular. Un cultivo puro de esta cepa
fue depositado el 19 de Octubre de 1999 en el Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) de
acuerdo con el Tratado de Budapest.
El plásmido pCR2.1zwa1exp es cortado con la
enzima de restricción EcoRI (Amersham-Pharmacia,
Freiburg, Alemania, después de la separación en un gel de agarosa
(0.8%) el fragmento zwa1 de 1 kb es aislado a partir del gel de
agarosa con la ayuda del Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen,
Hilden, Alemania y empleado para la ligazón con el vector de
clonación mobilizable pK18mobsacB descrito por Schäfer y otros, Gene
14, 69-73 (1994). Este es cortado de antemano con
la enzima de restricción EcoRI y desfoforilado con fosfatasa
alcalina (Fosfatasa alcalina, Boehringer Mannheim), mezclado con el
fragmento zwa1 de 1 kb y la mezcla es tratada con T4 ADN ligasa
(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemania).
La cepa de E. Coli DH5\alpha (Grant y
otros; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87
(1990) 4645-4649) es entonces transformada con el
lote de ligazón (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach.
Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York,
1989). La selección de las células que
llevan-plásmidos es hecha colocando en placas el
lote de transformación en agar LB (Sambrook y otros, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. 2^{nd} Ed., Cold Spring Harbor, New
York, 1989), que fue suplementado con 25 mg/l de kanamicina.
El ADN plasmídico es aislado a partir de un
transformante con la ayuda del Kit Miniprep Spin QIAprep de Qiagen
y chequeado por cortes de restricción con las enzimas NheI y EcoRI y
sucesiva electroforesis en gel de agarosa. El chequeo de los
plásmidos mostró que dos fragmentos de zwa1 fueron clonados
simultánemente y en la orientación deseada en el vector de
clonación pk18mobsac.
El plásmido es llamado pk18mobsacBzwa1zwa1. Un
mapa del plásmido se muestra en la Figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector pk18mobsacBzwa1zwa1 mencionado en el
Ejemplo 3.1 es transferido por un protocolo modificado de Schäfer y
otros,(1990 Journal of Microbiology 172: 1663-1666)
en la cepa ATCC21513_17 de C. glutamicum.
La cepa ATCC21513_17 de Corynebacterium
glutamicum fue producida por mutagénesis
no-dirigida, múltiple, selección y selección de
mutantes de C. glutamicum ATCC21513. La cepa es resistente al
análogo de lisina
S-(2-aminoetil)-L-cisteína
y prototrófica a ambas leucina y homoserina.
El vector no se puede replicar
independientemente en ATCC21513_17 y es retenido en la célula
solamente si este se ha integrado en el cromosoma.
La selección de clones con pk18mobsacBzwa1zwa1
integrado es llevada a cabo colocando en placas el lote de
conjugación en agar LB (Sambrook y otros, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2^{nd} Ed. Cold Spring Harbor, New York,
1989), que fue suplementado con 15 mg/l de kanamicina y 50 mg/l de
ácido nalidíxico. Clones que han crecido son colocados en placas de
agar LB con 25 mg/l kanamicina e incubadas durante 16 horas a 33ºC.
Para lograr el corte del plásmido con solamente una copia del gen
de zwa1, los clones son cultivados en agar LB con 10% de sucrosa,
después de la incubación durante 16 horas en medio LB líquido. El
plásmido pk18mobsacB contiene una copia del gen sacB, el cual
convierte la sucrosa en levan sucrasa, que es tóxica a C.
glutamicum.
Solamente aquellos clones en que el
pk18mobsacBzwa1zwa1 integrado ha sido cortado de nuevo crece por lo
tanto en agar LB con sucrosa. Aproximadamente de 40 a 50 colonias
son evaluadas para el fenotipo "crecimiento en la presencia de
sucrosa" y "no crecimiento en la presencia de kanamicina".
Durante el corte, ambas dos copias del gen zwa1 o solamente una
puede ser cortado junto con el plásmido.
Para demostrar que las dos copias de gen zwa1
han permanecido en el cromosoma, aproximadamente 20 colonias que
muestran el fenotipo "crecimiento en presencia de sucrosa" y
"no crecimiento en presencia de kanamicina" son investigados
con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa por el método
estándar de PCR de Innis y otros (PCR Protocols. A Guide to Methods
and Applications, 1990, Academic Press). Un fragmento de ADN que
lleva el gen zwa1 y regiones que lo rodean es amplificado aquí a
partir del ADN cromosomal de las colonias. Los siguientes
oligonucleótidos cebadores son seleccionados para la PCR.
Los cebadores permiten la amplificación de un
fragmento de ADN de aprox. 1.3 kb en el tamaño en los clones
control con el locus original zwa1. En los clones con una segunda
copia del gen zwa1 en el cromosoma en el locus zwa1, son
amplificados fragmentos de ADN con un tamaño de aprox. 2.3 kb.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Los fragmentos de ADN amplificados son
identificados por medio de electroforesis en un gel de agarosa 0.8%.
En base de la longitud del fragmento amplificado, una distinción
fue hecha entre los clones con una copia de gen zwa1 cromosomal y
clones con dos copias de gen zwa1 cromosomal. Podría de esta manera
ser demostrado que la cepa ATCC21513_17 lleva dos copias completas
del gen zwa1 en el cromosoma.
La cepa fue llamada C. glutamicum
ATCC21513_17zwa1::zwa1.
La cepa fue depositada como C. glutamicum
ATCC21513_17zwa1::zwa1 el 5 de Junio de 2002 bajo el número DSM15038
en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,
Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Las cepas de C. glutamicum
DSM13992lysC^{FBR}::lysC^{FBR}, ATCC21513_17lysE::lysE y
ATCC21513_17zwa1::
zwa1 obtenidas en los Ejemplos de 1 al 3 son cultivadas en un medio nutriente apropiado para la producción de lisina y fue determinado el contenido de lisina en el sobrenadante de cultivo.
zwa1 obtenidas en los Ejemplos de 1 al 3 son cultivadas en un medio nutriente apropiado para la producción de lisina y fue determinado el contenido de lisina en el sobrenadante de cultivo.
Para esto, las cepas son primero incubadas en
una placa de agar durante 24 horas a 33ºC. Comenzando a partir de
este cultivo de placa de agar, un precultivo es sembrado (10 ml de
medio en un frasco cónico de 100 ml). El medio MM es usado como el
medio para el precultivo. EL precultivo es incubado durante 24 horas
a 33ºC a 240 rpm en una máquina de zarandeo. Un cultivo principal
es sembrado a partir de este precultivo tal que la DO inicial (660
nm) del cultivo principal es DO 0.1. El medio MM es también usado
para el cultivo principal.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio MM
- CSL
- 5 g/l
- MOPS
- 20 g/l
- Glucosa (separadamente en autoclave)
- 50 g/l
\vskip1.000000\baselineskip
Sales:
- (NH_{4})_{2}SO_{4}
- 25 g/L
- KH_{2}PO_{4}
- 0.1 g/l
- MgSO_{4 *} 7 H_{2}O
- 1.0 g/l
- CaCl_{2*} 2 H_{2}O
- 10 mg/l
- FeSO_{4 *} 7 H_{2}O
- 10 mg/l
- MnSO_{4 *} H_{2}O
- 5 mg/l
- Biotina (estéril-filtrada)
- 0.3 mg/l
- Tiamina * HCl (estéril-filtrada)
- 0.2 mg/ml
- CaCO_{3}
- 25 g/l
\global\parskip1.000000\baselineskip
El CSL (licor de maíz escarpado), MOPS (ácido
morfolinopropanosulfónico) y la solución de sales son llevados a pH
7 con amonio acuoso y sometidos a autoclave. El sustrato estéril y
las soluciones de vitaminas, así como el CaCO_{3} sometido a
autoclave o en estado seco, son entonces añadidos.
El cultivo es llevado a cabo en un volumen de 10
ml en un frasco cónico de 100 ml con bafles. El cultivo es llevado
a cabo a 33ºC y 80% de humedad atmosférica.
Después de 48 horas, la DO es determinada a una
medida de longitud de onda de 660 nm con un Biomek 1000
(Instrumentos Beckmann GMBH, Munich). La cantidad de lisina formada
es determinada con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y derivación
post-columna con detección de ninidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 10.
Los números de los pares de base declarados son
valores aproximados obtenidos en el contexto de reproducibilidad de
medidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
Las abreviaturas y designaciones usadas tienen
la siguiente definición:
- KmR:
- Gen de resistencia a kanamicina
- HindIII:
- Sitio de corte de la enzima de restricción HindIII
- BamHI:
- Sitio de corte de la enzima de restricción BamHI
- lysC:
- Alelo lysC^{FBR} lysC T311I
- sacB:
- gen sacB
- RP4mob:
- región mob con el origen de replicación para la transferencia (oriT)
- oriV:
- origen de replicación V
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
Las abreviaturas y designaciones usadas tienen
la siguiente definición:
- KanR:
- Gen de resistencia a kanamicina
- SalI:
- Sitio de corte de la enzima de restricción SalI
- BamHI:
- Sitio de corte de la enzima de restricción BamHI
- EcoRI:
- Sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI
- ScaI:
- Sitio de corte de la enzima de restricción ScaI
- lysE:
- gen lysE
- sacB:
- gen sacB
- RP4mob:
- región mob con el origen de replicación para la transferencia (oriT)
- oriV:
- origen de replicación V
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
Las abreviaturas y designaciones usadas tienen
la siguiente definición:
- KanR:
- Gen de resistencia a kanamicina
- EcoRI:
- Sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI.
- NheI:
- Sitio de corte de la enzima de restricción NheI
- Zwa1:
- gen zwa1
- sacB:
- gen sacB
- RP4mob:
- región mob con el origen de replicación para la transferencia (oriT)
- Oriv:
- Origen de replicación V
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Degussa AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Bacterias corineformes que producen
compuestos químicos II.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 010303 BT
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1263
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
<222 (1)..(1263)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> lysC gen
tipo-salvaje
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 421
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1263
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1263)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> alelo lysC-fbr lysC
T311I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 421
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador lysCK1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador lysCK2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_ característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
LC-lysC1-fbr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_ característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
LC-lysC2-fbr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_ característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonicleótido
lysC311-C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_ característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonicleótido
lysC311-A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_ característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador lysEK-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_ característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador lysEK-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_ característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador zwa1-A2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_ característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador zwa1-E1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
Claims (20)
1. Bacterias corineformes con alta estabilidad
que producen un L-aminoácido seleccionado a partir
del grupo que consiste de L-lisina,
L-metionina, L-treonina y
L-valina donde estas bacterias comprenden al menos
dos copias de un gen donde dichas copias están presentes en el
sitio natural en dicha bacteria en rearreglo tandem y pertenecen a
los genes requeridos para la producción de dichos
L-aminoácidos y donde dichos genes son seleccionados
del grupo que consiste de:
\vskip1.000000\baselineskip
a) para la producción de
L-lisina:
uno o más de los genes seleccionados a partir
del grupo que consiste de
70
\vskip1.000000\baselineskip
b) para la producción de
L-metionina:
uno o más de los genes seleccionados a partir
del grupo que consiste de
71
\vskip1.000000\baselineskip
c) para la producción de
L-treonina:
uno o más de los genes seleccionados a partir
del grupo que consiste de
72
\newpage
d) para la producción de
L-valina:
uno o más de los genes seleccionados a partir
del grupo que consiste de
73
donde dichas bacterias son
obtenidas por transformación usando vectores que no se replican en
bacterias corineformes y que portan dos copias de dichos genes en
rearreglo tandem, y donde de 0 a 24 residuos de nucleótidos de
secuencias del vector usado permanecen en los flancos de dichos
genes.
2. Bacterias corineformes de acuerdo a la
reivindicación 1, que tienen al menos una tercera copia de dicho
gen en un sitio de gen adicional, donde de 0 a 24 nucleótidos de
residuos del vector usado permanecen en el flanco de dicha tercera
copia.
3. Bacterias corineformes de acuerdo a las
reivindicaciones 1 ó 2, donde dichas bacterias son libres de una
secuencia nucleotídica en dichos sitios que proporciona resistencia
a los antibióticos.
4. Bacterias Corineformes de acuerdo con una o
más de las reivindicaciones 1 a 3, que produce
L-lisina, que comprende al menos dos copias de un
gen seleccionado del grupo de lysC^{FBR}, lysE y zwa1.
5. Bacterias Corineformes de acuerdo con una o
más de las reivindicaciones 1 a 4, que produce
L-lisina, que comprende al menos dos copias de un
gen lysE.
6. Bacterias Corineformes de acuerdo con una o
más de las reivindicaciones 1 a a 4, que produce
L-lisina, que comprende al menos dos copias de un
gen zwa1.
7. Bacterias Corineformes de acuerdo con una o
más de las reivindicaciones 1 a 4, que produce
L-lisina, donde un alelo lysC^{FBR} es duplicado
que codifica para una forma resistente a la retroalimentación de
aspartato quinasa.
8. Bacterias Corineformes de acuerdo a la
reivindicación 7, donde un alelo lysC^{FBR} es duplicado que
codifica para una aspartato quinasa resistente a retroalimentación
que contiene uno o más intercambios de aminoácidos en la secuencia
de acuerdo a SEQ ID NO: 2, seleccionados del grupo que consiste de
A279V, S301F, T308I, S301Y, G345D, R320G, T311I y S381F.
9. Bacterias Corineformes de acuerdo a la
reivindicación 7, donde dicha aspartato quinasa resistente a la
retroalimentación tiene la secuencia de aminoácido de acuerdo a
SEQ ID NO: 4.
10. Bacterias Corineformes de acuerdo a la
reivindicación 7, donde dicho alelo lysC^{FBR} tiene la secuencia
de aminoácido de acuerdo a SEQ ID NO: 3.
11. Bacterias Corineformes de acuerdo a la
reivindicación 1, 9 y 10, que comprende una copia del gen lysC y
una copia del alelo lysC^{FBR}, que tiene la secuencia
nucleotídica de acuerdo a SEQ ID NO: 3 en rearreglo tandem.
12. Bacterias Corineformes de acuerdo a una o
más de las reivindicaciones de 1 a 10, donde la bacteria
corineforme pertenece al género Corynebacterium.
13. Bacterias Corineformes de acuerdo a la
reivindicación 12, donde dicha bacteria pertenece a la especie de
Corynebacterium glutamicum.
14. Proceso para la preparación de un
L-aminoácido, seleccionado a partir del grupo que
consiste de L-lisina, L-metionina,
L-treonina y L-valina que
comprende:
- a)
- fermentación de bacterias corineformes de acuerdo a las reivindicaciones de 1 a 13.
15. Proceso de acuerdo a la reivindicación 14,
que comprende:
- a)
- concentración de dicho L-aminoácido en el caldo de fermentación y/o las células de la bacteria, y
- b)
- aislamiento de dichos L-aminoácidos a partir del caldo de fermentación.
16. Proceso de acuerdo con la reivindicación 15,
que comprende:
- a)
- aislamiento de dichos L-aminoácidos a partir de dicho caldo de fermentación con constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa a la extensión de > 0 a 100%.
17. El plásmido pk18mobsacB2xlysCSma2/1,
depositado en forma de un cultivo puro de la cepa E. coli
bajo el número DSM14244.
18. La cepa Corynebacterium glutamicum
DSM139921lysC^{FBR}::lysC^{FBR} depositada en forma de un
cultivo puro bajo el número DSM15036.
19. La cepa Corynebacterium glutamicum
ATCC21513_17lysE::lysE depositada en forma de un cultivo puro bajo
el número DSM15037.
20. La cepa Corynebacterium glutamicum
ATCC21513_17zwa1::zwa1 depositada en forma de un cultivo puro bajo
el número DSM15038.
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