PL185465B1 - Zastosowanie stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny, kompozycja terapeutyczna do leczenia lub zapobiegania zwyrodnieniu plamki i dodatek do diety - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny do wytwarzania leku do leczenia zwyrodnienia plamkowego u ludzi. 16. Kompozycja do leczenia lub za- pobiegania zwyrodnieniu plamki u ludzi, znamienna tym, ze zawiera stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny w ilosci przydatnej terapeutycznie, w której stereoizomer 3R-3'R stanowi przynajmniej okolo 90% calej ilo- sci zeaksantyny, zas stereoizomery S-S i S-R stanowia mniej niz okolo 10% calej ilosci zeaksantyny w kompozycji. Figura 1 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny, kompozycja terapeutyczna do leczenia lub zapobiegania zwyrodnieniu plamki i dodatek do diety.

Wynalazek należy do dziedziny biochemii i dotyczy pewnych izomerów żółtego barwnika zwanego zeaksantyną (w skrócie ZX). Barwnik ten podawany ludziom jako lek lub witamina, może leczyć lub zapobiegać chorobie zwanej zwyrodnieniem plamkowym, które uszkadza siatkówkę i może powodować ślepotę.

Siatkówka jest tkanką leżącą z tyłu gałki ocznej. Jej budowa jest skomplikowana i zawiera tuzin różnorodnych warstw. Jest opisywana i pokazywana na rysunkach w wielu podręcznikach medycznych takich jak Gittinger 1988 i Vaughn and Asbury 1992 (wszystkie cytowania są podane poniżej).

185 465

Szczególny region naczyniowy zwany plamką, o średnicy u ludzi około 1 do 1,5 milimetra znajduje się w środkowej części siatkówki. Plamka posiada dwie odrębne cechy, wyróżniające ją od pozostałej części siatkówki. Po pierwsze plamka zawiera stosunkowo mało pręcików, większość z ich fotoreceptorów jest w kształcie czopka (w dołeczku, centralnej części plamki, nie ma w ogóle pręcików). Po drugie plamka posiada wyraźny żółty kolor spowodowany występowaniem dwóch barwników zwanych luteiną i zeaksantyną. Oba należą do klasy cząsteczek zwanych karotenoidami. Chemia tych karotenoidowych barwników jest omówiona poniżej po podsumowaniu zwyrodnieniu plamkowemu.

Zwyrodnienie plamkowe „Zwyrodnienie plamkowe” odnosi się do stanu, który obejmuje postępujące zniszczenie komórek siatkówki lub fotoreceptorów czopków w żółtym regionie plamki w centralnej części siatkówki. Zostało to opisane i zilustrowane w artykułach i pracach takich jak Taylor'a1993, Gittinger'a 1988 i Yaughan'a i Asbury'ego 1992.

Istnieje kilka rodzajów zwyrodnienia siatkówki. Najpopularniejszym rodzajem jest tak zwane „starcze zwyrodnienie plamki” (age-related macular degeneration) zwykle opisywane skrótem AMD (lub w niektórych artykułach jako ARMD). ADM może uszkodzić wzrok w różnym stopniu od niewielkiego upośledzenia do całkowitej ślepoty.

Występują dwie postaci AMD, często opisywane jako forma wysiękowa i zanikowa. Postać wysiękowa obejmuje agresywny rozrost naczyń włośniczkowych i innych naczyń krwionośnych do siatkówki, do miejsca gdzie naczynia krwionośne rozrywają i niszczą prawidłową organizację warstw siatkówki. Jednakże ta postać AMD może być czasami leczona przy zastosowaniu lasera zamykającego nowotworzące się naczynia krwionośne, leczenie laserem jedynie spowalnia na jakiś czas wzrost naczyń krwionośnych, zwykle nie zapobiega prawie całkowitej utracie wzroku; wysiękowa AMD prawie zawsze prowadzi do całkowitej lub prawie całkowitej ślepoty. Postać wysiękowa występuje jedynie u około 5 do 10 procent pacjentów cierpiących na AMD.

Inna postać AMD jest zwana AMD zanikową. Ponieważ występuje u około 90% przypadków zwykle jest opisywana po prostu jako AMD. Mimo że ta postać AMD zwykle nie powoduje całkowitej ślepoty to może spowodować poważne uszkodzenie wzroku pacjenta i czyni pacjenta niezdolnym do czytania lub dobrego rozpoznawania obiektów takich jak twarze przyjaciół i rodziny. Tak więc prowadzi do ślepoty czynnościowej, dotknięci nią pacjenci są niezdolni do bezpiecznego jeżdżenia i chodzenia w miejscach publicznych i niezdolni do prowadzenia normalnej aktywności.

Występuje również wiele zespołów chorobowych obejmujących zwyrodnienie plamkowe jako objaw, choroba Stargardfa, choroba Best'a, choroba Batten'a, zespół Sjogrena-Larssona, zwyrodnienie czopkowo-pręciokowe i owcza lipofuscynoza ceroidowa. Artykuły opisujące każdą z tych chorób są cytowane u Dorey’a i in. 1993. Dodatkowo inne choroby, które obejmują zaburzenia spichrzania lizosomalnego (takie jak choroba Tay-Sachs'a) lub postępującą degenerację komórek nerwowych (takie jak choroba Alzheimera) również wiążą się z degeneracją plamkową.

Wiele z tych chorób ma podłoże genetyczne, udowodnione przez dziedziczenie, niektóre geny powodujące te choroby zostały wyizolowane i przesiewowe testy genetyczne mogą wskazywać czy dana osoba posiada taki defektywny gen. Każda osoba będąca nosicielem lub prawdopodobnie będąca nosicielem takiego genu, jak to zostało wykazane testem genetycznym lub historią rodzinną ma zwiększone ryzyko degeneracji plamkowej.

Poprzez powolne ograbianie ludzi z ich wzroku, AMD wywołuje straszliwe cierpienia u swoich ofiar. Kosztuje to każdego roku miliardy dolarów, zarówno poprzez utratę produktywności i znaczne obciążenie członków rodziny, firm ubezpieczeniowych, służb socjalnych i innych, którzy muszą zaspokajać potrzeby lub pomagać płacić na podstawową opiekę medyczną i na inne ubezpieczenia dla ludzi cierpiących z powodu ślepoty lub znacznego uszkodzenia wzroku.

W świetle problemów wywoływanych przez AMD, naukowcy i lekarze od dziesiątków lat szukają sposobów leczenia i zapobiegania ślepocie i innemu uszkodzeniu wzroku powo185 465 dowanemu przez degenerację plamkową. Jednakże mimo tych ponad półwiecznych wysiłków nie są obecnie dostępne żadne skuteczne środki lecznicze.

Rozpoznanie: Druzy i lipofuscyna

Degeneracja plamkowa jest zwykle rozpoznawana poprzez specjalne fotografie siatkówki. W jednym sposobie postępowania diagnostycznego lekarz wstrzykuje pacjentowi lek fluorescencyjny, dając mu czas na opłynięcie układu krążenia pacjenta, a następnie wykonuje w powiększeniu zdjęcie siatkówki, zwane angiogramem. Lekarz następnie analizuje fotografię celem oceny obecności i stężenia jednego lub obu z dwóch rodzajów resztek komórkowych.

Jeden rodzaj resztek komórkowych, znany i badany od wielu dziesięcioleci zwany jest druzami. Występują one w dwóch różnych postaciach. Mała ilość twardych druzów (małe cząsteczki o średnicy poniżej 63 mikrometrów) jest zwykle obecna w oczach wszystkich osób powyżej 40 roku życia. Za wyjątkiem nienormalnego poziomu, twarde druzy nie wskazują na uszkodzenie siatkówki.

W przeciwieństwie, znacząca ilość złogów większych, miękkich druzów (zwanych również wilgotnymi druzami) wskazuje na to, że znaczące uszkodzenie siatkówki nastąpiło lub się rozpoczęło, ponieważ duże plamki miękkich druzów zaburzają i dezorganizują warstwy siatkówki i mogą uniemożliwiać komórkom siatkówki pobieranie prawidłowych substancji odżywczych z krwi. Pacjenci, których siatkówka zawiera znaczącą ilość miękkich druzów uważa się zwykle za cierpiących z powodu zwyrodnienia plamkowego.

Inny rodzaj resztek siatkówkowych zwykle obecny u pacjentów cierpiących z powodu degeneracji plamkowej jest zwany lipofuscyną. Związek pomiędzy lipofuscyną a AMD stał się jasny dopiero niedawno (np. Weiter i in. 1988, Dorey i in. 1993).

Chemia karotenoidów .

„Karotenoidy” obejmują dużą klasę cząsteczek; w przyrodzie zidentyfikowano ponad 600 karotenoidów. Cząsteczki te mają szereg cech wspólnych, w tym:

1. Karotenoidy są tworzone przez połączenie cząsteczek izoprenu, cząsteczki 5-węglowej. Ponieważ część składowa zawiera 5 atomów węgla, większość karotenoidów zawiera wielokrotność 5 atomów węgla.

2. Karotenoidy posiadają liczne wiązania nienasycone. Umożliwia to im pochłanianie fal światła o dużej energii w regionie widma światła niebieskiego i bliskiego ultrafioletu.

3. Ponieważ karotenoidy pochłaniają fale świetlne w regionie widma światła niebieskiego i bliskiego ultrafioletu bez pochłaniania dłuższych fal świetlnych w innych regionach widma, karotenoidy zwykle mają kolor żółty, pomarańczowy, brązowy albo czerwony. Nazwa „karotenoid” pochodzi od marchewki (ang. carrot); pierwsze znane karotenoidy zidentyfikowano jako barwniki nadające marchewce kolor pomarańczowy. Kolor wywołany karotenoidami w roztworze zależy od wielu czynników, w tym od stężenia i obecności innych związków chemicznych.

4. Karotenoidy mają „sprzężone” wiązania podwójne. Oznacza to, że wiązania podwójne występują naprzemiennie z wiązaniami pojedynczymi, tzn., że każdy atom węgla w łańcuchu jest połączony wiązaniem podwójnym z innym atomem, ale żaden z atomów nie jest połączony podwójnym wiązaniem z dwoma atomami. To uporządkowanie można zrozumieć przez porównanie z figurą 1, która pokazuje budowę β-karotenu, ZX i luteiny.

Różne karotenoidy wykazują różny stopień sprzężenia i ogólnie, bardziej sprzężona cząsteczka zapewnia lepszą ochronę przed uszkodzeniem „fototoksycznym” przez promieniowanie świetlne o dużej energii. Przykładowo, w trzech karotenoidach pokazanych na fig. 1, cała część stanowiąca łańcuch prosty każdej z cząsteczek jest sprzężona, z naprzemiennymi wiązaniami pojedynczymi i podwójnymi. W {-karotenie i ZX, sprzężenie rozciąga się na pierwsze wiązania na obu pierścieniach końcowych. W przeciwieństwie, luteina ma niższy stopień sprzężenia, ponieważ podwójne wiązanie w jednym z pierścieni końcowych nie ma odpowiedniego położenia dla kompletnego sprzężenia. Jedyna różnica pomiędzy ZX i luteiną polega na położeniu wiązania podwójnego w jednym (ale nie w obu) pierścieniu końcowym.

Ponieważ karotenoidy są zaprojektowane i wyselekcjonowane (przez ewolucję) w celu pochłaniania potencjalnie szkodliwej energii światła niebieskiego i bliskiego ultrafioletu, stosowane są w przyrodzie jako barwniki ochronne. Spotyka się je u roślin ponieważ jednym

185 465 z głównych celów roślin jest pochłanianie możliwie dużej ilości światła słonecznego, przy minimalizacji uszkodzeń komórek spowodowanych promieniowaniem niebieskim, ultrafioletowym i bliskim ultrafioletowym. Uszkodzenie promieniowaniem ultrafioletowym roślin stanowi główny problem, zaś karotenoidy pomagająje zmniejszyć.

Ponieważ karotenoidy dobrze nadają się do ochrony przed uszkodzeniem fototoksycznym, zwierzęta również przyjęły (drogą ewolucji) sposoby wykorzystania karotenoidów jako barwników chroniących przed światłem. Ponieważ zwierzęta nie są w stanie syntetyzować karotenoidów w swych organizmach, muszą spożywać karotenoidy (albo prekursory karotenoidów) w roślinach. Jednym z przykładów jest β-karoten; ssaki muszą go pozyskiwać z roślin albo z mięsa. W organizmie ssaka β-karoten jest przekształcany w inne postaci cząsteczkowe, w tym witaminę A (retinol), która jest wytwarzana przez rozszczepienie β-karotenu na dwie połowy.

Karotenoidy są podzielone na dwie główne klasy, karoteny i ksantofile. Karoteny nie zawierają tlenu; są prawdziwymi wodorowęglanami utworzonymi wyłącznie z węgla i wodoru. W przeciwieństwie, ksantofile (takie jak ZX i luteina) zawierają również tlen.

Figura 1 pokazuje numerację atomów węgla w prawym i lewym pierścieniu końcowym ZX. Konwencjonalnie, atomy węgla w lewym pierścieniu końcowym numerowane są od 1 do 6, podczas gdy atomy węgla w prawym pierścieniu końcowym są liczbami z indeksem „prim”, tak jak węgiel 3' (czytaj „trzy prim”). Ponieważ ZX jest całkowicie symetryczna pod względem prawego i lewego końca, określenia „prawy” i „lewy” są jedynie wprowadzone zwyczajowo, w celu ułatwienia dyskusji. Jednakże, należy zaznaczyć, że luteina nie jest symetryczna; położenie wiązania podwójnego w „lewym” pierścieniu nie jest takie samo jak wiązania podwójnego w „prawym” pierścieniu.

Ponieważ ZX jest utworzona przez dodanie dwóch grup hydroksylowych do [.(-karotenu, na węglu nr 3 obu końców, jej nazwa chemiczna brzmi 3.3'-dihydroks>'-^[(-e-karoten; niektórzy chemicy określają ją jako karotenodiol. Cząsteczce tej nadano nazwę „zeaksantyna” ponieważ zidentyfikowano ją po raz pierwszy jako barwnik, który nadaje kukurydzy żółty kolor, zaś naukow^y naową kukurydzy j est Zea m ays.

Jak zaznaczono powyżej, w przyrodzie zidentyfikowano ponad 600 kaiOtenoidów. Kilkadziesiąt z nich ma znaczenie w ^piochemii i handlu.. ZX i luteina są szczególnie istotne dla mniea_SZeg₀ wynalazku, ponieważ występują one w siatkówce ssaków i większości innych zwiejząt.

Lut_ein_a jest istotna handlowo, ponieważ karmi się nią obficie kury (w postaci ekstraktów roślinnych., głównie z aagie_tka), w celu nadania ich skórze i żółtkom jaj koloru żółtego, co p rzyciąga sprzedawców i konsumeatów.

ZX _może wykazywać ten sam wpływ i jest silniejsza niż luteina, ale źródła ZX były _zbyt drogie, _aby ztasować ją w hodowli drobiu. Patenty US 5,308,759 i 5,427,783 ((ιϊθζΙι^ϊ, przek^^e AA.pp licd Food Biatechnalogc, Inc. , firmie będącej zgłaszającym w niniejszej i^prawro) dotyc/tyły _zbyt wysokiego kosztu ZX do ąαseosa)raaziα w ży/wizniu ceeierząt Patenty t_e dotęimęły M^wam bakiern kto wctwarzazia ZX w ilo^aciach przemysłtitvcch, tak, że można było nią żywić drób i j^z'bcOpró_cz. roślin pewne bakterie syntetyzują niektóre Zazatenaaidγ. Bakterie te ewoluowały w _miej_scach eZsponowancch na światło słoneczne, zaś ich karotenoidy pełniły tę samą rolę whroitwą co u ro^io. Kazatenoid^a z bαktatπ opisane są w McDermott i in., 1972, patent US 5,429,939 (Miśawa i in., ^,z95) i intych cytowanych tu artykułach.

P_ate_nt US 5,429,939 (Misawa i in., 1995) wymienia sekwencje DNA licznych genów; które kodąą enzym² związane z biosyntezą różnych karotenoidów, w Dym ZX. Opisana jest rówrntó rola k^dego z głównych genów (w tym crtE, crtB, crtlm, crtY i crtZ) w wytwarzamu ZX. Komórki ZaYietające plazmidy zawierające te geny zdeponowano w American Type Culture C^tocticm (takie jak Erwinia uredovara ATCC 1932^z i Eowinia herbic-ola ATCC 39368) oraz w Ferme_at_atian Rasearch Iαstitute w Japonii (np. E. coli FERM BP 2377).

Stereochemia i izomery ąeaZsaatyac aspekt chemii katateaaidów dotyczy „steteakhemii” i „stereoiąometów”. Probl_em ten jest wyjaśniaαc w dowolnym akademickim podręczniku chemii organicznej.

185 465

Jeżeli cząsteczka organiczna zawiera atom węgla z przyłączonymi do niego czterema różnymi rodzajami atomów albo grup chemicznych, atom ten określany jest jako „chiralny” atom węgla.

Jeżeli w cząsteczce organicznej występuje chiralny atom węgla, cztery różne grupy przyłączone do niego mogą być uporządkowane w jednym z dwóch ustawień. Te dwa różne ustawienia zwane są stereoizomerami. Jeden z tych stereoizomerów skręca światło spolaryzowane w sposób „prawoskrętny”, podczas gdy drugi skręca światło spolaryzowane w sposób „lewoskrętny”. Izomer powodujący skręcenie w prawo nazywany jest stereoizomerem R (albo D). Izomer powodujący skręcenie w lewo nazywany jest stereoizomerem S (albo L).

Ponieważ oba, 3 i 3' atomy węgla ZX są chiralne, występują cztery możliwe stereoizomery. W izomerze 3R-3'R atomy węgla 3 i 3' są w konfiguracji R. W izomerze 3S-3'S atomy węgla 3 i 3' są w konfiguracji L. Dla wygody, te dwa stereoizomery określane są tu jako izomer R-R i izomer S-S.

Trzeci i czwarty izomer są izomerami „mieszanymi” albo „mezo” (jeden R i jeden S): izomer 3R-3'S i 3S-3'R. Ponieważ ZX jest całkowicie symetryczna względem swojego środka, izomery te są identyczne pod każdym względem; jeżeli izomer 3R-3'S zostanie narysowany na papierze, obrócenie papieru przemienia go w izomer 3S-3'R. W efekcie, pojedynczy izomer „mezo” tworzony jest przez oba izomery S-R i R-S.

Jeżeli do wytwarzania ZX stosuje się standardowe techniki chemiczne, każdy z możliwych izomerów będzie występował w około 25% całości. Jednakże, ponieważ stereoizomery S-R i R-S są właściwie identyczne, ich izomer „mezo” stanowi 50% całości, podczas gdy izomery R-R i S-S występują w ilości około 25% każdy. Mieszaninę wszystkich trzech stereoizomerów określa się jako mieszaninę „racemiczną”.

Jednakże, swoistości karotenoidów względem komórki i enzymu w tkance siatkówki są niezwykle dokładne i różne izomery albo stereoizomery nie są wzajemnie wymienialne. Luteina i ZX są traktowane przez komórki siatkówki jako całkowicie różne i odmienne cząsteczki, nawet jeżeli są one rozważane jako swoje wzajemne izomery według konwencjonalnej terminologii chemicznej (ponieważ mają identyczną liczbę atomów węgla, wodoru i tlenu).

Z powodu czynników biologicznych jedynymi istotnymi izomerami są tu stereoizomery. Jakikolwiek odnośnik do „izomeru” zeaksantyny dotyczy konkretnie stereoizomeru ZX i nie obejmuje luteiny. Luteina i ZX uważane są za całkowicie inne karotenoidy.

Różnice stereoizomeryczne u karotenoidów, które mogą wydawać się niewielkie, subtelne i nieznaczące, są w rzeczywistości niezwykle istotne gdy chodzi o tkankę siatkówki. Jedyny stereoizomer ZX, który jest prawidłowo pobierany i wykorzystywany przez ludzkie komórki siatkówki, jest izomerem R-R (stereoizomer 3R-3'R).

Istnieją doniesienia o znalezieniu śladowych ilości izomeru mezo (R-S) ZX w tkance siatkówki. Jednakże, te śladowe ilości można prawdopodobnie przypisać pewnym przekształceniom cząsteczkowym zachodzącym spontanicznie w pewnych warunkach, prowadzącym do tworzenia mezo-zeaksantyny z prekursorów luteiny (Bone i in., 1993 i 1994).

W warunkach laboratoryjnych, stereoizomery ZX można rozróżnić stosując metody takie jak chromatografia chiralna (Bone i in., 1993) albo analizę dichroizmu kołowego (Britton, 1994).

Zeaksantyna i luteina w plamce

Od roku 1970 dobrze znana jest rola karotenoidów w ochronie roślin przed fototoksycznym uszkodzeniem. Wiadomo również, że karotenoidy są obecne w tkankach zwierzęcych, i że wszystkie karotenoidy u zwierząt pierwotnie pochodzą z roślin, ponieważ zwierzęta nie mogą syntetyzować karotenoidów. W oparciu o te informacje wielu autorów różnych publikacji wskazuje na podobieństwa pomiędzy karotenoidami u zwierząt i roślin i wnioskują, że karotenoidy zabezpieczają przed fototoksycznym uszkodzeniem u zwierząt.

Po tym jak poznano fotoprotekcyjną rolę karotenoidów u zwierząt badacze rozpoczęli studiowanie chemii i roli karotenoidów w siatkówce. Jeden kierunek doświadczeń obejmuje testy, w których zwierzęta laboratoryjne otrzymywały dietę pozbawioną karotenoidów, przygotowaną z ziaren lub nasion, które nie zawierają karotenoidów (takie jak nasiona sorga). Wyniki wskazują, że siatkówki u zwierząt laboratoryjnych pozbawionych karotenoidów nie wykształcały obszaru plamki żółtej i te siatkówki obejmowały nienormalnie wysoki poziom

185 465 miękkich druzów, wskazujących na zniszczenie siatkówki (Malinow i in. 1980, Kirschfeld 1982, Ham i in. 1984 i Snodderly i in. 1984). W świetle tych znalezisk badacze sugerują, że karotenoidy wydają się być niezbędne dla zdrowej siatkówki. Badacze ci wnieśli molekularne podstawy do starej wiedzy, że marchewki i zielone, liściaste warzywa są dobre dla oczu. Jednakże jak dotąd naukowcy nie wiedzą czy żółte barwniki w plamce są przyjmowane z pokarmem w formie ostatecznej, czy są syntetyzowane przez zwierzęta z użyciem innych prekursorów takich jak beta-karoten lub likopen.

Luteina została zidentyfikowana w 1949 jako jeden z żółtych barwników w plamce (Wald 1949). ZX nie została zidentyfikowana jako inny barwnik plamkowy jeszcze przez wiele lat (Bone i in. 1985). Artykuły podsumowujące w połowie i końcu lat 80 wiedzę o barwnikach plamkowych obejmują prace Handelman'a i Dratz'a 1986, Wemer'a i in. 1987, Pease'a i in. 1987, Haegerstrom'a-Portnoy'a 1988 i Handelmann'a i in. 1988. Między innymi te artykuły dowodzą, że ZX (która jest całkowicie skonjugowana, i która przez to oferuje lepszą ochronę niż luteina przed uszkodzeniem powodowanym energią świetlną) jest dominującym barwnikiem dołeczka, małego regionu w samym środku plamki. Ilość ZX stopniowo zmniejsza się i ilość luteiny zwiększa się w miarę przesuwania się ekscentrycznie od dołeczka do zewnętrznych krawędzi plamki, tak że na zewnętrznych obrzeżach plamki luteina jest dominującym żółtym barwnikiem. Nowsze artykuły, których treść obejmuje różne aspekty starzenia się i uszkodzenia siatkówki i skupia się szczególnie na karotenoidach jako czynnikach ochronnych siatkówki obejmują artykuły Sperduto i in. 1990, Gerster'a 1991, Schalch'a 1992 i Seddona i in. 1994.

Podsumowując, wiadomo od ponad 10 lat, że luteina i ZX są dwoma barwnikami w plamce i naukowcy od ponad dekady spekulują czy te barwniki mogą pomagać chronić plamkę przed uszkodzeniem fototoksycznym.

Jednak pomimo faktu, że te odkrycia i sugestie zostały poczynione więcej niż 10 lat temu nie został wytworzony żaden rodzaj leku, rozwinięty odżywczy czy dietetyczny sposób uzupełnienia ani inna forma leczenia, o której wiedziano by, że jest skuteczna w znaczącym zapobieganiu lub opóźnianiu (nie mówiąc o odwracaniu) stopniowego postępu zwyrodnienia plamkowego.

Powyższe stwierdzenie wymaga pewnego ograniczenia, odkąd wiadomo, że β-karoten, witamina A i witamina E wykazują pewien poziom korzystnego, pomocnego działania w ochronie tkanki siatkówki (patrz np. patent USA 5,310,764, Baranowitz i in. 1994 i dwa cytowane poniżej artykuły z badania Eye Disease Case Control Study Group). Te patenty i te artykuły twierdzą lub sugeruj że β-karoten, witamina A i witamina E wywierają dostrzegalny efekt w zapobieganiu lub zmniejszaniu uszkodzenia związanego z degeneracja plamkową.

Te twierdzenia mogą być prawdziwe dzięki generalnej roli antyoksydacyjnej karotenoidów, witaminy i witaminy E. Jednakże, jest smutną prawdą, że korzyści zapewniane przez β-karoten, witaminę A i witaminę E w siatkówce są bardzo ograniczone i nie dochodzą do poziomu skutecznego leczenia. Ze względów praktycznych degeneracji plamkowej nie można zapobiec, nie można jej zahamować, ani jej odwrócić. Szerokie spektrum antyoksydantów (takich jak β-karoten, witamina A i witamina E) jest zaledwie środkiem paliatywnym. Dopóki nic rzeczywiście skutecznego nie będzie dostępne będą stosowane te witaminy (ze znacznymi ograniczeniami i nie satysfakcjonującymi wynikami) w celu próby zwolnienia nieubłaganego uszkodzenia powodowanego przez zwyrodnienie plamkowe.

Zgodnie z wcześniejszym stanem wiedzy należy również zauważyć, że wiele sklepów ze zdrową żywnością sprzedaje preparaty karotenoidowe, które są oznakowane jako korzystne dla oczu i wzroku. To oznakowanie utrzymuje, że stosowanie mieszanki karotenoidów może być racjonalne, jeżeli wiadomo (jak to podano powyżej), że β-karoten i witamina A są stosowane jako ogólne antyoksydanty. Jednakże, żadna dostępna na rynku mieszanka karotenoidów nie zawiera więcej ilości ZX niż skrajnie mały „ślad”. Znaczna większość karotenoidów w mieszankach karotenoidów sprzedawanych w sklepach ze zdrową żywnością są to karotenoidy bezzeaksantynowe (głównie β-karoten i witamina A).

Stanowiska i cele badawcze wielu ważnych agencji rządowych i konsorcjów badawczych są również warte bacznej uwagi. W Stanach Zjednoczonych National Institutes of He185 465 alth (działający poprzez National Eye Institute (NEI) i National Advisory Eye Council) wydał dwa nowe raporty zatytułowane „Vision Research: A national Plan 1994-1998” NIH Publication No. 93-3186 (1994; patrz szczególnie strony 55-65) i „Age related eye disease study” NIH Publication 93-2910 (1993). Obie publikacje i praca badawcza przez nie opisywana, skupiają się na β-karotenie (niż na ZX) jako najbardziej obiecującym związku do leczenia AMD. Zgłaszający zgodnie ze swą najlepszą wiedzą i w najlepszej wierze ustalił, po przedyskutowaniu tematu z urzędnikami NEI, że ani NEI ani inna organizacja powiązana z National Institutes of Health nie zamierza rozpoczynać, lub niedawno nie rozpoczęła żadnych badań nad zeaksantynąjako ewentualnym leczeniem AMD. Przeciwnie NIH i inne ogranizacje rządowe zaangażowały miliony dolarów w badaniach nad β-karotenem jako ewentualnie najbardziej obiecującym czynnikiem do leczenia lub zapobiegania AMD.

Inni znaczący badacze, którzy zasługują na baczną uwagę należą do „Eye Disease Case Control Study Group. Grupa ta opublikowała ostatnio dwa artykuły zatytułowane: „Antioxydant status and neovascular age-related macular degeneration” Arch. Ophtalmol. 11: 104-109 (1993) i „Risk factors for neovascular agerelated macular degeneration” Arch. Ophtalmol. 10: 1701-1708 (1992), tak jak w oficjalnych raportach NIH, żaden z tych artykułów nie poleca lub sugeruje zastosowanie zeaksantyny jako leku do leczenia AMD również i to konsorcjum odrzuciło lub odmówiło ufundowania badań nad ZX jako ewentualnym czynnikiem do leczenia lub zapobiegania AMD.

Warto również zauważyć, że istnieje ogromne zainteresowanie karotenoidami w leczeniu i zapobieganiu nowotworom (rozpoczęte przez Peto i in. 1981) i w zapobieganiu tworzenia się cholesterolu i w zmniejszaniu depozytów płytek miażdżycowych wewnątrz tętnic (Jialal i in. 1991). Jest niezwykła ilość literatury naukowej traktującej o różnych aspektach działania karotenoidów i istnieje ogromne zainteresowanie sposobami chemicznego zsyntetyzowania karotenoidów, włączając w to luteinę i zeaksantynę. Jednakże, pomimo wszystkich wysiłków poświęconych w ciągu ostatniego dziesięciolecia na badania karotenoidów i ich syntezę, nie doniesiono jeszcze o żadnej skutecznej metodzie leczenia lub zapobiegania zwyrodnieniu plamkowemu. W świetle ogromnych kosztów i cierpień ofiar dotkniętych degeneracją plamkową i społeczeństwa jest to ogromny problem, który musi być rozwiązany.

Synteza luteiny i zeaksantyny: stan techniki

W różnych publikacjach w stanie techniki opisywano sposoby wytwarzania ZX. Można je pogrupować na dwie kategorie: sposoby fermentacyjne, w których w procesie wytwarzania główną rolę odgrywały drobnoustroje; i nie fermentacyjne metody syntezy, w których stosowano czysto chemiczne metody. Większość publikacji w stanie techniki wskazywała, że ZX ma być stosowana do znanych celów, takich jak dodatki do paszy drobiu i ryb, w celu przyciemnienia koloru mięsa i uczynienia go bardziej atrakcyjnym. Jednakże, żaden z tych sposobów nie spowodował wytwarzania ani sprzedaży ZX w ilościach komercyjnych.

W październiku 1995 jedynym sposobem nabycia ZX, w postaci oczyszczonej albo pół-zatężonej, w której ZX stanowiła ponad około 5% wagi, wymagało zakupu miligramowych ilości ZX od wyspecjalizowanych firm chemicznych takich jak Atomergic Chemicals Corporation (Farmingdale, NY) albo Spectrum Chemical Manufacturing Company (Gardena, CA). Ceny w roku 1995 oczyszczonej ZX pochodzącej od wyspecjalizowanych producentów', w syntetycznych mieszaninach racemicznych zawierających niepożądane izomery S-S i S-R, wahały się od około 90$ do 125$ za miligram. Stanowi to około 100000$ (w walucie USA) za gram ZX w mieszaninie racemicznej. Jasne, że preparaty te nie miały realnej możliwości zastosowania jako leki albo dodatki żywieniowe, zarówno z uwagi na ich cenę, jak i z powodu zawartości znacznych ilości niepożądanych i, prawdopodobnie niebezpiecznych izomerów S-S i mezo. Przed dokonaniem niniejszego wynalazku oczyszczona albo pół-oczyszczona zeaksantyna R-R praktycznie nie była dostępna powszechnie w żadnej postaci.

Publikacje w stanie techniki, które opisują wytwarzanie ZX przy użyciu fermentacji drobnoustrojów obejmują:

(1) Courinjoon i Goo dwin 1955, najwczaśniejsza znana publikacja opisająca wytwarzanie ZX przez bakterie z rndząjo Ι·Ίρ\·(^ρ^ζγ.

185 465 (2) Patent US 3,891,504 (Schocher i Wiss, 1975, przekazany na Hoffmann La-Roche), również opisujący wytwarzanie ZX przez komórki Flavobacter. Komórkami tymi zawierającymi ZX karmiono kury co powodowało odpowiednie zabarwienie.

(3) Patent US 3,841,967 (Dasek i in., 1974) i patent US 3,951,743 (Shepherd i in., 1976). Oba przekazane Nestle. Opisują one metody i środki odżywcze, które można zastosować do zwiększenia ilości ZX wytwarzanej przez bakterie.

(4) Dwa niedawne patenty US ( (US 5,308,759 i 5,427,783), oba na wynalazki dokonane przez Gierhart) przekazane Applied Food Biotechnology, Inc., będącej zgłaszającym w niniejszej sprawie. Patenty te opisują szczepy bakterii (Flavobacterium multivorum) wyizolowanej z biegu Missouri. Bakterie te, jak stwierdzono, wytwarzają ZX bez wytwarzania istotnych ilości innych karotenoidów. Było to istotne w kontekście karmienia drobiu i ryb, w celu nadania ciemniejszego koloru mięsu i żółtkom jaj, ponieważ karotenoidy współzawodniczą ze sobą o wychwyt do krwiobiegu, po spożyciu przez zwierzę. Nieobecność innych karotenoidów szczepu F. multivorum zidentyfikowana przez Gierhart czyni ZX bardziej dostępną jako barwnik dla tkanek zwierzęcych i powoduje wzrost jej siły i wydajności.

Metody według zastrzeżeń patentu '759, do wytwarzania Zx do pasz dla drobiu i ryb, wykorzystują AFB bakterii F. multivorum. Patent '783, rozdzielony, zastrzega mieszaniny pasz. Oba patenty są ograniczone do zastosowania ZX w paszach dla drobiu i ryb, i żaden z nich nie wskazuje na zastosowanie ZX do leczenia ludzi.

Również patenty Gierhart nie stwierdzają nic o swoistych stereoizomerach ZX, z dwóch powodów: (1) stan stereoizomerów ZX wytworzonych przez AFB komórek F. multivorum nie był znany w 1989, gdy składano zgłoszenie i (2) ponieważ patenty całkowicie dotyczyły wytwarzania ZX do zastosowania w paszach dla drobiu i ryb, nie było powodu dla rozważań nad różnymi stereoizomerami.

AFB typu dzikiego szczepu F. multivorum zdeponowano w ATCC pod numerem ATCC 55238. Ponieważ bakterie te wytwarzały pewien rodzaj lipidów zwanych sfingolipidami, ATCC ponownie sklasyfikowała te bakterie jako Sphingobacterium multivorum i wymieniła te komórki pod tą nazwą w swoim katalogu. Nazwa Sphingobacterium, która pojawia się w katalogu ATCC nie pojawiała się jeszcze w pracach dotyczących oficjalnych wytycznych taksonomii bakterii: Bergy's Manual of Systematic Bacteriology, która jest uaktualniana przez International Journal of Systematic bacteriology.

Wysiłki w kierunku wytworzenia ZX standardową syntezą chemiczna (bez zastosowania drobnoustrojów) opisywano na przestrzeni ostatnich 20 lat, w tym w patentach US 4,153,615 (Saucy 1979), 4,952,716 (Lukac i in., 1990) i 5,227,507 (Lukac i in., 1993). Jednakże, procesy te wykazywały poważne wady. Wymagały one zwykle licznych etapów reakcji, zaś każdy z etapów miał uzysk niższy niż 100%, tak że końcowy uzysk ZX na zakończenie wieloetapowego procesu był względnie niski. Oprócz tego, chemiczna synteza zwykle daje niepożądane stereoizomery S-S i S-R ZX, jak również różne produkty konwersji albo degradacji, takie jak utleniona zeaksantyna, oraz cząsteczki zeaksantyny, które utraciły jedno lub wiele wiązań podwójnych w części prostej i/lub pierścieniach końcowych.

Podsumowując, przed dokonaniem niniejszego wynalazku, nieznane było źródło oczyszczonej zeaksantyny R-R przydatnej do konsumpcji przez ludzi, ani jako lek, ani jako uzupełnienie diety.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny do wytwarzania leku do leczenia zwyrodnienia plamkowego u ludzi, korzystnie w postaci użytkowej przydatnej do podawania ludziom, która zawiera ilość zeaksantyny wystarczającą do zapewnienia korzyści terapeutycznej ludziom cierpiącym na zwyrodnienie siatkówkowe i zawiera również dopuszczalną fizjologicznie zaróbkę, rozcieńczalnik albo nośnik.

Lek, do wytwarzania którego stosuje się stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny w dawce jednostkowej zawiera przynajmniej około 1 mg stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny.

Stosowany stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny jest wytworzony sposobem obejmującym hodowlę, w pożywce płynnej, w warunkach ułatwiających syntezę zeaksantyny, komórek, które syntetyzują stereoizomer 3R-3R zeaksantyny w ilości co najmniej 90% wszystkich cząsteczek karotenoidów wytwarzanych przez komórkę.

185 465

Korzystnie komórki syntetyzują stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny bez syntetyzowania jakichkolwiek wykrywalnych ilości innych stereoizomerów zeaksantyny.

Korzystnie są to komórki bakteryjne pochodzące od szczepu Flavobacterium multivorum, któremu nadano nr ATCC 55238.

Stosowany stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny korzystnie jest wytworzony przez komórki zmodyfikowane genetycznie w taki sposób, że zawierają przynajmniej jeden gen syntezy zeaksantyny zawierający sekwencję DNA otrzymaną z komórek pochodzących od szczepu Flavobacterium multivorum, któremu nadano nr ATCC 55238.

W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny do wytwarzania dodatku do diety, który jest przydatny do doustnego spożycia przez ludzi w celu zmniejszenia ryzyka zwyrodnienia siatkówkowego, korzystnie do wytwarzania dodatku do diety przeznaczonego dla pacjentów cierpiących na chorobę Stargardfa, chorobę Best'a, chorobę Batten'a, zespół Sjogrena-Larssona, zwyrodnienie czopkowo-pręcikowe i owczą lipofuscynozę ceroidową, zaburzenia spichrzania lizosomalnego albo podwyższoną podatność genetyczną na zwyrodnienie plamkowe.

Stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny stosuje się do wytwarzania dodatku do diety w postaci jednostki dawkowania, która zawiera przynajmniej około 0,1 mg stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny.

Wynalazek obejmuje też zastosowanie stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny do wytwarzania leku albo dodatku do diety do leczenia ludzi, które mają postać użytkową odpowiednią do podawania doustnego i zawierają izomer 3R-3'R zeaksantyny w ilości dostatecznej aby przy przyjmowaniu jednej dawki jednostkowej dziennie w tkance siatkówki osadziła się wykrywalna ilość dodatkowej zeaksantyny oraz w których stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny stanowi co najmniej około 90% całej obecnej zeaksantyny, a stereoizomery 3S-3'S i 3S-3'R stanowią mniej niż około 10% całej zeaksantyny.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja leczenia lub zapobiegania zwyrodnieniu plamki u ludzi która zawiera stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny w ilości przydatnej terapeutycznie, w której stereoizomer 3R-3'R stanowi przynajmniej około 90% całej zeaksantyny, zaś stereoizomery S-S i S-R stanowią mniej niż około 10% całej zeaksantyny w kompozycji, korzystnie w nośniku albo rozcieńczalniku przeznaczonym do podawania doustnego ludziom, w ilości skutecznej terapeutycznie do zastosowania w leczeniu albo zapobieganiu zwyrodnieniu plamkowemu u ludzi.

Kompozycja według wynalazku nie zawiera zasadniczo stereoizomerów S-S i R-S zeaksantyny.

Kompozycja jest w postaci użytkowej, przy czym każda jednostka dawkowania zawiera przynajmniej około 0,1 mg stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny, korzystnie przynajmniej około 1 mg stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny.

Nośnik obecny w kompozycji według wynalazku jest substancją spożywczą przeznaczoną do spożywania przez ludzi, a zeaksantyna ma powłóczkę ochronną zmniejszającą rozkład zeaksantyny w żołądku.

Kompozycja według wynalazku korzystnie zawiera niepatogenne komórki bakterii, które zawierają stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny w stężeniu co najmniej około 2% wagowe, jako frakcja masy komórek bakteryjnych.

Te komórki bakteryjne pochodzą od szczepu Flavobacterium multivorum, któremu nadano nr ATCC 55238.

W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja terapeutyczna lub dodatek do diety w postaci użytkowej do podawania ludziom, które zawierają fizjologicznie dopuszczalny nośnik, a jako substancję czynną zawierają stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny w ilości w dawce jednostkowej wystarczającej do wykrywalnego wzrostu stężenia zeaksantyny w tkance siatkówki przy podawaniu jednej dawki jednostkowej dziennie.

Poniżej opisano sposób wytwarzania zeaksantyny, zawierającej stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny (określany również jako, izomer R-R albo zeaksantyna R-R) jako jedyny wykrywalny albo dominujący izomer, jako lek albo uzupełnienie diety, do spożywania przez ludzi. ZX, żółtawy barwnik w komórkach plamki w siatkówce człowieka, pochłania promie12

185 465 niowanie niebieskie i bliski ultrafiolet, chroniąc siatkówkę przed uszkodzeniem fototoksycznym. Preparaty ZX, które zawierają wyłącznie pożądany izomer R-R, są wytwarzane przez komórki szczepu Flavobacterium multivorum (ATTC nr 55238).

Bakterie te nie wytwarzają wykrywalnych ilości niepożądanych stereoizomerów S-S i S-R i nie syntetyzują istotnych ilości innych karotenoidów, takich jak β-karoten albo luteina, które mogą współzawodniczyć z ZX o wychwyt w przewodzie pokarmowym po spożyciu. Po syntezie przy użyciu tych bakterii, ZX można oczyścić sposobami takimi jak ekstrakcja rozpuszczalnikiem i można ją przyjmować doustnie, jako lek przez pacjentów cierpiących na zwyrodnienie plamkowe, albo jako uzupełnienie diety przez każdego, kto chce zmniejszyć ryzyko cierpienia z powodu zwyrodnienia plamkowego związanego z wiekiem, które jest rozpowszechnione wśród ludzi w wieku około 50 albo 60. Ujawniono również wygodne kompozycje do spożycia, takie jak (1) wodoodporne kapsułki zawierające zeaksantynę R-R zmieszaną z nośnikiem takim jak olej roślinny; (2) różne produkty spożywcze (takie jak margaryna, produkty mleczne, syrop, ciasteczka i preparaty mięsne, które nie są poddawane gotowaniu), które zawierają zeaksantynę jako dodatek; i (3) kompozycje granulowane, które można dodać do zup, sałatek, napojów i innych produktów spożywczych.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia budowę cząsteczkową beta-karotenu, luteiny i zeaksantyny, pokazującą wzory strukturalne wszystkich trzech karotenoidów i system numeracji pierścieni końcowych. Te wzory strukturalne znane są w stanie techniki.

Figura 2 obejmuje schemat opisujący etapy fermentacji i oczyszczania ZX wytworzonej przez drobnoustroje, syntetyzujące stereoizomerycznie czystą zeaksantynę 3R-3'R.

Preparaty zeaksantyny przeznaczone do spożycia przez ludzi powinny zawierać stereoizomer 3R-3'R ZX (zwany również, dla wygody, izomerem R-R albo zeaksantyną. ZX) jako „istotnie dominujący” izomer. W znaczeniu tu zastosowanym, „istotnie dominujący izomer” dotyczy preparatu, który zawiera przynajmniej 90% albo więcej izomeru R-R, z 10% albo mniej pozostałych zeaksantyn w preparacie. Korzystnie, dowolny preparat przeznaczony do stosowania u ludzi powinien zawierać izomer R-R ZX jako jedyny wykrywalny izomer, bez wykrywalnych ilości niepożądanych izomerów S-S albo S-R. Takie preparaty ujawniono tu.

Ostatnio stwierdzono, stosując analizę chromatografii chiralnej (jak to opisali Bone i in., 1993), że szczep bakterii F. multivorum (ATCC nr 55238) wyizolowany przez Applied Food Biotechnology (AFB) wytwarza izomer R-R jako jedyny wykrywalny izomer ZX podczas fermentacji jak to opisano w przykładach. Jak to opisano w przykładzie 4, analiza dokonana przez prof. Landrum wskazuje, że nie było wykrywalnych ilości izomeru S-S albo izomeru mezo R-S w preparatach ZX wytworzonych przez fermentację tych komórek szczepu

F. multivorum.

Różnice pomiędzy izomerami R-R, R-S i S-S zeaksantyny będą bardzo istotne, jeżeli preparaty ZX podawane są ludziom jako lek albo uzupełnienie diety, ponieważ jedynym izomerem występującym w siatkówkach ludzkich jest izomer R-R. Uważa się, że spożycie znacznych ilości izomerów R-S i S-S powinno być, z medycznego punktu widzenia niepożądane i niebezpieczne, ponieważ (1) izomery R-S i S-S nie występują naturalnie w ludzkich siatkówkach, z wyjątkiem prawdopodobnie skrajnie małych śladowych ilości, występujących jako produkt uboczny wytwarzany gdy luteina jest rozkładana w komórkach siatkówki, (2) izomery R-S i S-S mogą kompetycyjnie wypierać pożądany izomer R-R w tkance siatkówki, prowadząc prawdopodobnie do poważnego, długofalowego uszkodzenia komórek i powikłań medycznych.

Zastosowanie jako leku recepturowego dla pacjentów z AMD

W pierwszym aspekcie niniejszego wynalazku preparat zeaksantyny R-R ujawniony tutaj może być przygotowywany i podawany jako lek tj. jako środek leczniczy, który może być przepisywany przez lekarzy do leczenia pacjentów, którzy są zdiagnozowani jako cierpiący z powodu degeneracji plamkowej lub choroby powodującej degenerację plamkową jako objaw subiektywny lub objaw manifestujący takie jak choroba Stargardt'a, choroba Best'a, choroba Batten'a, zespół Sjogren-Larssona, dystrofia czopkowo-pręcikowa, owcza lipofuscynoza ceroidowa lub choroby spichrzania lizosomalnego, takie jak choroba Tay'a-Sachs'a.

185 465

Gdy są użyte do takiego leczenia, preparaty ZX muszą posiadać wystarczającą ilość izomeru R-R ZX w celu osiągnięcia poziomu środka leczniczego, w substancji nośnikowej lub postaci (takiej jak kapsułka) odpowiedniej do podawania ludziom, jak to opisano poniżej. W korzystnym wykonaniu według wynalazku, ZX do terapii jest pakowana w postać jednostkowych postaci dawkowania, takich jak kapsułki lub tabletki. Każda dawka korzystnie powinna zawierać przynajmniej około 1 miligram (mg) zeaksantyny R-R i może zawierać zeaksantynę w ilości wahającej się w granicach od około 3 mg do około 10 mg zeaksantyny, jeśli jest to wymagane dla uzyskania lepszej skuteczności terapeutycznej.

W drugim aspekcie według wynalazku ujawnione tutaj preparaty zeaksantyny R-R mogą być przygotowywane i podawane jako środek profilaktyczny dla pacjentów, którzy są zdiagnozowani jako mający zwiększoną wrażliwość na wystąpienie zwyrodnienia plamkowego, w związku z historią rodzinną lub diagnozą genetyczną którejkolwiek z chorób podanych powyżej. Jednostkowa forma dawkowania do podawania pacjentom z podwyższonym ryzykiem AMD, lecz którzy obecnie nie cierpią z powodu AMD, może zawierać mniejsze ilości takie jak około 0,1 mg do około 2 mg na dawkę.

Każda z tych form dawkowania może być dostarczona w rozsądnej cenie rynkowej przy stosowaniu sposobów tutaj ujawnionych. Kapsułki zawierające 25 miligramów (lub każdą mniejszą ilość) w płynnym nośniku olejowym mogą być wytworzone w oszczędny sposób stosując fermentację mikrobiologiczną połączoną z etapem ekstrakcji płynnej. Formulacje w postaci proszku zawierające nawet większe ilości (takie jak 100 mg lub więcej na dawkę) mogą być również wytworzone, jeśli zostaną zastosowane metody bardziej intensywnego oczyszczania, takie jak metody opisane w przykładzie 4.

Zastosowanie jako witamina lub dodatek do diety

W trzecim aspekcie według niniejszego wynalazku ZX może być wytwarzane i pakowane w postaci witaminy lub dodatek do diety do przyjmowania z pokarmem przez ludzi, którzy aktualnie nie chorują na zwyrodnienie plamkowe, lecz którzy chcą zmniejszyć swoje ryzyko wystąpienia zwyrodnienia plamkowego w późniejszym życiu. Gdy jest spożywana z tych przyczyn odpowiednie dawkowanie musi być znacząco wyższe niż ślad ilości znajdowany obecnie w proszkach sprzedawanych w sklepach ze zdrową żywnością, lecz musi być niższy niż wtedy gdy ZX jest stosowany jako środek leczniczy u osób zdiagnozowanych jako cierpiące z powodu AMD. Należy się spodziewać, że takie dawkowanie będzie w granicach od 0,05 do 5 miligramów na dawkę dzienną, na przykład dawkowanie od 0,05 do 1 mg będzie wymagane gdy zeaksantyna R-R będzie jednym z tuzina lub więcej składników w kapsułkach multiwitaminowych lub tabletkach, podczas gdy dawkowanie 1 do 5 mg może być osiągnięte dla celów odręcznego kupna leków dla ludzi, którzy chcą wyższych dawek.

Niezależnie od tego czy jest stosowany jako środek terapeutyczny czy jako dodatek do diety preparat ZX do stosowania przez ludzi powinien zawierać izomer R-R jako podstawę lub wyraźnie dominujący stereoizomer ZX. Termin wyraźnie dominujący stereoizomer został użyty tutaj dla opisania preparatu ZX, w którym pożądany izomer R-R ZX stanowi przynajmniej 90% całej mieszaniny ZX, a niepożądane izomery S-S lub izomery S-R stanowią mniej niż 10%.

Korzystnie, izomer R-R powinien być jedynym wykrywalnym izomerem ZX w każdym preparacie, który ma być spożywany przez ludzi. Byłoby to możliwe do wykonania w ilościach handlowych i przy możliwych do przyjęcia kosztach według mniejszego wynalazku ponieważ linie bakterii F. multivorum opisane tutaj wytwarzają izomer R-R jako podstawowy, wykrywalny stereoizomer ZX. Jeśli są obecne jakiekolwiek izomery S-S lub S-R w mieszaninie fermentacyjnej po oczyszczeniu to ich ilości są zbyt małe do wykrycia metodami opisanymi w przykładzie 4.

Oprócz tego, odwrotnie niż większość szczepów bakterii, opisane tu komórki F. multivorum nie wytwarzają mieszaniny karotenoidów, komórki te wydzielają zeaksantynę R-R jako jedyny wykrywalny karotenoid. Ponieważ ZX musi współzawodniczyć z innymi karotenoidami o wychwyt z przewodu pokarmowego i odkładanie w tkankach, może to być przydatne do zwiększania wychwytu i odkładania w siatkówce ZX po spożyciu, zwłaszcza

185 465 w przypadkach, gdzie ZX jest stosowana jako lek do leczenia /.diagnozowanych przypadków zwyrodnienia plamkowego.

Wytwarzanie przez fermentację bakteryjną na skalę komercyjną

Jak wiadomo specjalistom, sposoby stosowane do fermentacji bakteryjnej w urządzeniach laboratoryjnych są bardzo drogie i trudne do kontrolowania przy przekształcaniu do operacji na wielką skalę przemysłową. Zgłaszający opracował ulepszone pożywki i sposoby komercyjnego zastosowania komórek F. multivorum. Ulepszone pożywki i sposoby są łatwiejsze do pracy z nimi, oraz znacznie tańsze w przeliczeniu na gram wytworzonej ZX, niż pożywki i warunki ujawnione uprzednio w patentach US 5,308,759 i 5,427,783. Korzystne pożywki i warunki opisano w przykładzie 1.

Po fermentacji, do komórek należy dodać jednego albo wielu związków stabilizujących w celu zapobieżenia rozkładowi ZX podczas oczyszczania. Gdy komórki znajdują się jeszcze w naczyniu fermentacyjnym, można dodać stabilizatorów, przed pasteryzacją albo rozpoczęciem innego etapu. Zgłaszający przebadał wiele potencjalnych stabilizatorów. Najlepsze wyniki uzyskane do tej pory wykorzystywały kombinację stabilizatorów wymienionych w przykładzie 2.

Po dodaniu stabilizatorów, bakterie można pasteryzować przez podgrzanie do 55°C przez 25 minut, w celu zabicia bakterii bez zniszczenia ZX. Hodowlę następnie schładza się do temperatury pokojowej z komórek usuwa się płyn metodami mechanicznymi, takimi jak mikrofiltracja przeciwprądowa. Może to zwiększyć gęstość komórek i części stałych z początkowej wartości około 10% do stężenia około 60 do 80% objętości. Tworzy to pastę komórek.

Możliwe jest, że komórki F. multivorum całe i prawdopodobnie w stanie żywym, mogą być przydatne do bezpośredniego spożywania przez ludzi, podobnie jak inne pożywienie (ser, jogurt, piwo itp.), które zawiera żywe albo zabite, ale całe komórki drobnoustrojów. Nic nie wiadomo na temat patogenności związanej z F. multivorum. Wyizolowano je z zimnego prądu wody i ponieważ są zaadaptowane do życia w zimnej wodzie nie mogą przeżyć i rozmnażać się w organizmie człowieka. Oprócz tego, komórki te nie zawierają żadnych znanych toksycznych składników; są one Gram-ujemne i nie posiadają budowy ściany komórkowej, charakteryzującej bakterie Gram-dodatnie. Spożywane bezpośrednio przez ptaki albo ryby, w postaci pasty komórkowej, komórki bakteryjne wydają się dobrze spełniać rolę nośników. ZX była uwalniana gdy komórki zostały spożyte przez zwierzęta, i wchłaniała się do krwiobiegu oraz odkładała się w różnych tkankach (w tym w siatkówkach) w odpowiednich miejscach.

Całe komórki F. multivorum zawierające zeaksantynę R-R mogą być przydatne do konsumpcji przez ludzi, jeżeli to konieczne, w trzech postaciach: (1) całych w postaci żywej;

(2) całych w postaci zabitej po pasteryzacji albo (3) w kompozycji, w której komórki bakterii są zabite, zaś ich ściany komórkowe zniszczone, w celu rozbicia komórek i uczynienia ZX bardziej dostępną. Można tego dokonać przez zastosowanie sonikacji (stosując fale o wysokiej częstotliwości), wysokiego ciśnienia albo mielenia. Alternatywnie, etap ten można pominąć jeżeli stosuje się procedurę ekstrakcji rozpuszczalnikiem, który niszczy błonę komórkową.

Jeżeli to pożądane, preparatyka ZX może obejmować etap płukania komórek, w którym usuwane są pozostałości pożywki i metabolity po fermentacji, przez przepłukiwanie komórek roztworem zawierającym pożądane składniki, takie jak stabilizatory, konserwanty, środki zapachowe itp.

Oczyszczanie

Jeżeli to pożądane, pastę komórkową (całych albo zniszczonych komórek) można wysuszyć w celu dalszego zagęszczenia komórek i zwiększenia stężenia ZX w wysuszonej masie. Można tego dokonać środkami mechanicznymi, takimi jak suszenie przez rozpylenie (z użyciem ciepła) albo liofilizację (zamrażanie i suszenie pod próżnią). Jeżeli stosuje się suszenie, powstała pozostałość stała określana jest zwykle jako sucha biomasa; zawiera zwykle około 1 do 10% wagowo ZX, wraz z innymi pozostałościami komórkowymi, pozostałościami stałymi pożywki fermentacyjnej i opisanymi wyżej stabilizatorami.

185 465

Przed albo po (albo zamiast) rozerwania albo wysuszenia, etap ekstrakcji można przeprowadzić w celu zatężenia ZX, która gromadzi się głównie w błonach komórkowych. Odpowiednie rozpuszczalniki do ekstrakcji ogólnie obejmują polarne rozpuszczalniki organiczne. Najlepszym rozpuszczalnikiem zidentyfikowanym do tej pory jest tetrahydrofuran (THF), który agresywnie atakuje komórki i czyni osobny etap rozrywania błon niepotrzebnym. Jakkolwiek, mieszanie nie jest konieczne gdy stosuje się THF w procedurach laboratoryjnych, mieszanie podczas etapu mieszania z rozpuszczalnikiem będzie prawdopodobnie konieczne podczas wytwarzania przemysłowego.

Badano również inne rozpuszczalniki i będzie się je badać dalej, ale żaden z przebadanych do tej pory nie działał równie dobrze jak THF. Zbadane do tej pory organiczne rozpuszczalniki nie aromatyczne (takie jak aceton i eter dietylowy) wykazują niższy poziom rozpuszczania ZX, podczas gdy inne rozpuszczalniki takie jak metanol, etanol i heksen wykazują jeszcze niższy poziom rozpuszczania ZX.

Rozpuszczalnik miesza się z pastą komórkową albo wysuszoną biomasy w warunkach powodujących rozpuszczenie przez rozpuszczalnik tak dużej ilości ZX jak to możliwe. Następnie, rozpuszczoną frakcję płynną oddziela się od części stałej, stosując takie środki jak wirowanie albo filtrację. Część stalą można usunąć albo zastosować jako wsad do innego etapu przetwarzania (w tym do powtórnego etapu ekstrakcji rozpuszczalnikiem, jeżeli to konieczne). Frakcję płynną traktuje się w sposób usuwający rozpuszczalnik, zwykle przez odparowanie. Pozostawia to lepki olej zawierający zeaksantynę R-R, wraz z innymi rozpuszczalnymi składnikami, które zostały ekstrahowane z komórki przez rozpuszczalnik. Gdy THF stosuje się w jednoetapowej ekstrakcji komórek zawierających 1 do 3% wagowo ZX, a następnie usunie się THF przez odparowanie, powstały płyn zawiera około 5% do około 20% wagowo ZX.

Inny rodzaj ekstrakcji rozpuszczalnikiem, który dał dobre wyniki w początkowych badaniach obejmował zastosowanie cieczy w stanie nadkrytycznym (tj. związku, który jest normalnie gazem w ciśnieniu atmosferycznym, ale staje się cieczą która działa jako rozpuszczalnik pod wyższym ciśnieniem). Dwutlenek węgla jest szeroko stosowanym rozpuszczalnikiem w ekstrakcji nadkrytycznej, i dostępne są układy ekstrakcji CO₃ na skalę komercyjną. W układach takich, płynny dwutlenek węgla mieszany jest z pastą komórkową albo wysuszoną biomasą w naczyniu reakcyjnym pod wysokim ciśnieniem. Następnie ciecz przeprowadza się przez szereg komór, które stopniowo obniżają ciśnienie. ZX precypituje z roztworu w dość wysokim ciśnieniu, tak, że można ją zebrać podczas wczesnych etapów zmniejszania ciśnienia, podczas gdy większość zanieczyszczeń pozostaje rozpuszczona w dwutlenku węgla i może być odprowadzona do innych komór reakcyjnych gdzie ciśnienie jest dalej obniżane. Skuteczność ekstrakcji rozpuszczalnikiem nadkrytycznym można dalej zwiększyć przez zastosowanie czynników azeotropujących (takich jak etanol, glikol propylenowy albo octan etylu). Niektóre z tych czynników azeotropujących przebadano wstępnie i wykazano, że istotnie zwiększają rozpuszczalność ZX w nadkrytycznym dwutlenku węgla.

Jakkolwiek dwutlenek węgla stosowany jest powszechnie w ekstrakcji nadkrytycznej, stosowane są również inne środki (w tym różne związki azotowe albo chlorofluorowęglowe). Można przebadać każdy z tych rozpuszczalników, który przechodzi przez fazę gazową i ciekłą jako funkcję ciśnienia, w celu stwierdzenia czy jest on odpowiedni do oczyszczania ZX z bakterii, jak to opisano.

Jeżeli to konieczne, oleisty płyn zawierający ZX, wytworzony przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem albo ekstrakcję nadkrytyczną można zmieszać z substancją nośnikową, taką jak olej roślinny, a następnie zamknąć w kapsułce przeznaczonej do spożycia przez człowieka, bez konieczności dalszego oczyszczania ZX. Dostarcza to ekonomicznego sposobu wytwarzania pół-oczyszczonych spożywczych postaci zeaksantyny R-R przydatnej do stosowania u ludzi, jako lek dla ludzi cierpiących na zwyrodnienie plamkowe, albo jako uzupełnienie diety dla ludzi pragnących zmniejszyć ryzyko zapadnięcia na zwyrodnienie plamkowe w podeszłym wieku.

Alternatywnie, zeaksantynę R-R w pół-oczyszczonym oleistym płynie można dalej oczyszczać w celu zwiększenia stężenia ZX i usunięcia jakichkolwiek zanieczyszczeń. Można

185 465 tego dokonać sposobami takimi jak (1) układy dwurnzposzezplnikows, wykorzystujące kombinację dwóch wybranych rozpuszczalników; (2) adsorpcji na subs^^ie (takim jak włókniste złoże filtracyjne), które ułatwia krystalizację ZX; albo (3) chromatografię przeeiwprądową. Metodę chromatograficzną stosowano w celu oczyszczenia ZX do około 98% czystości jak to opisano w przykładzie 4.

Techniki oczyszczania dla innych karotzaoidów oSawaionn w patentach US 5,382,714 (K^achik 1995) i 4,851,339 (Hills 1989). Z powodu podobieństwa chemicznego, dowolna technika oczyszczania β-karotenu albo ^teiny crpwdnpodnbaiz da dobre wyniki w oczyszczaniu ZX.

Sposoby podawania

Podawanie doustne jest korzystnym sposobem podawania ludziom ZX w celach ochrony siatkówki, używać można sposobu dawkowania takiego jak kapsułki do podawania codziennego i cotygodniowego, lub stosować pokarmy wzbogacone o ZX lub dodatki pokarmowe wzbogacone o ZX, jak to opisano poniżej. Leczenie nie wymaga regularnego przyjmowania w ustalonych odstępach czasu (takich jak proszki do przyjmowania codziennego lub cotygodniowego) lecz zamiast odnosić się do przypadkowego, odnosi się do sporadycznego przyjmowania, które pozwala na możliwy do przyjęcia odstęp czasu (taki jak jeden lub więcej dni, korzystnie mniej niż tydzień), który upłynął między dawkami, by pozwolić na stopniowe osadzanie się małych ilości ZX w tkance plamki. Jak z każdym uzupełnianiem witaminowym, pojedyncza dawka może być korzystna, lecz pojedyncze dawkowanie nie będzie tak korzystne przez okres roku jak okresowe małe dawki. Badania nad przyjmowaniem karotenoidów przez ssaki wskazują, że codzienne przyjmowanie jest korzystniejsze niż cotygodniowe lub ϊζζζ okresowe przyjmowanie, dzięki „naładowaniu” czynników zppzwziająezch odpowiednie stężenie we krwi.

Ponieważ wychwyt karotznoidów po podaniu doustnym ma tendencję do bycia stosunkowo niskim, może być wskazane dla pacjentów z ciężką postacią degeneracji plamkowej zastosowanie innych sposobów podawania, takich jak wstrzyknięcia domięśniowe i dożylne lub wszczepienie implantu powoli owalaiaSączgn. FnrmolaeSz nośników do wstrzykiwać mogą obejmować wodę, czynniki buforujące i związki organiczne posiadające liczne grupy wodorotlenowe, takie jak glikol propylenowy, dekstran lub związki czklndzkstrzny.

Mogą być stosowane różne sposoby pakowania związku do podawania doustnego, tak długo jak zabezpieczają ZX przed utlenianiem i uwzględniają oleistą naturę ZX. Przykłady odpowiednich kompozycji do przyjmowania doustnego obejmują:

(a) możliwe do strawienia wodoszczelne kapsułki i płyn w nich zawarty, gdzie kapsułki i płyn posiadają objętość umożliwiającą połknięcie w stanie nieuszkodzonym i są one farmakologicznie dopuszczalne i gdzie płyn zawierający zaoksantynę R-R jest zmieszany z odpowiednim nośnikiem lub rozcieńczalnikiem takim jak olej rośliznz. Jeśli jest to wymagane upłynniony ZX może być zamykany w mikrnkacsułkaeh lub miezllach, tak jak to opisano w przykładzie 9 i 10, by zabezpieczyć ZX przed rozpadem w żołądku. Takie kapsułki mogą być wytwarzane ze stosunkowo sztywnego, twardego materiału lub podatnego materiału takiego jaki zwykle jest używany do kapsułek zawierających witaminę E. Jeśli kapsułki są wytworzone z materiału, który opiera się kwaśnoźci żołądka i jest trawiony przez enzymy w jelicie cienkim, ZX może być ochroniona przed rozpadem w żołądku i bindostępnoZć ZX może się zwiększyć. Jednakże, wiadomo że przynajmniej część ZX, która dostaje się do żołądka jako część pogryzionej masy warzywnej może przejść przez żołądek nieuszkodzona, tak więc nie jest niezbędna ochrona Zx przed kwaśnością żołądka i wybór materiału na kapsułki będzie wynikał raczej z preferencji ekonomicznych niż z imperatywu naukowego.

(b) tabletki do przyjmowania doustnego przez ludzi, gdzie tabletki zawieraaą zzaksaatynę R-R i sprasowany materiał wiążący, który jest kompatybilny z zzaksaatzną, i który powoduje, że tabletka utrzymuje swój kształt po sprasowaniu pod odpowiednim ciśnieniem i gdzie tabletka jest farmakologicznie dopuszczalna i ma wielkość umożliwiającą połknięcie w stanie ziznarosznazm. Jeśli jest to wymagane tabletka może posiadać powłokę pomagającą ochronie ZX przed kwaZanZeią żołądka.

185 465 (c) kompozycje obejmujące substancje pokarmowe do spożywania przez ludzi, które są odżywczo możliwe do przyjęcia i przyjemne w smaku, które są odpowiednie jako nośniki dla zeaksantyny, i które zawierają zeaksantynę R-R jako dodatek. ZX jest żółtym barwnikiem z taką samą ogólną charakterystyką hydrofobową jak olej roślinny, tłuszcz kuchenny i tłuszcz kurzy, jest również podobna do innych karotenooidowych barwników spożywczych takich jak ((-karoten. Dlatego też może być dodana jako barwnik spożywczy do różnych substancji spożywczych, takich jak margaryna, nabiał, syrop, pieczone artykuły żywnościowe, pączki, drobne ciasteczka, wyroby mięsne, które nie będą wymagały ostrego gotowania i składniki zup. Inne odpowiednie substancje spożywcze mogą obejmować takie formulacje granulowane jak słone i ostre mieszanki smakowe używane jako dodatki do zup, sałatek, wypieków itp. Formulacje granulowane jeśli jest to wymagane mogą zawierać powłoki ochronne zmniejszające rozpad ZX w soku żołądkowym. Liczne przykłady opisują zastosowanie β-karotenu i innych karotenoidów jako barwników spożywczych i dodatków odżywczych; przykłady zawierają Klaui i in. 1970, Klaui i Bauemfeind 1981, Colombo i Gerger 1991 i patenty USA 4,522,743 (Horn i in. 1985) i 5,350,773 (Schweikert i in. 1994) i 5,536,636 (Schneider i in. 1994). Dzięki ich chemicznemu podobieństwu każdy sposób podawania β-karotenu i luteiny do żywności w odniesieniu do ludzi można również bezpośrednio odnieść do zeaksantyny R-R.

(d) kompozycje obejmujące artykuły żywnościowe do spożywania przez ludzi, które zawierają komórki bakteryjne, nieszkodliwe dla ludzi, i zawierające izomer R-R zeaksantyny. Takie artykuły żywnościowe można wybrać z grupy obejmującej ser, jogurt, mleko i piwo. Komórki bakteryjne jeśli jest to wymagane mogą być żywe lub mogą być zabite przy zastosowaniu metod takich jak pasteryzacja lub fermentacja.

Inne sposoby pakowania również są możliwe do przeprowadzenia i mogą być korzystne dla różnych zastosowań.

Badanie zeaksantyny R-R na zwierzętach

ZX została zsyntetyzowana wykorzystując komórki F. multivorum pochodzące z linii ATCC 55238 była badana w kierunku działania chroniącego siatkówkę na ptakach gatunku, Cotumix cotumix japonica, zwanego zwyczajowo przepiórką japońską. Gatunek ten zapewnia użyteczny model zwierzęcy zwyrodnienia plamkowego u ludzi, dzięki pewnej ilości czynników obejmujących:

(1) Cała siatkówka przepiórki japońskiej przypomina ludzką plamkę w wielu ważnych aspektach, na przykład, siatkówka przepiórki zawiera zarówno ZX jak i luteinę, podobnie jak plamka człowieka jest bogata w fotoreceptory czopków, a nie w fotoreceptory pręcików.

(2) Siatkówka przepiórki japońskiej wykazuje niektóre z takich samych wskaźników patologii jak w siatkówkach ludzkich. Na przykład, siatkówka japońskiej przepiórki akumuluje miękkie druzy i lipofuscynę, których obecność silnie koreluje z wystąpieniem AMD u ludzi.

(3) Mimo, że siatkówki przepiórki są znacznie mniejsze niż siatkówki ludzkie to cała siatkówka przepiórki jest w kolorze żółtym dzięki obecności ZX i luteiny. Pozwala to skutecznie na to by cała siatkówka przepiórki służyła za model małego regionu plamki w centralnej części ludzkiej siatkówki, czyni to analizowanie i obserwację znacznie łatwiejszą.

(4) Siatkówka przepiórki japońskiej jest nieunaczyniona, i posiada budowę podobną do regionu dołeczka ludzkiej siatkówki.

(5) Długość życia przepiórki japońskiej wynosi w przybliżeniu dla samic od 1 do 1,5 roku, dla samców od 3 do 4 lat. Pozwala to na badanie procesów starzenia, które byłoby bardzo trudne dla gatunków żyjących dłużej.

Te czynniki są bardziej szczegółowo omawiane u Fite'a i in. 1991 i Fite'a i in. 1993.

Testy są opisane w przykładach od 5 do 8. Wyniki są znakomite i jasno wskazują na to, że zeaksantyna produkowana przez komórki F. multivorum jest (1) odpowiednio magazynowana w plamce po przyjęciu jej doustnym i (2) wysoce efektywna w ochronie komórek siatkówki przez uszkodzeniem fototoksycznym.

Dodatkowo, jak jest to dyskutowane w przykładzie 8, wstępne wyniki wskazują na to, że zeaksantyna R-R jest dużo silniejsza i skuteczniejsza niż β-karoten w zabezpieczaniu siatkówki przed uszkodzeniem fototoksycznym. Gdy badane zwierzęta karmiono β-karotenem

185 465 w wysokich dawkach to powodował on tak niewielkie działanie chroniące siatkówkę, że nawet nie osiągnęło ono poziomu znamienności statystycznej. W przeciwieństwie do tego gdy badane zwierzęta karmiono zeaksantyną R-R w tych samych dawkach to całkowicie blokowała i zapobiegała wystąpieniu mierzonych wskaźników uszkodzenia siatkówki.

Mikrobiologiczne źródła zeaksantyny R-R

Ujawnione tu komórki Flavobacterium multivorum zdeponowano w ATCC (ATCC nr 55238; jak zaznaczono wyżej, w katalogi ATCC określa się je jako Sphingobacterium multivorum, ale ich nazwa nie jest zmieniona w podręczniku Bergy'ego). Linia ta dostarcza specjalistom kilku możliwości syntezy mikrobiologicznej izomerycznie czystej zeaksantyny R-R.

Po pierwsze, bezpośrednie i niezmienione potomstwo tych komórek można zastosować do syntezy zeaksantyny R-R bez wykrywalnych ilości innych niepożądanych stereoizomerów. Całość karotenoidów wytwarzanych przez te komórki zawiera ponad 90% ZX, pożądanego karotenoidu.

Po drugie, potomstwo szczepu ATCC 55238 można zastosować po zmodyfikowaniu ich w sposób zwiększający wytwarzanie izomeru R-R ZX. Zmutowane albo inaczej zmienione linie komórkowe można wytworzyć w dowolny inny sposób, taki jak (1) traktowanie potomstwa szczepu ATCC 55238 typu dzikiego czynnikami mutagennymi takimi jak promieniowanie ultrafioletowe albo rentgenowskie, albo znanymi mutagenami chemicznymi, takimi jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna; (2) tworzenie kombinacji płciowych, przez mieszanie komórek F. multivorum z innymi rodzajami bakterii, które aktywnie prowadzą do koniugacji i wymiany DNA pomiędzy komórkami bakteryjnymi; albo (3) traktowanie komórek F. multivorum bakteryjnymi transpozonami albo wirusami, które mogą powodować rearanżacje względnie dużych fragmentów DNA. Techniki te wprowadzają losowe zmiany w komórkach potomnych, po czym potomstwo analizuje się w celu zidentyfikowania i wyizolowania komórek potomnych wytwarzających wyższe poziomy ZX.

Testy przesiewowe można wspomóc przez zastosowanie chemikaliów (takich jak difenyloamina, nikotyna albo lowastatyna), które hamują jeden albo wiele enzymów związanych ze szlakiem biosyntezy tworzenia ZX. Według definicji Layman'a, te związki hamujące tworzą przeszkody, które są możliwe do przezwyciężenia jedynie przez komórki zmutowane, które wytwarzają ponadnormalne ilości ZX. Na szczęście testy, które można zastosować do identyfikacji wysokoproduktywnych mutantów albo odmian są proste, szybkie i łatwe. Ponieważ ZX jest żółtym barwnikiem, można zastosować prostą obserwację wzrokową w celu identyfikacji zmutowanych kolonii niosących pożądane cechy (1) szybkiego tempa wzrostu komórek, i (2) zdolności do wytwarzania ponadnormalnych ilości żółtego barwnika. Jeżeli to konieczne, w testach przesiewowych po traktowaniu mutagenem można zastosować przyrządy automatyczne (takie jak automatyczne czytniki płytek albo urządzenia do sortowania komórek sprzęgnięte z cytometrami przepływowymi).

Te techniki mutagenne i przesiewowe są konwencjonalne i dobrze znane w stanie techniki. Dowolne komórki pochodzące bezpośrednio od szczepu ATCC 55238 typu dzikiego są uważane za potomstwo tych komórek, nawet jeżeli zostały zmodyfikowane, mutagenizowane albo krzyżowane płciowo z innymi liniami komórkowymi w jakikolwiek opisany wyżej sposób.

W trzecim możliwym podejściu, można wytworzyć komórki drobnoustrojów nie będące potomstwem w taki sposób, że zawierają geny wyizolowane albo pochodzące z linii komórkowej ATCC 55238, która wyraża enzymy ułatwiające syntezę zeaksantyny. Takie geny można wyizolować i zidentyfikować znanymi technikami. Przykładowo, sekwencje DNA z genów „crt” wytwarzających karotenoidy, wymienionych w patencie US 5,429,939 (Misawa i in., 1995, opisanym wyżej) można zastosować jako sondy hybrydyzacyjne do przeszukiwania genów wytwarzających karotenoidy o homologicznych sekwencjach DNA, w genomie linii komórkowej ATCC 55238. Następnie, geny wytwarzające karotenoidy można wprowadzać do plazmidów, kosmidów, fagów albo innych odpowiednich wektorów, które można zastosować do transformacji genetycznej dowolnego rodzaju komórek gospodarza, takich jak komórki E. coli, komórki drożdży, komórki owadów albo komórki ssaków. Ten rodzaj kontrolowanej inżynierii genetycznej umożliwia komórkom transformowanym wytwarzanie zeaksantyny R-R, przy użyciu genów pochodzących z komórek ATCC 55238.

185 465

Oprócz tego, część kodująca białko genów wytwarzających ZX z komórek ATCC 55238 (tj. części genów, które ulegają transkrypcji na posłańcowy RNA, który następnie ulega translacji na enzymy syntetyzujące ZX) można umieścić pod kontrolą silnych i/lub możliwych do indukcji promotorów genów·'. Takie geny „chimeryczne” zawierające promotory genów uzyskane z innych genów można zastosować z różnych względów, takich jak (1) w celu zahamowania wytwarzania ZX podczas wzrostu i namnażania komórek, a następnie zwiększenia wytwarzania ZX przez komórki podczas fermentacji; i (2) w celu wprowadzenia genów do nowych rodzajów komórek gospodarza, które mogą być korzystne do zastosowania komercyjnego, takich jak komórki E. coli albo komórki drożdży, które wykorzystują dobrze znane i zoptymalizowane techniki fermentacji, przetwarzania i oczyszczania.

Geny wytwarzające ZX wyizolowane z linii komórkowej ATCC 55238 można dalej wzmacniać stosując dobrze znane techniki. Przykładowo, geny bakteryjne często wykorzystują kodony „nie preferowane”, które zmniejszają albo ograniczają ilość białka wytwarzanego przez gen. W celu zwolnienia tego mechanizmu ograniczającego, nie preferowane kodony w genie syntetyzującym ZX z linii komórkowej ATCC 55238 można zastąpić kodonami „preferowanymi”, które mogą zwiększyć ekspresję enzymu wytwarzającego ZX w wybranej komórce gospodarza.

Jako inny przykład, reszty cysteinowe mogą osłabiać aktywność albo stabilność enzymu przez tworzenie niepożądanych wiązań disiarczkowych z innymi resztami cysternowymi, w tej samej albo innej cząsteczce. Aktywność albo stabilność enzymu może być czasem zwiększona przez zastąpienie jednej albo wielu reszt cysteinowych inną resztą aminokwasową (np. patent US 4,737,462, Mark). Oprócz tego, ekspresję białka można często zwiększyć przez wprowadzenie kodonów powszechnych aminokwasów takich jak glicyna, w miejsce kodonów, które kodują metioninę albo tryptofan, które są mniej powszechne i prowadzą do opóźnienia albo osłabienia ekspresji białka. Po stworzeniu genu syntetycznego, który powoduje zamianę aminokwasową tego typu, zmodyfikowane białko można badać w celu stwierdzenia czy zachowuje ono pożądaną aktywność enzymatyczną podczas ekspresji w większych ilościach albo stabilniejszej postaci.

Znane są przykłady technik inżynierii genetycznej, które można zastosować na genach wytwarzających ZX, wyizolowanych z linii komórkowej ATCC 55238, w celu stwierdzenia czy taka modyfikacja zwiększa wytwarzanie ZX przez komórki F. multivorum, albo przez inne rodzaje komórek gospodarza.

Zwrot w zastrzeżeniach dotyczący „komórek, które zmodyfikowano genetycznie w taki sposób, że zawierają sekwencje DNA uzyskane ze szczepu Flavobacterium multivorum, któremu nadano numer ATCC 55238” obejmuje komórki zawierające geny zawierające sekwencje DNA, które syntetyzowano chemicznie, stosując sekwencje DNA albo mRNA określone przez badanie linii komórkowej ATCC 55238 albo jej potomstwa. Urządzenia do automatycznej syntezy DNA są dobrze znane i mogą być zastosowane do powielenia dowolnej sekwencji genu, bez konieczności replikacji oryginalnej komórki gospodarza. „Gen syntezy zeaksantyny” obejmuje dowolny gen, który wyraża enzym albo inne białko związane ze szlakiem biosyntezy ZX, który może być zastosowany do zwiększenia wytwarzania ZX po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza, niezależnie od tego, który konkretny enzym w szlaku biosyntezy ZX koduje gen.

Przykłady

Przykład 1: Fermentacja na skalę przemysłową

Pożywkę preferowaną przez Zgłaszającego do badań Flavobacterium multivorum na skalę laboratoryjną zidentyfikowano jako pożywkę E w przykładzie 3 patentu US 5,308,759 (Gierhart 1994) i 5,427,783 (Gierhart 1995). Pożywka ta zawierała kilka składników drogich i uutr^(^i^iia^^c^(^łi pr^ća^t^. W celu /Γηηί^ζεηί3 kosztów i niewygód, po początkowej daNe zgłoszenia, przeprowadzono badania w celu stworzenia lepszej pożywki przemysłowej. Pożywka, która jest obecnie korzystna do fermentacji na skalę przemysłową pozbawiona jest mąki kukurydzianej i kilku innych składników. Korzystne pożywki zawierają syrop kukurydziany o diżeej t^^ai^ai^Oo:^iii maltozy albo melasę z burakai cukrowego i w stężeniu od 1 do 10% (wag./obj.) wraz z płynem macerującym kukurydzę w stężeniu 0,5 do 4% (wag./obj.); hepta20

185 465 hydrat siarczanu amonu 0,5% (wag/obj.)', chlorek sodu 0,5% (wag./aba.); heptahydrat siarczanu magnezu 0,1% (wag/obj.); octan sodu 0,1% (wag./obj.); heptahydrat siarczanu żelaza 0,001% (wag^ty.) ekstrakt drożdżowy 0,2% (wag/obj.); chlorowodorek tiaminy 0,01% (wag./aba.); od 1 do 6% (γag./aba.) hydralizaγanęj kazeiny (takiej jak NZ Amine hD, sprzedawana przez Sheffield Produ^s, Division of Quest Iαtezαational, Nozγikh, NY) i olej roślinny 1% (abj./aba.).

Po zmieszaniu tych składników, dodano odpowiednią ilość NaOH w celu doprowadzenia pH do 6,5; w przeciwieństwie, gdy pożywka zostanie doprowadzona do pH 7,5 jak to opisano w doświadczeniach na skalę laboratoryjną w patentach US 5,308,759 i 5,427,783 z płcααega syropu kukurydzianego wytrąciło się zbyt wiele części stałych. Pożywkę wysterylizoγana w autoklawie w 121 °C przez 30 minut, a następnie schłodzono do 27°C i zaszczepiono 5 do 10% (obj./obj.) „wstępnej hodowli płcaaej” zawierającej szczep F. multh-Orum, który wytwarza zeaZsantynę R-R bez γytγaząaniα śtezeoizometów S-S albo R-R.

Komórki zastosowane do wytworzenia hodowli wstępnej utrzymywano w probówce aakhylaaea na agarze do liczenia płytek. Hodowle w probówkach nachylonych zaszczepiono koloniami Zlaαalαymi F. multivoza pochodzącymi od szczepu zdeponowanego przez Zgłaszającego w ATCC (ATTC zz 55238). Po inkubacji przez 48 godzin w 28°C zapasy hodowli nachylonych schłodzono w 4°C do momentu zastosowania ich jako zaszczep do pożywek płynnych. Żywe komórki są również zamrażane przy użyciu Zonwezkaozalnych zamrażarek, suchego lodu albo płyzzega azotu, w celu długotrwałego przechowywania.

Płynne hodowle wstępne wytworzono przez zastosowanie komórek z agaru przechylonego w celu zaszczepienia 30 ml pożywki płynnej wytγoząonea jak opisano wyżej, umieszczonej w 300 ml butelce żebrowanej. Warunki wzrostu: 28°C w pH 7,2-7,6, napowietrzanie przez wytrząsanie przy 250 obrotach na minutę przez 24 gadą.izy. Po początkowej inkubacji przez 24 godziny, komórki porcjoγaze w jednej albo wielu 30 ml butelkach hodowli wstępnej zastosowano do zaszczepienia 10-Zrotnie większej objętości pożywki w odpowiedniej wielkości naczyniu fermentacyjnym. Komórki izZuraγaza przez 48-72 godziny w 28°C. pH utrzymywano pomiędzy 6,80 i 7,20 stosując NaOH i/lub kwas fosforowy. Poziom rozpuszkąanega tlenu utrzymywano na poziomie 30-40% wysyceziα przez barbotowanie filtrowanym powietrzem z szybkością 1 objętości powietrza na objętość płynu na minutę wytrząsając naczynie z częstotliwością 400 do 1000 obrotów na minutę. Testy, wykorzystujące okresowe pobieranie próbek i badanie γysaZosprawną chromatografią kieZłofaąawą wskazywały, że maksymalne ilości ZX są zwykle wytwarzane w ciągu 72 godzin, gdy komórki fermentują w powyższych warunkach.

Przykład 2: Dodatek środków stabilizujących

ZX wctYotzaza w procesie fermentacji według przykładu 1 musi być stabilizowana w celu polepszenia następującego potem oczyszczania i tworzenia kompozycji, oraz w celu zapewnienia czystości. Związki stabilizujące można dodać do komórek F. multivofum (albo ekstraktu komórkowego zawierającego ZX) w dowolnym momencie podczas procesu preparacji albo oczyszczania; ogólnie, do komórek znajdujących się jeszcze w naczyniu należy dodać jeden albo wiele stabilizatorów początkowych.

Zgłaszający badali różne potencjalne stabilizatory. Najlepsze wyniki uzyskano do tej pory stosując kombinację środków stabilizujących, które zmieszano ze sobą w malej ilości odpowiedniego rozpuszczalnika (takiego jak 2 ml etanolu na 20-litrowe naczynie fermentacyjne) przed dodaniem do komórek. Korzystna mieszanina stabilizatorów obejmuje trzeciorzędowy hydraZγizon butylu (w skrócie TBHQ; zwany również 2-(1,1-dimetylo)-1,4-bezzenediol) w ilości dającej stężenie końcowe w zakresie od około 250 pg/l (mikzogtamów/litr) do około 50 mg/l po zmieszaniu z komórkami; etoZśckγiαę w stężeniu końcowym od około 250 pg/1 do około 250 mg/l; α-taZofetal w stężeniu w zakresie od około 250 pg/1 do około 250 mg/l i EDTA (kwas etylenodϊamϊzatettαactowc) w stężeniu w granicach od około 500 pg/l do około 500 mg/l . Odpowiednie stężenia będą się znacznie różniły w zależności od różnych cąyzaiZÓY takich jak kolejne etapy acącszkąazia oraz zamierzony sposób paczkowania i przyjmowania. Korzystne stężenia tych śtαrϊhąαt(arów. do zastosowania w jednoetapowej ekstrakcji THF po zmieszaniu z olejem roślinnym i wodoodpornym kαpsułkawαziu

185 465 w pigułkach typu witamin, wynoszą około 25 do 50 mg/l dla THBQ; 250 do 500 pg/l dla α-toksykwiny; 250 do 500 pg/1 dla atokoferolu i 500 do 100 μ/pl dl a EDTA.

Po dodaniu stabilizatorów, hodowlę komórkową pasteryzuje się przez podgrzanie do 55°C przez 25 do 50 minut. Zabija do bakterie bez uszkadzania wytworzonej przez nie ZX. Następnie hodowlę schłanlza się do temperatury pokojowei i oddziela się komórki zawierające ZX i inne cząstki stałe zawarte w brzeczce od fazy płynnej przre zastosowanie układu mikrofiltracj i przepływowej, który zwiększa gęstość komórreⁿcząs^rek stałych z począfoowej wartości 10 do ^% do gęstości po filtracji równej okoto 60 do 80 % objętościowo. Peyces ten powoduj e powstanie pasty komórkowej, która zawiera równi rż nieco części stałyc^p z pttżywe⁾.

D o preparatów ZX, którymi karmiynz sąprzzpióaki jap niskie do badania siatkówek, jak to opisano w przykⁱanach 5-7, pastę- kymózkową zamraża się w -70^zC , następnie: suszy przez liofilizację w 25°C w całkowitej próżni, tworząc suszoną biomasę zawierającą od około 1 do 1(0% wagowo ZX. W/ kolejnych testach mierzy się ilość ZX w każnej partii i łączy się ze sobą partie o różnych stężeniach w celu eapzunirnia stałego stężenia dla testów na przepiórkach japońskich.

W celu wytworzenia ZX do spożycia przez ludzi, stosuje się ekstrakcję rozpuszczalnikiem aby wytworzyć lepki płyn oleisty, jak to opisano w przykładzie 3.

Przykład 3: Czę ściowe o^yszczen^ w otei stym płynie

Po wytworzeniu pasty komórkowej jak to opisano w przykładzie 2, może być ona traktowana na róme spyjyky. Jak wspompiano powyżej, błony komórkowe można rozerwać, jkżeli to konieczne, w celu otworzenia komórek i uczynienia ZX bardziej dostępną, przez zastosowani ie takich spasobów ja^y sonieacjn (stosując fale o wysokizj częstotliwość), wysokie ciśnienie albo mielenie, utrzymując temperaturę komórek poniżej około 30°C w celu zapobieżenia utlenieniu. Jednakże, etap ten nie jest konieczny, gdy w etapie ekstrakcji rozpuszczalnikiem stosuje się tetrahydrofuran (THF), ponieważ THF jest barneo skuteczny w niszczeniu Men komórkowych bez pomocy mechanirwręj. Mieszanie nie jest koniecene^l gdy stosuje się THF na skalę laboratoryjną; jednakże prawnoponobnir, mieszanie podczas etapu mieszania p rozpuszczalnikiem będzie prawnypodybme korzystne w procesach no skalę przżmyłłzwą.

W wykonanych do tej pory badnyiach, ekstrakcja THF obejmowała mieszanie około 8 do 20 objętości oczyszczonego, filtrowanego THF z jedną objętością pasty komórkowej zawieraj ącrj 6:0-80% części s-tełej, w temperaturze poniżej 25°C przez okres od 2 do 24 godzin. THF agresywnie atakuje komórki, tworząc płyn z enwirsmą kłacekywetych częśc^t stałych. Po ^wirow^m przy około 20000 x g przez kilka minut, większość TH^aF można usurn^ przez ^ye^unntaeję. P ozostaty THF można u suną; przez odpęrywnme pod próżną z po zostawieniem l_epkiegy oleju. Gdy pasty komónkowę zawteeające ^p do 3%% ZX traktowano przez ekstrakcję THF w ζ^^^ρι^Ζ ożrracn, perrutnły olej zawierał euykle około 5 do 20%) wagowo ZX.

P z z y kład 4: Wy^twnraanir wyso^eopnzyszceonzż zraksantyny w sęcher p ostaci proszkowrij, 1 00 % ctystzgo ieomzrjl R-R

Wy_sykyoceyseceyny preparat ZX w suchej postaci proszkowej wytworzono przzz pr_zrtwbr_znniⁿ olćstego płynu ekstrahowane go THF opisanego w prz^pJrłndeie 3, przez zastorow^te diromatografii jirkło^eazywej w następujący sposób. Oleisty ptyn zawierający ZX iΌ^apuszjz_On_O w hrklnnir, następnie przepuszneono prere kolumnę chromatograficzną zαp^fzrającą Obojotnp prysere t lenku glinu. Do przemycia kolumny zastosowano dwir obio^,tośri heks_nn ^y, iP celu u^,ypⁱu^kani_a e_anieczyszceeń takich jak P-kmnten i likopzn^l tak róunizż lipidów i innpch eantZjeysejnZń. Przez koⁱumno ż^rzzpjjlece))eo mieszaninę heksanu z acetonem w stosunku 80:20, _u yslu uwolnienia ZX. Rozpuszczona ZX, która się pojawiła osuszono pod żróż._ntjj.. AMlira cłPΌmatogrαficznn wykazała co najmmzj 9 8%% czystą ZXⁱ wykrywnlny był jedynte ślad zamzcdysejlzeń.

Po około 6 mizstąjαcd przechowywania w warunkach względnie nie zabeeptzceonyjd (zwykle w lodówcm, przy umiarkywapym pokierαpiu żiΌkzk, bzz zawertości przećwutlnniaczy i bzz zachowania yrtroⁿności prnzd kontaktem z ż))uietrzrm aimorfzryżznym) próbkę tego preparatu ZX wysłano do prof. John Landrum w crlu przzprowadzznia analizy sterzo^tzomżryjenej (wspótautora Bone, Landrum i in.) w ąlyrina Intornational Untyzasity w Miami, Floryda. Analiza ta, uykoreystująja chromatografię jdiI^a1nćtz nzrywatyzαcję diknrbnmatzm,

185 465 wykazała że sześciomiesięczny, nie zabezpieczony preparat ZX zawiera 92% ZX. Zanieczyszczenia wydawały się głównie być keto-karotenoidami, które eluowały przed ZX; keto-karotenoidy mają dodatkowy atom tlenu przyłączony gdzieś do karotenoidu i są powszechnymi produktami ubocznymi powstającymi gdy karotenoidy są przechowywane bez zabezpieczenia przed utlenianiem. Analiza chiralna prof. Landruma wykazała, że 100% ZX w preparacie było pożądanym izomerem R-R. Nie było wykrywalnych ilości niepożądanych stereoizomerów S-S i S-R ZX.

Uważa się, że oczyszczanie przez chromatografię jak to opisano wyżej, jakkolwiek całkowicie proste i niezwykle skuteczne, nie nadaje się idealnie do wytwarzania wysokooczyszczonej ZX w ilościach przemysłowych. Alternatywna metoda, którą opracowano w celu oczyszczania luteiny, opisana w patencie US 5,382,714 (Khnachik 1995; patrz również Khnachik i in., 1991), która wykorzystuje zimną mieszaninę etanolu z wodą w dwuskładnikowym układzie ekstrakcyjnym, poprzedzającą liofilizację, stanowi dobrą potencjalną metodę do zbadania zastosowania w wytwarzaniu przemysłowym.

Przykład 5: Badania zeaksantyny na przepiórkach japońskich

Zastosowanie różnych grup dietetycznych.

Wszystkie testy obejmujące przepiórki japońskie przeprowadzono w Schepens Eye Research Institute of Harvard Medical School (Boston, Massachusets), na warunkach umowy z Applied Food Biotechnology Inc. (beneficjent tego zgłoszenia). Wszystkie grupy leczone i grupy kontrolne obejmowały znaczącą statystycznie liczbę ptaków. W większości przypadków grupy kontrolne były tej samej wielkości co grupy badane.

Ptasią paszę pozbawioną karotenoidów otrzymano od Purina Mills (St. Louis, Missouri). Ta ptasia pasza jest sprzedawana jedynie w celach doświadczalnych i jest uzyskiwana przez wykorzystanie ziaren (takich jak nasiona sorga), które są naturalnie pozbawione karotenoidów.

Wszystkie preparaty ZX, którymi karmiono przepiórki japońskie występowały w postaci suchej biomasy z komórek F. multivorum, które były fermentowane, stabilizowane z czynnikami opisanymi w przykładzie 2, pasteryzowane w celu zabicia komórek i wysuszane przy użyciu liofilizacji. Etapy fermentacji i opracowania były przeprowadzone przez Applied Food Biotechnology, Inc., w ich pomieszczeniach w O'Fallon, Missouri.

Wszystkie badane zwierzęta wylęgły się z jaj pozbawionych karotenoidów. Otrzymano je przez karmienie pokolenia rodzicielskiego (oznaczone jako ptaki Pl) jedynie karmą nie zawierającą karotenoidów, po osiągnięciu przez ptaki dojrzałości. Ich jajka były otwierane przez stłuczenie i badane w kierunku obecności karotenoidów, aż do momentu otrzymania jaj pozbawionych karotenoidów. Z jajek, które były składane przez ptaki rodzicielskie pozbawione karotenoidów, wykluwały się wszystkie badane i kontrolne ptaki.

Ptaki badane i kontrolne dzielono na cztery duże grupy otrzymujące odmienne diety. Grupy zostały oznaczone jako grupa C+, grupa C-, grupa BC+, grupa ZX(5+) i grupa ZX(50+), zależnie od tego jakie karotenoidy otrzymywały w ich diecie.

Ptaki w grupie C+ karmiono normalną dostępną na rynku karmą zawierającą różne karotenoidy; dieta ta zawierała również syntetyczny a-tokoferol (witaminę E) jako dodatek.

Ptaki w grupie C- karmiono paszą całkowicie pozbawioną wszystkich karotenoidów, jak opisano powyżej. Jednakże, karma ta zawierała wszystkie niezbędne składniki odżywcze, zawierała jako dodatek syntetyczną witaminę A i E.

Ptaki w grupie BC+ otrzymywały karmę pozbawioną wszystkich karotenoidów za wyjątkiem β-karotenu jako dodatku, w tej samej dawce, która była użyta w grupie z wysokim dawkowaniem ZX (tj. dodano 50 mg β-karotenu na kilogram paszy). Na 7 dni przez rozpoczęciem procedury uszkadzania światłem ptaki w grupie BC+ rozpoczynano karmić paszą zawierającą β-karoten. Ta grupa pozwalała na bezpośrednie porównanie grupy β-karotenu i jednej podgrupy ptaków, które po otrzymywaniu diety nie zawierającej ZX na 7 dni przed u_szkod_zeniem światłem rozpoczęły otrzymywanie uzupełnienia ZX. Jak to opisano w przykładzi_e 8, to bezpośrednie porównanie wykazało, że ZX jest wysZce skuteczna w zapobieganiu! uszkodzeniu fotote^osacznemu, podczas gdy efekt ochronny β-karotenu jest tak słaby, że me osiąga proiomu zoamieonośdi statystycznej.

185 465

Ptaki w grupie ZX+ otrzymywały karmę pozbawioną wszystkich innych karotenoidów, lecz zawierały suchą biomasę zawierającą zeaksantynę R-R z komórek F. multivorum z AFB. Ptaki te karmiono dwiema różnymi dawkami ZX by pozwolić na wystąpienie związku efekt zależny od dawki dla oceny i korelacji z różnymi wskaźnikami uszkodzenia siatkówki. Ptaki w grupie ZX(5+) otrzymywały stosunkowo niewielką ilość ZX, średnio 5 mg dodanej ZX na kilogram karmy. Jeśli przepiórki japońskie jedzą około 25 do 35 gramów karmy na dzień, około 0,125 do 0,175 mg ZX było spożywane przez ptaka na dzień grupie niskiej dawki. Ptaki w grupie ZX(50+) otrzymywały dziesięć razy większą ilość (50 mg ZX na kilogram karmy) co powodowało, że ptaki te przyjmowały od 1,25 do 1,75 miligramów ZX przez ptaka na dzień.

Stężenie karotenoidów w grupie kontrolnej, na diecie pozbawionej ZX i w grupie ZX+ było analizowane ciekłą chromatografią wysokiej rozdzielczości (HPLC), przy wykorzystaniu metody opisanej przez Stacewicza-Sapuntzakis'a i in. 1993. Wyniki pokazano na tabeli 1.

Tabela 1

Dieta Kontrola (C+)	Stężenie karotenoidów (pg/g)
ZX 0.59	Luteina 1,55*	β-kryp 0,11	β-kar 0,24	kantaks 0,00	likop 0,00
Pozbawione (C-)	0,26	0,59*	0,00	0,00	0,00	0,00
zeaksantyna ZX(5+)	67,60	0,59*	1,90	3,00	0,00	2,9
zeaksantyna ZX(50+)	6,74	0,06*	0,20	0,28	0,00	0,27

oznaczenie:

ZX = 3R-3'R-zeaksantyna β-kryp = β-kryptoksantyna β-kar = β-krroten

Likop = likopen * = próbna identyfikacja; może to również być cis-izomer zeaksantyny

Wszystkie ptaki były hodowane i trzymane w zwykłych klatkach lęgowych. Za wyjątkiem, jak podano poniżej, trzymano w warunkach światła o szerokim spektrum, przez około 10 do 14 godzin dziennie.

Przykład 6: Odkładanie siatkówkowe przyjmowanej doustnie zeaksantyny

Analizy chemiczne wykonano w celu określenia stężenia ZX (i innych karotenoidów), które odłożyły się w siatkówce ptaków w każdej z grup żywieniowych opisanych w przykładzie 5.

W celu wykonania tych analiz, ptaki wyklute z jaj ubogich w karoten i które hodowano na odpowiedniej diecie przez ostatnie sześć miesięcy, zabito przez przerwanie rdzenia. Tkankę siatkówki pobrano przez wycięcie z enukleowanego oka, po czym tkankę z pojedynczej siatkówki ucierano prawie do homogenności w 250 pl dejonizowanej wody destylowanej, stosując moździerz szklany albo z politetrafluoroetylenu (Teflon™). Pobrano 10 pl homogenatu i zastosowano do analizy białka w celu standaryzowania wyników z różnych próbek siatkówki. 250 pl metanolu zawierającego 2% pirogallolu i 50 pl 60% wodorotlenku potasu dodano do pozostałych 240 pl zawiesiny tkanki siatkówki. Mieszaninę podgrzano w łaźni wodnej do 70°C przez godzinę, następnie dodano 500 pl 50% etanolu, a następnie 2 ml heksanu. Mieszaninę wytrząsano w celu dokładnego wymieszania, następnie pozostawiono w 5°C do wystąpienia rozdziału. Pobrano fazę górną (tj. jaśniejszą, pływającą na powierzchni pozostałego płynu), zawierającą heksan i ekstrahowane karotenoidy, tokoferole i retinole. Do homogenatu tkanek dodano dodatkowe 2 ml heksanu, po czym wytrząsano mieszaninę i po24

185 465 zostawiono do ponownego rozdzielenia się. Epifazę pobrano i połączono z pierwszą. Procedurę powtórzono jeszcze raz, w trzecim cyklu ekstrakcji, w celu zapewnienia całkowitej ekstrakcji kprntzaoidów, tokoferoli i retiaoidów.

Połączone ekstrakty heksanem płukano 1 ml wody, w celu usunięcia pozostałości wodorotlenku potasu. Do mieszaniny wody z heksanem dodano dodatkowy 1 ml heksanu, a następnie ostrożnie pobrano pipetą, górną fazę (epifazę). Heksan odparowano pod ciągłym strumieniem azotu. Pozostałość zawierała karnteaoidy, tokoferole, rztinolz i ϊζζζ niezidentyfikowane związki rozpuszczalne w heksanie. Tę pozostałość rozpuszczono w rozpuszczalniku (mztaanl:ehlnroform:trietylpmina) i analizowano przzz HPLC, jak to opisano wyżej.

Wyniki podano aa tabeli 2, niżej, które pokazują również poziom uszkodzenia po ekspozycji na silne światło.

Tabela 2

Rodzaj diety	Średnia wartość (n=6)
KarotenoH siatkówkowy (ng/mg białka)	Liczba acnptntycznych jąder pręcików w centralnej siatkówcz (powiększenie 400x)
	Zzaksaatzaa	Lutsina	Niz uszkodzone światłem	Uszkodzone światłem
Kontrola (C+)	30,18	10,41	0	60
Ubogiz (C-)	10,29	8,03	0	120
β-Car (+50)	10,01	7,83	0	109
Zzaksaatyaa (ZX+5)	31,00	3,64	0	15
Zzaksaatzaa (ZX+50)	104,17	ND	0	0

ND = niz wykryto w próbkach. Wykryto związek przypominający lutsinę, alz nie była to luteina, jak określono przez okrzs retencji w HPLC i skanowanie fotodiodą danego szczytu.

Nalzży zaznaczyć, żz nie wykryto w ogóle P-karotenu w żadnej z siatkówek ptaków na opisanych dietach.

Stężenia siatkówkowe wymienione w tabeli 2 wskazują, że przyjmowana doustnie zzaksaatzna R-R, wytworzona przzz fermentację komórek pochodzących od F^obactermm multivorum (ATCC nr 55238) w rzeczywistości odkładała się w siatkówkach badanych zwierząt, które otrzymywały zzaksaatyaę R-R jako dodatek do diety, w postaci dodatku paszowego. Jest to istotne odkrycie, ponieważ ZX musi zostać strawiona w normalny sposób, musi przejść przez barierę jelitową, musi wniknąć do krwiobiego i zostać pobrana przez komórki siatkówki w oczach ptaków w ilości wystarezasąezs do ochrony tkanki siatkówki przzd uszkodzeniem fototokszczaym. Wszystkie te przeszkody są przezwyciężane przez opisane tu preparaty zzpksaatzny R-R wytworzone przez fermentację bakteryjną.

Przykład 7 : Ochrona siatkówek przez zzaksaatzaę R-R

Nizktórz z ptaków w każdzj z grup żywieniowych poddano działaniu silnego światła widzialnego, 2000 do 3000 luksów, przez 28 godzin, stosując cykle 1 godziny światła poprzedzającej 2-gndziaaz okrzs nizmal całkowitej ciemności. Po okresie naprzemiennego światła, ptaki umieszczono w nizmal całkowitej ciemności na okrzs 14 godzin, po czym zabito jz. Zbadano tę grupę poddaną działaniu silnego światła wz wstępnych testach, w czlu wywołania powtarzalnego ciężkiego uszkodzenia u ptaków w grupie pozbawionej karoteaoido i umiarkowanego uszkodzenia u ptaków w grupie koatrolasś (dizta normalna). Wz wstępnych badaniach określono również okrzs 14 godzin po ekspozycji na światło był niezbędny w celu zmierzenia maksymalnej liczby ρpnctntyezazch jądzr pręcików u aizchronioazch ptaków (ubogich w karnteanid).

185 465

Ptaki karmione dietą kontrolną wykazywały maksymalną apoptozę w około 24 godziny po ekspozycji, podczas gdy ptaki karmione dietą z dodatkiem ZX wykazywały maksymalną apoptozę w czasie późniejszym o 24 godziny. Wydłużenie czasu przed uszkodzeniem stanowi silny wskaźnik ochronnego wpływu ZX.

Siatkówki tych ptaków wyizolowano mikrochirurgicznie, utrwalono w ksylenie i odwodniono w etanolu, po czym zatopiono w żywicy paraplast (Oxford, 56°C). Tkanki siatkówki skrawano i barwiono metodą Gallayas 1990, albo jodkiem propidium w celu uwidocznienia jąder pyknotycznych, które charakteryzują apoptozę. Policzono liczbę jąder pyknotycznych, które można było zaobserwować w pojedynczym polu widzenia przy powiększeniu 400x (liniowym). Dla każdej z grup leczenia policzono jądra w przynajmniej 6 do 8 osobnych pól, po czym uśredniono wyniki.

Wyniki na tabeli 2 jasno pokazują, że śmierć komórkowa i uszkodzenia w siatkówkach były: (1) znacznie zmniejszone i/lub opóźnione przez zeaksantynę syntetyzowaną przez bakterie, nawet w niskim dawkowaniu ZX(+5), w porównaniu z ptakami, które otrzymały normalną dietę kontrolną; (2) zmniejszone jeszcze więcej przez wyższe dawki ZX(+50). Całkowity brak jakichkolwiek jąder pyknotycznych w siatkówkach z grupy ZX(+50) dostarcza dowodu, że zeaksantyna R-R z linii komórkowej F. multivorum (ATCC nr 55238) stanowi dramatyczny i niezwykły przełom w ochronie komórek siatkówki przed uszkodzeniem fototoksycznym. Według najlepszej wiedzy zgłaszających, żaden inny środek badany do tej pory nie był zdolny do osiągnięcia albo nawet zbliżenia się do tego poziomu zabezpieczenia.

Przykład 8: Bezpośrednie porównanie zeaksantyny R-R wobec karotenu^ w ochro nie tkanki siatkówki

Jak zaznaczono wyżej, ptaki w grupie BC+ karmiono z dodatkiem β-karotenu (50 mg/kg paszy), co równało się dawce zeaksantyny w grupie ZX(+50). Umożliwiło to bezpośrednie porównanie β-karotenu z ZX w ochronie komórek siatkówki przed uszkodzeniem fototoksycznym.

Wyniki pokazują, że uszkodzenie fototoksyczne w grupie BC+ było zmniejszone o mały margines (średnio około 10% albo mniej). W porównaniu z odchyleniem standardowym w grupie kontrolnej, zmniejszenie to nie było istotne statystycznie; prawdopodobieństwo, że to niewielkie zmniejszenie było czysto losowe wynosiło 0,12 do 0,14.

Brak lepszej ochrony tkanek siatkówki przed uszkodzeniem fototoksycznym oferowanej przez β-karoten, przy 100% zmniejszeniu śmierci komórkowej i uszkodzenia zapewnianym przez zeaksantynę R-R, stanowi wielki przełom, nie oferowany przez żaden znany do tej pory czynnik.

Przykład 9: Tworzenie wzmacniaczy absorpcji „Micelle” zawierające zeaksantynę, o średnicy mniejszej niż 1 pmetr i zawierające wyłącznie pożądany izomer R-R zeaksantyny, można uzyskać przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem biomasy albo płynu oleistego opisanego w przykładzie 3, stosując pewien rodzaj soli żółciowych jak to opisał Olson 1994. Płyn oleisty zawierający zeaksantynę R-R można zmieszać z odpowiednią solą żółciową, taką jak fosforan gliko- albo taurocholanu, sprzedawaną przez Marcor Development Company z Hackensack, New Jersey, albo przez zastosowanie ekstraktów pęcherzyka żółciowego zawierających mieszaninę soli żółciowych, takich jak sprzedawany przez Saltzman Corporation z Davenport, Iowa. Taki materiał żółciowy można mieszać z ekstraktem rozpuszczalnikiem albo oleistą masą oraz pewnymi solami, w tym chlorkiem sodu, chlorkiem wapnia albo chlorkiem potasu, tę mieszaninę przetwarza się mechanicznie w homogenizatorze, który zawiera urządzenia mieszające takie jak wirujące ostrza przy prędkości i w czasie, które mogą być optymalizowane w rutynowych doświadczeniach, przez analizowanie wielkości micelli wytworzonych przy różnych kombinacjach wielkości i kształtów ostrz, prędkości wirowania i czasu. Powstałe micelle osusza się z rozpuszczalnika, jeżeli to konieczne, rozcieńcza do pożądanego stężenia stosując nośniki albo rozcieńczalniki takie jak olej roślinny. Mieszaninę taką zamyka się w kapsułkach albo innej postaci, która umożliwia połknięcie i chroni micelle przed rozłożeniem przez kwas żołądkowy.

Można również wykorzystać inne emulgatory i lipidy, w celu wytworzenia emulsji o małej wielkości cz.ąs tecze^o. Moaia n^komyltać detergepty niejonowe takiejal·; Tween atoo

185 465

Span, jak to opisał Olson 1994, jak również materiał lipidowy taki jak fosfolipidy i sfingolipidy, które tworzą pęcherzyki lipidowe o małej wielkości (poniżej 1 mikrometra).

Przykład 10: Mikrokapsułkowanie zeaksantyny

Przykład ten opisuje wytwarzanie mikrokapsułkowanych postaci zeaksantyny. Mikrokapsułki są stałymi cząstkami o wielkości w zakresie od 10 do 1000 pm, zbudowane z materiału rdzenia (takiego jak zeaksantyna R-R) pokrytego materiałem otoczkowym albo powłoką, wytworzone z różnych związków takich jak żelatyna, guma arabska, skrobia, zeina (białko kukurydzy) itp. Podczas wytwarzania materiału otoczki można dodać innych związków w celu utrzymania kształtu, faktury, stabilności albo innych pożądanych cech powstałego preparatu. Związki takie obejmują emulgatory, sorbitol, przeciwutleniacze takie jak TBHQ albo 2-[ 1,1 -dimetylo]-1,4-bcnzenodiol albo środki żelujące takie jak karrageenan.

Czysta albo częściowo oczyszczona zeaksantyna rozpuszczana jest w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak etanol, aceton albo THF. W roztworze, tworzy się mikrokryształy mniejsze niż 10 mikrometrów przez dodanie rozpuszczonej zeaksantyny do wody. Proces ten jest ulepszony gdy podczas dodawania zeaksantyny do wody roztwór sonikuje się wysokimi częstotliwościami w obecności środków emulgujących takich jak Tween 80.

Po wytworzeniu mikrokryształów, materiał powłoczki dodaje się do mieszaniny wody, zeaksantyny i rozpuszczalnika. Przy użyciu niektórych materiałów powlekających, takich jak żelatyna, temperaturę mieszaniny należy utrzymywać powyżej 60°C przez dwie godziny. Po całkowitym rozpuszczeniu materiału otoczki mieszaninę umieszcza się w sonikatorze na okres od 5 do 10 minut w celu reemulgacji kryształów.

Tworzenie mikrokapsułek uzyskuje się przez wysuszenie mieszaniny materiału rdzenia i otoczki przez zastosowanie odpowiedniej metody suszenia, takiej jak suszenie przez rozpylenie albo zastosowanie wirującego dysku metodą Sparks i in. opisaną w patencie US nr 4,675,140. Suszarki dyskowe są szeroko stosowane w przemyśle spożywczym i paszowym. Wirujący dysk jest urządzeniem zbudowanym z dysku (średnicy około 4), który można utrzymać w odpowiedniej temperaturze w kontrolowanych warunkach. Może pracować z różnymi prędkościami w zakresie od 1000 do 10000 obrotów na minutę. Mieszaninę rdzenia i otoczki umieszcza się na środku dysku podczas wirowania z prędkością 4000 obrotów na minutę. Mikrokapsułki tworzą się podczas kontaktu płynu z podgrzanym dyskiem. Mikrokapsułki są wyrzucane ze środka przez siłę bezwładności i zbierane na płaskiej powierzchni pokrytej środkiem „zbierającym” albo „wychwytującym” takim jak hydrofobowa skrobia albo dekstryna. Mikrokapsułki oddziela się od środka wychwytującego przez przesiewanie. Mikrokapsułki umieszcza się w pojemniku w celu ochrony przed światłem i powietrzem, i przechowuje się w zamrożeniu do momentu zamknięcia ich w kapsułkach do podawania doustnego.

185 465

Literatura

Bauemfeind, J. C. (ed.), Caroteooies as Colorants and Vitamin A

Precursors: Technological and Nutritional Applications (Academic Press, New York, 1981)

Bone, R. A., „The role of the macular pigment in the dete^im of polarized light,” Vision Research 20: 213-220 (1980)

Bone, R. A., et al, „Prelimmary ieeotSficstion of the human macular pigment,” ^sion Res. 25: 1531-1535 (1985)

Bone, R. A., et al, „Analysis of the macular pigment by HPLC: retinal eistrSbetion and age study,” Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 29: 843-849 (1988)

Bone, R. A., et al, „Stereochemistry of the macular carotenoids,” Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34: 2033-2040 (1993)

Bone, R. A., et al, „Distribution of macular pigment stereomers in ineivieusl eyes, including those with age-related macular degeneratim (AMD),” ARVO Abstracts: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35: 1502 (1994) di Mascio, P., et al, „Lycopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxygen quencher,” Archives of Biochemistry and Biophysics 274: 532-538 (1989)

Dorey, C. K., et al, „Lipofuscm in aged and AMD eyes,” in Retinal Degeneratim (Hollyfield et al, editors, Plenum Press, New York, (1993)

Eye Disease Case Control Study Group, „Ant^idant status and oeovasculαr age-related macular degeneratiom” Arch. Ophthalmol. 11: 104-109 (1993)

Eye Disease Case Control Study Group, „Risk factors for neovascular age-related macular degeneratim,” Arch. Ophthalmol. 10: 1701-1708 (1992)

Foote, C. S. et al, „Chemistry of singlet oxygen. XI. Cis-Trans isomerization of carotenoids by singlet oxageo and a probable queoching mechanism,” J. Amer. Chem. Soc. 92: 5218-5219(1970)

Foote, C. S. et al, „Chemistry of singlet oxygen. X. Caroteooie queochiog parallels biological protection,” J. Amer. Chem. Soc. 92: 5216-5218 (1970)

Galiyas, P., Acta Neuropathologica 79: 620 (1990)

Gerster, H., „Review: antioxieaot protection of the ageing macula,” Age and Aging 20: 60-69 (1991)

Gittinger, J. W., Manual of Clmical and Problem Ophthalmology (Little-Brown, Boston,

1988)

Haegerstrom-Portnoy, G., „Shrrt-wavelength-sensitive-cone sensitivity loss with aging: a protective role for macular pigment?,” J. Opt. Soc. Am. A5: 2140-2144 (1988)

Ham, W. T., Jr., et al, „Basic mechaoisms uoderlaiog the produ^on of photochemical lesions in the mammalian retina,” Current Eye Research 3: 165-174 (1984)

Haoeelmso, G. J. and Dratz, E. A., „The role of antioxidants in the retina and retinal pigment epithelium and the nature of prooxieant-ineuced damage,” Adv. in Pree Radical Biolo^y & Medic^e 2: 1-89 (1986)

Handelman, G. J., et al, „Carrtenoies in the human macula and whole retina,” Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: 850-855 (1988)

Jialal, I., et al, „P-Carotene inhibits the oxidative modificatirn of low-density lipoprotein,” Birchimicα et Birphysics Acta 1086: 134-138 (1991)

Khachlik, F., et al., „Separation, ieentificatioo and quaotification of csrotenoies in fruits, vegetables and human plasma by high performance liguid chromatography,” Pure and Applied Chemistry 63: 71-80 (1991)

Kirschfeld, K., „Caroteooie pigments: their possible role in protecting against photooxieαtioo in eyes and photoreceptor cells,” Proc. R. Soc. Lond. B 216: 71-85 (1982)

Malinow, M. R., et al., „Diet-related macular anomalies in monkeys,” Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 19: 857-863 (1980)

Pease, P. L., et al, „Optical density of human macular pigment,” VSsSoo Res. 27: 705710(1987)

185 465

Peto, R., et al, „Can dietary beta-carotene materially reduce human cancer rates?” Nature 290: 201-208 (1981)

Schalch, W., „Carotenoids in the retina—a review of their possible role in preventing or limiting damage caused by light and oxygen,” EXS 62: 280-298 (1992)

Seddon, J. M., et al, „Dietary carotenoids, vitamins A, C, and E, and advanced age-related macular degeneration,” JAMA 272: 1413-1420 (1994)

Snodderly, D. M., et al, „The macular pigment. I. Absorbance spectra, localization, and discrimination from other yellow pigments in primate retinas,” Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25: 660-673 (1984)

Sperduto, R. D., et al, „Do we have a nutritional treatment for age-related cataract or macular degeneration?,” Arch. Ophthalmol. 108: 1403-1405 (1990)

Taylor, A., et al., „Oxidation and aging: impact on vision,” Journal of Toxicology and Industrial Health 9: 349-371 (1993)

Vaughn, D. And Asbury, T., General Ophthalmology, 13th ed. (Appleton and Lange, Norwalk, CT, 1992)

Wald, G., „The photochemistry of vision,” Doc. Ophthalmol. 3: 94 (1949)

Weiter, J. J., et al, „Central sparing in annular macular degeneration,” Am. J. Ophthalmol. 106: 286-292 (1988)

Werner, J. S. et al, „Aging and human macular pigment density,” Vision. Res. 27: 257268(1987)

185 465

Figura 2

185 465

Figura 1

Numeracja pierścienia karotenoidu

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (25)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny do wytwarzania leku do leczenia zwyrodnienia plamkowego u ludzi.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku mającego postać użytkową przydatną do podawania ludziom zawierającą ilość zeaksantyny wystarczającą do zapewnienia korzyści terapeutycznej ludziom cierpiącym na zwyrodnienie siatkówkowe i zawierającą również dopuszczalną fizjologicznie zaróbkę, rozcieńczalnik albo nośnik.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 2, do wytwarzania leku, który w dawce jednostkowej zawiera przynajmniej około 1 mg stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny jest wytworzony sposobem obejmującym hodowlę, w pożywce płynnej, w warunkach ułatwiających syntezę zeaksantyny, komórek, które syntetyzują stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny w ilości co najmniej 90% wszystkich cząsteczek karotenoidów wytwarzanych przez komórkę.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że komórki syntetyzują stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny bez syntetyzowania jakichkolwiek wykrywalnych ilości innych stereoizomerów zeaksantyny.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że komórkami są komórki bakteryjne pochodzące od szczepu Flavobacterium multivorum, któremu nadano nr ATCC 55238.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że komórki są zmodyfikowane genetycznie w taki sposób, że zawierają przynajmniej jeden gen syntezy zeaksantyny zawierający sekwencję DNA otrzymaną z komórek pochodzących od szczepu Flavobacterium multivorum, któremu nadano nr ATCC 55238.
8. 8. Zastosowanie stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny do wytwarzania dodatku do diety, który jest przydatny do doustnego spożycia przez ludzi w celu zmniejszenia ryzyka zwyrodnienia siatkówkowego.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, do wytwarzania dodatku do diety przeznaczonego dla pacjentów cierpiących na chorobę Stargardt'a, chorobę Best'a, chorobę Batten'a, zespół Sjogrena-Larssona, zwyrodnienie czopkowo-pręcikowe i owczą lipofuscynozę ceroidową, zaburzenia spichrzania lizosomalnego albo podwyższoną podatność genetyczną na zwyrodnienie plamkowe.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 8 albo 9, do wytwarzania dodatku do diety w postaci jednostki dawkowania, która zawiera przynajmniej około 0,1 mg stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że izomer 3R-3'R zeaksantyny jest wytworzony sposobem obejmującym hodowlę, w pożywce płynnej, w warunkach ułatwiających syntezę zeaksantyny, komórek, które syntetyzują stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny w ilości co najmniej 90% wszystkich cząsteczek karotenoidów wytwarzanych przez komórkę.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że komórki syntetyzują stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny bez syntetyzowania jakichkolwiek wykrywalnych ilości innych stereoizomerów zeaksantyny.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że komórkami są komórki bakteryjne pochodzące od szczepu Flavobacterium multivorum, któremu nadano nr ATCC 55238.
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że komórki są zmodyfikowane genetycznie w taki sposób, że zawierają przynajmniej jeden gen syntezy zeaksantyny zawierają185 465 cy sekwencję DNA otrzymaną z komórek pochodzących od szczepu Flavobacterium multivorum, któremu nadano nr ATCC 55238.
15. 15. Zastosowanie stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny do wytwarzania leku albo dodatku do diety do leczenia ludzi, które mają postać użytkową, odpowiednią do podawania doustnego i zawierają izomer 3R-3'R zeaksantyny w ilości dostatecznej aby przy przyjmowaniu jednej dawki jednostkowej dziennie w tkance siatkówki osadziła się wykrywalna ilość dodatkowej zeaksantyny oraz w których stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny stanowi co najmniej około 90% całej obecnej zeaksantyny, a stereoizomery 3S-3'S i 33-3'R stanowią mniej niż około 10% całej zeaksantyny.
16. 16. Kompozycja do leczenia lub zapobiegania zwyrodnieniu plamki u ludzi, znamienna tym, że zawiera stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny w ilości przydatnej terapeutycznie, w której stereoizomer 3R-3'R stanowi przynajmniej około 90% całej ilości zeaksantyny, zaś stereoizomery S-S i S-R stanowią mniej niż około 10% całej ilości zeaksantyny w kompozycji.
17. 17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że zawiera stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny, w nośniku albo rozcieńczalniku przeznaczonym do podawania doustnego ludziom, w ilości skutecznej terapeutycznie do zastosowania w leczeniu albo zapobieganiu zwyrodnieniu plamkowemu u ludzi.
18. 18. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że nie zawiera zasadniczo stereoizomerów S-S i R-S zeaksantyny.
19. 19. Kompozycja według zastrz. 16 albo 18, znamienna tym, że jest w postaci użytkowej, przy czym każda jednostka dawkowania zawiera przynajmniej około 0,1 mg stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny.
20. 20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że jest w postaci jednostki dawkowania, która zawiera przynajmniej około 1 mg stereoizomeru 3R-3'R zeaksantyny.
21. 21. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że nośnik jest substancją spożywczą przeznaczoną do spożywania przez ludzi.
22. 22. Kompozycja według zastrz. 11 albo 17, znamienna tym, że zeaksantyna ma powłoczkę ochronną zmniejszającą rozkład zeaksantyny w żołądku.
23. 23. Kompozycja według zastrz. 11 albo 17, znamienna tym, że zawiera niepatogenne komórki bakterii, które zawierają stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny w stężeniu co najmniej około 2% wagowe, jako frakcja masy komórek bakteryjnych.
24. 24. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, że zawiera komórki bakteryjne pochodzące od szczepu Flavobacterium multivorum, któremu nadano nr ATCC 55238.

    24. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, że zawiera komórki bakteryjne pochodzące od szczepu Flavobacterium multivorum, któremu nadano nr ATCC 55238.
25. 25. Kompozycja terapeutyczna lub dodatek do diety w postaci użytkowej do podawania ludziom, zawierająca substancję czynną i fizjologicznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera stereoizomer 3R-3'R zeaksantyny w ilości w dawce jednostkowej wystarczającej do wykrywalnego wzrostu stężenia zeaksantyny w tkance siatkówki przy podawaniu jednej dawki jednostkowej dziennie.