BRPI0814726B1 - processo para preparar um produto nutricional e produto nutricional - Google Patents
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Abstract
fortificação de produtos nutricionais com extratos de oliveiras contendo hidroxitirosol e produtos nutricionais fortificados com hidroxitirosol a presente invenção se relaciona com produtos nutricionais que contêm hidroxitirosol, particularmente produtos alimentícios (ou seja, óleos comestíveis fortificados e produtos que contêm óleo comestível fortificado) e suplementos dietéticos (ou seja, cápsulas de gel mole que contêm óleos comestíveis fortificados) com aumento da capacidade antioxidante para serem usados como fonte de hidroxitirosol para evitar ou tratar doenças cardiovasculares, acúmulo de placa nas artérias, hipertensão arterial e síndrome metabólica, graças ao suprimento nutricional de uma composição rica em hidroxitirosol.
Description
PROCESSO PARA PREPARAR UM PRODUTO NUTRICIONAL E PRODUTO NUTRICIONAL (001) A presente invenção se relaciona com fortificação de produtos nutricionais com extratos de oliveira que contêm hidroxitirosol; também se relaciona com produtos nutricionais fortificados com hidroxitirosol e com o uso tanto de extratos de oliveira quanto de produtos nutricionais fortificados com extratos de oliveira para uso médico, particularmente para prevenção ou tratamento de doenças cardiovasculares (CVD), acúmulo de placa nas artérias, hipertensão arterial e síndrome metabólica.
(002) De acordo com a invenção, acrescenta-se o extrato de oliveira derivado da fruta oliveira ou de resíduos de extração de azeite de oliva (bagaço) a um óleo comestível e, através desse óleo, a produtos nutricionais, o que resulta em aumento no nível de hidroxitirosol. Mais particularmente, a invenção se relaciona com a fortificação de produtos que contêm óleo comestível a serem usados como fonte hidroxitirosol para evitar ou tratar doenças cardiovasculares (CVD), acúmulo de placa nas artérias, hipertensão arterial e síndrome metabólica, graças ao suprimento nutricional de composição purificada e rica em hidroxitirosol.
(003) De acordo com o suplemento publicado pela British Heart Foundation (Fundação Cardíaca Britânica) - European cardiovascular disease statistics, 2005 edition -, CVD constituem a principal causa de morte na Europa, respondendo por mais de 4,35 milhões de mortes por ano. A cardiopatia coronariana (CHD) constitui, sozinha, a causa única de morte mais comum na Europa, respondendo por 1,95 milhão de mortes por ano nesse continente.
(004) Esse suplemento incluiu uma nova seção sobre estimativa de custos econômicos de CVD. Os custos totais de CVD chegam a 169 bilhões de euros, dos
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2/54 quais 105 bilhões são para tratamento de CVD na União Europeia e 64 bilhões são devidos a perda de produtividade e custo de cuidados informais.
(005) Os acúmulos de placa nas artérias, também chamados de aterosclerose, constituem a causa principal de CVD e a causa mais frequente de CHD. Os acúmulos de placa aterosclerótica nas artérias constituem um distúrbio comum das artérias. Ocorrem quando gordura, colesterol e outras substâncias se acumulam nas paredes de artérias e formam substâncias duras, chamadas de placa.
(006) Finalmente, os depósitos de placa podem tornar a artéria estreita e menos flexível. Isso torna mais difícil que o sangue flua. Se as artérias coronárias ficarem estreitas, o fluxo sanguíneo para o coração pode retardar ou parar, causando dor peitoral (angina estável), falta de fôlego, ataque cardíaco e outros sintomas.
(007) Pedaços da placa podem se desprender e se mover pela corrente sanguínea. Isso é uma causa comum de ataque cardíaco e acidente vascular cerebral. Também podem se formar coágulos sanguíneos ao redor dos depósitos da placa. Coágulos bloqueiam o fluxo sanguíneo. Se o coágulo se mover para o interior do coração, pulmões ou cérebro, pode causar acidente vascular cerebral, ataque cardíaco ou embolia pulmonar.
(008) Tem sido demonstrado que hipertensão arterial, altos níveis de triglicerídeos e colesterol total no sangue e fumo são fatores que contribuem para o desenvolvimento dessa afecção. Nos últimos anos, pesquisadores descobriram que alguns desses fatores de risco se agrupam em determinadas pessoas. Esse agrupamento de fatores de risco é conhecido como síndrome metabólica.
(009) Pessoas com síndrome metabólica apresentam agrupamento dos seguintes fatores de risco:
(010) Obesidade central, significando peso adicional na área abdominal
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3/54 (estômago).
(011) Problema na digestão de um tipo de açúcar chamado glicose (intolerância a glicose). Pacientes com síndrome metabólica apresentam geralmente hiperinsulinemia ou diabetes tipo 2.
(012) Altos níveis de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e triglicerídeos na corrente sanguínea.
(013) Baixos níveis de lipoproteínas de alta densidade (HDL) na corrente sanguínea.
(014) Pressão sanguínea alta (hipertensão).
(015) Ainda há muito a ser aprendido sobre síndrome metabólica, mas os médicos sabem que pessoas com síndrome metabólica possuem risco aumentado de CVD.
(016) Numerosos estudos têm demonstrado que a oxidação in vivo de LDL exerce um papel central no desenvolvimento de aterosclerose (Knight, 1995; Witzum, 1994).
(017) O azeite de oliva, o principal componente gorduroso da dieta mediterrânea, tem sido associado com incidência mais baixa de CHD (De Lorgeril et al., 1999; Hertog et al., 1993; Mattson e Grundy, 1985) e determinados cânceres (d'Amicis e Farchi, 1999; Braga et al., 1998; Trichopoulou et al., 1995; Martin-Moreno et al., 1994).
(018) Os benefícios de saúde do consumo de azeite de oliva na prevenção de oxidação de LDL seriam ligados tanto ao seu teor de antioxidantes quanto ao seu alto teor de ácidos graxos monoinsaturados (Nicolaiew et al., 1998). Os compostos fenólicos do azeite de oliva virgem possuem fortes propriedades antioxidantes, que protegem o azeite da oxidação (Visioli et al., 1998; Papadopoulos e Boskou, 1991) e, além disso, têm demonstrado benefícios positivos de saúde (Owen et al., 2000;
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Manna et al., 1999). Alguns dos compostos fenólicos mais representativos no óleo de azeite de oliva virgem são hidroxitirosol, tirosol e alguns de seus derivados, que são extraídos da oliveira durante a produção do azeite de oliva (Brenes et al., 1999). (019) O hidroxitirosol está presente no azeite de oliva e possui a seguinte fórmula:
OH
OH
OH (020) Nas solicitações de patente copendentes EP07001791 e PCT/IB2008/000173, descrevem-se o processo e o aparato para a produção de hidroxitirosol a partir de oliveiras e/ou resíduos de extração de azeite de oliva, que objetivam a produção de produtos ou extratos que contêm hidroxitirosol para serem usados como fonte de hidroxitirosol nas indústrias alimentícias, médicas e cosméticas. O teor das solicitações acima está incorporado aqui para referência.
(021) Sabe-se bem que várias propriedades sensoriais são acionadas por polifenóis da oliveira nos azeites de oliva extravirgem e virgem. O aspecto sensorial desses azeites de oliva possui repercussões em sua aceitabilidade pelos consumidores. Alguns fenóis acionam principalmente a percepção de paladar de amargor; no entanto, outras moléculas fenólicas podem estimular as extremidades livres do nervo trigêmeo, localizado no palato, e também nas papilas gustativas que dão origem às percepções quimioestésicas de pungência, adstringência e atributos metálicos.
(022) A oleuropeína, o composto fenólico que deixa a oliveira amarga, é hidrossolúvel em vez de lipossolúvel, e assim é pouco transferida para o óleo quando a fruta é espremida e, consequentemente, o teor médio de oleuropeína
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5/54 varia de 1 ppb a 11 ppm em azeites de oliva extravirgem e virgem.
A oleuropeína está presente no azeite de oliva e possui a seguinte fórmula:
(023)
(024)
Entretanto, um certo número de compostos relacionados à oleuropeína é mais solúvel em óleo que a própria oleuropeína, e realmente acabam em um teor mais alto no azeite, na forma de isômero (ou isômeros) de oleuropeína-aglicona (por exemplo, forma aldeídica de oleuropeína-aglicona, AOA) e na forma dialdeídica de ácido elenólico ligada a hidroxitirosol ou tirosol, chamadas respectivamente de 3,4DHPEA-EDA e p-HPEA-EDA, que são os polifenóis da oliveira responsáveis principalmente pelo gosto amargo, de acordo com Gutierrez-Rosales e coautores (J.
Agric. Food Chem. 2003, 51, 6021-6025).
(025) A oleuropeína-aglycona (por exemplo, forma aldeídica da oleuropeínaaglicona) está presente no azeite de oliva e possui a seguinte fórmula:
FORMA ALDEÍDICA DA OLEUROPEÍNA-AGLICONA (026) Frank e coautores (J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 231-238) revelam um procedimento chamado “análise de diluição de gosto” para apontar o limiar sensorial
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6/54 do amargor para derivados da oleuropeína. O amargor foi avaliado por meio da preparação de diluições seriadas de amostras em água e depois provando-as de acordo com uma concentração crescente, até que se encontre a concentração na qual se consegue diferenciar a amostra a partir de água, conforme julgado em um teste triangular.
(027) Também foi mostrado que, pelo menos no caso desses compostos, a correlação direta do amargor com a absorbância em 225 (o valor de K225); Mateo et al. (J. Am. Oil Chem. Soc. 2004, 81, 71-75) verificaram a correlação entre a forma aldeídica da oleuropeína-aglicona (obtida por meio de hidrólise da oleuropeína com β-glicosidase proveniente de amêndoas adquiridas a partir de Sigma) e amargor.
(028) Andrewes et al. (J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1415-1420) avaliaram a relação entre polifenóis e a pungência do azeite de oliva; p-HPEA-EDA foi a origemchave da sensação de queimação encontrada em muitos azeites de oliva.
(029) Em 2005, Beauchamp e coautores (Nature 2005, 437, 45-46) mediram a intensidade pungente da p-HPEA-EDA isolada a partir de diferentes azeites de oliva extravirgens e virgens, confirmando que essa molécula é o principal agente em azeites de oliva extravirgens e virgens responsável por irritação da garganta.
(030) Resumindo, qualquer maneira que se estabeleça para aumentar a capacidade antioxidante utilizando técnicas baseadas na fortificação do azeite de oliva com polifenóis da oliveira não deve alterar as características organolépticas naturais dos óleos, nem aumentar a quantidade dos polifenóis da oliveira de gosto amargo ou, do contrário, ficando sujeito à alteração subsequente das propriedades organolépticas do óleo, consequentemente causando um gosto desagradável devido a amargor, pungência e/ou adstringência excessivos e, subsequentemente, causando rejeição a partir de muitos consumidores.
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7/54 (031) Sabe-se que se acrescentam polifenóis e hidroxitirosol a produtos alimentícios.
(032) US-B1-6942890 revela um método de fortificação de produtos alimentícios por meio do acréscimo de material sólido derivado de oliveiras a tais produtos, resultando em aumento do nível de antioxidantes, particularmente de polifenóis da oliveira. Esse processo requer incubação do produto a ser fortificado durante um determinado período (por exemplo, um óleo vegetal com material sólido derivado de oliveiras que não foram submetidas a um tratamento de remoção do amargor) e, depois, separação do sólido a partir do óleo por meio de filtração. O principal problema relacionado com esse processo está associado com alteração das propriedades organolépticas do óleo vegetal, causando um gosto desagradável quando amargor e/ou adstringência excessivos são produzidos em relação com quando o óleo aumenta seu teor de polifenóis. De acordo com os inventores, essa alteração poderia ser evitada particularmente quando o produto final obtido é produzido acrescentando-se tanto quanto 2,5% de material sólido de oliveira, o que faz com que os azeites de oliva extravirgens aumentem os polifenóis da oliveira de 145 para 530 ppm como máximo.
(033) US-A-6162480 revela um método de fortificação de óleo vegetal com antioxidantes. oliveiras ainda amargas são embebidas por 1 a 30 dias em óleo vegetal, resultando em aumento no nível de antioxidantes, particularmente dos polifenóis da oliveira. De acordo com o exemplo 1, o acréscimo de 10% de oliveiras ainda amargas provenientes da Toscana foi mexido lentamente por 30 dias com azeite de oliva extravirgem da Toscana, o que faz com que azeites de oliva extravirgens aumentem os polifenóis da oliveira de 420 para 591 ppm, com esse aumento sendo o máximo permitido de acordo com a invenção. Esse método é
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8/54 substancialmente o mesmo bem conhecido usado para preservar oliveiras em azeite de oliva, exceto quanto a mexer.
(034) O principal problema relacionado com os métodos revelados em US-B16942890 e US-A-6162480 é que apenas polifenóis que são lipossolúveis são (parcialmente) extraídos a partir de material sólido de oliveira ou de oliveiras em azeite.
(035) US-B1-6746706 revela um método de fortificação de composições alimentícias (produtos para passar no pão, vinagrete e molho de tomate), em que tais composições que continham 20-100% em peso de uma fase aquosa caracterizada por intensificação do teor de tirosol e hidroxitirosol em fase aquosa corresponderam a pelo menos 15 ppm. Entretanto, esse método é pouco efetivo: nenhum dos exemplos de patente mostra que as composições alimentícias preparadas atingem concentrações na fase aquosa mais altas que 50 ppm para o hidroxitirosol e o tirosol juntos.
(036) US-B1-6361803 revela (exemplo 13) um método caracterizado pelo uso de um produto de extrato de oliveira, de acordo com o exemplo 4, para permitir uma intensificação da atividade antioxidante em um óleo. Entretanto, a capacidade antioxidante da amostra controle, 0,18 mM de equivalente de Trolox por grama, ficou intensificada em apenas aproximadamente três vezes pelo método da invenção: 0,53 mM de equivalente de Trolox por grama.
(037) US-B-6361803 requer o uso de solventes orgânicos, particularmente solventes polares, para produzir um extrato de oliveira que contém hidroxitirosol com um grau de pureza aceitável. Os solventes aquosos polares são selecionados entre metanol, etanol, acetonitrila ou acetona, enquanto que os solventes orgânicos polares são selecionados, por exemplo, entre ésteres, amidas, dimetilsulfóxido,
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9/54 dioxano, DMF e suas mistures. O uso de solventes orgânicos (por exemplo, metanol, que é um solvente tóxico) é inconveniente, particularmente quando o produto final obtido deve ser usado no campo alimentício.
(038) O principal problema relacionado com esse processo, além do problema que surge a partir do uso de solventes orgânicos (e, em alguns casos, tóxicos), é que a redissolução do extrato de oliveira rico em hidroxitirosol revelada no exemplo 13 (composição antioxidante) precisa de uma mistura de água/etanol/ácido acético para dissolver anteriormente o extrato e conferir uma emulsão estável no óleo a ser fortificado, com esse procedimento sendo inconveniente no campo alimentício.
(039) IT 01326553 revela um azeite de oliva fortificado obtido por meio da adição de extratos que derivaram de folhas de oliveira ou de água de vegetação ao azeite de oliva. Os extratos são ricos em todos os tipos de polifenóis (ou seja, possuem baixa pureza de hidroxitirosol). De fato, extratos de folhas que quase não contêm hidroxitirosol. O problema dessa patente e das patentes reveladas anteriormente está principalmente na baixa quantidade de hidroxitirosol livre com relação à quantidade total de polifenóis: quanto mais baixa for a quantidade de hidroxitirosol com relação a outros polifenóis, maior será o amargor (ou seja, o gosto amargo) do produto fortificado para a mesma quantidade de hidroxitirosol livre no óleo.
(040) US 5998641 se relaciona com um processo de aumento do teor geral de polifenóis em azeite de oliva sem aumentar o gosto amargo. Para esse propósito, emulsifica-se o azeite de oliva com uma solução hídrica que contém polifenóis e uma enzima para retirar o amargor (por exemplo, beta-glicosidase proveniente de amêndoas adquiridas a partir de Sigma (exemplo 1)). Depois, remove-se a água por meio de evaporação ou ultrafiltração para evitar perda dos polifenóis resultantes que são solúveis em água e insolúveis em óleo. Os problemas desse método são que
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10/54 ele é bastante longo (pelo menos 24 horas, de acordo com os exemplos, e de até 100 horas) e que todos os produtos da reação enzimática, incluindo oleuropeínaaglicona e açúcares, permanecem no óleo.
(041) Deve-se observar que a hidrólise da oleuropeína por meio da β-glicosidase (por exemplo, proveniente de amêndoas, adquiridas a partir de Sigma) tem sido usada normalmente por vários autores para a preparação de um isômero (ou isômeros) de oleuropeína-aglicona que se descobriu ser mais amargo, com um limiar de 50 pmol (Frank e coautores [J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 231-238]). Mateo et al. (J. Am. Oil Chem. Soc. 2004, 81, 71-75) também verificaram a correlação entre a forma aldeídica de oleuropeína-aglicona (obtida por meio de hidrólise de oleuropeína com β-glicosidase proveniente de amêndoas adquiridas a partir de Sigma) e o amargor. Em outras palavras, em US 5998641, o resultado da hidrólise enzimática é uma pluralidade de subprodutos, incluindo compostos polifenólicos que, ao serem provados, conferem um gosto amargo ao óleo, mas não são detectáveis com o teste K225.
(042) Também se deve considerar que a remoção de água por meio de evaporação possui influência negativa nos atributos sensoriais (características qualitativas) dos azeites de oliva virgens, pois a maioria das substâncias voláteis responsáveis pelo aroma único desse óleo será extraída conjuntamente com a água durante o processo de evaporação.
(043) Resumindo, as técnicas mencionadas acima são longas demais ou complexas demais para o campo alimentício ou ambas as coisas; além da quantidade de hidroxitirosol que pode ser incorporada no óleo comestível sem apresentar gosto amargo, intensidade pungente ou teor de açúcar e subprodutos exagerados e sem perder compostos voláteis aromáticos é baixa demais para
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11/54 proteger efetivamente as LDL contra a modificação oxidativa em qualquer extensão importante.
(044) Também se deve observar que todas as técnicas mencionadas acima permitem obter um azeite de oliva com aumento do teor de polifenóis da oliveira, mas com baixo teor de hidroxitirosol com relação ao teor total de polifenóis da oliveira, conforme presente no óleo, devido ao fato de que a maior parte dos polifenóis incorporados no óleo são secoiridoides, compostos relacionados à oleuropeína caracterizados por solubilidade em óleo mais alta que o hidroxitirosol, e que são consequentemente incorporados ao óleo, como a oleuropeína-aglicona (AOA), a 3,4-DHPEA-EDA e a p-HPEA-EDA, em teor mais alto que o hidroxitirosol, e que são esses polifenóis da oliveira os principais responsáveis pelo gosto amargo e pela pungência. A incorporação desses secoiridoides, capaz de produzir alterações indesejáveis nas propriedades organolépticas do azeite de oliva, está, na verdade, diretamente relacionada com a fonte dos polifenóis da oliveira usados em todas as técnicas mencionadas acima, que, na verdade, apresentam baixo teor de hidroxitirosol e/ou baixo grau de pureza.
(045) Um dos objetivos da presente invenção é resolver os problemas mencionados acima e proporcionar óleo comestível e/ou produtos alimentícios que contêm óleo fortificados para serem usados como fonte de hidroxitirosol para impedir ou tratar doenças cardiovasculares, acúmulo de placa nas artérias, hipertensão arterial e síndrome metabólica, mas evitando alterações desagradáveis das propriedades organolépticas dos alimentos fortificados.
(046) Outro objetivo da presente invenção é proporcionar óleo comestível e/ou produtos alimentícios que contêm óleo fortificados, caracterizados por grande quantidade de hidroxitirosol, para serem usados como fonte de hidroxitirosol para
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12/54 evitar ou tratar doenças cardiovasculares, acúmulo de placa nas artérias, hipertensão arterial e síndrome metabólica.
(047) Outro objetivo da presente invenção é proporcionar óleo comestível e/ou produtos alimentícios que contêm óleo fortificados que, mesmo sendo caracterizados por alto teor de hidroxitirosol, estão na forma de uma emulsão estável e durável.
(048) Novamente, um objetivo da presente invenção é proporcionar óleo comestível e/ou produtos alimentícios que contêm óleo fortificados, caracterizados por grande quantidade de hidroxitirosol muito puro. Tais objetivos são atingidos por meio da presente invenção, que proporciona óleo comestível e/ou produtos alimentícios que contêm óleo fortificados com extratos de oliveira.
(049) O processo de produção de tais extratos de oliveira livres de solvente, obtidos a partir de oliveiras, bem como de subprodutos da extração de azeite de oliva, permite aumentar, em uma extensão nunca descrita até agora, a capacidade antioxidante no óleo e/ou produtos que contêm óleo fortificados, mas evitando alterações desagradáveis das propriedades organolépticas dos alimentos fortificados. Um aspecto da invenção se relaciona com um processo para preparar um extrato de oliveira rico no antioxidante hidroxitirosol.
(050) Outro aspecto da invenção se relaciona com processo para preparar o óleo e/ou produtos que contêm óleo fortificados com extrato de oliveira, que compreende as seguintes etapas:
(051) Seleção do extrato de oliveira apropriado, entre as formas líquida e de pó, preparado a partir de oliveiras ou resíduos da extração de azeite de oliva ou bagaços (ou seja, os resíduos definidos acima, provenientes de extrações de azeite de oliva e ricos em hidroxitirosol). Essa seleção depende do produto nutricional a
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13/54 ser fortificado, preferindo-se extrato de oliveira na forma líquida para fortificação de óleos comestíveis e extrato de oliveira na forma sólida para fortificação de produtos que contêm óleo, compreendendo pelo menos 10% de água.
(052) Incorporação e mistura do extrato de oliveira selecionado em a) com o óleo e/ou produtos que contêm óleo.
(053) Conforme mencionado, um aspecto da invenção se relaciona com um produto nutricional, compreendendo pelo menos 30 ppm de hidroxitirosol, preferivelmente de 30 para 30000 ppm de hidroxitirosol. Uma faixa preferida, quando o produto nutricional está, por exemplo, na forma de um óleo comestível fortificado (como uma emulsão homogeneizada, preferivelmente uma microemulsão), bem como quando o produto nutricional é um produto alimentício que contém tal óleo comestível fortificado, é de 30 a 300 ppm, em que o teor de hidroxitirosol fica preferivelmente dentro da faixa de 45 a 70 ppm e, mais preferivelmente, entre 50 e 60 ppm. Por exemplo, quando o produto nutricional está na forma de um suplemento dietético que consiste de um óleo comestível fortificado encapsulado (como cápsulas de gel mole que contêm uma emulsão homogeneizada, preferivelmente uma microemulsão), o teor de hidroxitirosol fica dentro da faixa de 300 a 30000 ppm, preferivelmente 500 a 3000 ppm.
(054) O valor K225 de um óleo fortificado de acordo com a invenção (ver explicação seguinte para os exemplos 13 e 14) é de 0,28 ou menos e, preferivelmente, de 0,25 ou menos. Além disso, o teor de AOA de tal óleo fortificado é de menos de 120 ppm, preferivelmente menos de 85 ppm e, mais preferivelmente, menos de 55.
(055) O produto nutricional de acordo com a presente invenção, e compreendendo o extrato de oliveira adicionado mencionado, mostra melhora da capacidade
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14/54 antioxidante.
(056) Finalmente, um quarto aspecto da invenção se relaciona com o uso dos produtos nutricionais (óleo e/ou produtos que contêm óleo fortificados) na prevenção ou tratamento de doenças cardiovasculares, acúmulo de placa nas artérias, hipertensão arterial e síndrome metabólica. Como mencionado acima, o primeiro aspecto da invenção se relaciona com a preparação de um extrato de oliveira rico no antioxidante hidroxitirosol em forma muito pura. O problema encontrado foi intensificar a incorporação do hidroxitirosol hidrofílico no óleo; esse problema foi resolvido por meio da presente invenção, que faz uso de um processo de extração de hidroxitirosol na ausência de solventes e capaz de proporcionar um extrato de oliveira final, rico em hidroxitirosol e caracterizado por um grau de pureza muito alto, com relação a subprodutos, açúcares e sais.
(057) Em uma versão, resíduos da extração de azeite de oliva ou bagaço poderiam ser usados como material inicial para extração de hidroxitirosol. Esse processo está descrito nas solicitações de patente copendentes EP-A-07001791, arquivada em 26/01/2007, e PCT/IB2008/000173, arquivada em 28/01/2008, no nome do atual solicitante, e está aqui incorporado por referência. Em outra versão, usam-se oliveiras como material inicial para a produção de extrato de oliveira, preferivelmente oliveiras verdes e, mais preferivelmente, oliveiras verdes inteiras.
(058) No processo que segue o conhecimento das solicitações mencionadas acima, os resíduos de extração ou oliveiras inteiras ou oliveiras esmagadas são homogeneizados/misturados com água desmineralizada. Com a preparação das oliveiras inteiras ou da massa homogênea da polpa de oliveira ou da massa de resíduos misturadas com água, a etapa seguinte é a hidrólise ácida em água dessa mistura, realizada em uma temperatura compreendida entre 20 e 140°C,
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15/54 preferivelmente entre 70 e 140°C e, mais preferivelmente, em um sistema de esterilização contínua em temperatura entre 110 e 140°C. O pH da mistura acidificada que sofre a hidrólise fica dentro da faixa de 1,0 a 6,0. Depois da hidrólise, a mistura é clareada por meio de métodos físicos conhecidos no ofício (por exemplo, por meio de filtração e/ou centrifugação), para remover as oliveiras inteiras ou os sólidos suspensos a partir do produto hidrolisado e obter uma solução clareada substancialmente livre de sólidos em suspensão.
(059) De acordo com uma versão preferida da invenção, as etapas acima são seguidas pelas etapas de carregamento do produto assim obtido em pelo menos uma coluna cromatográfica de uma resina selecionada a partir de resinas de troca aniônica ativadas por ácido e resinas não-iônicas adsorventes e de eluição dos produtos retidos em tais colunas cromatográficas com água.
(060) De acordo com um aspecto adicional da invenção, o produto líquido é concentrado, por exemplo, por meio de concentração por osmose reversa. De acordo com uma etapa adicional, após a purificação cromatográfica e a concentração por osmose reversa, o produto líquido resultante é levado, em outra versão, à forma sólida por meio de secagem por spray, com carreadores tais como maltodextrinas.
(061) O extrato de oliveira assim obtido é bastante rico em hidroxitirosol e possui baixo teor de produtos iniciais, bem como de subprodutos, e, em geral, apresenta teor muito baixo de açúcares e sais.
(062) Os extratos obteníveis de acordo com o processo mencionado acima podem estar na forma líquida ou sólida e são caracterizados por apresentar teor de hidroxitirosol de pelo menos 0,5% (p/p) e pureza de pelo menos 40% e, preferivelmente, teor de pelo menos 10% e pureza de pelo menos 80% e, mais
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16/54 preferivelmente, teor de pelo menos 35% e pureza de pelo menos 90% (conforme determinado por meio da área do pico de HPLC medida em 280 nm). De acordo com um aspecto preferido da invenção, o produto líquido que contém hidroxitirosol (extrato de oliveira na forma líquida) obtenível de acordo com a invenção apresenta teor de hidroxitirosol de pelo menos 35% (p/p) ou, ainda mais preferivelmente, de pelo menos 45% (p/p), pureza de pelo menos 90% (por meio de HPLC em 280 nm) e teor total de fenóis de pelo menos 35%. De acordo com um aspecto mais preferido da invenção, o produto sólido que contém hidroxitirosol (extrato de oliveira na forma sólida) obtenível de acordo com a invenção apresenta teor de hidroxitirosol de pelo menos 20% (p/p), pureza de pelo menos 90% (por meio de HPLC em 280 nm) e teor total de fenóis de pelo menos 20%.
(063) De acordo com um aspecto preferido da invenção, o produto sólido que contém hidroxitirosol apresenta teor de hidroxitirosol de pelo menos 40% (p/p) e pureza de pelo menos 90% (por meio de HPLC em 280 nm).
(064) Esses extratos são livres de solventes orgânicos e também substancialmente livres de açúcares e sais.
(065) Os extratos de oliveira verde da invenção são preferidos com relação a extratos de resíduos de produção de azeite de oliva devido à sua maior quantidade de hidroxitirosol e do teor reduzido de hidroximetilfurfural. Esses extratos podem ser empregados na prevenção ou tratamento de doenças cardiovasculares, acúmulo de placa nas artérias, hipertensão arterial e síndrome metabólica. Também poderiam ser empregados na preparação de suplementos dietéticos.
(066) Um segundo aspecto da invenção se relaciona com um processo para preparação de óleo e/ou produtos que contêm óleo fortificados com extrato de oliveira, ou seja, para preparação do chamado alimento funcional.
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17/54 (067) A primeira etapa consiste na seleção do extrato de oliveira apropriado. Para a fortificação do óleo, escolhe-se normalmente um extrato de oliveira na forma líquida. Tal de extrato de oliveira possui um teor de hidroxitirosol de pelo menos 35% (p/p) ou, ainda mais preferivelmente, de pelo menos 45% (p/p) e pureza de pelo menos 90% (por meio de HPLC em 280 nm) e teor total de fenóis de pelo menos 35%. Prefere-se o uso de tais extratos de oliveira para a fortificação de óleos devido ao fato de que uma emulsão estável do extrato de oliveira poderia ser preparada sem aumento significativo na água residual presente no óleo, devido à quantidade pequena de extrato de oliveira exigida para atingir a capacidade antioxidante desejada no óleo fortificado.
(068) De fato, o extrato de oliveira de acordo com a presente invenção, que apresenta alto teor de hidroxitirosol, baixo teor de subprodutos indesejados (por exemplo, AOA, 3,4-DHPEA-EDA e p-HPEA-EDA) e é substancialmente livre de açúcares e sais, resulta em emulsões estáveis quando incorporado no óleo a ser fortificado. De fato, como ele se caracteriza por alto teor de hidroxitirosol (por exemplo, não menos de 35% (p/p)), pequenas quantidades do extrato de oliveira são adequadas para obter um óleo fortificado caracterizado por alto teor de hidroxitirosol. Além disso, por causa da pureza do extrato de oliveira de acordo com a invenção (que tem como resultado ser substancialmente livre de sais e açúcares, quando é incorporado no óleo a ser fortificado), obtêm-se emulsões estáveis mesmo na ausência de emulsificantes ou outros aditivos, com vantagem imediata, pois o óleo fortificado resultante pode ser usado nos campos alimentício, médico e cosmético.
(069) Portanto, os óleos fortificados resultantes contêm pelo menos 30 ppm de hidroxitirosol e retêm propriedades organolépticas que não são afetadas
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18/54 adversamente.
(070) Para a fortificação de produtos que contêm óleo e compreendem pelo menos 10% de água, seleciona-se normalmente um extrato de oliveira em pó. Tal extrato de oliveira apresenta teor de hidroxitirosol de pelo menos 20% (p/p). Os carreadores adequados são, por exemplo, maltodextrinas, lactose, caseinatos, etc. Prefere-se o uso de tais extratos de oliveira para a fortificação de produtos que contêm óleo e compreendem pelo menos 10% de água, devido ao fato de que tal pó é facilmente manipulado e completamente dissolvido em tais produtos nutricionais na faixa empregada para atingir a capacidade antioxidante desejada nos produtos que contêm óleo.
(071) A segunda etapa consiste na incorporação do extrato de oliveira selecionado com o óleo e/ou produtos que contêm óleo. A incorporação do extrato de oliveira ao produto nutricional é obtida por meio de mistura e homogeneização, de acordo com o processo tecnológico de cada produto.
(072) A fortificação do óleo consiste na incorporação do extrato de oliveira durante sua preparação tecnológica. Em geral, adiciona-se extrato de oliveira na forma líquida na proporção de peso desejada para o óleo e mistura-se completamente, sob parâmetros controlados de temperatura e agitação; depois, é necessário deixar o produto se sedimentar para remover o excesso de extrato de oliveira baseado em água. Para fazer isso, é possível usar qualquer método conhecido, tal como, por exemplo, decantação convencional. De fato, durante a produção de óleos vegetais, várias etapas consecutivas de decantação convencional são normais para eliminar água residual e, de modo natural, poderia se incorporar o antioxidante de oliveira ao óleo imediatamente antes da última etapa de decantação normalmente realizada durante essa produção.
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19/54 (073) Devido à alta concentração de hidroxitirosol no extrato baseado em água, bem como devido a seu alto grau de pureza, é possível transferir uma boa quantidade de hidroxitirosol para o produto de óleo em cada etapa de mistura. A fase aquosa decantada a partir da fase oleosa contém geralmente um pouco de hidroxitirosol e, portanto, é recuperada para uso posterior.
(074) Em uma versão preferida da invenção, acrescenta-se extrato de oliveira na forma líquida ao óleo, pré-misturado sob atmosfera inerte (ou seja, atmosfera de nitrogênio), de acordo com parâmetros controlados de temperatura e agitação. O produto é alimentado em um homogeneizador que opera de acordo com um procedimento de homogeneização de estágio duplo, com o primeiro estágio sendo realizado em um valor de pressão compreendido entre 200 e 700 bar e o segundo estágio sendo realizado mantendo-se a pressão entre 30 e 50 bar. A homogeneização da pré-emulsão permite obter uma emulsão estável.
(075) Em uma versão da invenção, acrescenta-se hidroxitirosol puro a água, e mistura-se e homogeneiza-se a solução resultante com óleo para transferir hidroxitirosol para a fase oleosa. Usam-se preferivelmente extratos naturais de acordo com a invenção, de forma a evitar qualquer vestígio de solventes orgânicos no produto final, especialmente diante de seu uso na prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares, acúmulo de placa nas artérias, hipertensão arterial e síndrome metabólica.
(076) A fortificação de produtos sólidos que contêm óleo consiste na incorporação e mistura do extrato de oliveira durante sua preparação tecnológica. Em geral, o processo para preparação do produto que contém óleo é caracterizado por conter:
a) presença de uma fase oleosa, que compreende óleo comestível e/ou gordura comestível e, opcionalmente, constituintes lipofílicos adicionais; b) etapa de
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20/54 emulsificação, que compreende a adição a a) de um emulsificante sob faixas controladas de agitação e temperatura; c) presença de fase aquosa, que contém água e, opcionalmente, constituintes hidrofílicos adicionais; a proporção de peso da fase oleosa com relação à fase aquosa fica na faixa de 9:1 a 1:9.
(077) Acrescenta-se extrato de oliveira em pó na proporção de peso desejada à fase aquosa (c) e dissolve-se completamente a mesma, sob condições bem controladas de temperatura e agitação, logo depois à fase oleosa (a), à qual se incorporou previamente um emulsificante à fase aquosa (c), para criar uma matriz estável de óleo/água.
(078) Um terceiro aspecto da invenção se relaciona com um produto nutricional ao qual se acrescentou hidroxitirosol, preferivelmente na forma do extrato de oliveira definido acima, produzindo óleo e/ou produtos que contêm óleo fortificados. No contexto da presente invenção, a expressão “produto nutricional” significa qualquer produto alimentício, produto comestível ou suplemento dietético que seja um óleo comestível ou contém pelo menos um óleo comestível. Os produtos nutricionais da invenção compreendem preferivelmente uma concentração do extrato de oliveira da invenção que varia de 0,01 a 93% (p/p). Uma faixa mais preferida vai de 0,01 a 30% (p/p) do extrato de oliveira da invenção. Produtos nutricionais que são óleos comestíveis que contêm essa quantidade de extrato de oliveira adicionado podem ser, por exemplo:
a) óleos vegetais obtidos a partir de várias fontes, tais como oliveira (azeite de oliva extravirgem (EVOO), azeite de oliva virgem, azeite de oliva, azeite de oliva de iluminação, azeite de oliva refinado, azeite bruto de bagaço de oliveira, óleo refinado de bagaço de oliveira), girassol, milho, soja, semente de linho, amêndoa, canola, cártamo, coco, colza, entre outros, derivados tecnologicamente modificados dos
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21/54 óleos mencionados acima ou misturas de dois ou mais destes poderiam ser usados para sua fortificação.
b) óleos marinhos ou de peixes obtidos a partir de várias fontes, tais como algas, krill, savelha, anchova, atum, arenque, sardinha, cavala, bacalhau, entre outros, derivados tecnologicamente modificados dos óleos acima ou misturas de dois ou mais dos mesmos poderiam ser usados para sua fortificação.
(079) Outra faixa mais preferida vai de 0,05 a 35% (p/p) do extrato de oliveira da invenção. Produtos nutricionais que contêm pelo menos um óleo comestível e contêm a quantidade acima do extrato de oliveira adicionado podem ser, por exemplo: produtos que contêm óleo, tais como margarina, maionese, maionese com alho, sopa gazpacho, molhos para passar no pão, molhos de salada, entre outros, derivados tecnologicamente modificados dos produtos que contêm óleo mencionados acima ou misturas dos mesmos poderiam ser usados para sua fortificação.
(080) Finalmente, um quarto aspecto da invenção se relaciona com o uso dos produtos nutricionais da invenção (óleo e/ou produtos que contêm óleo fortificados) na prevenção ou tratamento de doenças cardiovasculares, acúmulo de placa nas artérias, hipertensão arterial e síndrome metabólica.
(081) Em uma versão preferida da invenção, usou-se uma emulsão de extrato de oliveira (na forma líquida) e óleo comestível para preparar cápsulas de gel mole.
(082) Vários aspectos devem ser considerados quando se fabricam cápsulas de gel mole. Um aspecto está relacionado com o tamanho da cápsula. O limite superior de tamanho que a maior parte dos consumidores acha aceitável é de cerca de 1,2 g, o que representa um tamanho comumente usado para outros suplementos dietéticos de óleo. O segundo aspecto é representado pelo número de cápsulas exigidas para
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22/54 serem tomadas por dia. Geralmente, o limite superior é de 4 a 6 cápsulas por dia. Quando se considera o tamanho de cápsula maior, prefere-se uma forma retangular (1000 mg ou mais), pois é mais fácil de engolir. A presente invenção não é limitada por esses parâmetros.
(083) Outra consideração é a dose mínima exigida para eficácia. A dosagem mínima preferida para prevenção ou tratamento de doenças cardiovasculares, acúmulo de placa nas artérias, hipertensão arterial e síndrome metabólica é de 2 g de óleo comestível fortificado, administrando de 3 a 50 mg de hidroxitirosol por dia, o que pode ser administrado, por exemplo, em duas doses de 1 g de óleo comestível fortificado por dia.
(084) A invenção será agora revelada adicionalmente, em maiores detalhes com referência aos seguintes exemplos e desenhos não-limitantes anexos, em que: (085) As figuras 1-5 são gráficos que mostram a correlação linear entre a capacidade antioxidante de diferentes produtos nutricionais obtidos de acordo com a presente invenção (ver exemplos 3 a 7) e seu teor de hidroxitirosol medido por meio de HPLC como resultado de sua fortificação com quantidades crescentes de extratos de oliveira obtidos de acordo com a presente invenção.
(086) A figura 6 é um gráfico que compara as curvas de distribuição de tamanho de partículas de emulsões de extrato de oliveira líquido e azeite de oliva extravirgem, preparado com ou sem uso de um homogeneizador.
(087) As figuras 7-9 são gráficos que mostram os efeitos do azeite de oliva extravirgem fortificado com azeite de oliva de acordo com a presente invenção em triglicerídeos de ratos, o índice aterogênico (colesterol total/colesterol-HDL) e a capacidade antioxidante total no plasma (TAC), respectivamente.
(088) A figura 10 é um gráfico que mede o efeito do azeite de oliva extravirgem
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23/54 fortificado com extrato de oliveira de acordo com a presente invenção na pressão sanguínea de ratos.
(089) A figura 11 é um gráfico que mostra os efeitos do extrato de oliveira rico em hidroxitirosol altamente puro de acordo com a presente invenção no índice aterogênico (colesterol total/colesterol-HDL) de ratos. A figura 11 é relacionada com o exemplo 12, em que os grupos de animais foram organizados de acordo com a Tabela 6.
(090) A invenção será agora discutida adicionalmente com referência aos seguintes exemplos não-limitantes.
(091) EXEMPLO 1 (092) Produção de extratos de oliveira a partir de oliveiras (093) Misturam-se 25 kg de uma amostra de oliveiras com 50 L de água desmineralizada. A mistura obtida é misturada por alguns minutos e, depois, acrescentam-se 636 g de ácido sulfúrico (98%). A mistura obtida é mantida em autoclave em 15 psi (acima da pressão atmosférica) por 30 minutos em 121°C. Depois disso, separa-se a fase aquosa a partir do resíduo, por meio de filtração em um filtro. Lava-se a fase sólida, retida no filtro, com 12,5 L de água desmineralizada e coleta-se a água proveniente dessa operação de lavagem com a fase aquosa previamente recuperada. Depois, centrifuga-se e refina-se a fase aquosa, aproximadamente 56 L, para eliminar partículas sólidas que passaram pelo filtro. Depois da eliminação do sólido, obtêm-se 52 L de extrato aquoso bruto, que contêm 141 g de hidroxitirosol, com pureza por HPLC de 50,5%.
(094) Em seguida, carrega-se o extrato aquoso bruto em uma coluna cromatográfica que contém uma resina de troca iônica ativada por ácido do tipo aniônico, previamente ativada por meio do ciclo do acetato. Por exemplo, pode-se
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24/54 usar IRA-67. A fase líquida recuperada no final da coluna não contém hidroxitirosol, que, em vez disso, é continuamente eluído com água desmineralizada até se recuperar pelo menos 90% do hidroxitirosol inicialmente carregado.
(095) A fase eluída proveniente da primeira coluna é carregada preferivelmente em outra coluna cromatográfica que contém uma resina não-iônica de adsorção. Por exemplo, pode-se usar a resina XAD-1180. A fase líquida recuperada no final dessa segunda coluna não contém hidroxitirosol. Depois, elui-se o hidroxitirosol a partir da resina com água desmineralizada até se recuperar pelo menos 90% do hidroxitirosol inicialmente carregado.
(096) A fase eluída contém aproximadamente 114 g de hidroxitirosol, com pureza por HPLC de cerca de 96,7%.
(097) Depois, concentra-se uma fração de 461 L de extrato purificado, que contêm
114 g de hidroxitirosol, obtida em uma planta piloto usando-se uma planta piloto de osmose reversa, equipada com uma membrana polimérica de 2,5 m2, para reduzir o volume para 10 L de produto concentrado. Em seguida, usa-se uma membrana de 0,35 m2 feita do mesmo material para obter um concentrado de hidroxitirosol que contém 3,5% de hidroxitirosol. Finalmente o concentrado RO é rotaevaporado em 78°C, sob pressão de vácuo de 245 mbar, para permitir uma concentração de cerca de 10 vezes do extrato de oliveira na forma líquida, atingindo uma concentração final de hidroxitirosol de 37,2% (p/p), com pureza por HPLC de 93,3%.
(098) EXEMPLO 2 (099) Preparação do extrato de oliveira em pó por meio de secagem por spray (0100) Mexe-se lentamente uma amostra de 260 mL de extrato de oliveira purificado na forma líquida, contendo 19,5 g de hidroxitirosol obtidos de acordo com o Exemplo 1, com 58 g de maltodextrina previamente dissolvida em 260 mL de água
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25/54 desmineralizada. Por exemplo, pode-se usar maltodextrina de batata. Usa-se uma bomba peristáltica para alimentar o secador por spray, que é previamente equilibrado com temperatura do ar na entrada de 150°C. Ajusta-se a velocidade alimentação para obter uma temperatura de ar na saída que seja de menos de 100°C. Obtêm-se 76 g de um pó branco, com umidade de 5,4% (Karl Fischer) e riqueza de hidroxitirosol de 21,9% (p/p).
(0101) EXEMPLO 3 (0102) Preparação de azeite de oliva extravirgem fortificado com extrato de oliveira (0103) Seleciona-se uma amostra de extrato de oliveira purificado na forma líquida que contenha uma concentração de 40,6% (p/p) de hidroxitirosol obtida com um processo de acordo com o Exemplo 1 para a fortificação de azeite de oliva extravirgem. Foram preparadas 6 amostras, com 400 g cada, de tal azeite de oliva extravirgem. Acrescentam-se quantidades crescentes de extrato de oliveira na forma líquida na proporção de peso desejada ao azeite de oliva extravirgem e misturam-se completamente as mesmas, sob parâmetros bem controlados de temperatura e agitação por 1 h. Depois disso, desliga-se o misturador e preenche-se um funil de decantação com a mistura, deixando-se que esta se sedimente por 72 h. Em seguida, o excesso de extrato de oliveira formou uma camada no fundo, que foi separada da fase oleosa superior para obter o azeite de oliva extravirgem fortificado. (0104) Depois disso, usou-se uma alíquota de cada uma das 6 amostras de azeite de oliva extravirgem fortificada para medir a capacidade antioxidante (capacidade de absorção ABTS radical, medida em 734 nm, usando Trolox como padrão) e o teor de hidroxitirosol por meio de HPLC. Obteve-se uma correlação linear quando se projetaram os resultados (ver figura 1) como capacidade antioxidante contra concentração de hidroxitirosol. Concretamente, a capacidade antioxidante do azeite
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26/54 de oliva extravirgem não-fortificado foi de 0,24 mM de equivalente de Trolox por grama e a capacidade antioxidante do azeite de oliva extravirgem fortificado com a proporção de peso mais alta usada neste exemplo foi de 5,05 mM de equivalente de Trolox por grama, significando que se obteve um aumento de 21 vezes na capacidade antioxidante do azeite de oliva extravirgem.
(0105) EXEMPLO 4 (0106) Preparação de óleo de girassol fortificado com extrato de oliveira (0107) Seleciona-se uma amostra de extrato de oliveira purificado na forma líquida que contenha uma concentração de 40,6% (p/p) de hidroxitirosol, obtida com um processo de acordo com o Exemplo 1, para a fortificação de óleo de girassol. Prepararam-se 6 amostras, de 400 g cada, de tal óleo de girassol. Acrescentaramse quantidades crescentes de extrato de oliveira na forma líquida na proporção de peso desejada ao óleo de girassol, e estas foram completamente misturadas, sob parâmetros bem controlados de temperatura e agitação por 1 h. Depois disso, desligou-se misturador, e preencheu-se um funil de decantação com a mistura, deixando-se sedimentar por 72 h. Depois, o excesso de extrato de oliveira formou uma camada no fundo, que foi separada a partir da fase oleosa superior para obter o óleo de girassol fortificado.
(0108) Depois disso, usou-se uma alíquota de cada uma das 6 amostras de óleo de girassol fortificado para medir a capacidade antioxidante (capacidade de absorção ABTS radical, medida em 734 nm, usando-se Trolox como padrão) e o teor de hidroxitirosol por meio de HPLC. Obteve-se uma correlação linear quando os resultados foram projetados (ver figura 2) como capacidade antioxidante contra concentração de hidroxitirosol. Concretamente, a capacidade antioxidante do óleo de girassol não-fortificado foi de 0 mM de equivalente de Trolox por grama e a
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27/54 capacidade do antioxidante do óleo de girassol fortificado com a proporção de peso mais alta usada neste exemplo foi de 5,42 mM de equivalentes de Trolox por grama. (0109) EXEMPLO 5 (0110) Preparação de óleo de milho fortificado com extrato de oliveira (0111) Seleciona-se uma amostra de extrato de oliveira purificado na forma líquida que contenha uma concentração de 40,6% (p/p) de hidroxitirosol, obtida com um processo de acordo com o Exemplo 1, para a fortificação de óleo de milho. Prepararam-se 6 amostras, de 400 g cada, de tal óleo de milho. Acrescentaram-se quantidades crescentes de extrato de oliveira na forma líquida na proporção de peso desejada ao óleo de milho, e estas foram completamente misturadas, sob parâmetros bem controlados de temperatura e agitação por 1 h. Depois disso, desligou-se misturador, e preencheu-se um funil de decantação com a mistura, deixando-se sedimentar por 72 h. Depois, o excesso de extrato de oliveira formou uma camada no fundo, que foi separada a partir da fase oleosa superior para obter o óleo de milho fortificado.
(0112) Depois disso, usou-se uma alíquota de cada uma das 6 amostras de óleo de milho fortificado para medir a capacidade antioxidante (capacidade de absorção ABTS radical, medida em 734 nm, usando-se Trolox como padrão) e o teor de hidroxitirosol por meio de HPLC. Obteve-se uma correlação linear quando os resultados foram projetados (ver figura 3) como capacidade antioxidante contra concentração de hidroxitirosol. Concretamente, a capacidade antioxidante do óleo de milho não-fortificado foi de 0 mM de equivalente de Trolox por grama e a capacidade do antioxidante do óleo de milho fortificado com a proporção de peso mais alta usada neste exemplo foi de 5,23 mM de equivalentes de Trolox por grama. (0113) EXEMPLO 6
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28/54 (0114) Preparação de margarina fortificada com extrato de oliveira (0115) Seleciona-se uma amostra de extrato de oliveira purificado na forma sólida que contenha uma concentração de 23,3% (p/p) de hidroxitirosol, obtida com um processo de acordo com o Exemplo 2, para a fortificação de margarina. Prepararam-se 6 amostras, de 200 g cada, de tal margarina. Acrescentaram-se quantidades crescentes de extrato de oliveira na forma sólida na proporção de peso desejada à fase aquosa junto com os outros ingredientes normais da margarina (soro, salmoura, etc.). Depois, a fase aquosa e o óleo refinado misturado com emulsificantes (lecitina) foram misturados conjuntamente, em temperaturas ao redor de 50-60o C, enquanto estavam sendo ligeiramente mexidos. Finalmente, a pasta misturada foi resfriada para solidificar.
(0116) Depois disso, usou-se uma alíquota de cada uma das 6 amostras de margarina fortificada para medir a capacidade antioxidante (capacidade de absorção ABTS radical, medida em 734 nm, usando-se Trolox como padrão) e o teor de hidroxitirosol por meio de HPLC. Obteve-se uma correlação linear quando os resultados foram projetados (ver figura 4) como capacidade antioxidante contra concentração de hidroxitirosol. Concretamente, a capacidade antioxidante da margarina não-fortificada foi de 0 mM de equivalente de Trolox por grama e a capacidade do antioxidante da margarina fortificada com a proporção de peso mais alta usada neste exemplo foi de 189,05 mM de equivalentes de Trolox por grama.
(0117) EXEMPLO 7 (0118) Preparação de maionese fortificada com extrato de oliveira (0119) Selecionou-se uma amostra de extrato de oliveira purificado na forma sólida que contenha concentração de 23,3% (p/p) de hidroxitirosol obtido de acordo com o Exemplo 2 para fortificação de maionese. Preparam-se 5 amostras, de 400 g cada,
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29/54 de tal maionese como se segue. Primeiramente, adicionam-se gemas de ovo à vasilha de mistura e misturam-se as mesmas completamente em velocidade 3. Em um recipiente separado, misturam-se extrato de oliveira (acrescentam-se quantidades crescentes de extrato de oliveira na forma sólida, de acordo com a proporção de peso desejada, à fase aquosa), água destilada, sumo de limão, vinagre e sal. Mistura-se até o extrato de oliveira ser dissolvido. Acrescenta-se essa mistura às gemas de ovo e mistura-se em velocidade 3 por cerca de 2 a 3 minutos. Finalmente, acrescenta-se lentamente o óleo e aumenta-se a velocidade para 6, para fazer uma emulsão.
(0120) Depois disso, usou-se uma alíquota de cada uma das 6 amostras de maionese fortificada para medir a capacidade antioxidante (capacidade de absorção ABTS radical, medida em 734 nm, usando-se Trolox como padrão) e o teor de hidroxitirosol por meio de HPLC. Obteve-se uma correlação linear quando os resultados foram projetados (ver figura 5) como capacidade antioxidante contra concentração de hidroxitirosol. Concretamente, a capacidade antioxidante da maionese não-fortificada foi de 0 mM de equivalente de Trolox por grama e a capacidade do antioxidante da maionese fortificada com a proporção de peso mais alta usada neste exemplo foi de 148,33 mM de equivalentes de Trolox por grama.
(0121) EXEMPLO 8 (0122) Preparação de azeite de oliva extravirgem fortificado por meio de emulsificação de extrato de oliveira usando um homogeneizador (0123) Seleciona-se uma amostra de extrato de oliveira purificado na forma líquida que contenha uma concentração de 31,1% (p/p) de hidroxitirosol obtido com um processo de acordo com o Exemplo 1 para fortificação de azeite de oliva extravirgem. Prepararam-se 3 amostras, de 1000 g cada, de tal azeite de oliva
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30/54 extravirgem fortificado de acordo com o desenho experimental mostrado na Tabela
1, a seguir:
Tabela 1.
| Quantidade de extrato de oliveira pL de extrato de oliveira/ L de óleo | Pressão total, bar 1o estágio/2o estágio | Observações |
| 230 | Não | (Controle sem homogeneizador) |
| 230 | 300/30 | |
| 230 | 500/30 | |
| (0124) Derrama-se o conteúdo de um frasco de azeite de o | iva extravirgem de 1 |
em um recipiente, e liga-se o misturador. Depois, acrescentam-se 230 microlitros de extrato de oliveira na forma líquida ao óleo e mistura-se mexendo-se suavemente em 100 rpm. Depois de 30 minutos, forma-se uma pré-emulsão. A pré-emulsão é alimentada no depósito alimentador do homogeneizador, que opera de acordo com um procedimento de estágios duplos de homogeneização. A homogeneização da pré-emulsão permite obter uma emulsão estável.
(0125) Depois disso, usou-se uma alíquota de cada uma das 3 amostras de azeite de oliva extravirgem fortificada para medir a eficiência da homogeneização por meio de um analisador de tamanho de partículas a laser, e mediu-se o teor de hidroxitirosol por meio de HPLC. As curvas de distribuição de tamanho de partículas foram projetadas (ver figura 6) e calculou-se o tamanho médio de partícula. Os resultados foram resumidos na Tabela 2, a seguir:
Tabela 2.
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| Amostra | [hidroxitirosol], ppm | Tamanho médio de partícula, Dm |
| Não-homogeneizada | 51 | 1,999 |
| 300/30 | 60 | 1,259 |
| 500/30 | 59 | 0,849 |
(001) Considerando as curvas de distribuição de tamanho de partícula (Figura 6), o tamanho médio de partícula e o teor de hidroxitirosol (tabela 2), pode-se concluir que a tecnologia de homogeneização tem um desempenho muito bom, permitindo a preparação de microemulsões estáveis de extrato de oliveira líquido em óleos, por exemplo, quando se homogeneiza a pré-emulsão em 500/30 bar.
(002) EXEMPLO 9 (003) Preparação de cápsulas de gel mole de azeite de oliva extravirgem fortificado com extrato de oliveira (004) Seleciona-se uma amostra de extrato de oliveira purificado na forma líquida que contenha uma concentração de 35,6% (p/p) de hidroxitirosol obtida com um processo de acordo com o Exemplo 1 para fortificação de azeite de oliva extravirgem.
(005) Derrama-se o conteúdo de um frasco de azeite de oliva extravirgem de 1 L em um recipiente e liga-se o misturador. Depois, acrescentam-se 4,68 g de extrato de oliveira na forma líquida ao óleo e mistura-se mexendo-se suavemente em 100 rpm. Depois de 30 minutos, forma-se uma pré-emulsão. A pré-emulsão é alimentada no depósito alimentador do homogeneizador, que opera em 10 L/h e 500 bar no primeiro estágio de homogeneização e 30 bar no segundo estágio.
(006) Depois, encapsula-se a emulsão preparada com uma gelatina comestível que contém glicerina, água, dióxido de titânio como agente mascarador e um agente
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32/54 corante. A forma de cápsula usada é retangular. As cápsulas são secas por dois dias em temperatura ambiente antes da embalagem.
(007) A criação e a fabricação comercial de cápsulas de gel mole é bem conhecida no ofício e não está descrita em detalhes aqui. Consequentemente, cápsulas de gel mole de azeite de oliva extravirgem fortificado com extrato de oliveira de acordo com a invenção podem ser preparadas de acordo.
(008) EXEMPLO 10 (009) Uso de azeite de oliva extravirgem fortificado com extrato de oliveira na prevenção ou tratamento de doenças cardiovasculares (010) 10.1. Animais (011) Quarenta e oito ratos Sprague Dawley machos (peso de aproximadamente 150-180 g) foram obtidos a partir da Harlan Interfauna Iberica SA (Barcelona, Espanha) e mantidos por todo o experimento nas instalações do serviço de animais da Universidade de Murcia. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em seis grupos experimentais de 8 ratos cada e, cada subgrupo de 4 ratos foi abrigado sob condições padrão de iluminação (ciclos de dia/noite de 12 h), temperatura (22 ± 2°C) e umidade (60%).
(012) 10.2. Dietas (013) As dietas usadas no estudo foram como se segue:
(014) DIETA CONTROLE (C): 97% de dieta padrão de ratos (Panlab) acrescido de 3% de óleo refinado de girassol.
(015) DIETA ATEROGÊNICA (A): 95,5% de dieta padrão de ratos (Panlab) acrescido de 1,5% de colesterol (Aldrich) e 3% de banha suína para produzir aterosclerose.
(016) AZEITE DE OLIVA EXTRAVIRGEM EXTRA (EVOO) (O): 97% de dieta
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33/54 padrão de ratos (Panlab) acrescido de 3% de azeite de oliva extravirgem (EVOO), cujo teor natural de hidroxitirosol (HT) foi determinado, resultando em 5,7 mg de HT/kg de EVOO.
(017) PADRÃO + GAVAGEM ORAL (5 mg de HT/kg (PC)) DE AZEITE DE OLIVA EXTRAVIRGEM FORTIFICADO (G5): dieta padrão de ratos (Panlab) mais gavagem oral de azeite de oliva extravirgem fortificado (preparado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção). Administrou-se a quantidade precisa de azeite de oliva extravirgem fortificado por meio de gavagens orais todo dia para suprir 5 miligramas de hidroxitirosol (HT)/kg de peso corporal (PC) a cada rato.
(018) PADRÃO + GAVAGEM ORAL (8 mg de HT/kg (PC)) DE AZEITE DE OLIVA EXTRAVIRGEM FORTIFICADO (G8): dieta padrão de ratos (Panlab) mais gavagem oral de azeite de oliva extravirgem fortificado (preparado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção). Administrou-se a quantidade precisa de azeite de oliva extravirgem fortificado por meio de gavagens orais todo dia para suprir 8 miligramas de hidroxitirosol (HT)/kg de peso corporal (PC) a cada rato.
(019) Água de bebida e alimento ficaram disponíveis ad libitum. Entretanto, em todo o estudo, o suprimento alimentar médio para cada animal foi padronizado em 30 g/dia (desconheceu-se o consumo alimentar real por animal). Adicionalmente, administrou-se a quantidade precisa de azeite de oliva extravirgem fortificado (EVOO fortificado) por meio de gavagens orais em grupos de animais que estavam experimentando dietas G5 e G8 para suprir 5 e 8 miligramas de HT/kg de peso corporal (PC), respectivamente, todo dia. Para evitar oxidação de gorduras, todas as dietas foram preparadas diariamente por meio de uma mistura das quantidades certas da dieta padrão de ratos (Panlab) e de gorduras/óleos e mantidas em 4°C no escuro até o uso, e retirou-se a dieta não-consumida do dia anterior.
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34/54 (020) As concentrações de hidroxitirosol (HT) nas dietas O, G5 e G8 usadas no estudo foram medidas por meio de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
(021) 10.3. Desenho experimental (022) O desenho experimental está exibido na Tabela 3, a seguir:
Tabela 3.
| GRUPO | Dos dias 1 a 30 | Dos dias 31 a 60 | Observações |
| 1 | Dieta C | Dieta C | Dieta resultante: CC (Dieta controle) |
| 2 | Dieta A | Dieta A | Dieta resultante: AA (Dieta aterogênica- controle negativo) |
| 3 | Dieta A | Dieta C | Dieta resultante: AC (efeito da dieta controle após uma dieta aterogênica) |
| 4 | Dieta A | Dieta O | Dieta resultante: AO (efeito da dieta com EVOO, que compreende naturalmente 5,7 mg de HT/kg de EVOO após uma dieta aterogênica) |
| 5 | Dieta A | Dieta G5 | Dieta resultante: AG5 (efeito da dieta com EVOO fortificado, que resulta em consumo diário de 5 mg de HT/kg (PC), após uma dieta aterogênica) |
| 6 | Dieta A | Dieta G8 | Dieta resultante: AG8 (efeito da dieta com EVOO fortificado, que resulta em consumo diário de 8 mg de HT/kg (PV), após uma dieta aterogênica) |
(023) Os grupos de animais tratados com dietas CC, AA, AC, AO, AG5 e AG8 foram alimentados como se segue:
(024) Os grupos de animais tratados com dietas CC ou AA, respectivamente, foram alimentados por 2 meses com dietas C ou A.
(025) O grupo de animais tratados com dieta AC foi alimentado por 1 mês com a
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35/54 dieta A (dieta aterogênica, controle negativo), seguido por um mês adicional com a dieta C (em que se forneceu apenas dieta padrão de ratos (Panlab), sem adição de óleo de girassol).
(026) O grupo de animais tratados com dieta AO foi alimentado por 1 mês com a dieta A (dieta aterogênica, controle negativo), seguido por um mês adicional com a dieta O (dieta com EVOO, que compreende naturalmente 5,7 mg de HT/kg de EVOO).
(027) O grupo de animais tratados com a dieta G5 foi alimentado por 1 mês com a dieta A (dieta aterogênica, controle negativo), seguido por um mês adicional com a dieta G5 (dieta com EVOO fortificado, que resulta em consumo diário de 5 mg de HT/kg (PC), suprido por meio de gavagem oral.
(028) O grupo de animais tratados com a dieta G8 foi alimentado por 1 mês com a dieta A (dieta aterogênica, controle negativo), seguido por um mês adicional com a dieta G8 (dieta com EVOO fortificado, que resulta em consumo diário de 8 mg de HT/kg (PC), suprido por meio de gavagem oral.
(029) No final do experimento, animais em jejum foram anestesiados e, imediatamente após a eutanásia, fez-se uma punção intracardíaca para coletar sangue em tubos. O plasma foi separado por meio de centrifugação para análise.
(030) 10.4. Determinação de lipídeos e capacidade antioxidante total (TAC) no plasma (031) As concentrações plasmáticas de colesterol total (TC), colesterol-HDL (HDLC) e triglicerídeos (TG) foram determinadas por meio de colorimetria usando kits comerciais adquiridos a partir da Biosystems (Barcelona, Espanha), de acordo com as instruções do fabricante.
(032) A TAC plasmática foi medida conforme descrito por Re et al. (1999), usando
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Trolox como padrão. Diluiu-se plasma fresco em PBS e incubaram-se 20 pL no escuro com 980 pL de cátion de radical ABTS+ ([2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolina6-ácido sulfônico)]) por 10 min em temperatura ambiente. Depois de 10 minutos, leu-se a absorbância em 734 nm. A solução-mãe de cátion ABTS+ foi preparada por meio da adição de 440 pL de persulfato de potássio 14 mM em água a 25 mL de uma solução 7 mM de ABTS (Sigma A-1808) em água e incubação por 12-14 h no escuro. A solução de trabalho foi obtida por meio de diluição da solução-mãe com PBS até que a absorbância em 734 nm ficasse em 0,7 ± 0,02.
(033) 10.5. Análise estatística (034) Os dados estão expressos como médias ± erro-padrão das médias (EPM), e foram analisados por meio de ANOVA unidirecional. As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas quando os valores p foram < 0,05. Os dados foram analisados usandose o software Sigma Stat (Versão 2.03).
(035) 10.6. Discussão (036) Os resultados obtidos estão exibidos nas figuras 7 a 9 anexas, em que os níveis de triglicerídeos, o índice aterogênico e a capacidade antioxidante total (TAC) foram correlacionados com diferentes grupos de animais.
(037) A figura 7 mostra a correlação entre os níveis de triglicerídeos e os animais, dividida de acordo com os diferentes esquemas dietéticos. De acordo com tal figura, o grupo 1 de animais tratados com a dieta CC (dieta controle) mostra os níveis mais baixos de triglicerídeos, enquanto que o grupo 2 de animais tratados com a dieta AA (dieta aterogênica-controle negativo) mostra a mais alta, com a diferença dos níveis de triglicerídeos entre os grupos 1 e 2 sendo estatisticamente significativa, com valor p < 0,001. Mostra-se um resultado interessante de acordo com os grupos 5 e 6
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37/54 de animais que foram tratados com as dietas G5 e G8, respectivamente. Os valores de triglicerídeos mostram que, mesmo que os animais tenham sido alimentados com dieta aterogênica no primeiro mês, não se observou nenhuma diferença estatisticamente significativa no nível de triglicerídeos entre os grupos 5 e 1 ou 6 e 1 no mês subsequente de tratamento, quando foram alimentados com uma dieta padrão mais gavagem oral de azeite de oliva extravirgem fortificado de acordo com a presente invenção. Em outras palavras, após o mês de tratamento com a dieta aterogênica, observou-se uma redução significativa nos níveis de triglicerídeos até um valor que é comparável ao nível obtido com a dieta controle nos grupos G5 e G8 de animais. Não se observou o mesmo efeito quando se administrou apenas azeite de oliva extravirgem (EVOO) aos animais além de uma dieta padrão no mês seguinte ao mês de tratamento com a dieta aterogênica (grupo 4 de animais). Nesse caso, o nível de triglicerídeos (mesmo que seja mais baixo que o do grupo controle negativo 2) resultou em uma diferença estatisticamente significativa com relação ao nível de triglicerídeos detectado para os animais alimentados com a dieta controle (grupo 1), com valor p < 0,001. Além disso, observou-se uma diferença estatisticamente significativa no nível de triglicerídeos entre os grupos 3 e 1, com valor p < 0,001, significando que o efeito do azeite de oliva extravirgem nãomodificado (G4) não é significativamente melhor que o de uma dieta padrão, depois de um mês de dieta aterogênica (G3).
(038) A figura 8 mostra a correlação entre o índice aterogênico e os animais, dividida de acordo com os diferentes esquemas dietéticos. De acordo com tal figura, o grupo 1 de animais tratados com a dieta CC (dieta controle) mostra o valor mais baixo de índice aterogênico, enquanto que o grupo 2 de animais tratados com a dieta AA (dieta aterogênica-controle negativo) mostra o mais alto, com a diferença
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38/54 do valor do índice aterogênico entre os grupos 1 e 2 sendo estatisticamente significativa, com valor p < 0,001. Mostra-se um resultado interessante de acordo com os grupos 5 e 6 de animais, que foram tratados com as dietas G5 e G8, respectivamente. Não se observou diferença estatisticamente significativa no valor do índice aterogênico entre os grupos 5 e 1 ou 6 e 1. Em outras palavras, depois do mês de tratamento com a dieta aterogênica, observou-se nos grupos G5 e G8 de animais uma redução significativa no valor do índice aterogênico para um valor comparável com o nível obtido com a dieta controle. Contrariamente, não se observou o mesmo efeito quando se administrou apenas azeite de oliva extravirgem (EVOO) aos animais além de uma dieta padrão no mês após o mês de tratamento com a dieta aterogênica (grupo 4 de animais). Nesse caso, o valor do índice aterogênico (mesmo com a diferença com relação aos do grupo 2 controle negativo sendo estatisticamente significativa) resultou em diferença estatisticamente significativa com relação ao valor de índice aterogênico detectado no caso dos animais alimentados com a dieta controle (grupo 1), com valor p < 0,05. Os níveis de índice aterogênico derivados dos grupos 5 e 6 de animais sugerem um possível efeito sinérgico devido ao azeite de oliva extravirgem fortificado de acordo com a presente invenção.
(039) A figura 9 mostra a correlação entre os valores plasmáticos de TAC e os animais, dividida de acordo com os diferentes esquemas dietéticos. De acordo com tal figura, os grupos 5 e 6 de animais exibem a capacidade antioxidante total mais alta, com a diferença do valor de TAC entre os grupos 5 e 1 (valor p < 0,001) e 6 e 1 (valor p < 0,001) sendo estatisticamente significativa. Esse resultado confirma novamente que o óleo/produto que contém óleo fortificado de acordo com a presente invenção e, particularmente, o azeite de oliva extravirgem fortificado
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39/54 apresentam várias vantagens e podem ser usados na proteção do sistema cardiovascular.
(040) De fato, altos níveis de colesterol/triglicerídeos, baixos níveis de colesterolHDL e, especialmente, LDL oxidados estão entre os fatores de risco associados com acúmulos de placa aterosclerótica nas artérias e síndrome metabólica. Resumindo os resultados acima, foram realizados estudos sobre o efeito que um produto nutricional fortificado que contém extrato de oliveira possui em biomarcadores de eventos cardiovasculares, e os resultados obtidos foram comparados com os resultados obtidos com produtos nutricionais semelhantes na ausência de fortificação com o extrato de oliveira de acordo com a presente invenção. Considerando-se todos os parâmetros medidos (ver figuras 7 a 9), podese concluir que os componentes do produto nutricional fortificado (que contém extrato de oliveira) mostra efeito sinérgico. Também se pode concluir que a administração regular do produto nutricional fortificado (que contém extrato de oliveira de acordo com a presente invenção) protege o sistema cardiovascular, o que, em maior ou menor extensão, impede a ocorrência de eventos cardiovasculares adversos e, portanto, pode ser considerado um produto nutricional que promove saúde.
(041) EXEMPLO 11 (042) Uso de azeite de oliva extravirgem fortificado (EVOO, adicionado de azeite de oliva de acordo com a invenção) no tratamento de hipertensão (043) 11.1. Animais (044) Trinta e seis ratos Sprague Dawley machos (peso de aproximadamente 200 g no início do experimento) foram obtidos a partir da Harlan Interfauna Iberica SA (Barcelona, Espanha) e mantidos durante todo o experimento nas instalações do
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40/54 serviço de animais na Universidade de Murcia. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em seis grupos experimentais de 6 ratos cada um, abrigados sob condições padrão de iluminação (ciclos de dia/noite de 12 h), temperatura (22 ± 2oC) e umidade (60%).
(045) 11.2. Dieta (046) Durante o período de ajuste e os períodos experimentais, os ratos foram alimentados com dieta padrão sólida para ratos (Panlab). Água de bebida e alimento ficaram disponíveis ad libitum. Foram iniciados tratamentos de acordo com o desenho experimental depois de um período de ajuste de 7 dias.
(047) 11.3. Desenho experimental (048) Usou-se o modelo de hipertensão induzida por N-nitro-L-argininometiléster (L-NAME) para determinar o efeito do azeite de oliva extravirgem fortificado (EVOO adicionado com o extrato de oliveira de acordo com a presente invenção). Depois do período de ajuste, mas antes de iniciar o tratamento da hipertensão induzida por LNAME, mediram-se os registros basais de pressão sanguínea arterial (D0) com equipamento Letica 5002.
(049) Os animais foram tratados de acordo com um desenho experimental, conforme mostrado na Tabela 4, a seguir:
Tabela 4.
| GRUPO | Água de bebida com L-NAME* | Gavagens orais | Observações |
| 1 | Não | Não | Sem indução de hipertensão |
| 2 | 40 mg de L- NAME/kg* | Não | Indução de hipertensão (controle negativo) |
| 3 | 40 mg de L- NAME/kg* | 0,2 mL de azeite de oliva extravirgem (EVOO) | Indução de hipertensão paralelamente à administração de azeite de oliva |
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| extravirgem (EVOO), que contém naturalmente 5,7 ppm de HT/kg de EVOO | |||
| 4 | 40 mg de L- NAME/kg* | 0,2 mL de EVOO fortificado, que foi adicionado com azeite de oliva de acordo com a invenção, consequentemente resultando em consumo diário de 5 mg de HT/kg PC | Indução de hipertensão paralelamente à administração de EVOO fortificado, o que resulta em consumo diário de 5 mg/kg (PC) de HT |
| 5 | 40 mg de L- NAME/kg* | 0,2 mL de EVOO fortificado, que foi adicionado com azeite de oliva de acordo com a invenção, consequentemente resultando em consumo diário de 8 mg de HT/kg PC | Indução de hipertensão paralelamente à administração de EVOO fortificado, que resulta em consumo diário de 8 mg de HT/kg (PC) |
| 6 | 40 mg de L- NAME/kg* | 100 mg de captopril/kg | Controle positivo: Indução de hipertensão paralelamente à administração de 100 mg de captopril (agente redutor de pressão sanguínea) |
| (050) *: O tratamento com L-NA | ME foi administrado a todos os grupos através do |
consumo de água de bebida, disponível ad libitum, considerando-se um peso corporal de 200 g por animal e padronizando-se o suprimento médio de água de bebida para o animal em 40 mL/dia (desconhecia-se o consumo real de água de bebida).
(051) 11.4. Cronograma de atividades (052) Para fazer com que os ratos se habituassem, foram feitas medições da pressão sanguínea arterial usando-se o registro de pulsações da artéria caudal com equipamento Letica 5002 que foi feito durante o período de ajuste.
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42/54 (053) O cronograma das medições/tratamentos experimentais foi resumido na
Tabela 5, a seguir:
Tabela 5.
| Dia | Medições de pressão sanguínea arterial | Água de bebida suplementada com LNAME | Gavagens orais |
| 0 | Sim | Sim | Não |
| 1 | Não | Sim | Sim |
| 2 | Sim | Sim | Sim |
| 3 | Não | Sim | Sim |
| 4 | Sim | Sim | Sim |
| 5 | Não | Sim | Sim |
| 6 | Não | Sim | Sim |
| 7 | Sim | Sim | Sim |
(054) 11.5. Determinação de pressão sanguínea arterial (055) A pressão sanguínea arterial foi medida periodicamente, de acordo com o cronograma acima, pelo método cauda-manguito. Antes da medição, os ratos foram mantidos em 37°C por 10 min para tornar detectáveis as pulsações da artéria caudal. O equipamento usado no presente estudo, LE 5002 (Letica, Hospitalet, Barcelona, Espanha) possui um transdutor de pulso de alta sensibilidade acoplado a um programa de microprocessador acurado e permite medições acuradas de pressão sanguínea arterial. As medições de pressão sanguínea arterial foram realizadas no mesmo horário do dia para evitar qualquer influência no ciclo circadiano.
(056) 11.6. Análise estatística
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43/54 (057) Os dados estão expressos como médias ± erro-padrão das médias (EPM) e foram analisados usando-se o software Sigma Stat (Versão 2.03).
(058) 11.7. Discussão (059) A figura 10 mostra a correlação entre os valores detectados de pressão sanguínea e os animais, dividida de acordo com os diferentes esquemas de tratamento. De acordo com tal figura, o grupo 1 de animais não exibiu hipertensão, enquanto que o grupo 2 de animais exibiu valores altos e crescentes de pressão sanguínea, induzidos pelo tratamento com L-NAME. O grupo 6 de animais (controle positivo), em uníssono com indução de hipertensão por L-NAME, foi tratado com captopril, um agente redutor de pressão sanguínea conhecido e altamente eficiente, e exibiu redução significativa nos valores de pressão sanguínea. O grupo 3 de animais, em uníssono com a indução de hipertensão por L-NAME, foi tratado com azeite de oliva extravirgem (EVOO), enquanto que os grupos 4 e 5 de animais, em uníssono com a indução de hipertensão por L-NAME, foram tratados com azeite de oliva extravirgem fortificado (EVOO fortificado). Os níveis de pressão sanguínea dos grupos 4 e 5 de animais foram significativamente mais baixos que os do grupo 3 de animais, consequentemente resultando em melhor ação na hipertensão, explorada pelo azeite de oliva extravirgem fortificado de acordo com a presente invenção com relação à ação explorada pelo EVOO não-fortificado.
(060) Os resultados indicados acima são bastante interessantes, pois hipertensão arterial está entre os fatores de risco associados com acúmulos de placa aterosclerótica nas artérias e síndrome metabólica. O efeito que o azeite de oliva extravirgem fortificado com extrato de oliveira de acordo com a presente invenção possui na pressão sanguínea arterial tem sido estudado e comparado com grupos controle que não receberam o tratamento com extrato de oliveira. Considerando-se
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44/54 as medições de pressão sanguínea sistólica (figura 10), pode-se concluir que o extrato de oliveira e a administração regular do produto nutricional que contém extrato de oliveira de acordo com a invenção, exibe atividade anti-hipertensiva que, em maior ou menor extensão, impede a ocorrência de eventos cardiovasculares. Portanto, pode-se muito bem considerar o produto nutricional que contém extrato de oliveira de acordo com a invenção como um suplemento dietético promotor de saúde e este pode constituir uma estratégia bem-sucedida para produzir alimentos funcionais, como azeite de oliva extravirgem fortificado com atividade antihipertensiva.
(061) EXEMPLO 12 (062) Uso de extrato de oliveira rico em hidroxitirosol altamente puro na prevenção ou tratamento de doenças cardiovasculares (063) 12.1. Animais (064) Trinta e dois ratos Sprague Dawley machos (peso de aproximadamente 150180 g) foram obtidos a partir de Harlan Interfauna Iberica SA (Barcelona, Espanha) e mantidos durante todo o experimento nas instalações do serviço de animais da Universidade de Murcia. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos experimentais de 8 ratos cada um e cada subgrupo de 4 ratos foi abrigado sob condições padrão de iluminação (ciclos de dia/noite de 12 h), temperatura (22 ± 2oC) e umidade (60%).
(065) 12.2. Dietas (066) As dietas usadas nesse estudo foram como se segue:
(067) DIETA CONTROLE (C): 97% de dieta padrão de ratos (Panlab), acrescidos de 3% de óleo refinado de girassol.
(068) DIETA ATEROGÊNICA (A): 95,5% de dieta padrão de ratos (Panlab),
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45/54 acrescidos de 1,5% de colesterol (Aldrich) e 3% de banha suína para produzir aterosclerose.
(069) DIETA ATEROGÊNICA + GAVAGEM ORAL (8 mg de HT/kg (PC)) DE HIDROXITIROSOL (A-G8): 95,5% de dieta padrão de ratos (Panlab), acrescidos de 1,5% de colesterol (Aldrich) e 3% de banha suína para produzir aterosclerose mais gavagem oral de extrato de hidroxitirosol (8 miligramas de hidroxitirosol/kg de peso corporal), tendo sido administrada por meio de gavagens orais para suprir 8 miligramas de hidroxitirosol (HT)/kg de peso corporal a cada rato.
(070) Água de bebida e alimento ficaram disponíveis ad libitum. Entretanto, o suprimento alimento alimentar médio para cada animal foi padronizado em 30 g/dia (desconheceu-se o consumo alimentar real por animal) por todo o estudo. Para evitar oxidação de gorduras, todas as dietas foram preparadas diariamente por meio da mistura de quantidades certas de dieta padrão de ratos (Panlab) e gorduras/óleos e manutenção em 4°C no escuro até o uso, e retirou-se a dieta nãoconsumida no dia anterior.
(071) As concentrações de hidroxitirosol (HT) na dieta A-G8 usada no estudo foram medidas por meio de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
(072) 12.3. Desenho experimental (073) O desenho experimental está exibido na Tabela 6, a seguir:
Tabela 6.
| GRUPO | Dos dias 1 a 30 | Dos dias 31 a 60 | Observações |
| 1 | Dieta C | Dieta C | Dieta resultante: CC (dieta controle) |
| 2 | Dieta A | Dieta A | Dieta resultante: AA (Dieta aterogênica- controle negativo) |
| 3 | Dieta A | Dieta C | Dieta resultante: AC (Efeito da dieta controle após uma dieta aterogênica) |
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| 4 | Dieta A-G8 | Dieta A-G8 | Dieta resultante: AG8-AG8 (Efeito de HT em 8 mg/kg (PC) com dieta aterogênica) |
(074) Os grupos de animais tratados com as dietas CC, AA, AC e A-G8 foram alimentados como se segue:
(075) Os grupos de animais tratados com as dietas CC ou AA, respectivamente, foram alimentados por 2 meses com as dietas C ou A.
(076) O grupo de animais tratados com a dieta AC foi alimentado por 1 mês com a dieta A (dieta aterogênica, controle negativo), seguido por um mês adicional com a dieta C (em que se forneceu apenas dieta padrão para ratos (Panlab), sem adição de óleo de girassol).
(077) O grupo de animais tratados com a dieta AG8-AG8 foi alimentado por 2 meses com A-G8 (dieta aterogênica mais gavagem de 8 mg/kg de HT).
(078) No final do experimento, os animais em jejum foram anestesiados e, imediatamente após a eutanásia, realizou-se uma punção intracardíaca para coletar sangue em tubos. Separou-se plasma por meio de centrifugação para análise.
(079) 12.4. Análise estatística (080) Os dados estão expressos como médias ± erro-padrão das médias (EPM) e foram analisados por meio de ANOVA unidirecional. Diferenças entre os grupos foram avaliadas por meio do teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas quando os valores p ficaram < 0,05. Os dados foram analisados usando-se o software Sigma Stat (Versão 2.03).
(081) 12.5. Discussão (082) Os resultados obtidos estão exibidos na figura 11 anexa, em que o índice aterogênico foi correlacionado com diferentes grupos de animais que, como já foi dito, estão indicados na Tabela 6.
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47/54 (083) A figura 11 mostra a correlação entre o índice aterogênico e os animais, dividida de acordo com os diferentes esquemas dietéticos. De acordo com tal figura, o grupo 1 de animais tratados com a dieta CC (dieta controle) mostra o valor mais baixo de índice aterogênico, enquanto que o grupo 2 de animais tratados com a dieta AA (dieta aterogênica-controle negativo) mostra o mais alto, com a diferença do valor de índice aterogênico entre os grupos 1 e 2 sendo estatisticamente significativa, com valor p < 0,001. Mostra-se um resultado interessante de acordo com o grupo 4 de animais, que, nesse experimento, foram tratados com a dieta AG8. Não se observou diferença estatisticamente significativa no valor de índice aterogênico entre os grupos 4 e 1. Em outras palavras, após dois meses de tratamento com a dieta aterogênica mais gavagem de extrato de oliveira rico em hidroxitirosol, observou-se um valor de índice aterogênico inalterado, comparável ao nível obtido com a dieta controle, no caso dos grupos de animais A-G8. Contrariamente, não se observou o mesmo efeito quando se forneceu uma dieta padrão de ratos aos animais do grupo 3 no mês após o primeiro mês de tratamento com a dieta aterogênica (grupo 3 de animais). Nesse caso, o valor de índice aterogênico (mesmo com a diferença com o grupo 2 controle negativo sendo estatisticamente significativa) resultou em uma diferença estatisticamente significativa com relação ao valor de índice aterogênico detectado no caso dos animais alimentados com a dieta controle (grupo 1), com valor p < 0,05. O nível de índice aterogênico derivado do grupo 4 de animais sugere um efeito preventivo devido ao extrato de oliveira rico em hidroxitirosol obtido de acordo com a presente invenção.
(084) Considerando todos os parâmetros medidos, pode-se concluir que a administração regular do extrato de oliveira de acordo com a presente invenção
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48/54 protege o sistema cardiovascular, o que, em maior ou menor extensão, impede a ocorrência de alguns dos fatores de risco que são considerados associados com acúmulos de placa aterosclerótica nas artérias e síndrome metabólica e, portanto, ele pode ser muito bem considerado um extrato natural promotor de saúde para ser usado na preparação de suplementos dietéticos.
(085) Como mencionado anteriormente, o óleo comestível da invenção mantém as propriedades organolépticas originais, ou seja, não ocorre aumento no valor de amargor e não há subprodutos da hidrólise de polifenóis complexos (por exemplo, oleuropeína, que é um éster de hidroxitirosol), tais como oleuropeína-aglicona (por exemplo, forma aldeídica da oleuropeína-aglicona), e açúcares (por exemplo, glicose, que é o açúcar presente na oleuropeína).
(086) A seguir há uma explicação dos testes de qualidade realizados normalmente em óleos, nominalmente azeites de oliva.
1) Acidez (087) A acidez expressa o teor porcentual (em peso) de ácidos graxos livres no óleo sob exame. Ácidos graxos livres também estão normalmente presente em óleos obtidos a partir de oliveiras sadias; quando se forma triglicerídeos, ocorre aumento progressivo na acidez devido à ação de enzimas (lipases) naturalmente presentes na fruta, que ajudam os ácidos graxos a se destacarem da molécula de triglicerídeo (lipólise). O mesmo fenômeno lipolítico pode ser causado por enzimas produzidas por micro-organismos que crescem sobre a fruta. Logo, para obter um produto que seja organolepticamente melhor e apresente acidez mais baixa, é necessário preservar bem as oliveiras na armazenagem.
(088) 2) Valor de peróxido (089) O teor de peróxidos no óleo sob exame é expresso por meio do valor de
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49/54 peróxido. Quanto maior for o número, maior será a degradação devida a oxidação do óleo. Por sua vez, os peróxidos ficam sujeitos a oxidação adicional, que dá origem à formação de outros compostos, que são determináveis em maneiras diferentes (aldeídos, cetonas, etc.). Esses compostos, chamados de compostos de oxidação secundária, são responsáveis por deixar o óleo rançoso. Devido à oxidação e às enzimas presentes no tecido da fruta (lipo-oxigenases), uma certa concentração de peróxidos já está presente na fruta antes da prensagem. Circunstâncias naturais particulares (por exemplo, temperaturas abaixo do congelamento, infestações por Dacus, seca, etc.) ou oliveiras incorretamente colhidas e preservadas podem estimular formação adicional de peróxidos. Mesmo durante a moagem, os peróxidos podem aumentar enormemente através de um mau processamento ou devido a higiene incorreta na prensa de oliveiras e/ou nos recipientes. Finalmente, uma exposição prolongada de óleo a fontes de luz ou calor constitui outra causa do aumento de peróxidos. Estes são determinados através de titulação.
(090) 3) Investigação espectrofotométrica em ultravioleta (091) Este teste consiste em medir três parâmetros (K232, K270, ΔΚ) determinados durante o mesmo procedimento analítico. Quanto maior for o valor de K232, maior será a concentração de dienos conjugados, enquanto que K270 é proporcional à concentração de trienos conjugados. No entanto, compostos de oxidação dos dienos conjugados contribuem para K232, enquanto que compostos de oxidação secundária (aldeídos, cetonas, etc.) contribuem para K270.
(092) É por essa razão que, se o valor de K270 exceder o limite da categoria ao qual se acredita que o óleo pertença, os regulamentos da CE proporcionam um prétratamento particular da amostra (com alumina) antes de um segundo teste
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50/54 espectrofotométrico. Se o valor novo exceder esse limite, o óleo deve ser declarado como impuro.
(093) 4) Gosto amargo (094) Este teste é realizado de acordo com Gutierrez et al (J. Am. Oil. Chem. Soc. 1992, 69(4), 394-395), que descobriram uma correlação linear entre a absorbância em 225 nm (teste K225) e o gosto amargo do óleo.
(095) A experiência tem mostrado que podem surgir problemas para o consumo direto do óleo quando o valor de K225 exceder 0,300 ou mais. Além disso, valores de K225 da ordem de 0,360 ou acima correspondem a óleos bastante amargos, que são rejeitados pela maior parte dos consumidores.
(096) EXEMPLO 13 (097) Exemplo comparativo: preparação de azeite de oliva extravirgem fortificado com diferentes fontes de polifenóis de oliveira (098) Para propósitos comparativos, escolheram-se uma amostra de extrato de oliveira purificado obtido com um processo de acordo com o Exemplo 1 e amostras comerciais de extrato de oliveira provenientes de folhas de oliveira e da água de vegetação de moagem de oliveira para a fortificação de azeite de oliva extravirgem. As especificações de cada extrato estão exibidas na Tabela C1, a seguir:
Tabela C1
| Extrato | [HT], % | [oleuropeína ], % | pureza de HT (por HPLC em 280 nm) | Solvente orgânica residual, ppm |
| extrato de oliveira purificado (de acordo com Exemplo 1) | 34,5 | N.D. | 93,4 | N.D. |
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| Extrato de folha de oliveira | 0,4 | 35,6 | 5,2 | Etanol: 156 ppm |
| Água de vegetação de | 2,5 | 0,2 | 51,3 | Acetona: 105 |
| moagem de oliveira | ppm |
N.D.: não-detectado (099) Obteve-se um frasco de 3 L de azeite de oliva extravirgem (Hojiblanca) a partir do supermercado e usou-se o mesmo para os diferentes estudos.
(0100) Verteram-se 4 amostras, de 500 mL cada, de cada azeite de oliva extravirgem em béqueres de vidro. E acrescentaram-se os diferentes extratos de acordo com a Tabela C2, a seguir:
Tabela C2
| Extrato | Peso de extrato adicionado, g | Aumento teórico máximo de [HT] no óleo, ppm |
| A) extrato de oliveira purificado (de acordo com Exemplo 1) | 0,1 | 69 |
| B) Extrato de folha de oliveira | 20 | 160 |
| C) Água de vegetação de moagem de oliveira | 20 | 1000 |
| D) Sem adição de extrato (controle) | _ | _ |
Depois, realizou-se cada teste A, B, C e D, como se segue:
A) Acrescenta-se 0,11 g de extrato de oliveira purificado (de acordo com o Exemplo
1) na forma líquida aos 500 mL de amostra de azeite de oliva extravirgem e misturase por meio de mexida suave em 100 rpm. Depois de 30 minutos, forma-se uma pré-emulsão. A pré-emulsão é alimentada no depósito alimentador do homogeneizador, que opera de acordo com um processo de estágios duplos de homogeneização. A homogeneização da pré-emulsão, operada em pressão de 300/30 bar para o 1o estágio/2o estágio, respectivamente, permite que se obtenha uma emulsão estável.
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B) Acrescentaram-se 20 g de extrato de folha de oliveira aos 500 mL de amostra de azeite de oliva extravirgem e misturaram-se magneticamente por 2 h em 60°C (para comparação com o Exemplo comparativo 1 de IT1326553). Depois de se concluir o tratamento de aquecimento, a amostra apresenta coloração verde-escura e ainda contém muito material sólido. Depois, decanta-se o sólido e resfria-se o óleo em temperatura ambiente e, finalmente, centrifuga-se a amostra para remover os sólidos.
C) Acrescentaram-se 20 g de água de vegetação de moagem de oliveira aos 500 mL de amostra de azeite de oliva extravirgem e misturaram-se magneticamente por 2 h em 60°C (para comparação com o Exemplo comparativo 3 de IT1326553). Depois de se concluir o tratamento de aquecimento, a amostra ainda contém muito material sólido. Depois, decanta-se o sólido e resfria-se o óleo à temperatura ambiente e, finalmente, centrifuga-se a amostra para remover os sólidos.
Depois disso, usou-se uma alíquota de cada uma das 4 amostras, 3 amostras de azeite de oliva extravirgem fortificado (amostras A, B e C) e 1 amostra controle de azeite de oliva extravirgem (amostra D), para medir o índice de amargor (K225), medido de acordo com Gutierrez et al. (J. Am. Oil. Chem. Soc. 1992, 69(4), 394395), e os teores de hidroxitirosol e oleuropeína por meio de HPLC. Os resultados estão resumidos na Tabela C3, a seguir:
Tabela C3
| Extrato | K225 | [HT] no óleo, ppm. | [oleuropeína] no óleo, ppm. | Rendimento da incorporação de HT no óleo, % |
| A) Extrato de oliveira purificado (de acordo com o Exemplo 1) | 0,24 | 71 | N.D. | 92,8 |
| B) Extrato de folha de oliveira | 0,35 | 28 | 10 | 13,1 |
| C) Água de | 0,32 | 38 | 1 | 3,1 |
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| vegetação de moagem de oliveira | ||||
| D) Sem adição de extrato (controle) | 0,25 | 7 | N.D. | — |
(0101) O teste preliminar relacionado com a tabela acima mostrou que a origem e a pureza do extrato de oliveira são críticos para aumentar o nível de hidroxitirosol, enquanto evita a alteração das propriedades organolépticas do óleo, causando gosto desagradável, por causa de amargor e/ou adstringência excessivos.
(0102) Além disso, o uso de extratos de folha de oliveira e extratos de água de vegetação de moagem de oliveira e o uso das técnicas mencionadas acima (aquecimento em 60°C por 2 horas), de acordo com a patente IT 1326553, são rudes demais, tecnicamente complexos e não práticos (muito extrato sólido permanece no óleo após o tratamento) ou não economicamente viáveis (teor muito baixo de hidroxitirosol incorporado no azeite de oliva) para o campo alimentício. Além disso, a quantidade de hidroxitirosol incorporado no óleo vegetal é baixo demais para proteger efetivamente LDL contra modificação oxidativa em qualquer extensão importante.
(0103) EXEMPLO 14 (0104) Exemplo comparativo; determinação das propriedades organolépticas de óleos comestíveis fortificados com diferentes extratos.
(0105) As amostras A-C e o controle de acordo com o Exemplo 13, foram testadas quanto às seguintes propriedades de qualidade, resumidas na Tabela C4.
Tabela C4
| Extrato | Acidez livre, como % de ácido oleico NMT 0,8% | Índice de peróxido, como mEq O2/kg NMT 20 | K270, NMT 0,22 | K232, NMT 2,5 |
| A) extrato de oliveira purificado (de acordo com o | 0,22 | 7 | 0,17 | 1,76 |
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| Exemplo 1) | ||||
| B) Extrato de folha de oliveira | 0,35 | 9,5 | 0,27 | 2,13 |
| C) Água de vegetação de moagem de oliveira | 0,40 | 7,9 | 0,18 | 1,91 |
| D) Sem adição de extrato (controle) | 0,22 | 7,2 | 0,15 | 1,85 |
Foram encontradas alterações em parâmetros de qualidade, nomina mente valor de acidez livre, valor de peróxido, K270 e K232. O valor de K270 de 0,27 para o azeite de oliva fortificado com extratos de folha de oliveira é bastante alto e excede o valor máximo aceito para os azeites de oliva extravirgens, de acordo com o Regulamento da comissão (CE) N° 702/2007, de 21 de Junho de 2007.
Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES1. “PRODUTO NUTRICIONAL”, que é um óleo comestível, que apresenta valor de K225 de 0,28 ou menos, caracterizado por ter um teor de pelo menos 30 ppm de hidroxitirosol e um teor de forma aldeídica de oleuropeínaaglicona de menos de 120 ppm.
- 2. “PRODUTO NUTRICIONAL”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter de 30 a 300 ppm de hidroxitirosol, preferivelmente de 50 a 60 ppm de hidroxitirosol.
- 3. “PRODUTO NUTRICIONAL”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter de 300 a 30000 ppm de hidroxitirosol.
- 4. “PRODUTO NUTRICIONAL”, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo óleo ser um óleo vegetal preferivelmente selecionado a partir de azeite de oliva virgem, azeite de oliva extravirgem, azeite de oliva, azeite de oliva para iluminação, azeite de oliva refinado, azeite de oliva-bagaço bruto, azeite de oliva-bagaço refinado, óleo de girassol, óleo de milho, óleo de soja, óleo de semente de linho, óleo de amêndoa, óleo de canola, óleo de cártamo, óleo de palmeira, óleo de coco, óleo de colza, derivados tecnologicamente modificados dos óleos mencionados acima ou misturas de dois ou mais dos mesmos.
- 5. “PRODUTO NUTRICIONAL”, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo óleo ser um óleo marinho ou de peixe obtido preferivelmente a partir de várias fontes, tais como algas, krill, savelha, anchova, atum, arenque, sardinha, cavala, bacalhau, derivados tecnologicamente modificados dos óleos mencionados acima ou misturas de dois ou mais dos mesmos.
- 6. “PRODUTO NUTRICIONAL”, que é um produto alimentício que contém um óleo comestível, de acordo com qualquer reivindicação 1 a 5,Petição 870190078363, de 13/08/2019, pág. 4/62/3 caracterizado por conter 30 a 300 ppm de hidroxitirosol.
- 7. “PRODUTO NUTRICIONAL”, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ser selecionado a partir de margarina, maionese, maionese com alho, sopa gazpacho, molhos para passar no pão e molhos de salada.
- 8. “PRODUTO NUTRICIONAL”, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser um suplemento dietético, na forma de uma cápsula de gel mole, que encapsula um óleo comestível.
- 9. “PRODUTO NUTRICIONAL”, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado pela prevenção ou tratamento de doenças cardiovasculares.
- 10. “PRODUTO NUTRICIONAL”, de acordo com as reivindicações 1 a8, caracterizado pela prevenção ou tratamento de acúmulo de placa nas artérias.
- 11. “PRODUTO NUTRICIONAL”, de acordo com as reivindicações 1 a8, caracterizado pela prevenção ou tratamento de síndrome metabólica.
- 12. “PRODUTO NUTRICIONAL”, de acordo com as reivindicações 1 a8, caracterizado pela prevenção ou tratamento de hipertensão arterial.
- 13. “PROCESSO PARA PREPARAR UM PRODUTO NUTRICIONAL”, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender mistura de uma solução aquosa que contém hidroxitirosol com tal óleo e decantação da fase aquosa, opcionalmente na presença de emulsificantes e, opcionalmente, realizando uma homogeneização.
- 14. “PROCESSO”, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que tal homogeneização é realizada em um primeiro e um segundo estágio, com tal primeiro estágio sendo realizado em pressão entre 200 e 700 bar e tal segundo estágio sendo realizado em pressão entre 30 e 50 bar,Petição 870190078363, de 13/08/2019, pág. 5/63/3 preferivelmente com tal primeiro estágio sendo realizado em pressão entre 300 e500 bar e tal segundo estágio sendo realizado em pressão de 30-35 bar.
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