ITMI20131814A1 - Uso antiangiogenico di fitocomplessi liquidi da olive - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

“USO ANTIANGIOGENICO DI FITOCOMPLESSI LIQUIDI DA OLIVE”

La presente invenzione riguarda l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento dell’angiogenesi e/o dell’infiammazione di un fitocomplesso naturale ricco di composti polifenolici, in particolare ricco di idrossitirosolo e di 3,4-DHPA-EDA, derivato dalle acque di spremitura delle olive da olio (comunemente note come acque di vegetazione) o da sanse olearie residue del processo di molitura delle olive.

In particolare, l’angiogenesi e/o l’infiammazione a cui si fa riferimento è di tipo patologico, per esempio quella che sostiene lo sviluppo e la diffusione di un tumore oppure l’angiogenesi e/o l’infiammazione legata a patologie di tipo non tumorale.

L’angiogenesi è un processo fisiologico che si verifica durante le fasi di crescita e sviluppo dell’individuo e comporta la formazione di nuovi vasi sanguigni a partire da quelli del compartimento vascolare pre-esistente.

L’angiogenesi è un processo che caratterizza anche diversi fenomeni patologici tra cui i tumori.

Una massa tumorale (o neoplastica) può crescere e svilupparsi autonomamente fino a dimensioni di circa 1-2 mm<3>, tuttavia, per crescere ulteriormente, deve garantirsi il vitale apporto di nutrienti ed ossigeno e quindi ha la necessità di crearsi un proprio compartimento vascolare.

Il tumore è in grado di secernere fattori angiogenici, come VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) e PDGF (Platelet-Derived Growth Factor), in grado di promuovere lo sviluppo di vasi sanguigni. I fattori angiogenici secreti dal tumore attivano le cellule endoteliali che in risposta cominciano a proliferare e a secernere sostanze che degradano la matrice cellulare e le membrane basali (es. matrix metalloproteases-MMP) per migrare e invadere i tessuti circostanti. Successivamente le cellule endoteliali si organizzano a formare delle strutture tubulari stabilizzate dalla presenza dei periciti, ovvero cellule contrattili che circondano i vasi sanguigni neo-formati, in grado di modificare il flusso ematico e di regolare la permeabilità vasale.

I vasi sanguigni di derivazione tumorale sono irregolari e sono caratterizzati da elementi strutturali che li distinguono dai vasi “normali”. Per esempio essi sono caratterizzati dall’assenza di periciti, da ampie fenestrature ed da una forte dilatazione vasale. Queste caratteristiche alterano la permeabilità e i livelli pressori dei vasi e di conseguenza interferiscono anche con la veicolazione dei farmaci anti-tumorali che, invece di raggiungere il tumore, vengono dispersi nel liquido interstiziale e pertanto non riescono ad espletare la loro funzione.

Considerata l’importanza dell’angiogenesi nei processi di sviluppo, accrescimento e metastatizzazione dei tumori, sono stati condotti numerosi studi atti ad identificare sostanze che siano in grado di bloccare lo sviluppo irregolare dei vasi sanguigni tumorali e quindi che siano in grado di migliorare la veicolazione dei farmaci al sito tumorale. In particolare, grandi sforzi sono stati fatti allo scopo di identificare molecole che siano in grado di prevenire lo sviluppo anomalo dei vasi sanguigni portando alla formulazione del concetto di “angioprevenzione”(ovvero prevenire l'angiogenesi di tipo tumorale).

La maggior parte di queste molecole sono di origine naturale (o comunque loro analoghi sintetici). Un esempio molto interessante è rappresentato dalle molecole derivanti dall’olio d’oliva.

E’ ben noto, infatti, che i tassi di incidenza delle patologie cardiovascolari e dei tumori siano notevolmente ridotti a livello di popolazioni che adottano la dieta mediterranea basata sul consumo di olio di oliva. Questa evidenza scientifica, ha incentivato notevolmente lo studio dell’olio d’oliva al fine di definire la sua composizione ed, in particolare, al fine di identificare le sostanze con un potenziale medico-farmacologico.

Una caratteristica dell’olio di oliva che ha destato particolare interesse è stato l’alto livello di polifenoli in esso contenuti. Questi composti sono antiossidanti naturali, di origine vegetale, in grado di inibire la formazione di radicali liberi.

Le benefiche proprietà dell’olio di oliva hanno indotto un notevole incremento, soprattutto in Italia, della sua coltura e della sua produzione. Di conseguenza si è assistito anche ad un forte incremento di derivati collaterali della produzione di olio di oliva, principalmente le acque di vegetazione e le sanse, che sono caratterizzate da un elevato carico inquinante e quindi generano un notevole impatto ambientale.

Lo smaltimento di questo materiale è rigorosamente regolamentato sia a livello nazionale che regionale e l'attuazione della normativa (legge 574 dell’11/1196) comporta pesanti spese da parte dei produttori che non riescono a trarre alcun vantaggio da questi prodotti di scarto, che tuttavia sono ricchi di molecole dall’alto potenziale medico-farmaceutico.

L’idrossitirosolo è il polifenolo contenuto nelle acque di vegetazione maggiormente studiato. Esso è presente nelle acque di vegetazione e nelle sanse e si forma anche dall’idrolisi dell’oleuropeina, una sostanza presente soprattutto nelle foglie degli ulivi.

Recenti ricerche hanno dimostrato che l’idrossitirosolo da solo ha un effetto citoprotettivo nei confronti delle cellule PC12 (una linea cellulare di feocromocitoma), è anti-apoptotico quando somministrato alle cellule U937 (una linea mielomonocitica umana) e alle C2C12 (una linea di mioblasti murini), inibisce in vivo la proliferazione tumorale mammaria nel caso di neoplasie indotte, è un chemopreventivo in studi sulle linee di tumore HL60 e HL60R (una linea di leucemia promielocitica umana e la sua derivata multi-drug resistant) ed è preventivo della sindrome premestruale e dell’osteoporosi.

Inoltre, è stato dimostrato che la somministrazione in vivo di idrossitirosolo (anche a concentrazioni elevate) non ha alcun effetto tossico.

Altre ricerche hanno dimostrato che l’oleuropeina quando somministrata da sola svolge un’attività anti-microbica, ha un potenziale anti-tumorale in linee cellulari di tumore colorettale, in tumori mammari metastatici e in linee cellulari ER-negative ed ha la capacità di alterare la stabilità cellulare a livello di citoscheletro.

Sebbene siano state avviate molte ricerche sulle acque di vegetazioni è ancora molto sentita l’esigenza di identificare nuove proprietà che possano dare un valore a questi prodotti di scarto che diversamente sarebbero solo un costo per il produttore ed un pericolo per l’ambiente. Particolarmente sentita è l’esigenza di individuare nuove proprietà nutrizionali e/o medicofarmacologiche che nobilitino questo prodotto di scarto.

A tale riguardo, la Richiedente ha sorprendentemente trovato che le acque di vegetazione sono in grado di bloccare/prevenire, in vitro ed in vivo, l’angiogenesi e/o l’infiammazione, in particolare l’angiogenesi e/o l’infiammazione patologica, per esempio quella che sostiene lo sviluppo e la diffusione di un tumore oppure l’angiogenesi e/o l’infiammazione associata alle patologie non tumorali.

In particolare, la Richiedente ha trovato che, concentrando mediante osmosi inversa il permeato di acque di vegetazioni sottoposte a microfiltrazione, si ottiene un fitocomplesso ricco di composti polifenolici in grado di prevenire e/o bloccare l’angiogenesi e/o l’infiammazione, in particolare l'angiogenesi e/o l’infiammazione patologica come quella/e associata/e ad un tumore oppure quella/e associata/e ad una patologia non tumorale, in una maniera più efficace rispetto a quanto riescono a fare gli stessi composti polifenolici presi singolarmente, cioè isolati dalle acque di vegetazione e/o sanse mediante tecniche di purificazione.

Questo effetto risulta particolarmente vantaggioso per la salute umana soprattutto in termini di angioprevenzione. Infatti, a tale scopo il concentrato di acque di vegetazione della presente invenzione, da solo od in associazione con ulteriori sostanze antitumorali e/o antiangiogeniche e/o antiinfiammatorie, possono essere utilizzate, per esempio in forma di bevanda, per trattare o prevenire l'angiogenesi e/o l’infiammazione, in particolare l’angiogenesi e/o l’infiammazione patologica associata ad un tumore oppure l’angiogenesi e/o l’infiammazione patologica associata ad una malattia non tumorale.

Ulteriori vantaggi della presente invenzione saranno evidenti della descrizione dettagliata a seguire che è fatta con l'ausilio delle annesse Figure di cui:

− La Figura 1 mostra i risultati del saggio MTT ai fini della valutazione della proliferazione delle cellule HUVE a seguito del trattamento con diluizioni progressive di: A) concentrato polifenolico della presente invenzione (il campione A009); B) bianco (il campione A012); C) idrossitirosolo purificato (HyT); e D) bianco dell’idrossitirosolo purificato (cioè etanolo- EtOH).

− La Figura 2 mostra i risultati del saggio di apoptosi e di morte delle cellule HUVE a seguito del trattamento con diluizioni progressive di:

A,C) concentrato polifenolico della presente invenzione (il campione A009); B,D bianco (il campione A012) a 24 e 48 ore dopo il trattamento.

− La Figura 3 mostra i risultati del saggio di apoptosi e di morte delle cellule HUVE a seguito del trattamento con diluizioni progressive di: A,C) idrossitirosolo purificato (HyT); B,D bianco dell’idrossitirosolo purificato (cioè etanolo-EtOH) a 24 e 48 ore dopo il trattamento. La Figura 4 mostra i risultati del saggio di morfogenesi mediante valutazione della capacità delle cellule HUVE di formare strutture tubulari tipo-capillari su matrigel a seguito del trattamento con: A) terreno di coltura senza siero (SFM), terreno di coltura completo (CTRL), diluizioni 1:500 e 1:250 di concentrato polifenolico della presente invenzione (il campione A009), diluizioni 1:500 e 1:250 di bianco (il campione A012); B) terreno di coltura senza siero (SFM), terreno di coltura completo (CTRL), diluizioni 1:500 e 1:250 di idrossitirosolo purificato (HyT), diluizioni 1:500 e 1:250 di bianco dell’idrossitirosolo purificato (cioè etanolo-EtOH).

La Figura 5 mostra i risultati del saggio di chemiotassi delle cellule HUVE a seguito di trattamento con: A) terreno di coltura completo (CTRL), terreno di coltura senza siero (SFM), diluizioni progressive di concentrato polifenolico della presente invenzione (il campione A009), bianco (il campione A012); B) terreno di coltura completo (C+), terreno di coltura senza siero (SFM), diluizioni progressive di idrossitirosolo purificato (HyT), di bianco dell’idrossitirosolo purificato (cioè etanolo-EtOH).

La Figura 6 mostra i risultati del saggio di chemioinvasione delle cellule HUVE a seguito di trattamento con: A) terreno di coltura completo (CTRL), terreno di coltura senza siero (SFM), diluizioni progressive di concentrato polifenolico della presente invenzione (il campione A009), bianco (il campione A012); B) terreno di coltura completo (C+), terreno di coltura senza siero (C-), diluizioni progressive di idrossitirosolo purificato (HyT), di bianco dell’idrossitirosolo purificato (cioè etanolo-EtOH).

La Figura 7 mostra i risultati dello stress ossidativo (misurato come % di cellule DCFH-DA<+>) a carico delle HUVE trattate con H2O2prima del trattamento con A) diluizioni progressive di concentrato polifenolico della presente invenzione (il campione A009) e rispettivo bianco (il campione A012); B) diluizioni progressive di idrossitirosolo purificato (HyT) e rispettivo bianco (cioè etanolo-EtOH).

− La Figura 8 mostra i risultati dello stress ossidativo (misurato come % di cellule DCFH-DA<+>) a carico delle HUVE trattate con H2O2a seguito di pre-trattamento con A) diluizioni progressive di concentrato polifenolico della presente invenzione (il campione A009) e rispettivo bianco (il campione A012); B) diluizioni progressive di idrossitirosolo purificato (HyT) e rispettivo bianco (cioè etanolo-EtOH).

− La Figura 9 mostra i risultati dell’analisi colorimetrica macroscopica di inoculi di matrigel impiantati sotto la cute di topi A) senza trattamento (matrigel alone), in presenza di VTH-VEGF,TGF,HGF (controllo positivo C+), in presenza di VTH e una diluizione 1:500 di concentrato polifenolico della presente invenzione (il campione A009) e rispettivo bianco (il campione A012); B) senza trattamento (matrigel alone), in presenza di VTH-VEGF,TGF,HGF (controllo positivo C+), in presenza di VTH e una diluizione 1:500 di idrossitirosolo purificato (HyT).

− La Figura 10 mostra il dosaggio dell’emoglobina negli inoculi di matrigel espiantati di Figura 9.

La presente invenzione riguarda un fitocomplesso o concentrato di acque di vegetazione e/o sanse comprendente composti polifenolici, preferibilmente idrossitirosolo e 3,4-DHPA-EDA, per uso nel trattamento e/o nella prevenzione dell’angiogenesi e/o dell’infiammazione.

Preferibilmente l'angiogenesi e/o l’infiammazione a cui si fa riferimento è l’angiogenesi e/o l’infiammazione patologica, più preferibilmente l’angiogenesi e/o l’infiammazione tumorale. Alternativamente l’angiogenesi e/o l’infiammazione è quella non tumorale associata a patologie come: patologie reumatiche, preferibilmente artrite reumatoide e gotta; patologie infiammatorie del colon-retto, preferibilmente morbo di Crohn, colon irritabile e colite; patologie bronchiali, preferibilmente bronco pneumopatia cronica ostruttiva e asma; patologie del fegato preferibilmente cirrosi e fibrosi; patologie della prostata, preferibilmente iperplasia prostatica e prostatite acuta/cronica; mucositi; dermatiti o lesioni preneoplastiche per esempio alla mammella, all'utero, al polmone o al cavo orale.

Infatti, il concentrato di acque di vegetazione e/o sanse della presente invenzione si è dimostrato, in maniera sorprendente, particolarmente efficace nella prevenzione della neo-formazione di vasi sanguigni (cioè l'angiogenesi) di tipo tumorale. Questi vasi hanno una struttura chimicofisica e di conseguenza anche un funzionamento biologico, distintivi rispetto ai normali vasi sanguigni. Essi sono largamente fenestrati, sono spesso privi di periciti e per questo hanno un'alterata permeabilità vasale. Questa struttura è spesso alla base del fallimento o comunque della difficoltà di molte cure farmacologiche perché il farmaco viene perso negli spazi interstiziali nel corso della veicolazione al tumore attraverso i vasi e quindi non arriva a destinazione o arriva in quantità inefficace. L'inibizione della formazione di questo tipo di struttura vasale chiaramente consente una migliore veicolazione delle sostanze al tumore e quindi la possibilità di migliorare la cura dei tumori.

Le acque di vegetazione sono preferibilmente derivanti da un processo di molitura delle olive a tre fasi (olio, acque di vegetazione e sanse), e/o a due fasi (olio e sanse acque di vegetazione). Preferibilmente, le acque di vegetazione generate dal frantoio possono essere trattate con una soluzione a pH acido, preferibilmente ad un pH che varia da 3 a 5, preferibilmente è 4/5, per esempio mediante l’aggiunta di un acido forte, e/o con enzimi pectolitici, ovvero enzimi che idrolizzano la matrice cellulosica della buccia di olive.

Le sanse sono preferibilmente denocciolate, diluite e/o prefiltrate. Le sanse hanno preferibilmente una pezzatura o taglio che varia da 0,5 a 1 millimetri (mm), più preferibilmente di circa 0,7 mm. Un esempio di taglio è quello ottenuto con vagliatura tipo vibro-vaglia.

Eventualmente la sansa denocciolata può essere solubilizzata o dispersa in una matrice acquosa a pH compreso fra 3 e 5, preferibilmente tra 3,5 e 4.

La fase di solubilizzazione ha lo scopo di solubilizzare i polifenoli che altrimenti resterebbero intrappolati nella matrice solida delle bucce di oliva. In una forma preferita di realizzazione dell'invenzione il concentrato di acque di vegetazione e/o sanse (a seguire “il concentrato”) comprende ulteriormente: almeno un ulteriore composto fenolico preferibilmente scelto tra: tirosolo, acido cloro genico, β-idrossiverbascoide, rutina, verbasco ide e luteolina; e/o almeno un metallo preferibilmente scelto tra: sodio, calcio, magnesio e potassio; e/o almeno un anione preferibilmente scelto tra: cloruri, solfati, fosfati e nitrati; e/o almeno un glucide scelto tra: glucosio, fruttosio, mannitolo e saccarosio.

In una ulteriore forma di realizzazione dell'invenzione il concentrato comprende sostanze azotate (proteine, aminoacidi), preferibilmente in una quantità compresa tra 15 e 60 mg/kg, più preferibilmente tra 20 e 40 mg/kg (mg di azoto per litro di soluzione attiva). In ogni caso i composti fenolici presenti nel concentrato in maggiore quantità sono l'idrossitirosolo e il 3,4-DHPA-EDA.

Preferibilmente la quantità dell'idrossitirosolo varia tra 1 e 10 grammi per litro di acque di vegetazione (g/L), più preferibilmente tra 1,5 e 5 g/L, ancora più preferibilmente tra 2 e 3 g/L.

Preferibilmente la quantità di 4-DHPA-EDA è compresa tra 0,5 e 8 g/L, più preferibilmente tra 1 e 6 g/L, ancora più preferibilmente tra 1,5 e 2,5 g/L. Preferibilmente la quantità di tirosolo è compresa tra 0,1 e 0,4 g/L, più preferibilmente tra 0,15 g/L e 0,25 g/L.

Preferibilmente la quantità di acido clorogenico è compresa tra 0,06 e 0,24 g/L, più preferibilmente tra 0,8 e 0,16 g/L.

Preferibilmente la quantità di tb-idrossiverbascoside è compresa tra 0,3 e 1,5, più preferibilmente tra 0,5 e 1 g/L.

Preferibilmente la quantità di rutina è compresa tra 0,05 e 0,2 g/L, più preferibilmente tra 0,08 e 0,15 g/L.

Preferibilmente la quantità di verbascoside è compresa tra 0,4 e 1,7 g/L, più preferibilmente tra 0,6 e 1 g/L.

Preferibilmente la quantità di luteolina è compresa tra 0,1 e 0,5 g/L, più preferibilmente tra 0,15 e 0,28 g/L.

Preferibilmente la quantità di sodio è compresa tra 75 e 300 mg/L, più preferibilmente tra 120 e 180 mg/L.

Preferibilmente la quantità di calcio è compresa tra 5 e 10 g/L, più preferibilmente tra 2 e 5 g/L.

Preferibilmente la quantità di magnesio è compresa tra 220 e 900 mg/L, più preferibilmente tra 400 e 500 mg/L.

Preferibilmente la quantità di potassio è compresa tra 3 e 15 g/L, più preferibilmente tra 6 e 9 g/L.

Preferibilmente la quantità di cloruri è compresa tra 1,5 e 7 g/L, più preferibilmente tra 2,5 e 4,5 g/L.

Preferibilmente la quantità di solfati è compresa tra 12 e 45 g/L, più preferibilmente tra 18 e 28 g/L.

Preferibilmente la quantità di fosfati è compresa tra 1,5 e 7 g/L, più preferibilmente tra 2,5 e 5 g/L.

Preferibilmente la quantità di nitrati è compresa tra 12 e 50 mg/L, più preferibilmente tra 18 e 30 mg/L.

Preferibilmente la quantità di glucosio è compresa tra 15 e 60 g/L, più preferibilmente tra 25 e 35 g/L.

Preferibilmente la quantità di fruttosio è compresa tra 3,5 e 15 g/L, più preferibilmente tra 5 e 9 g/L.

Preferibilmente la quantità di mannitolo è compresa tra 1 e 4 g/L, più preferibilmente tra 1,5 e 3 g/L.

Preferibilmente la quantità di saccarosio è compresa tra 4 e 16 g/L, più preferibilmente tra 6 e 10 g/L.

In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione il concentrato è ottenuto/ottenibile mediante un processo comprendente le fasi di: (i) microfiltrare un campione di acque di vegetazione e/o sanse in modo da ottenere un concentrato ed un permeato di microfiltrazione; e (ii) concentrare mediante osmosi inversa il permeato di microfiltrazione ottenuto dalla fase (i).

Preferibilmente la microfiltrazione è fatta dopo la fase di solubilizzazione come prima descritta.

La microfiltrazione ha lo scopo di separare un concentrato, ovvero la frazione concentrata del contenuto in sospensione delle acque di vegetazione/sanse, per esempio micro-frammenti, fibre e materiale corpuscolare come cellule e batteri. Essa è realizzata nelle condizioni standard per questo tipo di matrice.

Oltre al concentrato, a seguito della fase di microfiltrazione si ottiene un permeato, ovvero una frazione limpida, caratterizzata da un colore che varia a seconda del materiale di partenza e che contiene le componenti disciolte delle acque di vegetazione/sanse, per esempio proteine, zuccheri, sali, polifenoli, acidi organici e varie molecole organiche solubili. Preferibilmente la microfiltrazione è realizzata con almeno una, preferibilmente due, membrana/e ceramica/che. La membrana è caratterizzata da una forma preferibilmente tubolare

In una forma di realizzazione preferita la membrana è fatta in ossido di allumina e zirconia.

Preferibilmente la membrana ha le seguiti caratteristiche: un diametro esterno che varia da circa 30 a circa 40 mm, preferibilmente di circa 25 mm; e/o una lunghezza che varia da circa 500 a circa 1500 mm, preferibilmente di circa 1200 mm; e/o una serie di canali con diametro, preferibilmente idraulico, che varia da circa 2,5 a circa 5 mm, preferibilmente di circa 3,5 mm; e/o una superficie filtrante che varia da circa 0,15 a circa 0,7 m<2>, preferibilmente di circa 0,35 m<2>; e/o un taglio molecolare che varia da circa 0,1 micron fino a circa 300 kDa.

La fase di osmosi inversa, per concentrare il permeato ottenuto dalla microfiltrazione delle acque di vegetazione/sanse come prima descritto, è realizzata nelle condizioni standard per questo tipo di matrice preferibilmente mediante l’uso di una membrana polimerica, più preferibilmente in poliammide.

In particolare, la membrana ha una conformazione a spirale avvolta e un taglio molecolare ad alta reiezione salina, ovvero in grado di respingere la molecola di sodio cloruro con una percentuale del 99,9 %. Ciò significa che la membrana da osmosi trattiene le molecole di interesse biomediche e lascia passare soltanto la molecola dell’acqua.

Preferibilmente la membrana polimerica ha una superficie filtrante che varia da circa 5 a circa 15 m<2>, più preferibilmente di circa 7 m<2>.

La fase di osmosi inversa consente di concentrare il permeato ottenuto dalla microfiltrazione preferibilmente di circa 4 volte, ciò vuol dire che da 100 L di permeato di microfiltrazioni si ottengono 25 L di concentrato.

In questo caso il Rapporto Volumetrico di Concentrazione (VCR) è 4 cioè 100/25.

Il VCR può cambiare in base alla matrice di partenza (acque di vegetazione) e soprattutto in base al suo contenuto salino perché il processo di osmosi inversa deve controbilanciare la pressione osmotica della matrice che si procede a concentrare.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un concentrato (o fitocomplesso) di acque di vegetazione/sanse ottenibile/ottenuto col procedimento descritto sopra.

Il concentrato ha preferibilmente la composizione prima descritta relativamente al contenuto di composti fenolici, metalli, carboidrati, anioni ed azoto. Esso è utilizzabile, da solo od in combinazione con altre sostanze, molecole o terapie antitumorali e/o antiangiogeniche e/o antinfiammatorie, per il trattamento e/o la prevenzione dell'angiogenesi e/o l’infiammazione, preferibilmente dell'angiogenesi e/o l’infiammazione patologica, in particolare l’angiogenesi e/o l’infiammazione associata ai tumori o l’angiogenesi e/o l’infiammazione associata a patologie non tumorali come: patologie reumatiche, preferibilmente artrite reumatoide e gotta; patologie infiammatorie del colon-retto, preferibilmente morbo di Crohn, colon irritabile e colite; patologie bronchiali, preferibilmente bronco pneumopatia cronica ostruttiva e asma; patologie del fegato preferibilmente cirrosi e fibrosi; patologie della prostata, preferibilmente iperplasia prostatica e prostatite acuta/cronica; mucositi; dermatiti o lesioni preneoplastiche per esempio alla mammella, all'utero, al polmone o al cavo orale. Preferibilmente il concentrato della presente invenzione è utilizzabile, da solo od in combinazione con altre sostanze/molecole, allo scopo di inibire, preferibilmente in maniera preventiva, la formazione dei vasi sanguigni di tipo tumorale.

I tumori a cui la presente invenzione fa riferimento sono preferibilmente i tumori del colon-retto, della mammella, della prostata, i tumori cutanei (melanoma e non), del pancreas, del polmone, delle ovaie, della vescica del rene e del fegato.

Le condizioni infiammatorie associate all'angiogenesi a cui la presente invenzione fa riferimento sono: patologie reumatiche, preferibilmente artrite reumatoide e gotta; patologie infiammatorie del colon-retto, preferibilmente morbo di Crohn, colon irritabile e colite; patologie bronchiali, preferibilmente bronco pneumopatia cronica ostruttiva e asma; patologie del fegato preferibilmente cirrosi e fibrosi; patologie della prostata, preferibilmente iperplasia prostatica e prostatite acuta/cronica; mucositi; dermatiti o lesioni preneoplastiche per esempio alla mammella, all'utero, al polmone o al cavo orale.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda una bevanda comprendente il concentrato di acque di vegetazione/sanse prima descritto ed eventuali eccipienti normalmente aggiunti per la produzione delle varie tipologie di bevande.

La bevanda può essere a base di acqua e/o frutta e/o latte. Nella forma di realizzazione particolarmente preferita dell’invenzione la bevanda è a base di frutta, preferibilmente è a base di uva. In particolare è preferito il succo e/o il mosto d’uva, preferibilmente l’uva biologica Eventualmente la bevanda può essere liofilizzata.

Alternativamente il concentrato di acque di vegetazione/sanse prima descritto può essere formulato come compresse, pasticche, tavolette per un uso orale.

Praticamente la bevanda o la formulazione orale può essere assunta come integratore alimentare, in particolare, allo scopo di prevenire l'angiogenesi e/o l’infiammazione, preferibilmente l'angiogenesi e/o l’infiammazione patologica, in particolare quella associata ad un tumore o quella associata ad una patologia non tumorale come: patologie reumatiche, preferibilmente artrite reumatoide e gotta; patologie infiammatorie del colon-retto, preferibilmente morbo di Crohn, colon irritabile e colite; patologie bronchiali, preferibilmente bronco pneumopatia cronica ostruttiva e asma; patologie del fegato preferibilmente cirrosi e fibrosi; patologie della prostata, preferibilmente iperplasia prostatica e prostatite acuta/cronica; mucositi; dermatiti o lesioni preneoplastiche per esempio alla mammella, all'utero, al polmone o al cavo orale.

Preferibilmente la bevanda o la formulazione orale è assunta come integratore alimentare allo scopo di inibire, preferibilmente in maniera preventiva, la formazione di vasi sanguigni tumorali.

Eventualmente la bevanda può essere assunta in associazione con sostanze, molecole, farmaci o terapie antitumorali e/o antiangiogenici e/o antinfiammatori.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda una crema, un olio, un unguento, un aerosol, uno shampoo od un gel comprendente il concentrato di acque di vegetazione/sanse prima descritto ed eventuali eccipienti.

Detta crema, olio, unguento o gel possono essere utilizzati per il trattamento, preferibilmente topico, e/o la prevenzione di una condizione fisio-patologica causata da una aumentata e/o alterata angiogenesi e/o da infiammazione.

ESEMPIO

Produzione di polifenoli concentrati a partire da acque di vegetazione olearie/sanse

L'intero processo di produzione è incentrato sull'impiego di tecnologie separative di filtrazione tangenziale a membrana.

Il processo a membrana realizzato per la produzione di concentrati polifenolici a partire da acque di vegetazione olearie/sanse ha impiegato unicamente due stadi di filtrazione: la microfiltrazione e l'osmosi inversa. Tuttavia, a seconda del prodotto desiderato è possibile integrare il processo con stadi di ultrafiltrazione e di nanofiltrazione.

La microfiltrazione permette la separazione di solidi sospesi, batteri, grassi, mentre l'osmosi inversa trattiene tutte le sostanze presenti, inclusi gli ioni anche monovalenti, e lascia permeare solo l'acqua.

Il processo è stato realizzato a partire da acque di vegetazione olearie derivanti da un processo di molitura delle olive a tre fasi, ma è possibile applicarlo anche a sanse umide derivanti da un processo a due fasi dopo un pretrattamento.

Le sanse umide possono essere denocciolate, diluite e prefiltrate con taglio di circa 0,7 mm (ad esempio con vibro vaglio) e poi trattate con impianti a membrana, oppure possono essere trattate in decanter a tre fasi con eventuali diluizioni e riprocessamenti in decanter a tre fasi prima di essere trattate con processi a membrana.

Il processo di microfiltrazione realizzato ha come obiettivo la separazione nella frazione concentrata di tutto il contenuto in sospensione (microframmenti, fibre e materiale corpuscolare come cellule e batteri) presente nelle acque di vegetazione/sanse.

Il permeato della microfiltrazione è una frazione limpida, con un colore differente a seconda del cultivar delle olive trattate, contenente tutte le componenti disciolte delle acque di vegetazione/sanse, per esempio proteine, zuccheri, sali, polifenoli, acidi organici e varie molecole organiche solubili.

In microfiltrazione sono state impiegate due membrane ceramiche tubolari in ossido di allumina con strato selettivo in ossido di zirconia aventi le seguenti caratteristiche: diametro esterno 25 mm, lunghezza 1178 mm, 23 canali con diametro idraulico del canale di 3,5 mm, superficie filtrante di 0,35 m<2>e taglio molecolare rispettivamente di 0,14 micron – 300 KDa. In microfiltrazione, impiegando membrane con diametro idraulico dei 23 canali di 3,5 mm, è possibile concentrare le acque di vegetazione/sanse fino ad ottenere una frazione concentrata con un contenuto in solidi totali di circa il 12%.

Considerando le acque di vegetazione trattate, con un contenuto in solidi totali di circa il 7%, è stato possibile concentrare di un fattore quattro, ottenendo un permeato con un contenuto in solidi totali del 5,5% ed un concentrato con contenuto in solidi totali di 12,1%.

Il concentrato polifenolico della presente invenzione è stato prodotto concentrando il permeato ottenuto dalla microfiltrazione delle acque di vegetazione mediante osmosi inversa.

E' stata impiegata una membrana polimerica a spirale avvolta in poliammide ad alta reiezione salina con una superficie filtrante di 7 m<2>, ma possono essere impiegate anche membrane a bassa reiezione salina con una piccola perdita di polifenoli nel permeato.

In osmosi inversa è possibile concentrare il permeato di microfiltrazione delle acque di vegetazione trattare di un rapporto pari a circa 3,6.

Ovviamente il rapporto volumetrico di concentrazione può cambiare a seconda della matrice di partenza iniziale e soprattutto al suo contenuto salino e quindi alla pressione osmotica.

Composizione delle acque di vegetazione testate

La composizione del concentrato polifenolico è indicato nella Tabella I a seguire:

Tabella I

Composti fenolici

Idrossitirosolo 2,70 g/L Tirosolo 0,20g/L

Acido clorogenico 0,12g/L

β-idrossiverbascoside isomero 1<0,35g/L>

β-idrossiverbascoside isomero 2<0,32g/L>

Rutina 0,11g/L Verbascoside 0,84g/L Luteolina-7-O-gluside 0,22g/L

3,4-DHPEA-EDA 1,99g/L

I risultati sono espressi in g di tirosolo su L di acque. Standard interno: Acido Siringico

Metalli

Sodio 152mg/L

Calcio 2,95g/L

Magnesio 442mg/L

Potassio 7,6g/L

Anioni

Cloruri 3,4g/L (espresso come NaCl) Solfati 22,78g/L (espresso come K2SO4) Fosfati 3,2g/L (espresso come PO4<3-)>Nitrati 24,5mg/L (espresso come N nitrico) Carboidrati

Glucosio 31g/L

Fruttosio 7g/L

Mannitolo 2g/L

Saccarosio 8g/L

Azoto 0,03% 30mg/kg

Le sostanze riportate nella Tabella I sono contenute nel campione con identificativo A009, mentre il bianco (cioè il controllo negativo) è contrassegnato con la sigla A012.

Il bianco è stato ottenuto tramite separazione cromatografica in batch con resina XAD 7 del concentrato polifenolico.

Nel dettaglio, un volume di circa 50cc di resina XAD 7 è stata sciacquata con acqua distillata, rigenerata in etanolo e risciacquata con acqua distillata.

La resina è stata recuperata mediante filtrazione sotto vuoto con filtro da 0,45 micron ed aggiunta a circa 75 ml di concentrato di acque di vegetazione in un beker. La resina è stata lasciata in contatto col concentrato per circa 30 minuti in agitazione a temperatura ambiente. Con una filtrazione sotto vuoto è stato recuperato il concentrato di acque di vegetazione trattato con resina XAD 7 con una conducibilità elettrica di 23,4 mS/cm.

Il concentrato ddi acque di vegetazione recuperato dopo trattamento con resina XAD 7 è stato nuovamente trattato con resina XAD 7 rigenerata in etanolo e sciacquata con acqua distillata.

Dopo filtrazione sotto vuoto è stato recuperato il terzo campione di bianco di concentrato di acque di vegetazione trattato due volte con resina XAD 7, con una conducibilità elettrica di 16,92 mS/cm.

Le HUVEC (Human Umbelical Vein Endothelial Cell) sono state utilizzate come modello di cellula bersaglio del concentrato polifenolico della presente invenzione, in considerazione del fatto che la cellula endoteliale costituisce l’unità fondamentale del processo di angiogenesi.

I risultati ottenuti dalle analisi fatte con il concentrato polifenolico sono stati confrontati con quelli ottenuti trattando le HUVEC nelle stesse condizioni con il solo idrossitirosolo. E’ stato scelto l’idrossitirosolo come sostanza di confronto in quanto è il polifenolo maggiormente rappresentato nel campione A009 (2,70 g/L).

Lo scopo è quello di dimostrare che le acque di vegetazione (nella forma di concentrato come descritto), oltre ad avere un effetto anti-angiogenico, evidenzino una migliore capacità inibitoria rispetto alla singola sostanza. Per valutare se gli effetti ottenuti fossero dovuti realmente all’idrossitirosolo e non alla soluzione di etanolo in cui lo stesso è disciolto, le analisi sono state effettuate utilizzando come campione bianco il terreno (mezzo) contenente etanolo alla stessa concentrazione di quella in cui si trova disciolto l'idrossitirosolo.

Valutazione delle proprietà anti-angiogeniche delle acque di vegetazione Le diluizioni dei campioni corrispondono ai valori di mg/ml e µM presenti nella Tabella II a seguire:

Tabella II

DILUIZIONI mg/ml idrossitirosolo µM idrossitirosolo

1:100 0,0270 174,96

1:250 0,0108 69,984

1:500 0,0054 34,992

1:1000 0,0027 17,496

1:2500 0,00108 6,9984

1:5000 0,00054 3,4992

1:10000 0,00027 1,7496

Valutazione dell’effetto antiproliferativo delle acque di vegetazione sulle cellule endoteliali

L’effetto dei campioni A009 e A012 sulla proliferazione delle cellule endoteliali umane (HUVEC) è stato valutato mediante il saggio di vitalità MTT (sale di tetrazolio, [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)]-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Il saggio si basa sulla capacità del composto MTT di essere metabolizzato da un enzima mitocondriale, la succinato deidrogenasi. La riduzione del sale porta alla formazione di cristalli di un prodotto di colore blu, il formazano, insolubile in acqua. Le cellule vitali, a differenza di quelle non vitali, riducono il sale e la quantità del formazano prodotta è proporzionale al numero di cellule presenti. I cristalli formatisi vengono solubilizzati e i valori di assorbanza alla lunghezza d’onda di 570nm vengono rilevati mediante lettura allo spettrofotometro.

5000 cellule HUVE sono state seminate in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. In particolare, i pozzetti sono stati rivestiti con gelatina 1% e i saggi sono stati condotti a diversi tempi di trattamento (24 h, 48 h, 72 h, 96 h) e per ciascuna tempistica sono state testate diverse diluizioni dei concentrati (intervalli 1:10000-1:100).

E’ stato valutato l’effetto sulla proliferazione delle cellule endoteliale delle seguenti diluizioni di concentrato: 1:10000 - 1:5000 - 1:2500 - 1:1000 -1:500 - 1:250 - 1:100.

Come mostrato nella Figura 1A, si osserva una significativa riduzione della vitalità delle cellule endoteliali trattate con il campione A009, in particolare, a partire dalla diluizione di 1:1000, dopo 24 h di trattamento.

Il campione A012 (il bianco) non ha alcun effetto sulla vitalità delle HUVEC (Fig.1B).

Anche l'idrossitirosolo causa una riduzione della vitalità delle cellule HUVE, in particolare a partire dalla diluizione di 1:250, dopo le 24 h di trattamento (Fig.1C). Il terreno contenente l'etanolo, utilizzato come controllo, non produce alcun effetto sulla vitalità cellulare (Fig.1D). L’esperimento è stato condotto in duplicato e ripetuto per 2 volte.

Si può quindi concludere che il campione A009 cioè abbia un effetto maggiore sulla vitalità cellulare rispetto all’idrossitirosolo.

Valutazione dell’apoptosi

L’induzione dell’apoptosi (morte cellulare programmata) nelle cellule endoteliali trattate con il concentrato è stata valutata mediante marcatura con Annessina V e 7-Amino-actinomycin D (7-AAD). L’analisi citofluorimetrica di questi marcatori permette di distinguere, all’interno della stessa popolazione cellulare, la capacità di un trattamento di indurre morte cellulare a diversi stadi (precoce, tardiva, avanzata). L’Annessina V è una molecola in grado di legare la fosfatidil-serina, un glicerofosfolipide della membrana cellulare, normalmente associato allo strato citosolico interno, che viene esposta sul versante extracellulare in seguito a danni cellulari. La 7-AAD è un composto in grado di attraversare la membrana cellulare solo in cellule danneggiate o in apoptosi; la positività a questo marcatore è pertanto indicativa di morte cellulare e di tossicità del prodotto.

150.000 cellule HUVE sono state seminate in un pozzetto di una piastra da 6 rivestito con gelatina 1%. Successivamente le cellule sono state trattate (per 24h e 48h) con le diverse diluizioni dei campioni prima di essere staccate dalla piastra mediante trattamento con tripsina e colorate con 7-AAD e Annessina V per valutare i livelli di apoptosi.

Le cellule endoteliali sono state trattate per 24 e 48 ore, a diverse diluizioni di campioni A009, A012 e HyT-EtOH (range di diluizioni 1:2500– 1:250) ed analizzate per la positività ai due marcatori.

Come si può notare dalla Figura 2A, 2C, una diluizione 1:250 di campione A009 induce la fase tardiva di apoptosi nel 50% e 75% delle cellule endoteliali, rispettivamente dopo 24 h e 48 h di trattamento. La stessa diluizione del campione A012 non esercita alcun effetto pro-apoptotico (circa il 95% delle cellule risultano vitali).

Invece, il trattamento con idrossitirosolo e con il terreno contenente l'etanolo non aumenta la necrosi cellulare (Fig.3).

L’esperimento è stato condotto in duplicato e ripetuto per 2 volte.

Quindi l’idrossitirosolo evidenzia una minore attività rispetto al concentrato della presente invenzione.

Valutazione dell’ effetto delle acque di vegetazione sulla morfogenesi di cellule endoteliali

Le cellule endoteliali, quando sono coltivate in vitro su una matrice extracellulare e a seguito di opportuni stimoli attivatori, sono in grado di organizzarsi in strutture tubulari che mimano la struttura del lume interno dei vasi.

Mediante il saggio di morfogenesi su matrigel (cioè un polimero costituito da laminina, collagene IV, entactina, eparan solfato proteoglicano, fattori di crescita (es. PDGF, EGF, TGF-ß e MMP) è possibile valutare il potenziale anti-angiogenico di composti selezionati. Al fine di valutare la capacità del concentrato della presente invenzione di inibire la formazione di tubuli in vitro, ciascun pozzetto di una piastra da 24 è stato rivestito con 300 µL di matrigel (10 mg/mL) e, in seguito a polimerizzazione della matrice, sono state seminate sulla matrice polimerizzata 50.000 cellule HUVE in 1 mL di terreno completo. Le cellule sono state pretrattate per 24 ore con diverse diluizioni dei campioni A009, A012, HyT e EtOH (1:500 e 1:250).

Come controllo positivo e negativo sono stati utilizzati rispettivamente un terreno di coltura completo (CM) costituito da terreno M199 addizionato con 10 ng/ml aFGF (acid Fibroblastic growth factor), 10 ng/ml bFGF (basic Fibroblastic growth factor), 10 ng/ml EGF (Epidermal growth factor), 0,1 mg/ml eparina, 0,10 µg/ml idrocortisone, 10% FBS (Fetal Bovine serum), 1% glutammina (Gln), 1% Ampicillina/Streptomicina (P/S) e il terreno M199 privo di fattori e siero (serum free medium-SFM)

L’effetto inibitorio dei campioni è stato valutato dopo 6 ore di incubazione a 37°C e 5% CO2, mediante l’osservazione al microscopio della formazione di strutture tubulari.

Come si osserva in Figura 4A, il campione A009 è in grado di interferire con la formazione di strutture tubulari stabili da parte delle cellule endoteliali in maniera dose dipendente. Le stesse diluizioni del campione A012 (il bianco) non esercitano alcun effetto inibitorio.

Anche l'idrossitirosolo è in grado di interferire con la formazione di strutture tubulari stabili da parte delle cellule endoteliali in maniera dose dipendente, mentre le diluizioni di etanolo (il bianco) esercitano solo un lieve effetto inibitorio (Fig.4B). L’esperimento è stato condotto in duplicato e ripetuto per 2 volte.

L’idrossitirosolo, quindi, inibisce la morfogenesi endoteliale con un effetto meno marcato rispetto al campione A009 cioè al concentrato della presente invenzione.

Valutazione del potenziale inibitorio delle acque di vegetazione sull’attività migratoria delle cellule endoteliali

Le cellule endoteliali sono caratterizzate dalla capacità di migrare verso un sito specifico, seguendo un gradiente chemotattico. Al fine di valutare la capacità di migrazione delle HUVEC sono stati allestiti dei saggi di migrazione utilizzando camere di Boyden, con filtri porosi a cut-off di 12 µm imbevuti di collagene (50 µg/mL).

Il compartimento inferiore di ogni camera è stato caricato con 210 µL di CM contenente 10 ng/mL αFGF, 10 ng/ml bFGF,10 ng/mL EGF, 0,1 mg/mL eparina, 0,10 µg/mL idrocortisone, 10% FBS, 1% Gln, 1% P/S o il terreno M199 privo di fattori e siero (SFM).

Nel compartimento superiore della camera sono state seminate, in 500 µL di terreno senza siero, 50000 cellule HUVE preventivamente trattate per 24 ore con diverse diluizioni (1:2500, 1:1000, 1:500 e 1:250) di concentrato, di bianco, di idrossitirosolo o di terreno contenente etanolo. Le cellule sono state incubate a 37°C, 5% CO2per 6 h.

A fine saggio, i filtri sono stati puliti meccanicamente in modo da eliminare le cellule non migrate presenti sul lato superiore; quindi sono stati fissati in etanolo assoluto per 5 minuti, e poi reidratati e marcati con il colorante vitale DAPI. Le cellule presenti su ogni filtro sono state contate al microscopio a fluorescenza. In particolare, sono stati analizzati 5 campi ottici per filtro scelti in maniera casuale.

Come mostrato in Figura 5A, il concentrato della presente invenzione (il campione A009) è in grado di interferire con la capacità migratoria delle cellule endoteliali in modo statisticamente significativo alle diluizioni 1:500 e 1:250 (rispettivamente p-value=0,0057 e p-value=0,0003), mentre il campione A012 (il bianco) non interferisce con la capacità migratoria delle stesse.

L’idrossitirosolo riduce la capacità migratoria delle cellule endoteliali rispetto al terreno con l'etanolo utilizzato alla diluizione 1:250 con un pvalue = 0,0302 (Fig. 5B). Si può anche osservare che alle diluizioni più alte dell’idrossitirosolo le cellule endoteliali hanno un aumento della capacità migratoria, mentre il concentrato della presente invenzione la inibisce. L’esperimento è stato condotto in duplicato e ripetuto per 2 volte. Quindi, l’idrossitirosolo usato come sostanza singola presenta una minore capacità di interferire con la migrazione endoteliale, cioè non risulta efficace.

Valutazione del potenziale inibitorio delle acque di vegetazione sull’attività invasiva delle cellule endoteliali

Le cellule endoteliali, una volta reclutate in situ, hanno la capacità di invadere i tessuti circostanti producendo fattori in grado di degradare la matrice extracellulare, che costituisce una barriera fisica per la loro effettiva migrazione al sito chemotattico.

Il saggio di invasione è stato allestito utilizzando camere di Boyden, con filtri porosi a cut-off di 12 µm, rivestiti di matrigel (1 mg/mL).

210 µL di terreno di coltura completo (CM) contenente 10 ng/mL aFGF, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/mL EGF, 0,1 mg/mL eparina, 0,10 µg/mL idrocortisone, 10% FBS, 1% Gln, 1% P/S o 210 µL di terreno M199 privo di fattori e siero (SFM) sono stati versati nel compartimento inferiore di ciascuna camera.

50000 cellule HUVE risospese in 500 µL di SFM e preventivamente trattate per 24 ore con diverse diluizioni (1:2500, 1:1000, 1:500 e 1:250) di concentrato, di bianco, di idrossitirolo e della soluzione senza idrossitirosolo sono state incubate a 37°C, 5% CO2per 24 h.

A fine saggio, i filtri sono stati puliti meccanicamente in modo da eliminare le cellule presenti sul lato superiore che non avevano superato la matrice. Quindi i filtri contenenti le cellule che hanno invaso il matrigel, sono stati fissati in etanolo assoluto per 5 minuti, quindi reidratati e marcati con il colorante vitale DAPI. Le cellule presenti su ogni filtro sono state contate al microscopio a fluorescenza analizzando 5 campi ottici per filtro scelti in maniera random .

I risultati riportati in Figura 6A dimostrano che il campione A009 (cioè il concentrato della presente invenzione) è in grado di interferire con la capacità invasiva delle cellule endoteliali in maniera statisticamente significativa alle diluizioni 1:500 e 1:250 (rispettivamente p-value= 0,0335 e p-value= 0,0011), mentre il campione A012 (il bianco) non influisce sulla capacità invasiva delle stesse.

Come mostrato in Figura 6B l’idrossitirosolo riduce la capacità invasiva delle cellule endoteliali rispetto al terreno con l'etanolo utilizzato alle diluizioni 1:500 e 1:250 con un p-value= 0,0016 e p-value= 0,0159.

L’idrossitirosolo ha una migliore efficacia considerando tempistiche maggiori, in quanto inibisce l'invasione cellulare, ma non la migrazione. Il concentrato della presente invenzione funziona in maniera efficace sia sulla migrazione che sull’invasione.

Valutazione del ruolo protettivo nei confronti del danno da stress ossidativi da parte delle acque di vegetazione dopo trattamento con H2O2

Le Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) rappresentano uno dei principali meccanismi di danno cellulare e giocano un ruolo fondamentale nel processo di infiammazione e, di conseguenza, nell’angiogenesi correlata all’infiammazione. E’ stato quindi valutato il potenziale anti-ossidante su cellule HUVE sottoposte a trattamento con i concentrati di acque di vegetazione, dopo trattamento con H2O2, mediante marcatura con DCFH-DA (2’,7’-dichlorfluorescein-diacetate).

DCFH-DA è una sostanza in grado di rilevare la concentrazione di H2O2intracellulare e può essere rilevata con il citofluorimetro.

150.000 cellule HUVE sono state seminate in terreno completo in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti rivestito con gelatina 1%. Successivamente le cellule sono state tripsinizzate e risospese in terreno M199 completo con H2O2alla concentrazione 250 µM. Le cellule sono state quindi poste in incubatore a 37°C e 5% CO2, al buio, per 15 minuti. Successivamente le cellule sono state lavate con DPBS ed il surnatante è stato poi eliminato a seguito di centrifugazione 5 minuti a 1200 rpm. Infine, le cellule sono state risospese in DPBS contenente 10 µM di DCFH-DA e H2O2(controllo positivo) oppure con le diluizioni dei concentrati (A009 e A012), di idrossitirosolo o di solvente privo di idrossitirosolo. Le cellule sono state incubate a 37°C in un'atmosfera contenente 5% CO2 per 45 minuti al buio. Infine, si è proceduti alla lettura dei risultati tramite FACSCanto.

I risultati riassunti in Figura 7A dimostrano che il campione A009 (il concentrato della presente invenzione) è in grado di esercitare un effetto protettivo in maniera dose dipendente e in modo altamente significativo: pvalue 1:2500= 0,0310, p-value 1:1000= 0,0001, p-value 1:500= 0,0001, pvalue 1:250< 0,0001.

L'idrossitirosolo esercita un effetto antiossidante (Fig. 7B), mentre il terreno in cui è disciolto l’etanolo non possiede alcun effetto antiossidante.

I risultati dimostrano che il concentrato della presente invenzione è in grado di esercitare un effetto anti-ossidante maggiormente significativo. I p-value dell’idrossitirosolo sono infatti inferiori: p-value 1:2500= 0,0115, pvalue 1:1000=0,0062, p-value 1:500= 0,0082, p-value 1:250= 0,0223.

L’esperimento è stato condotto in duplicato e ripetuto per 2 volte.

Valutazione del ruolo protettivo nei confronti del danno da stress ossidativi da parte delle acque di vegetazione prima del trattamento con H2O2150.000 cellule HUVE sono state seminate in terreno completo in ciascun pozzetto di una piastra da 6 rivestito con gelatina 1%. Successivamente le cellule sono state tripsinizzate e risospese in terreno M199 completo ed il concentrato di acque di vegetazione (A009 e A012), l'idrossitirosolo o il terreno contenente etanolo alle diluizioni canoniche.

Le cellule sono state quindi poste in incubatore a 37°C e 5% CO2, al buio, per 30 minuti. Dopo lavaggio con DPBS le cellule sono state risospese in DPBS con 10 µM di DCFH-DA e H2O2sia nel controllo positivo che nei campioni in analisi. Le cellule sono state poste per 45 minuti al buio nell’incubatore a 37°C e 5% CO2. Infine, si è proceduti alla lettura dei risultati tramite FACSCanto.

In Figura 8A, si osserva un effetto protettivo da parte del campione A009 in maniera dose dipendente, mentre si può osservare come la produzione di ROS nei campioni trattati con il bianco (A012) venga mantenuta elevata. La riduzione nella produzione dei ROS è altamente significativa per il campione A009: p-value 1:2500= 0,0056, p-value 1:1000= 0,0015, p-value 1:500< 0,0001, p-value 1:250< 0,0001.

I risultati mostrati in Figura 8B dimostrano che l’idrossitirosolo non ha alcun effetto anti-ossidante significativo se usato dopo l’induzione dell’ossidazione mediante H2O2. Inoltre, è possibile osservare che il solvente privo di idrossitirosolo non produca alcun effetto significativo sulle cellule, così come avviene per il pretrattamento con H2O2.

L’esperimento è stato condotto in duplicato e ripetuto per 2 volte.

In conclusione, l’idrossitirosolo oltre ad avere un minor potere antiossidante rispetto al concentrato della presente invenzione se usato dopo induzione di ossidazione, non mantiene questo potenziale se utilizzato in pretrattamento.

Valutazione del potenziale anti-angiogenico delle acque di vegetazione in modello murino

La capacità da parte del concentrato di acque di vegetazione di inibire in vivo la formazione dei vasi sanguigni è stata valutata attraverso il saggio delle spugne di matrigel, come descritto da Albini et al. in “Angiogenic potential in vivo by Kaposi's sarcoma cell-free supernatants and HIV-1 tat product: inhibition of KS-like lesions by tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (AIDS, 1994)”

In particolare, sono stati utilizzati come modello animale topi maschi di 8 settimane di ceppo c57/BL6. Nei topi è stato iniettato sottocute il pellet di matrigel, in associazione con il campione A009, a differenti diluizioni, o il relativo bianco (A012). Il matrigel si presenta in forma liquida alla temperatura di 4°C, e polimerizza rapidamente a temperatura ambiente; questa sua proprietà viene sfruttata per simulare un tumore subcutaneo che secerne sostanze pro-angiogeniche. In questo esperimento, il matrigel in forma liquida, è stato associato ad una miscela detta VTH, contenente tutti i fattori necessari al processo di angiogenesi, costituita da VEGF (100 ng/µl), TNF α (1,2 ng/ µl) ed eparina (25 U/ml).

Il VTH viene considerato come controllo positivo, in quanto il VEGF rappresenta il principale fattore di crescita per la cellula endoteliale, il TNFα costituisce una citochina essenziale per il reclutamento della componente cellulare infiammatoria, e l’eparina permette di trattenere il sangue che si forma nel pellet, conseguente al reclutamento ed attivazione dell’endotelio. Una volta iniettato sottocute, a livello dei fianchi dell’animale, il matrigel polimerizza rapidamente e rilascia i fattori in esso contenuti. Essi fungono da chemoattrattante per l’endotelio e per le cellule infiammatorie che, una volta infiltrate nel matrigel, rimangono intrappolate e si attivano nel “microambiente” costituito dalla matrice. Per il saggio in oggetto, sono stati utilizzati 3 topi per ciascuna condizione. Le condizioni utilizzate sono: 1) solo matrigel (controllo negativo), 2) matrigel e VTH (controllo positivo), 3) matrigel con VTH in combinazione a 2 diluizioni del concentrato di acque di vegetazione (1:500 e 1:250) sia per il campione in analisi che per il campione bianco. Inoltre, sono state testate le medesime diluizioni per l’idrossitirosolo.

I pellets di matrigel sono stati iniettati al giorno 0, al giorno 4 i topi sono stati sacrificati e sono stati prelevati i pellets. I pellets espiantati sono stati pesati e posti in 300 µl di PBS, quindi divisi in due parti: una metà è stata utilizzata per il dosaggio dell’emoglobina, che è un indicatore di angiogenesi (presenza di sangue nel pellet conseguente al reclutamento della cellula endoteliale e sua attivazione), mentre l’altra metà è stata inclusa in OCT per eseguire le colorazioni immunoistochimiche per la valutazione della componente endoteliale e infiammatoria.

Per la quantificazione dell’emoglobina, i pellets sono stati disgregati meccanicamente, centrifugati a 4°C per 12 minuti a 13000g e in seguito è stato prelevato il surnatante.

200 µl di surnatante sono stati quindi posti in una eppendorf dove sono stati aggiunti 800 µl di soluzione di Drabkin. Questa sostanza si lega all’emoglobina formando dei cristalli che precipitano permettendo così la lettura dell’assorbanza tramite uno spettrofotometro (540 nm): la concentrazione di emoglobina è direttamente proporzionale al numero di cristalli formati e all’assorbanza registrata. La quantificazione dell’emoglobina è stata effettuata avvalendosi del seguente modello matematico:

HB= (assorbanza a 540 nm/peso in mg del pellet) x 100

Nella Figura 9A è possibile osservare come la colorazione sia proporzionale all’infiltrazione dell’endotelio e alla conseguente presenza di sangue.

Nella Figura 9B è possibile osservare come la colorazione dei pellet del trattamento 1:500 dell’idrossitirosolo sia superiore al controllo positivo. In Figura 10 vengono riportati i dati relativi alla quantificazione del contenuto emoglobinico dei pellet. Si può notare che la concentrazione dell’emoglobina diminuisce nei pellets associati al concentrato della presente invenzione (A009) in modo statisticamente significativo (p-value= 0,0058) rispetto ai pellet associati al campione A012 (il bianco) e all’idrossitirosolo.

In conclusione i risultati sperimentali sopra riportati indicano chiaramente che il concentrato polifenolico ottenuto a partire da acque di vegetazione (il campione A009) è dotato di attività anti-angiogenica. Infatti, il concentrato della presente invenzione inibisce la vitalità e aumenta l’apoptosi delle cellule endoteliali. Inoltre, esso impedisce anche la migrazione e l’invasione nelle matrici sintetiche utilizzate per simulare la matrice extracellulare. Infine, trattando le HUVEC con il concentrato della presente invenzione è anche possibile osservare l'inibizione della formazione delle strutture tubulari tipiche della vascolatura.

Oltre ai risultati in vitro, il potenziale anti-angiogenico del concentrato della presente invenzione è stato chiaramente dimostrato anche in un sistema fisiologico.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti confrontando il concentrato con lo stesso concentrato purificato dai polifenolo (il bianco) in modo da poter affermare che gli effetti osservati fossero dovuti alle molecole di interesse e non ad altri fattori che avrebbero potuto interferire con gli esperimenti. Inoltre, è stato testato anche l’idrossitirosolo solo ed i risultati hanno dimostrato che esso è meno efficace ed attivo, in tutti i test eseguiti, rispetto al concentrato della presente invenzione.

Pertanto, i risultati degli esperimenti sopra riportati dimostrano che il concentrato polifenolico ottenuto sottoponendo ad osmosi inversa il permeato di microfiltrazione delle acque di vegetazione possiede proprietà anti-angiogeniche.

In particolare, il concentrato ha un effetto anti-angiogenico migliorato rispetto al solo idrossitirosolo che rappresenta il principale composto polifenolico contenuto nelle acque di vegetazione.

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1. Concentrato di acque di vegetazione e/o sanse comprendente idrossitirosolo e 3,4-DHPA-EDA per uso nel trattamento e/o nella prevenzione dell’angiogenesi.
2. 2. Concentrato secondo la rivendicazione 1 comprendente ulteriormente: almeno un composto fenolico preferibilmente scelto tra: tirosolo, acido cloro genico, β-idrossiverbascoide, rutina, verbasco ide e luteolina; e/o almeno un metallo preferibilmente scelto tra: sodio, calcio, magnesio e potassio; e/o almeno un anione preferibilmente scelto tra: cloruri, solfati, fosfati e nitrati; e/o almeno un carboidrato scelto tra: glucosio, fruttosio, mannitolo e saccarosio; e/o azoto.
3. 3. Processo per la produzione di un concentrato di acque di vegetazione e/o sanse comprendente le fasi di: (i) microfiltrare un campione di acque di vegetazione e/o sanse in modo da ottenere un concentrato ed un permeato di microfiltrazione; e (ii) concentrare mediante osmosi inversa il permeato di microfiltrazione ottenuto dalla fase (i).
4. 4. Processo secondo la rivendicazione 3, in cui la fase di microfiltrazione prevede l’uso di almeno una membrana ceramica, preferibilmente caratterizzata da una forma tubolare.
5. 5. Processo secondo la rivendicazione 4, in cui la membrana è fatta in ossido di allumina e zirconia.
6. 6. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 3-5, in cui l’osmosi inversa è realizzata mediante l’uso di una membrana polimerica, preferibilmente in poliammide, detta membrana essendo preferibilmente caratterizzata da una forma a spirale.
7. 7. Concentrato di acque di vegetazioni e/o sanse ottenibile col processo secondo le rivendicazioni 3-6 per uso nel trattamento e/o nella prevenzione dell’angiogenesi.
8. 8. Concentrato secondo la rivendicazione 1 o 2, oppure secondo la rivendicazione 7, in cui l’angiogenesi è di tipo patologico, preferibilmente l’angiogenesi è di tipo tumorale oppure l’angiogenesi è di tipo non tumorale.
9. 9. Concentrato secondo la rivendicazione 8, in cui l'angiogenesi di tipo non tumorale è associata a: patologie reumatiche, preferibilmente artrite reumatoide e gotta; patologie infiammatorie del colon-retto, preferibilmente morbo di Crohn, colon irritabile e colite; patologie bronchiali, preferibilmente bronco pneumopatia cronica ostruttiva e asma; a patologie del fegato preferibilmente cirrosi e fibrosi; patologie della prostata, preferibilmente iperplasia prostatica e prostatite acuta/cronica; mucositi; dermatiti o lesioni preneoplastiche preferibilmente alla mammella, all'utero, al polmone o al cavo orale.
10. 10. Concentrato di acque di vegetazioni e/o sanse secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, o secondo la rivendicazione 7 per uso nell’inibizione della formazione di vasi sanguigni tumorali.
11. 11. Bevanda comprendente il concentrato di acque di vegetazioni e/o sanse secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, o secondo la rivendicazione 7.
12. 12. Bevanda secondo la rivendicazione 11 per uso nel trattamento e/o nella prevenzione dell’angiogenesi.
13. 13. Bevanda secondo la rivendicazione 12, in cui l’angiogenesi è di tipo patologico, preferibilmente l’angiogenesi è di tipo tumorale oppure l’angiogenesi è di tipo non tumorale.
14. 14. Bevanda secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-13, in cui detta bevanda è a base di acqua e/o frutta e/o latte, preferibilmente è a base di succo e/o mosto di uva.