CZ297575B6 - 3R-3´R Stereoizomer zeaxanthinu pro lécbu makulární degenerace u lidí - Google Patents

Abstract

Popisuje se pouzití 3R-3´R stereoizomeru zeaxanthinu, jako jediného detekovatelného izomeru, pro výrobu léciva nebo vitaminu u lidí, zvláste pro lécbu pacientu trpících makulární degenerací. Prípravky zeaxanthinu, které obsahují pouze pozadovaný 3R-3´R stereoizomer, mohou být produkovány kmenem Flavobacterium multivorum (prírustkové císlo ATCC 55238). Po syntéze mikrobiální fermentací je mozno zeaxanthin koncentrovat na úroven 5 az 20 % hmotnostních za pouzití jednoduchých a nenákladných metod,jako je extrakce rozpoustedlem. Jestlize je to zádoucí, muze se pouzitím jiných metod cistení dosáhnout daleko vyssí koncentrace. Dále se popisuje tableta nebo kapsle pro lécbu makulární degenerace ulidí s obsahem 3R-3´R stereoizomeru zeaxanthinu.

Description

(57) Anotace:

Popisuje se použití 3R-3'R stereoizomeru zeaxanthinu, jako jediného detekovatelného izomeru, pro výrobu léčiva nebo vitaminu u lidí, zvláště pro léčbu pacientů trpících makulární degenerací. Přípravky zeaxanthinu, které obsahují pouze požadovaný 3R-3'R stereoizomer, mohou být produkovány kmenem Flavobacterium multivorum (přírůstkové číslo ATCC 55238). Po syntéze mikrobiální fermentací je možno zeaxanthin koncentrovat na úroveň 5 až 20 % hmotnostních za použití jednoduchých a nenákladných metod, jako je extrakce rozpouštědlem. Jestliže je to žádoucí, může se použitím jiných metod čištěni dosáhnout daleko vyšší koncentrace. Dále se popisuje tableta nebo kapsle pro léčbu makulární degenerace u lidí s obsahem 3R-3'R stereoizomeru zeaxanthinu.

σ> CM N O

3R-3'R Stereoizomer zeaxanthinu pro léčbu makulární degenerace u lidí

Oblast techniky

Tento vynález náleží do oblasti biochemie a týká se jistého izomeru žlutého pigmentu, nazývaného zeaxanthin (zkratka ZX). Je-li podáván lidem jako lék nebo vitamin, může tento pigment léčit nebo předcházet onemocnění, které se nazývá makulární degenerace. Toto onemocnění poškozuje sítnici a může způsobit slepotu.

Dosavadní stav techniky

Sítnice je tkáň, která leží na zadní straně oční bulvy. Je velmi komplikovaná a obsahuje zhruba dvanáct různých vrstev. Sítnice je popsána a zobrazena v mnoha učebnicích medicíny, jako jsou publikace Gittinger, J. W., Manual of Clinical and Problém Ophthalmology, Little-Brown, 1988; a Vaughn, D. and Asbury, T., Generál Ophthalmology, 13^,h ed., Appleton and Lange, Norwalk, CT, 1992).

Speciální kruhová oblast nazývaná makula či skvrna, jejíž průměr u lidí je přibližně 1 až 1,5 milimetrů, se nachází ve středu sítnice. Makula má dvě charakteristiky, které ji odlišují od zbytku sítnice. Za prvé: makula obsahuje relativně málo tyčinek; většina zjejích fotoreceptorů má kónický tvar (v jamce (fovea), která se nachází v úplném středu makuly, se nevyskytují žádné tyčinky). A za druhé: makula má zřetelně žlutou barvu, což je způsobeno dvěma pigmenty nazývanými lutein a zeaxanthin. Oba patří do třídy molekul, které se nazývají „karotenoidy“. Chemie těchto karotenoidových pigmentů se popisuje dále v textu za popisem makulární degenerace.

Makulární degenerace

Termín „makulární degenerace“ se vztahuje na jakýkoli stav, který zahrnuje progresivní poškození buněk sítnice nebo fotoreceptorových čípků ve žluté makulární oblasti uprostřed sítnice. Je popsána a ilustrována v článcích a publikacích, jako jsou Taylor, A., et al. „Oxidation and aging: impact on vision,“ Journal of Toxicology and Industrial Health 9: 349-371 (1993), Gittinger, J. W., Manual of Clinical and Problém Ophthalmology, Little-Brown, 1988; a Vaughn, D. and Asbury, T., Generál Ophthalmology, 13^th ed., Appleton and Lange, Norwalk, CT, 1992).

Existuje několik typů makulární degenerace. Nejběžnější typ se nazývá „makulární degenerace spojená s věkem“, obvykle se zkracuje jako AMD (nebo se v některých článcích zkracuje jako ARMD, age-related macular degeneration). AMD může poškodit zrak v rozmezí od slabé ztráty zkratu až po celkovou slepotu.

Existují dvě formy AMD, často označované jako mokrá a suchá forma. Mokrá forma zahrnuje agresivní prorůstání kapilár a jiných krevních cév do sítnice až do okamžiku, kdy krevní cévy poruší a zničí organizaci vrstev sítnice. Ačkoli tato forma AMD se může někdy léčit použitím laseru, který lze použít pro uzavření nově vznikajících krevních cév, může léčba laserem pouze na určitou dobu zpomalit růst krevních cév a obvykle nemůže předejít konečné téměř úplné ztrátě zraku; mokrá AMD téměř vždy nakonec vede k úplné nebo téměř úplné slepotě. Mokrá forma se vyskytuje pouze u 5 až 10 % pacientů, trpících AMD.

Druhá forma AMD se nazývá „suchá“ forma AMD. Protože se tato forma vyskytuje nejméně u 90 % všech případů, často se označuje pouze jako AMD. Ačkoli tato forma AMD obvykle nevede k úplné slepotě, může silně poškodit zrak pacienta a činí pacienta neschopným číst nebo rozeznávat známé objekty, jako jsou obličeje přátel nebo příbuzných. Jako taková, často vede k funkční slepotě, což znamená, že lidé nejsou schopni na veřejnosti bezpečně řídit nebo chodit a nejsou schopni provozovat normální aktivitu.

- 1 CZ 297575 B6

Existuje také řada onemocnění, která zahrnují makulámí degeneraci jako symptom; sem patří Stargardtova nemoc, Bestova nemoc, Battenova nemoc, Sjogren-Larssonův syndrom, dystrofíe čípků a tyčinek a ovčí ceroidní lipofusfinóza. Články, popisující všechna tato onemocnění, jsou 5 citovány v publikaci Dorey, C. K., et al., „Lipofuscin in aged and AMD eyes,“ in Retinal Degeneration (Hollyfield et al., editors, Plenům Press, New York, 1993). S makulámí degenerací souvisejí i jiná onemocnění, která zahrnují problémy s uchováváním lysosomu (jako je Tay-Sachova nemoc) nebo progresivní degenerací nervových buněk (jako je Alzheimerova nemoc).

ío Rada těchto onemocnění má genetické složky, což prokazuje jejich dědičnost; byly izolovány některé geny, které způsobují taková onemocnění a test genového screeningu může ukázat, zda určitá osoba má defektní gen. Jakákoli osoba, která nese nebo pravděpodobně nese takový gen, což se prokáže genetickým vyšetřením nebo rodinnou anamnézou, má zvýšené riziko makulámí degenerace.

Tím, že lidi pomalu okrádá o zrak, způsobuje AMD velké utrpení svých obětí. Každoročně stojí miliardy dolarů jak ve ztrátě produktivity, tak ve velké zátěži členů rodiny, poskytovatelů pojištění, sociálních agentur a dalších, kteří musí poskytovat nebo pomáhat platit lékařskou péči a jinou pomoc lidem, kteří trpí slepotou nebo těžkým poškozením zraku.

Na základě problémů, které způsobuje AMD, vědci a lékaři po desetiletí hledají cesty, jak léčit nebo zabránit slepotě a jiným ztrátám vidění, které jsou způsobeny makulámí degenerací. Avšak navzdory veškerému úsilí, které se vyvíjí více jak půl století, dodnes není dostupná účinná léčba.

Diagnóza: drúzy a lipofuscin

Makulámí degenerace se obvykle diagnostikuje pořízením speciálních fotografií sítnice. Při jedné z diagnostických metod lékař zavede do pacienta fluorescentní látku, počká, až se látka rozšíří po těle pacienta a pak udělá zvětšenou fotografii sítnice, která se nazývá angiogram. Lékař pak ana30 lyžuje fotografii za účelem zjistit přítomnost a koncentraci jednoho nebo obou typů buněčného odpadu.

Jeden typ buněčného odpadu, který je znám a studován po několik desetiletí, se nazývá drúzy. Existuje ve dvou rozdílných formách. Malé množství tvrdých drúz (malé částice s průměrem 35 menším než 63 mikrometrů) se obvykle nacházejí v očích každého, do je starší 40 let. Pokud nejsou přítomny v abnormálním množství, tvrdé drúzy neindikují poškození sítnice.

Naopak podstatné množství usazenin větších měkkých drúz (které se také nazývají mokré drúzy) indikuje, že se objevilo nebo započalo podstatné poškození sítnice, protože velké hrudky měk40 kých drúz mohou poškodit a porušit organizaci vrstev sítnice a mohou zabránit přístupu výživy z krve do buněk sítnice. Na pacienta, jehož sítnice obsahují významné množství měkkých drúz, se obvykle nahlíží jako na trpícího makulámí degenerací.

Jiný typ odpadu sítnice, který se obvykle nachází u pacientů, kteří trpí makulámí degenerací, se 45 nazývá lipofuscin. Korelace mezi lipofuscinem a AMD se objasnila teprve nedávno (např.

Weiter, J. J., et al., „Centrál sparing in annular macular degeneration,“ Am. J. Ophthalmol. 106: 286-292 (1988), a Dorey, C. K., et al., „Lipofuscin in aged and AMD eyes,“ in Retinal Degeneration (Hollyfield et al., editors, Plenům Press, New York, 1993).

Chemie karotenoidů „Karotenoidy“ zahrnují velkou třídu molekul; v přírodě bylo identifikováno více než 600 karotenoidů. Tyto molekuly sdílejí několik rysů:

- 2 CZ 297575 B6

Karotenoidy vznikají spojováním molekul izoprenu, což je molekula spětí uhlíky. Protože stavební jednotka obsahuje 5 atomů uhlíku, obsahuje většina karotenoidů násobky pěti atomů uhlíku.

2. Karotenoidy obsahují násobné nenasycené vazby. To jim umožňuje absorbovat světelné vlny s vysokou energií v modré a blízké ultrafialové oblasti spektra.

3. Protože karotenoidy absorbují vlnové délky v modré a blízké ultrafialové oblasti spektra, aniž absorbují delší vlnové délky jiných oblastí spektra, mají obvykle žlutou, oranžovou, hnědou nebo červenou barvu. Název „karotenoidy“ je odvozen od karotky; první známé karotenoidy byly identifikovány jako pigmenty, které dávají karotce oranžovou barvu. Barva způsobená ίο karotenoidy v roztoku bude záviset na různých faktorech, mezi něž patří koncentrace a přítomnost jiných chemikálií.

4. Karotenoidy mají „konjugované“ dvojné vazby. To znamená, že dvojné vazby se střídají s jednoduchými vazbami, takže každý atom uhlíku v řetězci je vázán dvojnou vazbou k jednomu dalšímu atomu uhlíku, ale žádný uhlík není vázán dvojnou vazbou ke dvěma jiným uhlí- kům. Toto uspořádání je možné pochopit z obrázku č. 1, který ukazuje struktury β-karotenu,

ZX a luteinu.

Různé karotenoidy mají různou úroveň konjugace a obecně lze říct, že výše konjugovaná molekula poskytuje lepší ochranu proti „fototoxickému“ poškození ozářením světlem s vysokou ener20 gií. Například ve třech karotenoidech, které jsou na obrázku č. 1, je celá přímá část řetězce každého z nich konjugovaná se střídajícími se dvojnými a jednoduchými vazbami. U β-karotenu a ZX zasahuje konjugace k prvním vazbám v obou koncových kruzích. Naopak lutein obsahuje konjugaci na nižší úrovni, protože dvojná vazba v jednom z jeho koncových kruhů není správně umístěna pro celkovou konjugaci. Jediný rozdíl mezi ZX a luteinem je v umístění dvojné vazby 25 v jednom (ale ne v obou) koncových kruzích.

Protože karotenoidy jsou vytvořeny a vybrány (evolucí), aby absorbovaly potenciálně škodlivou energii modrého a ultrafialového světla, v přírodě se používají jako ochranné pigmenty. Ve velké míře se nacházejí v rostlinách, protože jedním z hlavních úkolů rostlin je absorbovat co nejvíce 30 slunečního světla za současné minimalizace poškození buněk způsobeného modiým, ultrafialovým a blízkým ultrafialovým zářením. Poškození rostlin ultrafialovým zářením je hlavní problém a karotenoidy ho napomáhají minimalizovat.

Protože karotenoidy jsou vhodné pro ochranu proti fototoxickému poškození, získala také zvířata 35 (prostřednictvím evoluce) způsob, jak využívat karotenoidy jako foto-ochranné pigmenty. Protože zvířata nemohou karotenoidy syntetizovat ve svém těle, musí karotenoidy (nebo jejich prekurzory) získávat z rostlinných zdrojů. Jedním z příkladů je β-karoten; savci ho musí získat z rostlin nebo z masa. Jakmile se β-karoten dostane do těla savce, mění se na jiné molekulové formy, mezi něž patří vitamin A (retinol), který se tvoří rozštěpením β-karotenu na dvě poloviny.

Karotenoidy se dělí na dvě hlavní třídy, karoteny a xanthofyly. Karoteny neobsahují žádný kyslík; jsou to pravé uhlovodíky tvořené pouze uhlíkem a vodíkem. Naopak xanthoíyly (jako je ZX a lutein) obsahují také kyslík.

Obrázek č. 1 ukazuje číslování atomů uhlíku v levém a pravém koncovém kruhu ZX. Podle pravidel jsou atomy uhlíku v levém koncovém kruhu číslovány od 1 do 6, zatímco atomy uhlíku v pravém koncovém kruhu jsou značeny čísly s čárkou, například uhlík 3' (čte se jako „tři s čárkou“). Protože ZX je s ohledem na levý a pravý konec zcela symetrický, termín „levý“ a „pravý“ je pouze konvence pro usnadnění diskuse. Avšak musí se poznamenat, že lutein symet50 rický není; poloha dvojné vazby v „levém“ kruhu není stejná jako umístění dvojné vazby v „pravém“ kruhu.

Protože ZX se tvoří přidáním dvou hydroxylových skupin k β-karotenu na uhlík č. 3 na obou koncích, je jeho chemický název 3,3'-dihydroxy-3~[3-karoten; někteří chemici ho označují jako karotendiol. Tato molekula byla nazvána „zeaxanthin“, protože byla poprvé identifikován jako pigment, který dává žlutou barvu kukuřici a vědecký název kukuřice je Zea mays.

Jak se uvádí shora v textu, bylo v přírodě identifikováno více než 600 karotenoidů. Několik desítek je jich důležitých v biochemii a pro komerční využití. Pro tento vynález jsou zvlášť významné ZX a lutein, protože jsou přítomny v sítnici savců a většina dalších zvířat.

Lutein je komerčně významný, protože je rozsáhle zkrmován kuřaty (ve formě rostlinných extraktů, hlavně z měsíčku), aby dodal jejich kůži a žloutku vajíček žlutější zbarvení, žádoucí pro nakupující a spotřebitele.

ZX může mít stejný účinek a je účinnější než lutein, ale zdroje ZX jsou příliš drahé pro použití v krmivech pro drůbež. Tento problém je řešen v patentech US 5 308 759 a 5 427 783 (autorem je Gierhart, majitelem Applied Food Biotechnology, lne.). Tyto patenty se týkají použití jako krmivo pro drůbež a ryby.

Kromě rostlin jsou některé karotenoidy syntetizovány některými bakteriemi. Tyto bakterie se vyvinuly na místech, vystavených přímému slunečnímu světlu, a jejich karotenoidy mají stejnou fotoohrannou úlohu jako u rostlin. Karotenoidy z bakterií popisují publikace McDermott et al., 1972, patent US 5 429 939 (Misawa, et al. 1995) a další články citované v těchto odkazech.

Patent US 5 429 939 (Misawa, et al. 1995) uvádí sekvence DNA řady genů, které kódují enzymy podílející se na biosyntéze různých karotenoidů i ZX. Je popsána úloha každého hlavního genu (mezi něž patří crtE, crtB, crtl, crtY a crtZ) při syntéze ZX. Buňky obsahující plazmidy a zahrnující tyto geny byly uloženy v instituci Američan Type Culture Collection (například Erwinia uredovora ATCC 19321 a Erwinia herbicola ATCC 39368) a v instituci Fermentation Research Institute v Japonsku (např. E. coli FERM BP 2377).

Stereochemie a izomery zeaxanthinu

Důležitý aspekt chemie karotenoidů je stereochemie a stereoizomeiy. Tento problém se vysvětluje v učebnicích vysokých škol organické chemie.

Kdykoli má organická molekula uhlíkový atom, k němuž jsou připojeny atomy nebo molekulové skupiny čtyř různých typů, nazývá se tento atom „chirální“ atom uhlíku.

Kdykoli je v organické molekule přítomen chirální atom uhlíku, pak čtyři různé skupiny, které jsou vázány na tento chirální atom uhlíku, mohou být uspořádány dvěma způsoby. Tato dvě rozdílná uspořádání se nazývají stereoizomery. Jeden z těchto izomerů bude stáčet polarizované světlo „doprava“, zatímco druhý stereoizomer bude stáčet polarizované světlo „doleva“. Izomer, který způsobuje rotaci doprava se nazývá R stereoizomer (také D stereoizomer). Izomer, který způsobuje rotaci doleva, se nazývá S stereoizomer (také L stereoizomer).

Protože oba atomy uhlíku č. 3 a 3' v ZX jsou chirální, molekula má čtyři možné stereoizomery. U 3R-3'R izomeru mají oba atomy uhlíku č. 3 a 3' konfiguraci R. V izomeru 3S-3'S mají oba atomy uhlíku č. 3 a 3' konfiguraci L. Tyto dva stereoizomery se zde označují jako R-R izomer a SS izomer.

Třetí a čtvrtý izomer jsou dva „smíšené“ nebo „meso“ (jeden R a jeden S) izomery: 3R-3'S izomer a 3S-3'R izomer. Protože ZX je zcela symetrický okolo svého středu, jsou tyto dva izomery v každém ohledu identické; jestliže je nakreslen na papíru izomer 3R-3'S, pootočením papíru se změní na 3S-3'R izomer. Oba izomery S-R a R-S vlastně tvoří jeden „meso“ izomer.

-4CZ 297575 B6

Jestliže se pro výrobu ZX používají standardní metody chemické syntézy, pak je přítomen každý ze čtyř možných izomerů jako asi 25% část celku. Protože však jsou S-R a R-S izomery ve skutečnosti identické, tvoří jejich „meso“ izomer 50 % celku, zatímco R-R a S-S izomeiy jsou přítomny každý v množství asi 25 %. Směs všech tří stereoizomerů se nazývá „racemická“ směs.

Buněčné a enzymatické specifikace karotenoidů v tkáni sítnice jsou však extrémně přesné a různé izomery nebo stereoizomery se nedají navzájem zaměnit. S luteinem a ZX zacházejí buňky sítnice jako se zcela odlišnými a různými molekulami, i když z pohledu konvenční chemické terminologie by vypadaly jako vzájemné izomery (protože mají stejný počet atomů uhlíku, vodíku a kyslíku).

Izomery, které jsou v tomto případě relevantní vzhledem k biologickým faktorům, jsou stereoizomery. Jakákoli zde uvedená zmínka o „izomeru“ zeaxanthinu se týká konkrétního stereoizomeru ZX a nezahrnuje lutein. Na lutein a ZX se pohlíží jako na zcela odlišné karotenoidy.

Stereoizomemí rozdíly mezi karotenoidy, které by se mohly zdát malé, sotva patrné a nevýznamné, jsou ve skutečnosti, pokud jde o tkáň sítnice, velmi důležité. Je zřejmé, že jediným stereoizomerem ZX, který je správně přijímán a využíván lidskými buňkami sítnice, je R-R izomer (3R-3'R stereoizomer).

Existují zmínky, že vtkáni sítnice byla nalezena stopová množství meso (R-S) izomeru ZX. Avšak tato stopová množství je pravděpodobně možno přisoudit určitým přeměnám molekul, ke kterým může spontánně docházet za některých podmínek a které vedou k vytvoření mesozeaxanthinu z prekurzorů luteinu (Bone R. A., et al., „Setereochemistry of the maxular carotenoids“, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34: 2033-2040 (1993) a Bone R. A., et al., „Distribution of macular pigment stereomers in individual eyes, including those with age-related macular degeneration (AMD),“ ARVO Abstracts: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35: 1502 (1994).

V laboratoři se dají stereoizomery ZX navzájem odlišit použitím metod, jako je chirální sloupcová chromatografíe (Bone R. A., et al., „Stereochemistry of the macular carotenoids,“ Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34: 2033-2040 (1993)) nebo analýza cirkulámího dichroismu (Britton 1994).

Zeaxanthin a lutein v makule

V roce 1970 již byla známa úloha karotenoidů při ochraně rostlin proti fototoxickému poškození. Bylo také známo, že karotenoidy se nacházejí v tkáni zvířat a že všechny karotenoidy ve zvířatech původně pocházejí z rostlin, protože zvířata nemohou karotenoidy syntetizovat. Na základě této informace byla v různých článcích zdůrazňována podobnost mezi karotenoidy vyskytujícími se u zvířat a v rostlinách a vyslovován závěr, že u zvířat karotenoidy působí jako ochrana proti fototoxickému poškození.

Poté, co byla rozpoznána úloha karotenoidů při ochraně proti světlu u zvířat, začali výzkumníci studovat chemii a úlohu karotenoidů v sítnici. Jedna linie experimentů zahrnovat testy, při nichž byla laboratorním zvířatům podávána dieta, která neobsahovala karotenoidy, vyrobená ze zrní nebo semen neobsahujících karotenoidy (jako jsou semena prosa). Výsledky ukázaly, že v sítnici u laboratorních zvířat, která nedostávají karotenoidy, se nevytvořily žádné oblasti žluté skvrny a že tyto sítnice obsahovaly abnormálně vysokou hladinu měkkých drúz, což indikuje poškození sítnice (Malinow, M. R., et al, „Diet-related macular anomalies in monkeys,“ Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 19: 857-863 (1980), Kirschfeld, K., „Carotenoid pigments: their possibile role in protecting against photooxidation in eyes and photoreceptor cells,“ Proč. R. Soc. Lond. B 216: 71-85 (1982), Ham, W. T., Jr. Et al, „Bacis mechanisms inderyling the production of photochemical lesions in the mammalian retina“, Current Eye Research 3: 165-174 (1984) a Snodderly, D. M., et al, „The macular pigment. I. Absorbance spectra, localization, and discrimi-5CZ 297575 B6 nation froin otheryellow pigments in primáte retinas,“ Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25: 660-673 (1984)). Na základě těchto zjištění činili výzkumníci závěr, že karotenoidy se zdají být pro zdravou sítnici nezbytné. Tito výzkumníci tak shromažďovali molekulární důkazy pro starou moudrost, že karotka a listnatá zelenina je zdraví pro oči. Vědci však dosud nevěděli, zda musejí být žluté pigmenty v makule požívány v konečné formě nebo zda mohou být syntetizovány ve zvířatech s použitím jiných prekurzorů, jako je beta-karoten nebo lykopen.

Lutein byl identifikován v roce 1949 jako jeden ze žlutých pigmentů v makule (Wald, G., The photochemistry of vision, „Doc. Ophthalmol. 3: 94 (1949). ZX byl identifikován jako druhý makulární pigment až o mnoho let později (Bone, R. A., „Preliminary identification of the human macular pigment,“ Vision Research 25: 1531-1535 (1985). Články, které shrnují informace o makulárních pigmentech, dostupné v polovině nebo na konci osmdesátých let, zahrnují publikace Handelman, G. J. and Dratz, E. A., „The role of antioxidants in retina and retinal pigment epithelium and the nátuře of prooxidant-induced damage,“ Adv. In Free Radical Biology and Medícine 2: 1-89 (1986), Werner, J. S., et al, „Aging and human macular pigment density,“ Vision Res. 27: 257-268 (1987), Pease, P. L., et al, „Optical density of human macular pigment,“ Vision. Res. 27: 705-710 (1987), Haegerstrom-Portnoy, G., „Short-wavelength-sensitive-cone sensitivity loss with aging: a protective role for macular pigment,“ J. Opt. Soc. Am. A5: 21402144 (1988), a Handelman, G. J., et al, „Carotenoids in the human macula and whole retina,“ Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: 850-855 (1988). Tyto články mimo jiné konstatovaly, že ZX (který je plně konjugován a proto nabízí poněkud lepší ochranu než lutein proti poškození způsobenému světelnou energií) je převládajícím pigmentem v jamce (fovea), malé oblasti v samém středu makuly. Při soustředném postupu ve směru od jamky k vnějším okrajům makuly se množství ZX postupně snižuje a množství luteinu roste, takže na vnějším obvodu makuly je dominantním žlutým pigmentem lutein. Mezi novější články, které se věnují mnoha aspektům poškození a stárnutí sítnice a které se specificky zaměřují na karotenoidy jako na ochranná činidla v sítnici, patří publikace Sperduto, R. D., et al, „Do we háve a nutritional treatment for age-related cataract or macular degeneration“, „Arch. Ophthalmol. 108: 1403-1405 (1990), Gerster, H„ „Review: antioxidant protection of the ageing macula,“ Age and Aging 20: 60-69 (1991), Schalch, W„ „Carotenoids in the retina - a review of their possibile role in preventing or limiting damage caused by light and oxygen,“ EXS 62: 280-298 (1992), a Seddon, J. M., et al „Dietary carotenoids, vitamins A, C, and E, and advanced age-related macular degeneration,“ JAMA 272: 1413-1420(1994).

Lze říci, že více jak deset let je známo, že lutein a ZX jsou dva pigmenty makuly a že vědci po více než deset let spekulují, že tyto pigmenty mohou pomáhat chránit makulu proti fototoxickému poškození.

Avšak navzdory skutečnosti, že tyto objevy a návrhy se všechny uskutečnily více jak před deseti lety, nikdo nevyvinul lék, nutriční nebo dietetický doplněk nebo jinou formu léčby, která by byla účinná při významné prevenci nebo zpomalení (nehledě na obrácení) postupné progrese makulární degenerace.

Právě uvedené tvrzení je třeba poněkud zmírnit, protože je známo, že beta-karoten, vitamin A a vitamin E mají určitý pozitivní účinek při ochraně tkáně sítnice (např. patent US 5 310 764, Baranowitz et al., 1994, Eye Disease Čase Control Study Group, „Antioxidant status and neovascular age-related macular degeneration,“ Arch. Ophthalmol. 11: 104-109 (1993), Eye Disease Čase Control Study Group, „Risk factors for neovascular age-related macular degeneration,“ Arch. Ophthalmol. 10: 1701-1708 (1992)). Tyto publikace uvádějí nebo naznačují, že beta-karoten, vitamin A a vitamin E mají detekovatelný účinek při prevenci nebo redukci poškození, které je spojené s makulární degenerací.

Tato tvrzení mohou být pravdivá vzhledem k obecně antioxidační roli karotenoidů, vitaminu A a vitaminu E. Avšak je také bohužel pravda, že přínos karotenoidů, vitaminu A a vitaminu E v sítnici je velmi limitován a nikdy nedosáhne úrovně účinné léčebné metody. Z mnoha praktic

-6CZ 297575 B6 kých důvodů se makulární degeneraci nedá předcházet, nedá se zastavit ani zvrátit. Libovolné širokospektrální antioxidanty (jako je beta-karoten, vitamin A a vitamin E) představují pouze paliativní opatření. Protože není k dispozici žádný skutečně účinný přípravek, používají se tyto vitaminy (s velice omezeným a neuspokojujícím účinkem) při pokusech o zpomalení úporného poškození způsobeného makulární degenerací.

Jako součást předchozího stavu techniky je třeba dále poznamenat, že řada obchodů s potravinami prodává karotenoidové přípravky, které se označují jako příznivě působící na zrak a vidění. Takové označení karotenoidových směsí může být přiměřené, protože (jak je uvedeno shora) beta-karoten a vitamin A jsou známy obecně jako antioxidanty. Avšak žádná komerčně dostupná směs karotenoidů neobsahuje více než extrémně malé „stopové“ množství ZX. Velkou část karotenoidů, které jsou obsaženy ve směsích prodávaných v obchodech s potravinami, tvoří jiné karotenoidy než zeaxanthin (hlavně beta-karoten a vitamin A).

Důkladné pozornosti jsou rovněž hodna stanoviska a výzkumné cíle několika významných vládních agentur a výzkumných konsorcií. V USA vydaly instituce National Institutes of Health (působící prostřednictvím National Eye Institute (NEI) a National Advisory Eye Council) dvě nedávné zprávy, nazvané „Vision Research: A National Pian 1994-1998,“ NIH Publication No. 93-3186 (1994; zvláště strana 55 až 65) a „Age related eye disease study,“ NIH Publication 93-2910 (1993). Obě tyto publikace a výzkum, který popisují, jsou zaměřeny na beta-karoten (nikoli na ZX) jako na sloučeninu, kteráje největším příslibem při léčbě AMD. Podle nejlepšího vědomí a domnění přihlašovatele tohoto vynálezu po prodiskutování s činiteli NEI, ani NEI ani jiná organizace podřízená National Institutes of Health nehodlá financovat ani v poslední době nefinancovala jakýkoli výzkum zeaxanthinu jako potenciálního prostředku pro léčbu AMD. Místo toho NIH a jiné zdaní placené organizace vynakládají milióny dolarů na výzkum betakarotenu jako nejslibnějšího potenciálního prostředku pro léčbu nebo prevenci AMD.

Jiní prominentní výzkumníci, kteří si zaslouží pečlivou pozornost, patří do výzkumné skupiny „Eye Disease Čase Control Study Group“. Tato skupina nedávno publikovala články s tituly „Antioxidant status and neovascular age-related for neovascular age-related macular degeneration,“ Arch. Ophthalmol. 10; 1701-1708 (1992). Stejně jako v oficiálních zprávách NIH, žádný z těchto článků nepopisuje ani nenavrhuje použití zeaxanthinu jako léku pro léčení AMD, a tato toto konsorcium také zavrhlo nebo odmítlo financovat jakýkoli výzkum na ZX jako na možném činidle pro léčbu nebo prevenci AMD.

Také je nutné poznamenat, že existuje velký zájem o karotenoidy pro léčbu a prevenci rakoviny (počínaje prací Peto, R„ et al., „Can dietary beta-carotene materially reduce human cancer retes?“ Nátuře 290: 201-208 (1981)) a pro prevenci tvorby cholesterolu a redukci usazování plaků uvnitř tepen (Jiakal, I. et al, „β-Carotene inhibits the oxidative modification of low-density lipoprotein,“ Biochimica et Biophysica Acta 1086: 134-138 (1991). Existuje velké množství vědecké literatury, která se zabývá různými aktivitami karotenoidů a existuje velký zájem o způsoby chemické syntézy karotenoidů včetně luteinu a ZX. Avšak navzdory všem studiím o karotenoidech a úsilí o syntézu v minulých desetiletích, dosud nikdo nezmiňuje účinnou metodu léčby nebo prevence makulární degenerace. Vzhledem k enormním nákladům a utrpení, které nesou oběti makulární degenerace a společnost, jedná se o velký problém, který musí být řešen.

Vynález nabízí potencionálně důležitý průlom, přičemž poskytuje (1) bezpečný a účinný lék pro léčbu pacientů, u kterých byla diagnostikována makulární degenerace, a (2) nutriční přípravek srovnatelný s vitaminovými pilulkami, který může být užíván každým, kdo chce omezit nebezpečí vzniku makulární degenerace po dosažení nebo překročení středního věku.

-7CZ 297575 B6

Syntéza luteinu a zeaxanthinu: Dosavadní stav

Dosavadní stav techniky popisuje způsoby tvorby ZX. Tyto dokumenty mohou být rozděleny do dvou kategorií: fermentační metody, ve kterých klíčovou úlohu ve výrobním procesu hrají mikroby; a nefermentační syntetické metody, ve kterých se používají čistě chemické reakce. Většina dosavadních prací naznačuje, že ZX by se měl používat pro už známé účely, například jako aditiva pro krmení drůbeže nebo ryb, pro ztmavování barvy masa k získání větší atraktivity. Žádné toto úsilí zjevně nevedlo k produkci nebo prodeji ZX v komerčním množství.

V říjnu 1995 jediný způsob, jak získat ZX, buď v čisté formě nebo v semi-koncentrované formě, kde ZX tvoří více než asi 5 % hmotnostních, vyžaduje nakoupit miligramová množství ZX od výrobců chemických specialit, jako je Atomergic Chemicals Corporation (Farmingdale, NY) nebo Spectrum Chemical Manufacturing Company (Gardena, CA). Ceny čištěného ZX od těchto výrobců specialit v roce 1995, v syntetických racemických směsích, které obsahují nežádoucí SS a S-R izomery, se pohybují v rozmezí od asi 90 dolarů do asi 125 dolarů za miligram. To je přibližně 100 000 dolarů (v US dolarech) za gram ZX v racemické směsi. Je jasné, že tyto přípravky nemohou být reálně použity jako léky nebo nutriční doplňky, jednak kvůli ceně a kvůli tomu, že obsahují velké množství nežádoucích a potenciálně nebezpečných S-S a meso izomerů. Až do doby, kdy vznikl tento vynález, není čistý nebo semi-čistý R-R zeaxanthin jednoduše dostupný veřejnosti v jakékoli formě.

Dosavadní stav techniky, který popisuje produkci ZX použitím mikrobiální fermentace zahrnuje:

(1) Courington and Goodwin 1955, což je první známá práce, popisující produkci ZX bakteriemi z rodu Flavobacter.

(2) US patent 3 891 504 (Schocher a Wiss, 1975, majitel Hoffman LaRoche) popisující také produkci ZX buňkami rodu Flavobacter. Buňky obsahující ZX se zkrmovaly kuřaty a způsobily jejich vhodné zabarvení.

(3) US patent 3 841 967 (Dasek et al, 1974) a US patent 3 951 743 (Shepherd et al., 1976). Oba patenty patří firmě Nestle. Popisují metody a živiny, které by mohly být použity pro zvýšení množství ZX produkovaného bakteriemi.

(4) Dva pozdější US patenty (US 5 308 759 a 5 427 783; původce Geirhart, majitel Applied Food Biotechnology, lne.). Popisují kmen bakterií (Flavobacterium multivorum), izolovaný z řečiště Missouri. Bylo objeveno, že tyto bakterie tvoří ZX, aniž by vytvářely podstatné množství dalších karotenoidů. To mělo význam při krmení drůbeže a ryb, aby jejich maso a žloutek měly tmavší barvu, protože po požití zvířetem karotenoidy navzájem soupeří o přijetí do krevního řečiště. Nepřítomnost jiných karotenoidů v případě kmene F. multivorum, identifikovaného Gierhartem, by tedy mohla znamenat více ZX dostupného jako pigment pro zvířecí tkáň a zvýšila by jeho sílu a účinnost.

US patent 5 308 759 nárokuje způsoby produkce ZX pro krmení drůbeže a ryb při použití bakterií F. multivorum AFB. Patent 5 427 783 (vyloučený) nárokuje krmné směsi. Oba patenty jsou omezeny na použití ZX v krmivu drůbeže nebo ryb a ani jeden z nich nenaznačuje nic o použití ZX pro léčbu lidí.

Žádný z Gierhartových patentů neuvádí nic o specifických stereoizomerech ZX, a to ze dvou důvodů: (1) status stereoizomerů ZX, vytvořených buňkami F. multivorum AFB, nebyl v roce 1989, kdy byla přihláška podána, znám, a (2) protože patenty se týkaly pouze tvorby ZX pro použití v krmivech drůbeže nebo ryb, zjevně neexistoval důvod se zabývat různými stereoizomery.

Kmen divokého typu F. multivorum AFB byl uložen v ATCC a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo 55238. Protože tyto bakterie tvoří jistý typ lipidů, které se nazývají sfingolipidy, ATCC překlasifikovala tyto bakterie jako Sphingobacterium multivorum a uvedla tyto buňky pod tímto

-8CZ 297575 B6 názvem ve svém katalogu. Název Sphingobacterium, který se objevuje v katalogu ATCC, se dosud nevyskytuje v žádné publikaci, které se považují za oficiální průvodce mikrobiální taxonomií: Bergy's Manual of Systematic Bacteriology, která je doplňována a aktualizována International Journal of Systematic Bacteriology.

Během posledních 20 let byly publikovány zprávy o úsilí připravit ZX standardní chemickou syntézou (bez použití mikrobů), zahrnující US patenty 4 153 615 (Saucy 1979), 4 952 716 (Lukac et al 1990) a 5 227 507 (Lukac et al 1993). Avšak tyto postupy mají vážné nedostatky. Typicky vyžadují řadu reakčních kroků a každý krok má menší výtěžek než 100 %, což znamená, že konečný výtěžek ZX na konci vícestupňového procesu je relativně nízký. Navíc chemickou syntézou obvykle vznikají nežádoucí S-S a S-R stereoizomery ZX, stejně jako různé konverzní a degradační produkty, jako je oxidovaný zeaxanthin, a molekuly zeaxanthinu, které ztratily jednu nebo více dvojných vazeb v přímé části nebo/a v koncových kruzích.

Před vznikem tohoto vynálezu tedy nebyl znám zdroj čistého R-R zeaxanthinu, vhodný pro lidskou spotřebu, buď jako léčivo nebo jako nutriční doplněk.

Účelem vynálezu je zjištění, že kmen F. multivorum AFB (přírůstkové číslo ATCC 55238) ajeho mutagenizovaní potomci generují R-R stereoizomer ZX jako jediný detekovatelný izomer s nedetekovatelným množstvím nežádoucích S-S nebo S-R stereoizomerů.

Dále je účelem vynálezu nalézt způsob použití buněk odvozených z kmene F. multivorum AFB (přírůstkové číslo ATCC 55238) pro výrobu léčiva pro léčbu pacientů s diagnózou makulámí degenerace, zvláště pak makulámí degenerace související s věkem.

Dále je účelem vynálezu nalézt způsob použití buněk odvozených z kmene F. multivorum AFB (přírůstkové číslo ATCC 55238) pro výrobu nutričního doplňku pro lidi ve formách, srovnatelných s vitaminovými pilulkami, nebo jako přísada do potravin, jako je margarin, pro snížení nebezpečí vzniku makulámí degenerace později během života.

Dále je účelem vynálezu nalézt přípravky zeaxanthinu, které obsahují R-R stereoizomer jako hlavní nebo silně dominantní izomer, ve formulacích, které jsou vhodné pro orální aplikaci u lidí, buď jako léčivo pro léčbu onemocnění nebo degenerace sítnice nebo jako nutriční doplněk pro snížení nebezpečí ztráty vidění u starých lidí.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití 3R-3'R stereoizomerů zeaxanthinu pro výrobu léčiva pro léčbu makulámí degenerace u lidí, kde alespoň 90 % všech molekul zeaxanthinu v uvedeném léčivu tvoří 3R-3'R stereoizomer zeaxanthinu a léčivo je upraveno v lékové formě a obsahuje alespoň 3 mg 3R-3'R stereoizomerů zeaxanthinu na dávku.

Předmětem vynálezu je dále použití 3R-3'R stereoizomerů zeaxanthinu pro výrobu léčiva nebo nutričního doplňku pro profylaxi makulámí degenerace u lidí, kde alespoň 90 % všech molekul zeaxanthinu v uvedeném léčivu nebo nutričním doplňku tvoří 3R-3'R stereoizomer zeaxanthinu a léčivo nebo nutriční doplněk je upraven v lékové formě a obsahuje alespoň 0,5 mg 3R-3'R stereoizomerů zeaxanthinu na dávku.

Léčivo nebo nutriční doplněk podle vynálezu obsahuje 3R-3'R stereoizomer (nazývaný také R-R izomer nebo R-R zeaxanthin) jako jediný detekovatelný nebo silně převládající izomer. ZX, nažloutlý pigment v buňkách makuly lidské sítnice, absorbuje záření modrého a blízkého ultrafialového světla, přičemž chrání sítnici proti fototoxickému poškození. Přípravky ZX, které obsahují pouze požadovaný izomer R-R, jsou produkovány buňkami kmene Flavobacterium multi

-9CZ 297575 B6 vorům (přírůstkové číslo ATCC 55238). Tyto bakterie netvoří detekovatelné množství nežádoucích S-S nebo S-R stereoizomerů a nesyntetizují podstatné množství jiných karotenoidů, jako je beta-karoten nebo lutein, které by mohly soupeřit se ZX při využití potravy po orálním požití. Po syntéze, při které se používají tyto bakterie, je možno ZX Čistit způsoby jako je extrakce rozpouštědlem a může být používán orálně, buď jako terapeutické léčivo pacienty, kteří trpí makulární degenerací, nebo jako nutriční doplněk kýmkoli, kdo chce snížit nebezpečí vzniku makulámí degenerace související s věkem, která je široce rozšířena mezi lidmi ve věku nad asi 50 nebo 60 let. Vynález je možno použít pro výrobu potravinářských formulací, jako jsou (1) vodě odolné kapsle obsahující R-R zeaxanthin smíšený s nosičem, jako je rostlinný olej; (2) různé potraviny (jako je margarin, mléčné výrobky, sirup, těsto na sušenky a masné výrobky, které nejsou určeny k dlouhému vaření), které obsahují R-R zeaxanthin jako přísadu; a (3) granulované formulace, které mohou být přidávány do polévek, salátů, nápojů nebo jiných potravin.

Vynález je možno použít k výrobě léčiva nebo nutriční formulace pro podávání lidem za účelem prevence nebo redukce makulámí degenerace, což je onemocnění, které poškozuje vidění a může způsobit slepotu. Přípravky zeaxanthinu určené pro konzumaci u lidí by měly obsahovat 3R-3'R stereoizomer ZX (pro pohodlnost také nazývaný R-R izomer nebo R-R zeaxanthin) jako „silně převládající“ izomer. „Silně převládající izomer“, jak se zde definuje, se vztahuje na přípravek, který obsahuje nejméně 90 % nebo více R-R izomeru s množstvím nežádoucích S-S nebo S-R izomerů, které je menší než 10 % veškerého zeaxanthinu v přípravku. Upřednostňují se přípravky určené pro použití u lidí, které obsahují R-R izomer ZX jako jediný detekovatelný izomer bez detekovatelného množství nežádoucích S-S nebo S-R izomerů. Takové přípravky popisuje tento vynálezu.

Nedávno se zjistilo použitím analýzy pomocí chirální sloupcové chromatografie (jak popsáno v Bone R. A., et al., „Stereochemistry of the macular carotenoids,“ Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34: 2033-2040 (1993)), že bakteriální kmen F. multivorum (přírůstkové číslo ATCC 55238), izolovaný firmou Applied Food Biotechnology (AFB) vytváří R-R izomer jako jediný detekovatelný izomer ZX, je-li fermentován způsobem popsaným v příkladech. Jak je uvedeno v příkladu 4, analýza provedená profesorem Landrumem ukázala, že v přípravcích ZX vytvořených fermentací těchto buněk tohoto kmene F. multivorum neexistovalo detekovatelné množství ani S-S izomeru ani R-S meso izomeru.

Rozdíly mezi R-R, R-S nebo S-S izomery zeaxanthinu jsou velmi důležité, jestliže se přípravky ZX podávají lidem jako léčivo nebo nutriční doplněk, protože jediným izomerem ZX, který se přirozeně vyskytuje v sítnici lidí, je R-R izomer. Má se za to, že požití podstatného množství RS a S-S izomerů by bylo z lékařského hlediska vysoce nežádoucí a nebezpečné, protože (1) R-S a S-S izomery se přirozeně v lidské sítnici nevyskytují, kromě případných extrémně malých „stopových“ množství jako vedlejších produktů, které se tvoří při degradaci luteinu uvnitř buněk sítnice, a (2) R-S a S-S izomery by mohly v tkáni sítnice konkurenčně nahradit požadovaný R-R izomer, což by pravděpodobně vedlo k vážnému dlouhodobému poškození buněk a ke komplikacím.

Stereoizomemí čistota přípravků ZX, získaných fermentací kmene F. multivorum podle vynálezu, je vysoce cenná, protože u chemicky syntetizovaného ZX je velmi obtížné a nákladné oddělit stereoizomery. Ačkoli separace stereoizomerů může být v malém laboratorním měřítku proveditelná, je neúměrně nákladná v komerčním měřítku.

Použití R-R zeaxanthinu jako předepisovaného léčiva pro pacienty s AMD

Přípravek R-R zeaxanthinu podle vynálezu může být formulován a podáván jako léčivo, to je jako medikament, který může být předepisuje lékařem za účelem léčby pacientů, u kterých byla diagnostikována makulární degenerace nebo onemocnění, které může vyvolat makulámí degeneraci jako symptom nebo projev, jako je Stargardtova nemoc, Bestova nemoc, Battenova nemoc,

- 10CZ 297575 B6

Sjogren-Larssonův syndrom, dystrofie čípků a tyčinek a ovčí ceroidní lipofuscinóza nebo problémy s uchováváním lysosomu, jako je Tay-Sachova nemoc.

Je-li přípravek ZX používán pro takovou léčbu, musí obsahovat dostatečné množství R-R izomeru ZX, aby dosáhlo úrovně terapeutického činidla, v nosné látce nebo formě (jako jsou kapsle), vhodných pro podávání lidem, jak se popisuje dále v textu. V preferovaném provedení vynálezu je ZX pro léčebné použití zabalen ve formě jednotkové dávky, jako jsou kapsle nebo tablety. Každá dávka by měla přednostně obsahovat nejméně asi 1 miligram (mg) R-R zeaxanthinu a podle potřeby může pro dosažení lepší terapeutické účinnosti obsahovat zeaxanthin v rozmezí asi 3 mg až asi 10 mg.

Přípravek R-R zeaxanthinu podle vynálezu může být dále formulován a podáván jako profylaktické léčivo pro pacienty, u kterých byla diagnostikována zvýšená náchylnost k makulámí degeneraci, například v důsledku rodinné anamnézy nebo genové diagnózy kteréhokoli z výše uvedených onemocnění. Jednotkové dávky, připravované pro podávání takovýmto pacientům, u kterých existuje zvýšené riziko AMD, ale dosud ještě neonemocněli aktuální AMD, mohou obsahovat menší množství aktivní látky, jako je asi 0,1 mg až asi 2mg na dávku.

Jakékoli takovéto dávky mohou být podle vynálezu poskytovány s komerčně přiměřenými náklady. Kapsle obsahující 25 miligramů (nebo menší množství) v olejovité nosné kapalině, mohou být připraveny ekonomickým způsobem za použití mikrobiální fermentace spojené s krokem extrakce rozpouštědlem. Jestliže se použije intenzivnější čištění, například jak se popisuje v příkladu 4, mohou být také připravovány práškové formulace, které obsahují ještě vyšší množství (jako je 100 mg nebo více na dávku).

Použití R-R zeaxanthinu jako vitaminu nebo nutričního doplňku

ZX může být podle vynálezu dále vyráběn a balen ve formě vitaminu nebo nutričního doplňku nebo přísady do jídla, pro spotřebu u lidí, kteří v dané době netrpí makulámí degenerací, ale chtějí snížit nebezpečí vzniku makulámí degenerace později během života. Pro použití pro tyto účely musejí být příslušné dávky podstatně vyšší než stopová množství, která se nalézají v preparátech dostupných dnes v prodejnách zdravých potravin, mohou být však nižší než v případech, kdy se ZX používá jako terapeutické léčivo pro lidi, u kterých byla diagnostikována AMD. Vhodné denní dávky se pohybují v rozmezí asi 0,05 mg až asi 5 mg. Například dávka 0,05 až 1,0 mg bude vhodná v případě, že R-R zeaxanthin je jedním z dvanácti nebo více činidel v multivitaminové kapsli nebo tabletě, zatímco dávka 1 až 5 mg by měla být k dispozici při nákupu přes pult pro lidi, kteří chtějí vyšší dávky.

Bez ohledu na to, zda se používá jako terapeutické léčivo nebo nutriční doplněk, měl by preparát ZX určený pro humánní použití, obsahovat R-R izomer jako jediný nebo „silně dominantní stereoizomer“ ZX. Termín „silně dominantní stereoizomer“ zde popisuje přípravek ZX, ve kterém požadovaný R-R izomer ZX představuje nejméně 90 % veškerého ZX ve směsi a nežádoucí izomery S-S nebo S-R jsou ve směsi zastoupeny méně než asi 10 %.

Upřednostňuje se, aby R-R izomer byl v libovolném přípravku určeném pro lidskou spotřebu jediným detekovatelným izomerem ZX. To je umožněno v komerčních objemech a za přijatelných nákladů použití tohoto vynálezu, protože zde popsaná bakteriální linie F. multivorum tvoří R-R izomer jako jediný detekovatelný stereo izomer ZX. V případě, že jsou ve fermentační směsi po izolaci přítomny jakékoli S-S nebo S-R izomery, jejich množství je příliš malé, aby mohlo být detekováno metodami, které se popisují v příkladu 4.

Na rozdíl od většiny bakteriálních kmenů zde popsané buňky F. multivorum navíc netvoří směs karotenoidů; tyto buňky tvoří R-R zeaxanthin jako jediná detekovatelný karotenoid. Protože ZX musí z hlediska příjmu z potravy a ukládání do tkáně soutěžit s jinými karotenoidy, může být tato skutečnost užitečná při zvýšení příjmu ZX a ukládání do buněk sítnice po orálním požití, zvláště

- 11 CZ 297575 B6 v příkladech, kdy se ZX používá jako léčivo pro léčbu diagnostikovaných případů makulámí degenerace.

Výroba v komerčním měřítku bakteriální fermentací

Jak je známo v oboru, způsoby používané pro fermentaci bakterií v laboratorním měřítku jsou po konverzi na velkoobjemové výrobní operace nákladné a těžko řiditelné. Vynález tedy vyvinul zdokonalené výživové přípravky a způsoby pro komerční použití s buňkami F. multivorum. Právě se zdokonalenými přípravky a způsoby je daleko jednodušší a náklady na gram vyrobeného ZX jsou nižší než s použitím médií a podmínek fermentace popsaných v US patentech 5 308 759 a 5 427 783. Preferované přípravky a podmínky se popisují v příkladu 1.

Po fermentaci, aby se předešlo degradaci ZX během čištění, se v buňkách přidá jedna nebo více stabilizačních látek. Stabilizátory mohou být přidávány k buňkám, pokud jsou ještě ve fermentoru, předtím než začne pasterizace nebo jiné zpracování. Testovala se řada stabilizátorů, nejlepších výsledků bylo dosud dosaženo s kombinací stabilizátorů, které jsou uvedeny v příkladu 2.

Po přidání stabilizátorů se bakterie mohou pasterizovat při teplotě 55 °C po dobu 25 minut, za účelem usmrcení buněk, aniž by se poškodil ZX. Kultura se pak ochladí na teplotu místnosti a kapalina se z buněk odstraní mechanickým způsobem, jako je mikrofiltrace s příčným tokem. Tímto způsobem se mohou buňky a pevné látky zakoncentrovat z počáteční hodnoty 10% na koncentraci po filtraci asi 60 až 80 % objemových. Tak vznikne pasta buněk.

Je možné, že buňky F. multivorum, inaktivní a popřípadě v živém stavu, mhou být vhodné pro přímou konzumaci lidmi, podobně jako jiné potraviny (sýry, jogurty, pivo atd.), které obsahují živé nebo usmrcené, avšak intaktní mikrobiální buňky. Neexistuje žádná známá patogenita, související s buňkami F. multivorum. Tyto buňky byly izolovány za studených vod, a protože jsou adaptovány na život ve studené vodě, nemohou dobře přežívat nebo se reprodukovat při teplotě lidského těla. Navíc nemají tyto buňky žádné známé toxické složky; jsou gramnegativní a nemají struktury buněčných stěn, které charakterizují gram-pozitivní bakterie. Při přímém podávání ptáků nebo rybám ve formě buněčné pasty se bakteriální buňky zdály vhodným vehikulem. Po požití buněk zvířata byl ZX uvolňován a absorbován do krevního řečiště a ukládal se na správných místech do různých tkání (včetně sítnice).

Intaktní buňky F. multivorum, obsahující R-R zeaxanthin, tedy mohou být vhodné pro přímou lidskou spotřebu, je-li to žádoucí, v kterékoli ze tří forem: (1) v intaktní živé formě, (2) v intaktní usmrcené formě po pasterizaci nebo (3) ve formulaci, v níž byly bakteriální buňky usmrcena a jejich membrány rozrušeny, aby došlo k otevření buněk a zpřístupnění ZX. Toho je možno dosáhnout sonifíkací (s použitím vysokofrekvenčních zvukových vln), vysokým tlakem nebo rozemletím. Alternativně je možno tento stupeň vynechat, použije-li se postup extrakce rozpouštědlem, který narušuje buněčné membrány.

Je-li to žádoucí, může příprava ZX zahrnovat krok promývání buněk, při kterém dojde k odstranění zbylých živin a odpadních metabolitů po fermentaci, proplachováním buněk roztokem, obsahujícím jakékoli požadované přísady, jako jsou stabilizátory, konzervační činidla, aromatizační činidla atd.

Čištění

Je-li to žádoucí, je možno buněčnou pastu (buď s intaktními nebo rozrušenými buňkami) sušit, aby došlo k dalšímu zakoncentrování buněk a ZX v suché hmotě. To je možno provádět mechanickými způsoby, jako je sprejové sušení (použitím tepla) nebo lyofilizace (sušení při teplotě hluboko pod bodem mrazu za vakua). Jestliže se používá sušení, pak se výsledný pevný zbytek obvykle označuje jako sušená biomasa; ta obvykle obsahuje asi 1 až 10 % hmotnostních ZX,

- 12CZ 297575 B6 vedle jiného pevného podílu buněk, zbytkového pevného podílu z fermentačního média a shora popsaných stabilizátorů.

Před nebo po (nebo místo) otevření buněk nebo sušení může proběhnout extrakční krok za účelem zakoncentrování ZX, který se hromadí hlavně v buněčných membránách. Vhodná rozpouštědla pro extrakci obecně zahrnují polární organická rozpouštědla. Dosud nejvhodnějším rozpouštědlem se jeví tetrahydrofuran (THF), který agresivně působí na buňky a při jehož použití není nutný samostatný krok rozrušování buněčných membrán. Ačkoli v laboratorním měřítku při použití THF nebylo míchání nutné, při komerční výrobě během kroku směšování rozpouštědla míchání pravděpodobně nutné bude.

Testovala se a nadále se budou testovat a hodnotit i jiná rozpouštědla, ale žádné z dosud testovaných rozpouštědel nefungovalo tak dobře jako THF. Dosud testovaná organická rozpouštědla, která neobsahují kruhovou strukturu (jako je aceton a diethylether), mají nižší rozpustnost ZX, zatímco jiná rozpouštědla, jako jsou methanol, ethanol a hexan, mají dokonce ještě nižší rozpustnost ZX.

Rozpouštědlo se smíchá s buněčnou pastou nebo sušenou biomasou za podmínek, které umožní, aby rozpouštědlo rozpustilo co nejvíce ZX. Rozpuštěná kapalná frakce se pak oddělí od pevné frakce způsobem, kterým může být centrifugace nebo filtrace. Pevné látky se mohou odstranit nebo se mohou použít jako surovina pro jiné zpracování (mezi něž patří opakované cykly extrakce rozpouštědlem, jestliže se požadují). Z kapalné frakce se dále odstraňuje rozpouštědlo, obvykle odpařováním. Výsledkem je viskózní olej obsahující R-R zeaxanthin spolu s jinými rozpustnými složkami, které se do rozpouštědla uvolnily z buněčné pasty. Jestliže byla v případě buněk, které obsahují 1 až 3 objemová procenta ZX, použita extrakce v jednom cyklu sTHF a jestliže byl THF následně odstraněn odpařením, obsahoval výsledný roztok asi 5 až asi 20 % hmotnostních ZX.

Jiný typ extrakce rozpouštědlem, který vykazuje dobře předběžné výsledky, zahrnuje použití nadkritické kapaliny (tj. sloučeniny, které je za normálního atmosférického tlaku plynná, ale při zvýšeném tlaku přechází na kapalné skupenství a působí jako rozpouštědlo). Nejrozšířenějším rozpouštědlem, které se používá při nadkritické extrakci, je oxid uhličitý a jsou k dispozici extrakční systémy CO₂ v komerčním měřítku. V takových systémech se zkapalněný oxid uhličitý mísí s buněčnou pastou nebo sušenou biomasou ve vysokotlaké reakční nádobě. Kapalina pak prochází sérií komor, kde se postupně snižuje tlak. ZX se za dosti vysokého tlaku sráží z roztoku a tak se může izolovat během částečného kroku, při kterém se sníží tlak, zatímco převážná část nečistot zůstává rozpuštěná v oxidu uhličitém a odchází do dalších reakčních komor, kde se dále redikuje tlak. Účinnost nadkritické extrakce se může dále zvýšit použitím unášeče (jako je ethanol, propylenglykol nebo ethylacetát). Několik takových unášečů se předběžně testovalo a vykazují podstatné zvýšení rozpustnosti ZX v nadkritickém oxidu uhličitém.

Ačkoli při nadkritické extrakci se široce používá oxid uhličitý, používají se i jiné sloučeniny (zahrnují různé dusíkaté nebo chlorfluoruhlíkaté sloučeniny). Za účelem určit, zdaje rozpouštědlo vhodné pro izolaci ZX z bakterií podle vynálezu, je možno testovat jakékoli takové rozpouštědlo, které mění své skupenství z plynného na kapalné v závislosti na tlaku.

Je-li to žádoucí, může být olejovitá tekutina obsahující ZX, vzniklá rozpouštědlovou nebo nadkritickou extrakcí, smísena s nosnou látkou, jako je rostlinný olej, a pak uzavřena v kapslí určené pro požití lidmi, aniž by bylo nutné další čištění ZX. Vynález tak poskytuje ekonomický způsob výroby semi-izolované stravitelné formy R-R zeaxanthinu, dostupné pro humánní aplikaci, buď jako léčivo pro lidi trpící makulámí degenerací nebo jako nutriční doplněk v případě lidí, kteří chtějí redukovat nebezpečí pozdějšího vzniku makulámí degenerace.

V jiném případě může být R-R zeaxanthin, který je obsažen v semiizolované olejovité kapalině dále čištěn za účelem zvýšení koncentrace ZX a odstranění veškerých nečistot. Je to možno pro

- 13CZ 297575 B6 vádět způsoby, jako jsou (1) systémy s dvěma rozpouštědly, kde se používají v kombinaci dvě vybraná rozpouštědla; (2) adsorpce na substrátu (jako je tkané filtrační lože), který podporuje krystalizaci ZX; nebo (3) protiproudá chromatografie. Chromatografická metoda, použitá k vyčištění ZX na čistotou asi 97 %, se popisuje v příkladu 4.

Čisticí postupy pro další karotenoidy se popisují v US patentech 5 382 714 (Khachik, (1995)) a 4 851 339 (Hills 1989). S ohledem na chemickou podobnost bude pravděpodobně jakýkoli způsob, jímž je možno čistit beta-karoten nebo lutein, poskytovat dobré výsledky i při čištění ZX.

Způsoby aplikace

Preferovaným způsobem aplikace ZX u lidí za účelem ochrany sítnice je orální aplikace ve formě denních nebo týdenních kapslí nebo použití potravin nebo přísad do jídla doplněných ZX, jak se popisuje dále v textu. Léčba nevyžaduje pravidelné podávání v pevných intervalech (jako jsou denní nebo týdenní pilule), ale místo toho spočívá v příležitostném, přerušovaném požívání, umožňujícím ponechání přiměřené doby (například jednoho nebo více dní, přednostně méně než týdne mezi jednotlivými dávkami, což umožňuje postupné ukládání malých množství ZX v tkáni makuly. Stejně jako je tomu s každým vitaminovým doplňkem tak i u ZX platí, že i jediná dávka může mít pozitivní účinek, ale nemusí mít stejně příznivý účinek během několika let jako opakované malé dávky. Studie příjmu karotenoidů savci ukazují, že vzhledem k „zátěžovým“ faktorům, které se projevují na koncentraci v krvi, je denní aplikace výhodnější než týdenní nebo jiná sporadická aplikace.

Protože využití karotenoidů při orální aplikaci je spíše relativně nízké, může být žádoucí, aby pacienti s těžkou makulámí degenerací používali jiné formy aplikace, jako je intramuskulámí nebo intravenózní injekce nebo implantace zařízení pro pomalé uvolňování. Nosičové formulace aplikovatelné injekcí mohou zahrnovat vodu, pufrující činidlo a organickou sloučeninu s několika hydroxylovými skupinami, jak je propylenglykol., dextran nebo cyklodextrin.

Pro orální aplikaci se mohou použít různé formy balení, pokud je ZX chráněn před oxidací a počítá se s olejovou podstatou ZX. Příklady vhodných kompozic pro orální aplikaci zahrnují:

(a) stravitelné vodotěsné kapsle obsahující tekutinu, mající takovou velikost, aby mohly být spolknuty v neporušeném stavu, farmakologicky přijatelné, přičemž kapalina v nich obsažená obsahuje R-R zeaxanthin smíchaný s vhodným nosičem nebo ředidlem, jako je rostlinný olej. Je-li to žádoucí, může být roztok ZX uzavřen v mikrokapslích nebo v micelách, jak se popisuje v příkladech 9 nebo 10, čímž se ZX chrání proti degradaci v žaludku. Takové kapsle mohou být vyráběny z relativně rigidního, tuhého materiálu nebo z pružného materiálu, který se běžně používá pro přípravu kapslí obsahujících vitamin E. Jestliže jsou kapsle vyrobeny z materiálu, který odolává kyselosti v žaludku a štěpí se enzymy ve střevech, pak ZX může být chráněn proti degradaci v žaludku a je možno zvýšit jeho biodostupnost. Avšak je známo, že alespoň část ZX, který vstupuje do žaludku jako složka rozžvýkané rostlinné hmoty, může projít žaludkem v nepoškozeném stavu, proto není nezbytné chránit ZX proti kyselosti žaludku a volba materiálu kapsle je spíše ekonomickou otázku.

(b) tabletu vhodnou pro orální použití člověkem, která obsahuje R-R zeaxanthin a stlačitelný pojivý materiál, který je kompatibilní s zeaxanthinem a způsobuje, že tableta si ponechává po lisování vhodným tlakem svůj tvar, přičemž tableta je farmakologicky přijatelná a její velikost je přizpůsobena k polykání bez porušení. Je-li to žádoucí, tableta může být potažena, aby ZX byl ochráněn před kyselostí v žaludku.

(c) kompozici obsahující potravinu pro lidskou spotřebu, která je nutričně přijatelná a má příjemnou chuť, je vhodná jako nosič zeaxanthinu a obsahuje R-R zeaxanthin jako přísadu. ZX je pigment žluto-oranžové barvy se stejnými obecně hydrofobními charakteristikami jako rostlinný olej, pokrmový tuk a kuřecí tuk; podobně také zbarvuje potraviny jako jiné karotenoidy např. beta-karoten. Může se tedy přidávat jako nutriční zbarvující činidlo k různým potravinářským výrobkům, jako jsou margarin, mléčné produkty, sirup, peká

- 14CZ 297575 B6 renské výrobky, těsto na sušenky, třené těsto na sladké pečivo, přípravky z masa, které nejsou určeny k dlouhému vaření, a přísady do polévek. Jiné vhodné potraviny mohou zahrnovat granulované formulace, jako jsou solené nebo kořeněné ochucovací směsi, používané do polévek, salátů, pro pečení atd. Je-li to žádoucí, granulované formace mohou být chráněny potahem za účelem redukovat degradaci ZX v kyselém prostředí žaludku. Mezi četné publikace popisující použití beta-karotenu a jiných karotenoidů jako potravinářských barviv a nutričních doplňků patří například Klaui et al 1970; Klaui and Bauernfeind, J.C. (ed.), Carotenoids ad Colorants and Vitamin A Precursor: Technological and Nutritional Applications (Academie Press, New York, (1981); Colombo and Gerber 1991, a US patenty č. 4 552 743 (Hom et al 1985), 5 180 747 (Matsuda et al 1993), 5 530 773 (Schweikert et al 1994) a 5 356 636 (Schneider et al 1994). Vzhledem k chemické podobnosti uvedených látek bude libovolná metoda přidání beta-karotenu nebo luteinu do potravin určených pro lidi rovněž pravděpodobně přímo aplikovatelná na R-R zeaxanthin.

(d) kompozici zahrnující potravinu určenou pro orální lidskou spotřebu, kde potravina obsahuje mikrobiální buňky, které jsou pro lidi neškodné a které obsahují R-R izomer zeaxanthinu. Takové potraviny mohou být vybrány ze skupiny, zahrnující sýry, jogurty, mléko a pivo. Jeli to žádoucí, používají se živé mikrobiální buňky nebo mohou být tyto buňky usmrceny způsobem, jako je pasterizace nebo fragmentace.

Pro další různá použití mohou být proveditelné i jiné formy balení.

Testy R-R zeaxanthinu na zvířatech

U ZX, který se syntetizoval použitím buněk F. multivorum odvozených z buněčné linie ATCC 55238, se testovala schopnost ochrany sítnice ptačího druhu Coturnix coturnic japonica, který se běžně nazývá japonská křepelka. Tento druh poskytuje vhodný zvířecí model makulámí degenerace u licí, což je způsobeno řadou faktorů, které zahrnují:

(1) Celá sítnice japonské křepelky se podobá v řadě důležitých aspektů lidské makule. Například sítnice křepelky obsahuje jak ZX tak i lutein a podobně jako lidská makula je spíše bohatá na fotoreceptorové čípky než tyčinky.

(2) Sítnice japonské křepelky vykazuje některé stejné patologické indikátory jako lidské sítnice. Například v sítnici japonské křepelky se hromadí měkké drúzy a lipofuscin, které jsou úzce spojeny se vznikem AMD u lidí.

(3) Ačkoli sítnice křepelky jsou daleko menší než lidské, celá sítnice křepelky je žlutá, což je způsobeno přítomnosti ZX a luteinu. Tato skutečnost umožňuje, že celá sítnice slouží jako model malé makulámí oblasti ve středu lidské sítnice a umožňuje daleko jednodušší analýzu a pozorování.

(4) Sítnice u japonské křepelky je bez cév a má strukturu podobnou foveální oblasti lidské sítnice.

(5) Slepice japonské křepelky žijí přibližně 1 až 1,5 roku a kohouti 3 až 4 roky. To umožňuje studovat procesy stárnutí, což by bylo velmi obtížné u jiných druhů, které žijí déle.

Tyto faktory jsou podrobněji diskutovány v publikacích Fite et al 1991 a Fite et al 1993.

Testy se popisují v příkladech 5 až 8. Výsledky jsou vynikající a jasně dokumentují, že R-R zeaxanthin produkovaný buňkami F. multivorum se (1) po orálním použití správně ukládá v makule a (2) je vysoce účinná při ochraně buněk sítnice proti fototoxickému poškození.

Navíc, jak se diskutuje v příkladu 8, předběžné výsledky ukazují, že R-R zeaxanthin je daleko silnější a účinnější při ochraně sítnice proti fototoxickému poškození ve srovnání s beta-karotenem. Když se testovací zvířata krmila vysokými dávkami beta-karotenu, nedosáhly slabé ochranné účinky beta-karotenu ani úrovně statistické významnosti. Naopak, když se zvířata

- 15CZ 297575 B6 krmila stejnou dávkou R-R zeaxanthinu, došlo k úplnému zablokování a prevenci měřeného indikátoru poškození sítnice.

Mikrobiální zdroje R-R zeaxanthinu

Buňky Flavobacterium multivorum podle vynálezu byly uloženy v ATCC (přírůstkové čísl ATCC 55238; jak je shora uvedeno, tyto buňky se v ATCC katalogu zmiňují jako Springobacterium multivorum, ale v Bergyho manuálu se jejich název nezměnil). Tato buněčná linie poskytuje odborníkovi několik možností mikrobiální syntézy izomemě čistého R-R zeaxanthinu.

1) Přímí a nezměnění potomci těchto buněk se mohou použít pro syntézu R-R zeaxanthinu, který obsahuje nedetekovatelné množství jiných žádoucích stereoizomerů. Celkové karotenoidy, vyprodukované těmito buňkami, obsahují více než 90 % ZX, požadovaného karotenoidu.

2) Potomci kmene ATCC 55238 se mohou použít po jejich modifikaci tak, aby došlo ke zvýšení produkce R-R izomeru ZX. Mutantní nebo jinak odlišné buněčné linie mohou vzniknout několika způsoby: (1) na potomky kmene ATCC 55238 divokého typu se působí mutagenními činidly, jako je ultrafialové nebo rentgenové záření nebo známými chemickými mutageny, jako je N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin; (2) míšením buněk F. multivorum sjinými typu bakterií, které aktivně podporují konjugaci a výměnu DNA mezi bakteriálními buňkami, se tvoří pohlavní kombinace; nebo (3) na buňky F. multivorum se působí bakteriálními transposony nebo viry, které mohou způsobit znovuuspořádání poměrně velkých oblastí DNA. Tyto metody do buněk potomků zavádějí náhodnou změnu a potomci se analyzují screeningovými testy za účelem určení a izolace buněk, které produkují vysokou koncentraci ZX.

Screeningové testy je možno usnadnit za použití chemikálií (jako je difenylamin, nikotin nebo lovastatin), které potlačují jeden nebo více enzymů, které se podílejí na biosyntetickém postupu, při němž vzniká ZX. Laicky řečeno tvoří tyto supresorové látky překážky, které je možné překonat pouze použitím mutantních buněk, jak produkují abnormálně vysoké množství ZX. Naštěstí testy, které slouží k identifikaci mutantů s vysokou produkci ZX nebo jejich variant, jsou jednoduché a rychlé. Protože ZX je žlutý pigment, postačí vizuální pozorování kultivačních ploten pro identifikaci mutantních kolonií, které vykazují, jak se požaduje, (1) dobrou růstovou rychlost a (2) schopnost tvořit abnormálně vysoké množství žlutého pigmentu. Po aplikaci mutagenu na buňky se ke screeningovému testu může použít, je-li to žádoucí, automatizovaný přístroj (jako je automatizované počítadlo kolonií nebo přístroj na rozdělování buněk spojený s průtokovými cytometry).

Tyto mutagenní a screeningové metody jsou běžné a jsou dobře známy v daném oboru. Buňky, které jsou přímo odvozeny z kmene ATCC 55238 divokého typu, se pokládají za potomky těchto buněk, a to i v případě, že byly modifikovány, mutagenizovány nebo pohlavně kombinovány sjinými buněčnými liniemi některým shora uvedeným způsobem.

3) Třetí možností je vytvářet mikrobiální buňky, které nejsou potomky a které obsahují geny izolované nebo odvozené z buněčné linie ATCC 55238, které exprimují enzymy napomáhající syntéze R-R zeaxanthinu. Takové geny se mohou izolovat a identifikovat použitím známých metod. Například za účelem vyhledávání genů produkujících karotenoidy a majících homologní sekvence DNA v genomu buněčné linie ATCC 55238, se mohou použít jako hybridizační sondy sekvence DNA z genů „crt“ produkující karotenoidy, které jsou uvedeny v US patentu 5 429 939 (Misawa et al 1995). Geny produkující karotenoidy izolované z těchto buněk se pak mohou vnést do plazmidů, kozmidů, fágů nebo jiných vhodných vektorů, které se mohou použít ke genetické transformaci požadovaného typu hostitelské buňky, jako jsou buňky E. coli, kvasinky, hmyzí buňky nebo savčí buňky. Tento typ kontrolovatelné genové manipulace umožňuje transformovat buňky genu získanými z buněk ATCC 55238, aby tvořily R-R zeaxanthin.

- 16CZ 297575 B6

Proteiny kódující oblasti genů, produkujících ZX, získaných z buněk ATCC 5238 (tj. oblasti genů, které se přepisují do mediátorové RNA, která se následně překládá na enzymy, které syntetizují ZX) se mohou kromě toho umístit tak, aby se řídily silné a/nebo indukovatelné promotory. Takové „chimérické“ geny, obsahující genové promotory získané z různých genů, jsou použitelné pro různé účely, jako (1) k potlačení produkce ZX, zatímco buňky rostou a pomnožují se, a pak ke značnému zvýšení produkce ZX během fermentace; a (2) k zavedení genů do nových typů hostitelských buněk, které mohou být výhodné pro použití v komerčním měřítku, jako jsou buňky E. coli nebo buňky kvasinek, u nichž je možno používat známé a vysoce optimalizované metody fermentace, manipulace a čištění.

Exprese genů produkujících ZX izolovaných z buněčné linie ATCC 55238 se může zvýšit dalšími známými metodami. Bakteriální geny často používají například „nepreferované“ kodony, které redukují a řídí množství proteinu tvořeného genem. Za účelem uvolnění tohoto limitujícího mechanismu je možno nepreferované kodony v genu syntetizujícím ZX z buněčné linie ATCC 55238 nahradit „preferovanými“ kodony, které mohou zvýšit expresi enzymu produkujícího ZX ve vybrané hostitelské buňce.

Dále mohou být například cysteinové zbytky na překážku stabilitě nebo aktivitě enzymu tím, že tvoří nežádoucí disulfidové vazby s jinými cysteinovými zbytky, buď ve stejných nebo jiných molekulách proteinu. Aktivita nebo stabilita enzymu se pak tedy může někdy zvýšit záměnou jednoho nebo více cysteinových zbytků jiným aminokyselinovým zbytkem (např. US patent 4 737 462, Mark). Exprese proteinu se může dále často zvýšit zavedením kodonů pro běžné aminokyseliny, jako je glycin, na místo kodonů, které kódují methionin a tryptofan, jež jsou méně běžné a mají tendenci zpomalit a redukovat expresi proteinu. Poté, co se vytvoří syntetický gen, který způsobuje substituci aminokyseliny této povahy, může být modifikovaný protein testován za účelem zjištění, zda si zachovává požadovanou enzymatickou aktivitu, zatímco se exprimuje ve větším množství nebo stabilnější formě.

Toto jsou příklady známé v oboru genových manipulací, které se mohou přenést na geny produkující ZX izolované z buněčné linie ATCC 55328 za účelem zjištění, zda takové modifikace zvýší produkci ZX buňkami F. multivorum nebo jiným typem hostitelských buněk.

Fráze uvedená v nárocích „buňky, které jsou genově manipulovány tak, aby obsahovaly nejméně jeden gen exprimující zeaxanthin, obsahující sekvenci DNA získanou z kmene Flavobacterium multivorum, kterému bylo přiděleno přírůstkové číslo ATCC 55238“ zahrnuje buňky obsahující geny, které mají chemicky syntetizované sekvence DNA za použití sekvence DNA nebo mRNA určené analýzou buněčné linie ATCC 55328 nebo jejích potomků. Automatizované DNA syntetizující přístroje jsou v oboru dobře známy a mohou být použití k vytvoření duplikátů jakékoli známé genové sekvence, aniž by byla nutná replikace původní hostitelské buňky. „Gen syntetizují zeaxanthin“ zahrnuje jakýkoli gen, který exprimuje enzym nebo jiný protein, který se podílí na biosyntéze ZX a který se může použít ke zvýšení produkce ZX, v případě, že je začleněn do vhodných hostitelských buněk, bez ohledu na to, který určitý enzym v cestě biosyntézy ZX gen kóduje.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek č. 1 zobrazuje molekulovou strukturu beta-karotenu, luteinu a zeaxanthinu, přičemž ukazuje vzorce všech tří karotenoidů a systém číslování koncových kruhů. Tyto struktury jsou známy v dosavadním stavu techniky.

Obrázek č. 2 obsahuje schéma popisující kroky při fermentaci a čištění ZX, produkovaného bakteriemi, jež syntetizují stereoizomemě čistý 3R-3'R zeaxanthin.

- 17CZ 297575 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Fermentace v komerčním měřítku

Živné médium, kterému dal přihlašovatel přednost před počátečním laboratorním testováním buněk Flavobacterium multivorum v malém měřítku, bylo identifikováno jako živné médium E podle příkladu 3 US patentů 5 308 759 (Gierhart 1994) a 5 427 783 (Gierhart 1995). Toto živné médium obsahovalo několik složek, které byly nákladné a bylo obtížné s nimi pracovat. Pro snížení nákladů a nepohodlnosti byl po prvním datu podání těchto přihlášek vynálezu zahájen intenzivní výzkum možnosti použití lepšího živného média vhodného pro komerční měřítko. Živná média, v současné době preferovaná pro fermentaci v komerčním měřítku, eliminovala kukuřičnou mouku a několik dalších složek. Tato preferovaná média obsahují buď kukuřičný sirup s vysokým obsahem maltózy nebo melasu z cukrové řepy v koncentraci, která se pohybuje od 1 do 10 % hm./obj., spolu s kukuřičným výluhem v koncentraci 0,5 až 4 % hm./obj.; heptahydrát síranu amonného v koncentraci 0,5% hm./obj.; chlorid sodný v koncentraci 0,5% hm./obj.; heptahydrát síranu hořečnatého v koncentraci 0,1 % hm./obj.; acetát sodný v koncentraci 0,1 % hm./obj.; heptahydrát síranu železnatého v koncentraci 0,001 % hm./obj.; kvasinkový extrakt v koncentraci 0,2 % hm./obj.; thiamin-HCl v koncentraci 0,01 % hm./obj.; hydrolyzovaný kasein v koncentraci mezi 1 a 6 % hm./obj. (jako je NZ Amine HD, prodávaný firmou Sheffield Products, Division of Quest Intemational, Norwich, NY); a rostlinný olej v koncentraci 1 % hm./obj..

Po rozmíchání těchto složek dohromady se přidá dostatečné množství NaOH, aby pH dosáhlo hodnoty 6,5; naopak jestliže se pH živného média upravilo na hodnotu 7,5, jak se popisuje v experimentech pro laboratorní měřítku v US patentech 5,308,759 a 5,427,783, vysráželo se z kukuřičného výluhu příliš mnoho pevných látek.

Kultivační médium se sterilizuje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 30 minut, pak se ochladí na teplotu 27 °C a izoluje se 5 až 10% o/o „kapalné prekultury“, obsahující kmen F. multivorum, který produkuje R-R zeaxanthin, aniž vznikají S-S nebo S-R stereoizomery.

Buňky, které se použily pro přípravu kapalné prekultury se udržují na šikmém agaru a na plotnách s agarem. Tyto kultury na šikmé agaru se inokulují klonálními koloniemi F. multivorum, které se odvozují z kmene uloženého v ATCC (přírůstkové číslo ATCC 55238). Po inkubaci po dobu 48 hodin při teplotě 28 °C se kultura na šikmém agaru udržuje v lednici při teplotě 4 °C po okamžiku použití pro inokulaci kapalného média. Živé buňky se mohou také zmrazit za účelem dlouhodobého skladování za použití běžných mrazniček, suchého ledu nebo kapalného dusíku.

Kapalná prekultura se připravuje inokulaci 30 ml kapalného média použitím buněk získaných z šikmého agaru, přičemž kapalné médium se připravuje shora popsaným postupem a je obsaženo v míchaných lahvích o objemu 300 ml. Podmínky kultivace jsou 28 °C, pH 7,2 až 7,6, kultura se provzdušňuje mícháním při 250 ot/min a doba kultivace je 24 hodin. Po počátečních 24 hodinách kultivace se buňky obsažené v jedné nebo více prekultivačních lahvích o objemu 30 ml použití pro inokulaci desetkrát většího množství živného média, které je obsažené ve fermentační nádobě o vhodném objemu. Buňky se pak inkubují po dobu 48 až 72 hodin při teplotě 28 °C. Hodnota pH se udržuje mezi 6,8 a 7,2 za použití NaOH a/nebo kyseliny fosforečné. Koncentrace rozpuštěného kyslíku se udržuje na hodnotě 30 až 40 % nasycení, přičemž vzduch probublává nádobou rychlostí 1 objem vzduchu najeden objem kapaliny za minutu, zatímco míchání nádoby probíhá rychlostí 400 až 1000 ot/min. Testy opakovaně odebíraných vzorků provedené HPLC ukazují, že maximální množství ZX obvykle vzniká v období do asi 72 hodin fermentace za uvedených podmínek.

- 18CZ 297575 B6

Příklad 2: Přidání stabilizačních činidel.

ZX, který vzniká při procesu popsaném v příkladu 1, se musí stabilizovat pro usnadnění následného čištění a formulace a zajištění čistoty. Stabilizační látky se mohou přidat k buňkám F. mul5 livorum (nebo kcelulárnímu extraktu, obsahujícímu ZX) v jakýkoli okamžik během přípravy nebo procesu čištění; obecně lze říci, že by měl být přidán jeden nebo více počátečních stabilizátorů k buňkám, pokud jsou ještě ve fermentační nádobě.

Testovala se řada stabilizátorů. Nejlepšího výsledku se dosud dosáhlo při kombinaci stabilizač10 nich činidel, které se smíchala dohromady v malém množství vhodného rozpouštědla (například asi 2 ml ethanolu) pro fermentační nádobu o objemu 20 1) a pak se přidala k buňkám. Preferovaná směs stabilizátorů obsahuje terciární butylhydrochinon (zkratka TBHQ; také se nazývá 2-(1,1dimethyl)-l,4-benzendiol) v množství, které zaručí, že konečná koncentrace po smíchání s buňkami se pohybuje od asi 250 pg/l do asi 50 mg/1; etoxyquin, jehož koncentrace po promíchání s buňkami je v rozmezí asi 250 pg/l až asi 250 mg/1; α-tokoferol v koncentraci v rozmezí asi 250 pg/l až asi 250 mg/1; a EDTA (etylendiamintetraoctovou kyselinu), jejíž koncentrace je v rozmezí asi 500 pg/l až asi 500 mg/1. Vhodné koncentrace mohou silně kolísat a závisí na různých faktorech, jako jsou následné kroky čištění a forma balení a požití. Preferované koncentrace těchto stabilizátorů, které se používají při extrakci s THF v jednom cyklu, po níž následuje míšení s rostlinným olejem a vodotěsná enkapsulace do pilulí vitaminového typu, jsou asi 25 až 50 mg/1 u TBHQ; 250 až 500 pg/l u etoxyquinu, 250 až 500 pg/l pro α-tokoferol a 500 až 1000 pg/l pro EDTA.

Po přidání stabilizátoru se buněčná kultura pasterizuje teplem při teplotě 55 °C po dobu 25 až 25 5 0 minut. Pasterizace usmrtí bakterie, aniž se poškodí ZX, který produkují. Kultura se pak chladí na teplotu místnosti a buňky obsahují ZX a další pevné částice přítomné v kultivační půdě se oddělují z kapalné fáze mikrofiltrací s křížovým tokem, což zvýší koncentraci buněk/pevných částic z počáteční hodnoty asi 10 až 15 % na koncentraci po filtraci asi 60 až 80 % (objemová procenta). Výsledkem postupu je buněčná pasta, která obsahuje některé zbytkové pevné látky 30 z živného média.

V případě přípravků ZX, kterými se krmí japonské křepelky za účelem testování sítnice, jak se popisuje v příkladech 5 až 7, buněčná pasta je zmrazená na teplotu -70 °C a pak je sušena lyofilizací při teplotě 25 °C při úplném vakuu, čímž vzniká sušená biomasa obsahující okolo 1 až 10 % 35 hmotnostních ZX. V testech se určilo množství ZX v každé várce a jednotlivé várky o různých koncentracích se kombinovaly a smíchaly dohromady, aby vznikla konzistentní koncentrace produktu určeného pro testování na japonských křepelkách.

Za účelem přípravy ZX pro aplikaci na lidech se použila extrakce rozpouštědlem, přičemž vzniká 40 viskózní olejová kapalina, jak se popisuje v příkladu 3.

Příklad 3: Semi-izolace do olejové kapaliny

Buněčná pasta vytvořená způsobem, který se popisuje v příkladu 2, se může dále zpracovat různými způsoby. Jak se shora uvádí, je-li to žádoucí, je možno rozrušit buněčné membrány, čímž se buňky otevřou a ZX se stává lépe dostupným, například sonifikací (zvukové vlny s vysokou frekvencí), vysokým tlakem nebo rozemletím, přičemž buňky se uchovávají při teplotě pod asi 30 °C, aby se předešlo oxidaci. Avšak tento krok nebyl nezbytný, pokud byl při extrakci roz50 pouštědlem použit tetrahydrofuran (THF), protože THF je velmi účinné činidlo, které rozrušuje buněčné membrány bez mechanické pomoci. Jestliže byl THF použit při operacích v laboratorním měřítku, nebylo míchání nutné; je však pravděpodobné, že při výrobě v komerčním měřítku bude míchání během míšení s rozpouštědlem výhodné.

- 19CZ 297575 B6

Při dosud provedených testech zahrnovala extrakce THF míšení 8 až 20 objemů čištěného filtrovaného THF s objemem buněčné pasty, obsahujícím 60 až 80 % pevných částic při teplotě pod 25 °C po dobu 2 až 24 hodin. THF na buňky působí agresivně a vzniká kapalina se suspenzí flokulovaných pevných látek. Po centrifugaci při až 20000 g po několik minut, je možno většinu THF odstranit dekantací. Zbytkový THF může být odstraněn odpařením při vakuu za vzniku viskózního oleje. Jestliže byla buněčná pasta obsahující 1 až 3 % ZX podrobena extrakci THF v jednom cyklu, obsahoval výsledný olej obvykle okolo 5 až 20 % hmotnostních ZX.

Příklad 4: Příprava vysoce čistého zeaxanthinu v suché práškové formě se 100% čistým R-R izomerem

Vysoce čistý přípravek ZX v suché práškové formě byl připraven zpracováním olejovité kapaliny extrahované THF, jak se popisuje v příkladu 3, kapalnou chromatografií. Olejovitá kapalina obsahující ZX byla rozpuštěna v hexanu a pak prošla chromatografickou kolonou obsahující neutrální práškovou aluminu. Pro promytí kolony byl použit objem hexanu odpovídající dvěma objemům kolony pro odstranění karotenoidových příměsí, jako je beta-karoten a lykopen, stejně jako lipidů a jiných nečistot. Pro uvolnění ZX z kolony byla použita směs hexan:aceton v poměru 80:20. Uvolněný rozpuštěný ZX byl sušen za vakua. ZX mělo nejméně 98% čistotu, což se prokázalo chromatografickou analýzou; detekovalo se pouze stopové množství nečistot.

Po zhruba šestiměsíčním skladování v relativně nechráněném stavu (obvykle v normální lednici, s umírněně častým odběrem vzorků a bez obsahu antioxidantů a bez zvláštních opatření po zamezení kontaktu s atmosférickým kyslíkem) bel vzorek tohoto přípravku ZX zaslán na stereoizomemí analýzu k prof. Johnu Landrumovi (spoluautor článků Bone, Landrum et al) na Florida International University v Miami, Florida. Jeho analýza za použití chirální kolonové chromatografie s dikarbamátovou derivatizací ukázala, že šest měsíců starý nechráněný přípravek obsahoval 92 % ZX. Ukázalo se, že nečistotami jsou hlavně keto-karotenoidy, které se vymývaly před ZX; keto-karotenoidy mají někde na molekule karotenoidu připojený další atom kyslíku a jsou běžnými vedlejšími produkty vznikajícími, když se karotenoidy skladují bez ochrany proti oxidaci. Chirální analýza prof. Landruma ukázala, že 100 % ZX tvoří v přípravku požadovaný R-R izomer. Ve vzorku nebylo detekovatelné množství nežádoucích S-S nebo S-R stereoizomerů ZX.

Je uznáváno, že shora popsané chromatografické čištění, ačkoli je plně realizovatelné a vysoce účinné, není zcela vhodné pro přípravu vysoce čistého ZX v komerčním množství. Alternativní metoda, která byla vyvinuta pro čištění luteinu, popsaná v US patentu 5 382 714 (Khachik 1995; viz také Thachik et al 1995), jež používá chladnou směs ethanol-voda vextrakčním systému dvou rozpouštědel, po níž následuje lyofílizace, nabízí vhodnou metodou pro výrobu v komerčním měřítku.

Příklad 5: Testování zeaxanthinu na japonské křepelce, použití různých dietních skupin

Všechny testy prováděné na japonské křepelce se uskutečnily v Schepens Eye Research Institute of Harvard Medical School (Boston, Massachusetts podle kontraktu s Applied Food Biotechnology, lne. (přihlašovatel tohoto vynálezu). Všechny léčené a kontrolní skupiny obsahovaly statisticky významný počet ptáků. Ve většině případ kontrolní skupiny obsahovaly stejný počet ptáků jako léčené skupiny.

Ptačí krmivá deficitní na karotenoidy byla získána od Purina Mills (St. Louos, Missouri). Tato ptačí krmivá se prodávají pouze pro experimentální účely a získávají se s použití zrní (jako jsou semena prosa), které přirozeně neobsahuje karotenoidy.

-20CZ 297575 B6

Všechny přípravky ZX, kterými se krmily japonské křepelky, byly ve formě sušení biomasy vytvořené z buněk F. multivorum, které byly fermentovány, stabilizovány činidly popsanými v příkladu 2, usmrceny pasterizací a sušeny lyofilizací. Tyto fermentační a preparativní kroky provedla Applied Food Biotechnology, lne. ve své zařízení v O'Fallon ve státě Missouri.

Všechna testovaná zvířata se vylíhla z vajec deficitních na karotenoidy. Tato vejce byla získána tak, že rodičovská generace (označená ptáci Pl) po dosažení dospělosti byla krmena pouze krmivém deficitním na karotenoidy. Jejich vejce byla otevřena a zkoumal se obsah karotenoidů do té doby, než se vejce stala deficitní na karotenoidy. Vejce, která pak snesli ptačí rodiče deficitní na karotenoidy, byly použita k vysedění všech testovaných a kontrolních ptáků.

Testovaní a kontrolní ptáci byly rozděleni do čtyř hlavních skupin, které dostávaly různé diety. Tyto skupiny byly označeny jako skupina C+; skupina C-, skupina BC+, skupina ZX(+5) a skupina ZX(+50) v závislosti na druhu karotenoidů, který dostávaly ve své dietě.

Ptáci ve skupině C+ byli krmeni standardní komerční dietou, která obsahovala několik karotenoidů; tato dieta obsahuje také jako přísadu syntetický alfa-tokoferol (vitamin E).

Ptáci ve skupině C- byli krmeni dietou, která je v podstatě zbavena všech karotenoidů, jak výše uvedeno. Tato dieta však obsahovala všechny ostatní nezbytné živiny a dále obsahovala jako přísady syntetické vitamin A a E.

Ptáci ve skupině BC+ dostávali dietu zbavenou všech karotenoidů s výjimkou β-karotenu jako přísady ve stejném dávkování jako ve skupině s vysokou dávkou ZX (bylo přidáno 50 mg betakarotenu na kilogram krmivá). Ptáci ve skupině BC+ byli převedeni na dietu obsahující betakaroten sedm dní před tím než byl zahájen postup poškození světlem. Tato skupina umožňuje přímé srovnání ptáků živených beta-karotenem a jedné podskupiny ptáků živených krmivém doplněným ZX, kteří byli také sedm dní před poškozením světlem převedení z deficitní diety na dietu doplněnou ZX. Jak se popisuje v příkladu 8, toto přímo srovnání ukázalo, že ZX je vysoce účinný při prevenci fototoxického poškození, zatímco ochranné účinky beta-karotenu jsou tak slabé, že nedosahují úrovně statistické významnosti.

Ptáci ve skupině ZX+ dostávali dietu zbavenou všech ostatních karotenoidů, ale obsahující sušenou biomasu s obsahem R-R zeaxanthinu z buněk F. multivorum AFB. Těmto ptákům byly podávány dvě různé dávky ZX, což umožnilo zhodnotit závislost dávka-účinek a korelovat ji s různými indikátory poškození sítnice. Ptáci ve skupině ZX(+5) dostávali relativně malé množství ZX, a sice v průměru 5 mg ZX na kilogram krmivá. Protože japonská křepelka zkonzumuje denně okolo 25 až 35 gramů potravy, požil každý pták ve skupině nízkého dávkování denně asi 0,125 až 0,175 mg ZX. Ptáci ze skupiny ZX(+50) dostávali desetkrát vyšší množství (50 mg ZX najeden kilogram krmivá), takže zkonzumovali průměrně 1,25 až 1,75 mg ZX na ptáka a den.

Koncentrace karotenoidů v kontrolní, deficitní a ZX+ dietě byla analyzována pomocí HPLC metodou, kterou popisuje Stacewicz-Sapuntzakis et al 1993.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 1

-91 CZ 297575 B6

Tabulka č. 1

Krmivo	Koncentrace karotenoidů (pg/ml)
ZX	lutein	β-kryp	β-kar	kanthax	lykop
kontrolní (C±L	0,59	1,55’	0,11	0,24	0,00	0,00
deficitní (C-)	0,26	0,59’	0,00	0,00	0,00	0,00
zeaxanthin (ZX+50)	67,60	0,59*	1,90	3,00	0,00	2,90
zeaxanthin (ZX+5)	6,74	0,06*	0,20	0,28	0,00	0,27

klíč: ZX 3 R-3' R-zeaxanthin β-kryp β-kryptoxanthin β-kar β-karoten kanthax kanthaxanthin lykop lykopen * předpokládaná identifikace; může jít i o cis-izomer zeaxanthinu

Všichni ptáci byli chováni v normálních chovných klecích, byli však, jak je uvedené dále, udržováni pod normálním širokospektrým osvětlením po dobu 10 až 14 h denně.

Příklad 6: Ukládání orálně požitého zeaxanthinu v sítnici

Byly provedeny chemické analýzy za účelem určit koncentraci ZX (a jiných karotenoidů), které se uložily v sítnicích ptáků v každé dietní skupině, které jsou popsány v příkladu 4.

Za účelem provedení uvedených analýz byli ptáci, vylíhnutí z vajec deficitních na karotenoidy a krmení příslušnou dietou po dobu nejméně šest měsíců usmrceni cervikální dislokací. Tkáň sítnice byla odebrána vyříznutím z vyjmutého oka a tkáň z jedné sítnice byla rozmělněna ve 250 μΐ destilované deionizované vody za použití skleněného nebo polytetrafluorethylenového (TEFLON⁰'”') tloučku. Bylo odebráno 10 μΐ homogenizované suspenze a použito pro analýzu proteinů za účelem normalizace výsledků z různých vzorků sítnice. Ke zbývajícím 240 μΐ suspenze tkáně sítnice bylo přidáno 250 μΐ methanolu obsahujícího 2 % hm./obj. pyrogallolu a 50 μΐ 60% hm./obj. hydroxidu draselného. Směs byla zahřívána ve vodní lázni na teplotu 70 °C po dobu jedné hodiny a pak bylo přidáno 500 μΐ 50% o/o ethanolu a následně 2 ml hexanu. Směs se míchala na vortexu, pak se nechala stát při teplotě 5 °C až došlo k separaci. Odstranila se epifáze (to je lehčí fáze, která pluje na povrchu zbývající kapaliny) obsahující hexan a extrahované karoteonoidy, tokoferoly a retinoly. K homogenizované tkáni byly přidány další 2 ml hexanu a směs se míchala na vortexu a nechala se opět oddělit. Odebrala se epifáze a zkombinovala se s první epifází. Tento postup se ještě jednou zopakoval ve třetím extrakčním cyklu, aby se zajistilo úplné odstranění karotenoidů, tokoferolů a retinoidů.

Za účelem odstranění zbylého hydroxidu draselného pak byly kombinované hexanové extrakty promyty 1 ml vody. Ke směsi voda hexan byl přidán další 1 ml hexanu, pak byla hexanová vrstva (epifáze) opatrně odstraněna pipetou. Hexan se pak odpařil v konstantním proudu dusíku. Zbytek pak obsahoval karotenoidy, tokoferoly, retinoly a jiné nedefinovatelné látky, které se extrahují do hexanu. Tento zbytek se pak rozpustil v rozpouštědle (methanol:chloroform:triethylamin) a analyzoval se na HPLC, jak se popisuje shora v textu.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 2, která také ukazuje poškozen po expozici na světle s vysokou intenzitou.

- 22 CZ 297575 B6

Tabulka 2

typ krmivá	průměrné hodnoty (n=6)
karotenoidy v sítnici (ng/mg proteinu)	počet čípkově apoptotických jader ve středu sítnice (zvětšeno 400 krát)
zeaxanthin	lutein	nepoškozeno světlem	poškozeno světlem
kontrolní (C+)	30,18	10,41	0	60
deficitní (C-)	10,29	8,03	0	120
p-kar(+5O)	10,01	7,83	0	109
zeaxanthin (ZX+5)	31,00	3,64	0	15
zeaxanthin (ZX+50)	104,17	nd	0	0

nd v těchto vzorcích nedetekováno. Byla detekována látka podobná luteinu, ale lutein to nebyl, což je zřejmé z retenčního času HPLC a skenování píku fotodiodovou mřížkou.

Je nutno poznamenat, že v žádném ze sítnic, odebraných ptákům na kterékoli z popsaných diet, nebyl stanoven beta-karoten.

Tyto sítnicové koncentrace uvedené v tabulce 2 ukazují, že orálně požitý R-R zeaxanthin produkovaný fermentací buněk odvozených od F. multivorum (přírůstkové číslo ATCC 55238) se skutečně uložil v sítnicích testovaných zvířat, která dostávala R-R zeaxanthin jako dietní doplněk ve formě přísady do krmivá. To je důležité zjištění, protože ZX musí být normálně stráven, musí projít střevní bariérou, musí vstoupit do krevního řečiště a musí být přijat buňkami sítnice v oku ptáka v dostatečném množství, aby chránil tkáň sítnice proti fototoxickému poškození. Všechny tyto překážky byly překonány pomocí bakteriálně fermentovaných zde popsaných přípravků R-R zeaxanthinu.

Příklad 7: Ochrana sítnic R-R zeaxanthinem.

Někteří ptáci v každé dietní skupině byli vystaveni působení viditelného světla o vysoké intenzitě 2000 až 3000 luxů po dobu 28 hodin. Cykly byly sestaveny z 1 hodiny světla a následujících dvou hodin téměř úplné tmy. Po těchto světelných cyklech byly ptáci předtím, než byli usmrceni, umístěni na 14 hodin do téměř úplné tmy. Tento rozsah expozice světlu o vysoké intenzitě byl stanoven v předběžných testech, aby vyvolal konzistentně těžké poškození u ptáků ve skupině deficitní na karotenoidy a mírné poškození u ptáků v kontrolní (normální dieta) skupině. V předběžných testech bylo také stanoveno, že po expozici světlu je nutná doba 14 h pro naměření maximálního množství apoptotických jader čípků u nechráněných (deficitních na karotenoidy) ptáků.

Ptáci krmení kontrolní dietou vykazovali maximální apoptózu přibližně 24 hodin po expozici, zatímco ptáci krmeni dietou doplněnou ZX vykazovali maximální apoptózu po době mnohem delší než 24 hodin. Prodloužení doby do poškození, které se dá měřit, je samo o sobě silným indikátorem ochranných účinků ZX.

Sítnice těchto ptáků byly vyříznuty mikrometodou, fixovány v xylenu a sušeny v ethanolu a pak zality do paraplastu (Oxford, 56 °C). Tkáně sítnic v paraplastu pak byly rozřezány a barvily se způsobem podle Gallyas, F., Acta Neuropathologica 79: 620 (1990) nebo propidium jodidem za účelem vizualizace pyknotických jader, která charakterizují apoptózu. Byl určen počet pyknotických jader, které je možné spatřit v jednom poli mikroskopu při zvětšení 400x (lineární). Pro

-23CZ 297575 B6 každou léčenou skupinu byla spočítána jádra, která se nacházejí v nejméně 6 až 8 oddělených polích a hodnoty se zprůměrovaly.

Výsledky, které jsou v tabulce 2, jasně ukazují, že odumření sítnicových buněk a jejich poškození bylo (1) silně redukováno a/nebo oddáleno bakteriálně syntetizovaným R-R zeaxanthinem, a to i ptáků, kteří patřili do skupiny ZX(+5) s nízkým dávkováním, ve srovnání s ptáky, kteří dostávali normální kontrolní dietu; (2) ještě více redukováno vyššími dávkami ZX(+50). Úplnou nepřítomnost pyknotických jader v sítnicích ptáků z léčebné skupiny ZX(+50) lze použít jako přesvědčivý důkaz, že R-R zeaxanthin z buněčné linie F. multivorum (přírůstkové číslo ATCC 55238) nabízí dramatický a výjimečný průlom v ochraně buněk sítnice proti fototoxickému poškození. Podle nejlepšího vědomí a svědomí přihlašovatele nebylo žádné jiné dosud testované činidlo schopno dosáhnout nebo se jen přiblížil této úrovni ochrany.

Příklad 8: Přímé srovnání schopnosti ochrany tkáně sítnice R-R zeaxanthinu a beta-karotenu

Jak se popisuje shora v textu, ptáci v dietní skupině BC+ dostávali dávku beta-karotenu (50 mg na kilogram krmivá), která je stejná jako dávka zeaxanthinu ve skupině ZX(+50). To umožnilo přímé srovnání účinku beta-karotenu a ZX při ochraně buněk sítnice proti fototoxickému poškození.

Výsledky ukázaly, že fototoxické poškození ve skupině BC+ se redukovalo pouze ve velmi malém rozsahu (v průběhu okolo 10 % nebo méně). Jestliže se tato hodnota srovná se standardními odchylkami v kontrolní skupině, pak tato redukce není statisticky významná; pravděpodobnost, že malá snížení byla způsobena pouze náhodnou fluktuací, byla 0,12 až 0,14.

Tato neschopnost beta-karotenu poskytnout lepší ochranu tkáně sítnice proti fytotoxickému poškození, zatímco R-R zeaxanthin ve stejné dávce nabízí 100% redukci stejného indikátoru poškození buněk a jejich odumření, silně demonstruje důležitost tohoto objevu. R-R zeaxanthin syntetizovaný bakteriální fermentací nabízí obrovský průlom, který zdaleka překoná jakékoli dříve známé činidlo.

Příklad 9: Tvorba zesilovačů absorpce „Micely“ obsahující zeaxanthin, jejichž průměr je menší než 1 μιη a které obsahují pouze požadovaný R-R izomer zeaxanthinu, je možno získat buď z extraktu biomasy v rozpouštědle nebo z olejovité kapaliny popsané v příkladu 3 použitím jistého typu žlučových solí, jak popisuje Olson 1994. Olejová tekutina, která obsahuje R-R zeaxanthin, se může smíchat s vhodnou žlučovou solí, jako jsou fosfátové soli glyko- nebo taurocholátu prodávané firmou Marcor Development Company, Hackensack, New Jersey, nebo použitím extraktů ze žlučníku, který obsahuje směs žlučových solí, jako jsou ty, co prodává firma Salzman Corporation, Devanport, Iowa. Tento žlučový materiál se může smíchat buď s extraktem v rozpouštědle nebo s olejovitou hmotou a s jistými dalšími solemi, mezi něž patří chlorid sodný, chlorid vápenatý nebo chlorid draselný. Tato směs se pak zpracovává v mechanickém homogenizátoru, který obsahuje míchací zařízení, jako jsou rotační lopatky, přičemž rychlost rotace a doba homogenizace může být optimalizována na základě rutinních experimentů analýzou rozmezí velikosti micel v závislosti na kombinaci velikosti a tvaru lopatek, na době a rychlosti rotace. Je-li to nutné, výsledné micely se osuší od zbytkového rozpouštědla a naředí se na požadovanou koncentraci použitím nosiče nebo ředicí kapaliny, jako je rostlinný olej. Tato směs pak může být uzavřena do kapsle nebo jiné formy, která usnadní její polykání a pomůže jí ochránit výsledné micely proti degradaci v kyselém prostředí žaludku.

Je možno používat i jiné emulgátory a lipidy k tvorbě emulzí s malou velikostí částic. Je možno používat neiontové detergenty, jako jsou Tweeny a Spaný, popsané v Olson 1994, stejně jako

-24CZ 297575 B6 lipidové materiály, jako fosfolipidy a sfingolipidy, které tvoří lipidové váčky o malé velikosti (menší než 1 pm).

Příklad 9: Zeaxanthin v mikrokapslích

Tento příklad popisuje přípravu zeaxanthinu ve formě mikrokapslí. Mikrokapsle jsou pevné částice, jejichž velikost je v rozmezí 10 až 100 pm, tvořené materiálem jádra (jako je R-R zeaxanthin), enkapsulovaným potahovým materiálem nebo skořepinou, a mohou být připravovány z různých látek, jako je želatina, arabská guma, škrob, zein (kukuřičný potein) atd. Během přípravy povlaku mohou být přidávány i jiné látky, které pomáhají udržet tvar, strukturu, stabilitu nebo jiné požadované vlastnosti výsledného přípravku. Takové látky mohou zahrnout emulgátory, sorbitol, antioxidanty, jako je TBHQ čili 2-[l,l-dimethyl]-l,4-benzendiol, nebo gelující činidla, jako je karagenan.

Izolovaný nebo částečně izolovaný zeaxanthin se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, jako je ethanol, aceton nebo THF. Jakmile je v roztoku, začnou se tvořit mikrokrystaly o průměru menší než 10 pm přídavkem rozpouštěného zeaxanthinu do vody. Tento proces se zdokonalí, jestliže se během přidávání do vody krystaly zeaxanthinu v rozpouštědle sonifikují při vysoké frekvenci v přítomnosti emulgačního činidla, jako je Tween 80.

Poté, co se vytvoří mikrokrystaly, přidá se do směsi voda, zeaxanthin a rozpouštědla obalový materiál. Při použití některých obalových materiálů, jako například želatina je nezbytné držet směs při teplotě 60 °C po dobu až dvě hodiny. Po úplném rozpuštění obalového materiálu se celá směs sonifikuje po dobu 5 až 10 minut za účelem reemulgace krystalů.

Tvoření mikrokapslí se dosáhne sušení směsi jaderného a obalového materiálu použitím jakékoli vhodné metody sušení, jako je sprejové sušení nebo použití rotujícího disku podle metody Sparks et al., jak se popisuje v US patentu č. 4 675 140. Sprejové sušičky se široce používají v potravinářském a krmivářském průmyslu. Rotační disk je zařízení, které je tvořeno diskem (o průměru přibližně 4, tj. asi 10 cm), který může být udržován na určité teplotě za řízených podmínek. Může se pohybovat různou rychlostí v rozmezí 1 000 až 10 000 (ot/min). Na střed disku se nanese směs jaderného a obalového materiálu, přičemž rychlost otáčení je například 4 000 ot./min. Mikrokapsle se tvoří, když kapalina přijde do styku se zahřátým rotujícím diskem. Mikrokapsle jsou odstředivou silou vymršťovány ze středu disku a hromadí se na rovném povrchu, který je předem potažen „zachytávacím“ činidlem, jak oje hydrofobizovaný škrob nebo dextrin. Mikrokapsle se pak od zachytávacího činidla oddělují na základě velikosti. Mikrokapsle se umisťují do nádoby, která je chrání před světlem a vzduchem a skládají se v chlazeném prostředí do doby, kdy se uzavírají do kapslí pro orální požití.

Vynález popisuje nový a použitelný způsob tvorby léčiv, která obsahují R-R zeaxanthin vhodný pro lidskou spotřebu, stejně jako formulace, které obsahují mikrobiálně syntetizovaný R-R zeaxanthin pro použití pro prevenci nebo léčbě makulámí degenerace. Přestože je vynález výše popsán pomocí osvětlujících příkladů a popisu určitých konkrétních provedení, je odborníkovi zřejmé, že jsou možné různé modifikace, obměny a ekvivalenty uvedených příkladů. Všechny obměny, které jsou odvozeny přímo ze skutečností zde uvedených a které nevybočují žduchá a rozsahu vynálezu, se pokládají za pokryté tímto vynálezem.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití 3R-3'R stereoizomerů zeaxanthinu pro výrobu léčiva pro léčbu makulámí degenerace u lidí, kde alespoň 90 % všech molekul zeaxanthinu v uvedeném léčivu tvoří 3R-3'R stereoizomer zeaxanthinu a léčivo je upraveno v lékové formě a obsahuje alespoň 3 mg 3R-3'R stereoizomerů zeaxanthinu na dávku.
2. 2. Použití 3R-3'R stereoizomerů zeaxanthinu pro výrobu léčiva nebo nutričního doplňku pro profylaxi makulámí degenerace u lidí, kde alespoň 90 % všech molekul zeaxanthinu v uvedeném léčivu nebo nutričním doplňku tvoří 3R-3'R stereoizomer zeaxanhinu a léčivo nebo nutriční doplněk je upraven v lékové formě a obsahuje alespoň 0,5 mg 3R-3'R stereoizomerů zeaxanthinu na dávku.
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde lékovou formou je kapsle nebo tableta.
4. 4. Použití podle nároku 3, kde lékovou formou je kapsle obsahující mikrokapsle zeaxanthinu, které mají velikost 10 až 1000 pm a obsahují jádro R-R zeaxanthinu zapouzdřené v povlakovém materiálu.
5. 5. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde zeaxanthin je odvozen z buněk, které syntetizují 3R-3'R stereoizomer zeaxanthinu na úrovni alespoň 90% veškerých molekul karotenoidů syntetizovaných buňkami.
6. 6. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde léčivo nebo nutriční doplněk je pro léčbu nebo profylaxi makulámí degenerace u pacienta trpícího Stargardtovou nemocí, Bestovou nemocí, Battenovou nemocí, Sjogren-Larssonovým syndromem, dystrofií čípků a tyčinek, ovčí ceroidní lipofuscinózou, onemocněním zahrnujícím problémy ukládání lysosomu nebo zvýšenou genetickou náchylností k makulámí degeneraci.
7. 7. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde 3R-3'R stereoizomer zeaxanthinu tvoří alespoň 90 % celkových karotenoidů v léčivu.
8. 8. Tableta nebo kapsle pro léčbu makulámí degenerace u lidí, vy z n a č uj íc í se tím, že zahrnuje 3R-3'R stereoizomer zeaxenthinu a fyziologicky přijatelný nosič, kde alespoň 90% veškerého zeaxanthinu v tabletě nebo kapsli tvoří 3R-3'R stereoizomer zeaxanthinu.
9. 9. Tableta nebo kapsle podle nároku 8, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň 3 mg 3R-3'R stereoizomerů zeaxanthinu.
10. 10. Tableta nebo kapsle podle nároku 8 nebo 9, v y z n a č u j í c í se tím, že 3R-3'R stereoizomer zeaxanthinu tvoří alespoň 90 % celkových karotenoidů v tabletě nebo kapsli.