JPH08508885A - アスタキサンチンを過剰に生成するphaffiarhodozyma菌株、その培養方法および動物飼料中への使用 - Google Patents

アスタキサンチンを過剰に生成するphaffiarhodozyma菌株、その培養方法および動物飼料中への使用

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JPH08508885A JP6523097A JP52309794A JPH08508885A JP H08508885 A JPH08508885 A JP H08508885A JP 6523097 A JP6523097 A JP 6523097A JP 52309794 A JP52309794 A JP 52309794A JP H08508885 A JPH08508885 A JP H08508885A
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Abstract

(57)【要約】 4パーセント、好ましくは6パーセントを上回る酵母乾燥固形分を含有する、少なくとも約1,500リットルという容積の栄養素培地で培養するとき、酵母乾燥固形分を基準に3,000ppmを上回るアスタキサンチンを生成するPhaffiarhodozyma菌株が述べられている。該菌株や他の菌株を、酵母細胞を低強度光線に曝露するか、急速に代謝されるエネルギー源、たとえばグルコースを該細胞に徐々に与えるか、または急速に代謝されるエネルギー源を徐々に代謝されるエネルギー源、たとえばグリセロールで置換えるような1種以上の種々の方法によって、発酵の成熟期を延長させることを含む改良発酵法によって培養する。該菌株の細胞を動物飼料、とくにサケ科魚類の飼料に包含させて、該動物および該動物からつくった製品の紅色着色を付与するかまたは向上させる。

Description

【発明の詳細な説明】 アスタキサンチンを過剰に生成するPHAFFIA RHODOZYMA 菌株、その培養方法および動物飼料中への使用 発明の背景 この発明はアスタキサンチンに関する。1つの態様では、この発明は酵母細胞 がつくるアスタキサンチンに関し、また別の態様では、この発明は、自然界に存 在する一般的なPhaffia rhodozyma酵母細胞よりも多くのアスタキサンチンを生 成するPhaffia rhodozyma酵母細胞の突然変異体菌株をつくって、培養する方法 に関する。さらに別の態様では、この発明は、該酵母細胞からつくった生成物の 、種々の動物飼料の飼料補足物としての使用に関する。 鮮紅色は、ある種の食品、とくに、サケ、タイ類、マス、小エビ、ロブスター や多くの他の海産動物が消費者に好まれるために極めて重要である。酸素化カロ テノイドアスタキサンチン(3,3′−ジヒドロキシ−6,6−カロテン−4, 4′−ジオン)が該水生動物の紅色の原因である。アスタキサンチンは該動物の 特有の色の原因となる以外に、これら海産動物の生命における重要な栄養上の役 割りを果す(Torrissen,1989,Proc.,Third Int.Symp.on Feeding and Nutr .in Fish,Toba Aug.28-Sept.1,Japan,pp.387-399,Meyers and Chen,198 2,World Aquaculture Society,Special Publication No.3,pp.153-165)。こ れらの参考書は、この明細書に参考資料として収録してある。このカロテノイド は、また、他の動物の肉や製品、ならびに他の食品、たとえば鳥肉や卵、種々の 乳製品、軽食品等を着色するのにも有効である。 アスタキサンチンは水生界に存在するもっとも豊富なカロテノイドである。水 生動物は、陸生動物と同様に、その多くは食餌中に存在するカロテノイド化合物 を蓄積するけれども、アスタキサンチンや他のカロテノイドを合成することはで きない。該動物の中には、甲殻類のように、あるカロテンを、アスタキサンチン が主な化合物を形成する酸素化型のカロテノイド(キサントフィルと呼ぶ)に転 換させることができるものもいる。しかし、サケ科魚類や紅タイ類は、他のカロ テノイド化合物をアスタキサンチンに変えることはできないにしても、食餌中の アスタキサンチンを蓄積している。したがって、サケ類やタイ類およびそれらか らつくった製品中に存在するアスタキサンチンは食餌源から直接得られるもので なければならない。 植物は、海生のミクロ藻類やPhaffia rhodozymaのような特別の酵母を含めて 世界中でのカロテノイドの主要源である。前記のように、カロテノイドは動物に よって新に生合成されない。しかし、動物は、一般に、直接または間接に利益を 享受するある種のカロテノイドを必要とし、該カロテノイドは食餌源から得られ る。ある種のカロテノイドから得られる大抵の動物にとっての必須物質の例はビ タミンAおよびロドプシンである。海洋界では、甲殻類のような食物連鎖の短か い動物は、植物界からミクロ藻類や他のカロテノイド含有生物を食べて、多量に 存在するカロテノイド化合物を自然代謝プロセスによってアスタキサンチンに変 える。アスタキサンチンは、さらにこれらアスタキサンチン生成動物の体内に貯 えられる。 野生のサケ科魚類や紅ダイ類は食餌の重要な部分を占める甲殻類や他のアスタ キサンチン含有生物からアスタキサンチンを獲得する。囲の中で生育したサケ類 や紅ダイ類の場合には、魚を育てるのに用いる飼料は、該魚のこの重要な天然成 分の食餌源とするためにアスタキサンチンを補わなければならない。現在では、 このカロテノイド化合物源とするために、サケ類や紅ダイ類を養殖して育てるた めに準備した飼料には合成アスタキサンチンを添加している。場合によっては、 サケ類や紅ダイ類の飼料中のアスタキサンチンの代りに合成カンタキサンチン( アスタキサンチンに極めて近い酸素化カロテノイド化合物)を使用することがあ るが、この化合物は魚体内では天然に広く存在するアスタキサンチンのようには 働らかない。 養殖業界からは食餌用アスタキサンチンの天然資源に対する需要が多い。養殖 魚用に調査された食餌用カロテノイドの天然資源にはオキアミ、イセエビ、甲殻 類加工副産物、藻類や高等植物がある。しかし、これら天然資源は、商業的に実 行しうるにはあまりにも高価であり、かつ入手可能性および確実性の点で十分で はない。 紅色酵母のPhaffia rhodozymaは、樹液から単離され、かつその紅色はアスタ キサンチンと判明しているので、アスタキサンチンの天然資源として業界から多 大の注目を受けている(Miller.YoneyamおよびSoneda,1976,Int.J.Syst.B acteriol.26:286-291.Andrewes,PhaffおよびStarr,1976,Phytochem.15: 1003-1007)。Phaffia rhodozymaが1977年に、まず、サケ科魚類を着色する 実験に用いられた(Johnson,ConklinおよびLewis,1977,J.Fish,Res.Board .Can.34:2417-2421,Johnson,VillaおよびLewis,1980,Aquaculture,20: 123-134)。養殖用カロテノイド顔料源としてのPhaffia rhodozymaの考えられる 利点は、必須栄養素(たとえばタンパク質、脂質およびビタミンB類)に富む天 然物であり、かつアスタキサンチンを含有するということである(Johnson,Vil laおよびLewis,1980,Aquaculture,20:123-134)。しかし、Phaffia rhodozy maの天然の隔離集団は、アスタキサンチンをほとんど生成しないので(概して、 100ないし300ppm)養殖の実用的または経済的な顔料源ではない(Torriss en,HardyおよびShcarer,1989,Reviews in Aauatic Science 1:209-225,Joh nsonおよびAn,1991,CRC Crit,Rev.Biotech.11:297-326)。もしもPhaffia 菌株を水生動物や他の考えられる食品(動物系ないしは他のもの)を着色する経 済的に実施可能な飼料添加物としようとするならば、アスタキサンチンを過剰に 生成する菌株を開発しなければならない。このパラグラフに示した参考書はいず れもこの明細書に参考資料として収録してある。 天然に存在する「野生型」Phaffiaの突然変異体が、野生型の酵母よりも多量 のアスタキサンチンを生成可能なようだと文献に記載されている(Internationa l Publication No.WO 88/08025(International Application No.PCT/DK88/00 068);EPO Publication No.0 438 182 A1 (EPO App1ication No.91900682.3 );EPO Publication No.54 024 A2(EPO Application No.91106436.8);Int ernational Publication No.WO 91/02060(International Application No.PC T/US90/00558);EPO Publication No.0 474 347 A1(EPO Application No.91 306489.5)およびEPO Publication No.0 427 405 A1(EPOApplication No.903 11254.8)これらはすべてこの明細書に参考資料として収録してある)。該菌株 は特定条件下では、野生型の隔離集団よりも多量のアスタキサンチンを生成する といわれる。し かし、この突然変異体菌株は生物量濃度の比較的低い場合にのみ多量のアスタキ サンチンを生成する。生物量濃度が比較的高い場合には、該突然変異体菌株は役 に立つほど多くはない少量のアスタキサンチンしか生成しない。 現在までのところでは、合成アスタキサンチンと経済的に十分に競合するだけ のアスタキサンチンを生成しうるPhaffia菌株は報告されていない。商業的に実 施可能な菌株は文献に記載されている菌株よりも実質的に多量のアスタキサンチ ンを生成しなければならない。経済的に実施可能なアスタキサンチン製造法を開 発するためには、大容積、たとえば1,500リットル(l)以上の栄養素培地 において、4重量%を上回る、好ましくは6重量%を上回る酵母固形分(dys) に対して、3,000ppmを上回る、好ましくは4,000ppmを上回るアスタキ サンチンを生成する必要がある。ここで使用する「酵母固形分重量%」または簡 単に「酵母固形分」とは、この明細書に参考資料として収録されているA.O. AC.第14版(1984年)公定分析法 第10,215−10,225節に 記されている方法によって求めた清浄な固形分のことである。 商業的アスタキサンチン生産に適するPhaffia rhodozyma菌株を開発する必要 性のほかに、大型発酵槽におけるアスタキサンチンの生成をできるだけ多くする Phaffia rhodozymaの培養方法も開発する必要がある。Phaffiaの生育および大型 発酵槽におけるアスタキサンチンの製造法を扱っている文献は極く僅かしか得ら れない(International Publication No.WO 88/08025(International Applica tion No.PCT/DK88/00068)、およびEPO Publication No.0454 024 A2(EPO App lication No.91106436.8)、いずれもこの明細書に参考資料として収録してあ る)。これらに報告されている発酵法は、経済的に実施可能な商業規模の発酵法 に必要とされるよりも著しく少ない酵母固形分およびアスタキサンチン量をもた らす。 酵母細胞からアスタキサンチンを生成させる種々の要素が改善を必要とするだ けでなく、動物の肉および動物製品にアスタキサンチンを吸収、沈着させる要素 も改善を必要とする。魚体へのカロテノイドの吸収および沈着は種々の要因、す なわち、遺伝現象、大きさ、時期、性、顔料給送期間、環境因子、および食餌の 組成によって影響される(Torrissen,HardyおよびShearer:1989:Reviews in Aquatic Science.1:209-225(この明細書に参考資料として収録))。 Phaffiaまたはカロテノイド製品の配合に関しては種々の報告がある(Inter-n ational Publication No.WO 88/08025(International Application No.PCT/D K88/00068),EPO Pbulication No.0 474 347 A1(EPO Application No.91306 489.5),EPO Publication No.0 454 024 A2(EPO Application No.91106436. 8)、ならびにJapanese Patent Application 57-206342,2238855および90 JP-2 85090を例示するが、いずれもこの明細書に参考資料として収録してある)。こ れらの報告では、乾燥中のみならずさらに魚の飼料に加工中顔料を保護するため にPhaffia製品が配合された。前記のために、Phaffia配合物に種々の酸化防止剤 および安定剤が加えられた。 サケ科魚類の体温はその生息する水の温度、たとえば一般に0ないし14℃に 等しい。これは該魚類の体温が10℃よりも低くなることがあり、時折は10℃ になることを意味する。Phaffia中のアスタキサンチンは油滴中に濃縮されてい る。Phaffia油は融点が64℃のパルミチン酸(16:00)を約13%、融点 が16℃のオレイン酸(18:ln9)を約32%含んでいる。このような高融 点の脂肪酸のために、Phaffia油は10℃近くで凝固する。このために、Phaffia 油が凝固する10℃を下回る温度では魚にPhaffiaアスタキサンチンを包含させ ることが難しい。 発明の概要 この発明の1つの態様において、我々は、適当な条件下で、少なくとも約1, 500lの栄養素培地の発酵容積において生育させるとき、4重量%を上回る、 しばしば6重量%を上回る酵母乾燥固形分に対して、3,000ppmよりも多い 。しばしば4,000ppmよりも多いアスタキサンチンを産生させるPhaffia rho dozymaの新菌株を発生させて、分離した。該Phaffia菌株は養殖および食品業界 にとって、商業生産規模で、経済的にアスタキサンチンを生成させることができ る。該Phaffia菌株のあるものは1993年、4月6日に、MarylandのRockville にあるAmerican Typeの微生物株保存機関にATCC−74218(UBX−A X1),ATCC−74219(UBV−AX2),ATCC−74220(U BX−AX3)、およびATCC−74221 (UBV−AX4)という番名で保管された。 この発明の別の態様では、我々は、高酵母固形分および多量のアスタキサンチ ンが得られるPhaffia rhodozyma細胞の培養法を発見した。概して、該方法は、 生育期間中の細胞数の増加という点、および成熟期間中の細胞内におけるアスタ キサンチンの蓄積の増大および定常化という点から見て生物の生育を促進させる 特別の発酵条件をもたらすことも含む。とりわけ、該方法は発酵の生育および成 熟期の間、酵母細胞を光源に曝露し、さらに/または発酵性糖、たとえばグルコ ースの給送速度を調節するか、もしくは酵母細胞に、徐々に代謝されるエネルギ ー源、たとえばグリセロールを与えることによって成熟期の間のアスタキサンチ ンの生成を増大させかつ活発にすることを含む。 この発明の別の態様では、我々は、アスタキサンチンをサケ類、タイ類、甲殻 類や他の動物に利用するために、この発明のPhaffia菌株を破壊する必要のない ことを見出した。未破壊の細胞内のアスタキサンチンは乾燥、貯蔵や飼料調製プ ロセスの間、一層安定である。 この発明のさらに別の態様では、我々は、Phaffia製品の新規配合物が魚類へ のアスタキサンチンの沈着を増大することを見出した。この配合物は未破壊Phaf fia細胞、植物油または低凝固点植物油混合物、乳化剤、および酸化防止剤の混 合物である。 図面の簡単な説明 図1はこの発明の3種のPhaffia突然変異体菌株の遺伝歴を示す。 図2−9は種々の突然変異体菌株の外観を示す顕微鏡写真である 図10は飼養試験過程全般にわたるニジマスの重量増加を示す。 図11は図10と同じ飼養試験過程全般にわたるニジマスの着色を示す。 発明の詳細な記述 突然変異誘発 連続的突然変異誘発に続く、すぐれたアスタキサンチン生成を示す突然変異体 菌株の適切な選択によって、アスタキサンチンを過剰に生成する酵母菌株を得る ことができる。該酵母細胞はPhafria属のものが好ましく、Phaffia rhodozyma種 のものがさらに好ましい。出発点の野生型酵母細胞菌株は、世界中のさまざま な微生物株保有機関、たとえばATCCやCentraalbureau voor Schimmelcultures( CBS)に保管されているものを含む。一般に、所望の突然変異体菌株を得るには 2回以上の連続的突然変異誘発ラウンドを行う必要がある。 酵母細胞に遺伝的変化を誘発させることができる任意の薬剤または非薬剤(た とえば紫外線)を突然変異誘発物として用いることができる。該剤は単独または 相互に組合せて用いることができ、該薬剤は純品のまま、または溶剤とともに使 用することができる。 化学的突然変異誘発物質を用いる突然変異誘発実験計画では、一般に突然変異 誘発物質を緩衝化した量の細胞内に入れ、十分に混合し、さらに管を絶えず穏や かに撹拌しながら室温で1ないし12時間培養する。培養後、反応混合物を寒天 培地プレート上に直接置く。寒天の組成はさまざまであるが、該して、該組成物 はグルコース(または他の炭素源)、酵母エキス(Universal Foods Coorporati onから入手できるような)、寒天、ならびに顔料形成および/または細胞生育を 阻害する遮断剤を含んでいる。細胞は、通常殺菌した5ミリメートル(mm)のガ ラスビーズとともに振ることによって寒天表面に均等に分布させる。次にプレー トを逆にして好ましくは低強度光線を照射して、約21℃で6〜10日間培養す る。突然変異誘発物が非薬剤である突然変異誘発実験計画の場合にも同様の生育 法を用いる。 多量のアスタキサンチンを生成する突然変異体のスクリーニング プレートおよび振とうフラスコにおける初期スクリーニング 培養期間後、突然変異が与えられた親菌株よりも肉眼的によく着色して見える 酵母のコロニーを集めて、新しい寒天プレート(突然変異が与えられた親菌株を 生育させるのに用いたものと同じ組成のものが多い)上で二次培養する。同一条 件下で6〜10日間、さらに培養した後、甚だしく着色し続ける新しい隔離集団 を、フラスコ、たとえばグルコースと酵母エキスとの混合物10mlを含有する5 0mlのフラスコ内に接種する。次に隔離集団を一般に、前記培養と同じ条件でさ らに6〜10日間培養するが、この度は、毎分約200回転(rpm)で作動する 振とう機上で培養する。この培養期間後、少量(たとえば0.2ml)を採ってカ ロテノイド含量およびアスタキサンチン含量の合計を測定する。すぐれたアスタ キサンチン生成能力を示す菌株が、小バッチの発酵でさらにスクリーニングを行 う候補者であって、次の突然変異誘発またはスクリーニングに必要となるまで、 概して、適当な培地、たとえば15容量%のグリセロール中に−80℃で凍結貯 蔵する。この貯蔵法はスクリーニング工程後または単に生成菌株を保存する場合 に用いることができる。 小バッチの発酵におけるスクリーニング 50mlフラスコレベルでの適当なアスタキサンチン生成突然変異体を選択した 後、約1.5lの栄養素培地を含有する2lの発酵槽(たとえば、ニューヨーク 州,GardinerのVirtis Corp.のOmni-Culture Fermentors)内で通常、突然変異 体の性能をスクリーニングする。このレベルにおける一般的なスクリーニング法 では、グルコースと酵母エキスとの混合物を30ml含有する250mlのフラスコ に、試験すべき酵母細胞菌株の凍結ストックから採った突然変異体酵母細胞10 0〜250μlをそれぞれ接種する。 次にこれらのフラスコを絶えず光を当てながら20〜22℃で3日間、200 rpmで振とうする。次に、これら細胞培養菌を少量(15〜20ml)用いて発酵 槽内に接種する。 これら2lの発酵槽の発酵容積は通常、同化可能な形の種々のビタミンおよび ミネラルを補足した1.5lの濃縮グルコース酵母エキス培地である。典型的な これらビタミン類およびミネラル類は硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸 マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸第二鉄アンモニウム、硫酸銅、イノシトール、ピ リドキシン塩酸塩、チアミン、パントテン酸カルシウム、ビオチン等である。グ リコースおよび酵母エキスを含むこれらの物質の組合せおよび濃度は便宜的に変 えることができる。必要ならば、消泡剤および/または他の添加剤を培地の中に 包含させるかまたは培地とともに用いることもできる。 培地を含む発酵槽をオートクレーブで殺菌する。培地のpHは通常4.5ない し7に保ち、温度は15ないし24℃に維持する。培地には、一般に、濾過し、 殺菌した空気を散布し、また絶えず撹拌する(たとえば、700rpm)。発酵は 、概して4〜6日間継続し、かつ定期的にサンプリングして細胞の生育およびア スタキサンチンの生成状態を調べる。適当な生育程度およびアスタキサンチン生 成 を示す菌株が流加発酵レベルでのスクリーニングの候補者である。 流加発酵におけるスクリーニング 小バッチ発酵でのアスタキサンチンを過剰に生成する突然変異体の確認後、突 然変異体は、さらに、14l,20l,250l、および2,000lの発酵槽 で、急速生育速度、高固形分生成、および高アスタキサンチン生成量についてス クリーニングを行う。一般に、菌株は、発酵槽内で、15℃から24℃の温度範 囲で、アンモニア水、水酸化ナトリウムまたはその両者を用いて調節した約4. 5から7にわたるpH範囲において増殖させる。所望の生育速度を保つように、必 要に応じて撹拌および通気を調節する。発酵槽に詰めた培地は小型発酵槽で用い たものと組成的に類似し、すなわち、培地はグルコース(または他の適当な炭素 源)、酵母エキス、ビタミン類、ミネラル類および他の添加剤を含み、すべては 同化可能な形をしているが、正確な処方は小型発酵槽で用いたものとは異なるか もしれないし、恐らくそうであろう。消泡剤や他の加工助剤も必要に応じて使用 することができる。 培養は、所望の細胞密度が得られるまで、バッチ発酵として行ってもよいし、 またはグルコース(または他の適当な炭素源)の供給を直ちに始めてもよい。こ の供給は、最良の酵母生育速度およびアスタキサンチン生成を得るために、必要 に応じて調節される。アンモニアまたは尿素として、補足的な窒素を発酵に供給 することができる。 Phaffia rhodozymaの培養 この発明のPhaffia菌株は初めは急速な生育を示すが、高細胞濃度に近づくに つれて、たとえば6重量%を上回る生物量固形分になると漸次遅くなる。一般的 な発酵では、アスタキサンチンの生成速度は、初期にはPhaffia細胞の生育速度 よりも遅いが、最後には(発酵の後期の間)アスタキサンチン生成速度が細胞の 生育速度を上回る。我々はこの後期を「成熟期」と呼んでいる。我々は、成熟期 の初期段階の間、アスタキサンチン生成速度が最高であることを見出した。 良好なアスタキサンチン生成発酵を得るために、我々は、成熟期の初期段階の 間に生じるアスタキサンチンの高生成速度を持続または高める3つの方法を開発 した。この増進成熟期の間、アスタキサンチン濃度は標準成熟期の少なくとも2 倍、しばしば3倍以上増大する。第1の方法は、成熟期の間、とくにその初めか らアスタキサンチン生成速度が著しく低下しはじめる成熟期の時点まで、酵母細 胞を光源、好ましくは連続低強度光に曝露することである。 AnおよびJohnson(Antonie van Leeuwenhoek.1991.57:191-203、この明細 書に参考資料として収録)は高強度の光がPhaffiaによる生育およびカロテノイ ド生成を阻害することを示した。Evansら(EPO Publication No.0 427 405 A1 ,EPO Application No.90311254.8)は暗黒内よりも日中の方がPhaffiaの菌株 はよく行動することを示している。いずれの研究も寒天プレート上で生育させた Phaffiaを使用した。我々も、AnおよびJohnsonと同様に、連続蛍光(正規の実験 室照明)が振とうフラスコ内のPhaffiaの顔料収率を低減させることを認め、ま た、Evansと同様に、我々も暗黒がある種のPhaffia菌株のカロテノイド生成を抑 制することを知った。しかし、我々は、また、低強度、好ましくは連続蛍光、す なわち発酵ブロス1キロリットル当り約100ワット未満、好ましくは約25ワ ット未満の光が液体培地内で生育されるある種のPhaffia菌株のカロテノイド生 成を実際に促進することも認めた。該菌株にはAmerican Type微生物株保有機関 に保管されているATCC−74218,ATCC−74219,ATCC−7 4220およびATCC−74221という数番号を有するものも含まれている 。我々は、また、流加発酵の間にこのような光源を菌種に与えるときに、良好な アスタキサンチン生成の得られることも知った。光は特定の波長に限定されない が、250から700nmの光、とくに可視光が好ましい。発酵槽が金属または他 の不透明な物質でできているような場合には、1個以上のガラス(または類似の 半透明物質)の穴を通して光を入れることができ、一方、酵母細胞を含む栄養素 培地は絶えず、穴の前を循環する。また、発酵ブロスを、光を通す管を経て戻り 回路に圧入してから発酵槽に戻すこともできる。いずれの場合にも、光に曝露す る表面積は極めて小さいので、高強度光、たとえば15w/Kl以上を放出する光を 使用することができる。 第2に、酵母細胞に制御量の、多糖類に比して、迅速に代謝されるエネルギー 源、たとえばグルコースまたはスクロースを与える。生育期の間、酵母細胞はで きるだけ速やかに、このエネルギー源、一般にはグルコースが与えられる。ただ し該エネルギー源は栄養素培地にかなりの程度には蓄積しないものとする。この 速度は酵母細胞菌株、栄養素培地の組成、発酵実験計画、および類似の要因によ って異なる。培地内のエネルギー源の蓄積は、一般に、生育期が終りつつあって 、成熟期が始まりつつあるという信号である。 所望の酵母固形分が得られた後で、エネルギー源の蓄積前に、エネルギー源の 給送速度を、生育期間中の最高給送速度の少なくとも約50%、好ましくは少な くとも約40%、より好ましくは少なくとも約30%に低下させる。エネルギー 源のこの減速給送期間中は、酵母細胞がアスタキサンチンを生成し続けるが、酵 母細胞の数の増大、すなわち細胞密度の増加は制約される。この期間を、細胞が 経済的に望ましい速度ではもはやアスタキサンチンを生成しなくなるまで続ける 。 成熟期の間のアスタキサンチンの蓄積を最大にするために、エネルギー源給送 速度を段階的または連続的に低下させることができる。たとえば、成熟期の始め には、エネルギー源給送速度を50%低下させることができ、さらにある時間後 、一般的には12ないし24時間後に、さらに50%低下させることができる。 第3の方法は、酵母細胞にグルコースに比べて徐々に代謝されるエネルギー源 を、生育および/または成熟期の間に、与えることである。このエネルギー源す なわち成熟延長剤には酵母細胞によって徐々に代謝させることができる物質がほ とんど含まれる。グリセロール;一般に糖みつやある種のコーンシラップ中に存 在するグルコース、スクロースや他の多糖類の重合体;メタノール、エタノール 等のような種々のアルコール類;およびコハク酸、グルタミン酸、マレイン酸等 のような種々の有機酸が典型的な延長剤である。 この方法の1つの態様では(エネルギー源の減速給送法のように)、該延長剤 は、エネルギー源(たとえばグルコース)の蓄積が栄養素培地に検知されるとき に、酵母細胞に与えられ、さらに、細胞のアスタキサンチン生成が望ましい速度 で続くような量および方法で与えられる。このアスタキサンチン生成速度が遅く なると、それに応じて細胞に給送する延長剤の量を減少させる。正確な量および 延長剤給送速度は菌株、発酵実験計画等の事情によって変化する。 この方法の別の態様では、徐々に代謝される延長剤を生育期の間、エネルギー 源飼料の一部として、またはそれに加えて酵素細胞に与えることができる。この 場合には、酵母細胞は、まず急速に代謝されるエネルギー源、たとえばグルコー スを減らし、このエネルギー源の消費速度が遅くなると、これは成育期が終りつ つあって、成熟期が始まりつつあることを示す。この時点で、栄養素培地へのエ ネルギー源の添加を止め、培地に残留する急速に代謝されるエネルギー源が使い 果されると、酵母細胞が残留する徐々に代謝されるエネルギー源を代謝させ始め る。該残留する徐々に代謝されるエネルギー源は必要に応じて、前記の別の物質 で補うことができる。 いずれの形式においても、成熟延長剤の使用は、他の2つの延長法と同様にこ の期間を延長させる。さらに、これらの方法は相互に組合せて使用することがで き、一般には連続光法を給送法の1つと組合せて使用する。 成熟期の初期段階は(単位容積当り単位時間当りのアスタキサンチン生成量、 たとえばmg/l/hrで測定した)、アスタキサンチン生成速度が遅くなるまで続 く。これは通常生育期終了後2ないし4日間存在する。速度はいうまでもなく連 続体であって、最大値から低下しはじめたある時点において、この期の初期段階 が終り、成熟期が経済的に望ましくなるまで続いて、該期を終える。 酵母細胞の回収および生成物の調製 Phaffia酵母を純粋な培養発酵生成物として製造する。発酵原料は、プロセス への有効利用性および適合性に基づいて多数の売り手から選ばれる。Phaffia rh odozymaの生育に資するための主成分には高デキストローズ当量(DE)のコー ンシラップ(または同等の発酵性糖源)、酵母エキス、アンモニア、無機リン酸 塩類、および硫酸マグネシウムがある。これら主成分以外に、多数の微量養素、 たとえば微量金属およびビタミン類が必要である。これら栄養素はすべて、飼料 や食料用酵母の製造を含めて、一般に商業発酵法で用いられている。各成分は、 Phaffia酵母がアスタキサンチンの最高収率を示すように、最適化される。発酵 中の発泡は食品に許容される消泡剤の添加によって制御する。 発酵は使用前に清浄にし、殺菌した清潔な培養発酵槽で行われる。発酵プロセ ス中に発酵槽に加えられる栄養素はすべて使用前に殺菌する。 この発明に示すPhaffia酵母の製造は流加発酵からなる。他の発酵法は、必要 があれば使用することができる。発酵中の栄養素の添加は、Phaffia酵母生物量 およびアスタキサンチンのいずれをも急速に生成させるように最適化される。 発酵中、多くの条件が制御かつ維持される。該条件の中には培地の酸度、発酵 温度および通気の程度がある。 発酵は、通常、アスタキサンチンの生成が商業的に望ましいレベルを下回ると きに停止し、一般的には培養物(すなわち発酵ブロス)を普通の方法で発酵槽か ら冷凍貯蔵容器に移すことによって終り、遠心分離か濾過による濃縮化の準備を する。連続的遠心分離または濾過装置は発酵ブロスの予備濃縮に使用する。発酵 ブロスをこれらの装置に通して、酵母濃縮物(すなわち酵母クリーム)を冷凍酵 母クリーム貯蔵タンクに移す。 エトキシキン、ビタミンE、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチ ル化ヒドロキシトルエン(BHT)またはアスコルビルパルミテートのような可 食酸化防止剤;植物油、たとえばコーン油、ベニバナ油、ヒマワリ油、大豆油等 のような食用油;および大豆レシチンまたはソルビタンエステル類のような可食 乳化剤をこの段階で酵母クリームに加えることができる。ここで使用する「可食 」という用語はヒトまたは動物の消費が許容される物質を意味する。これは加工 および輸送中にアスタキサンチンを保護するのに役立ち、さらにまた魚肉への顔 料の沈着をよくする。 油、乳化剤および酸化防止剤は、Phaffia酵母のプロセス中の都合のよいとき に加えることができる。1つの態様では、油または油混合物、乳化剤および1種 以上の酸化防止剤を相互に混合した後、混合物をブロス濃縮物(酵母クリーム) と混合し、乾燥し、包装して輸送する。別の態様では、油、乳化剤および酸化防 止剤を、酵母クリームの乾燥後に酵母クリームに添加する。さらに別の態様では 、添加剤の1種または2種を、乾燥前に酵母クリームと混合し、一方、残りの添 加剤は、乾燥後に、酵母クリームと混合する。最終乾燥物の総重量に対して、油 または油混合物は約0.1ないし10重量%を占め、乳化剤は約0.1ないし1 0重量%を占め、酸化防止剤は約0.02ないし2重量%を占める。 酵母クリームは、乾燥前に、適当なアスタキサンチン含量、通常は飼料酵母( Universal Foods Corporation製YeacoTM-20または同等品)の添加により製品1 キログラム当り3,000、4,000または5,000ミリグラム(mg/kg) となるように標準化する。 標準化製品は、次に適当な手段、たとえば噴霧乾燥、ドラム乾燥等によって乾 燥して最後に、一般に20または25kgのヒートシールしたポリライニング箱に 収める。包装は光、酸素および水分から製品を保護するように設計されている。 この発明の1つの態様では、酵母クリームを通常の設備および方法を用い、細 胞の相当数、好ましくは、過半数が、該方法によって破壊しないよう、すなわち 細胞が大部分の球形を保持するように乾燥する。我々は、壊れていない酵母細胞 が、消費する動物に、壊れた細胞と同じか、またはほぼ同程度に有効にアスタキ サンチンを与えることを認めた。 この発明の別の態様では、酵母クリームを、乾燥生成物中の細胞のほとんどが 壊れるかまたはばらばらになる、すなわち細胞がもはやほとんど球形を保たない ように、細胞の破壊を促進させるやり方で乾燥する。このような壊れた細胞が望 ましく、しかも乾燥プロセスによっては得られない場合には、細胞を微粉砕工程 にかけるかまたは細胞を破壊する酵素処理を行うことができる。 下記実施例はこの発明のある特定態様を説明するためのものである。とくに断 らなければ、部および百分率はすべて重量単位である。 特定態様 顔料抽出およびアスタキサンチン分析 Sedmak.WeersingheおよびJollyがBiotechnol.Techniques 4:107-112(19 90年7月)(この明細書に参考試料として収録)に報告した通りにアスタキサ ンチン含量を測定する。 酵母細胞を12×100mm試験管中で脱イオン水4mlを用いて2回洗う。洗浄 および水分傾しゃ後、洗浄した細胞ペレットの入った試験管をさかさにして水を 切る。次に、管内面をティッシュペーパーで拭って大部分の水分を除去する。つ いで、各試験管に55℃に予熱した0.5mlのジメチルスルホキシド(DMSO )(ミズリー州,St,Louis.Sigma Chemical Co.)を加える。試験管を20〜 30秒(sec)渦巻状に撹拌し、さらに0.1mlの0.02Mリン酸ナトリウム (pH7.0)を入れ、次に加える1mlの有機溶剤中にカロテノイドを分配させ る。アスタキサンチンの高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析に適合さ せるた めに、1mlのヘキサン:酢酸エチル(50:50容量基準、HPLC級)を使用 する。次に試験管を30〜40秒間渦巻状に撹拌して、水相と有機相とを混合さ せる。卓上型臨床用遠心機で3分間遠心分離を行って両相を分離させる。有機相 を取り出して、480nmの吸光度(A480)から有機相の着色カロテノイド含量 ンチンを用いる測定に基づく)を用いて計算する。 次に、アスタキサンチン含量はHPLCによって求める。HPLC分析用試料 は、ヘキサン:酢酸エチル(50:50容量単位)で希釈した後氷酢酸を用いて 0.1%酢酸として、濾過してから注入する。カラムはAlltech(イリノイ州,D eerfield)のNucleosil 100シリカ 5ミクロン、Alltechガードカラム付2 50×4.6mmステンレス鋼カラムである。溶離溶剤はヘキサン:酢酸エチル( 50:50容量単位)で氷酢酸は含まない。溶離剤は476nmでモニターする。 次に合成アスタキサンチンの基準の位置の曲線の下方の面積からアスタキサンチ ン百分率を計算する。 次にアスタキサンチン濃度は次のように計算する 発酵ブロスml中の総カロテノイドμg =(A480/2,150)×104×希釈係数 発酵ブロスml中のアスタキサンチンμg =(発酵ブロスml中の総カロテノイドμg ×HPLCにより求めたアスタキサンチン百分率%)÷100 酵母g中のアスタキサンチンμg =発酵ブロスml中のアスタキサンチンμg÷酵母乾燥固形分g/ml 実施例1:突然変異体菌株の発生 突然変異誘発という表題の節で述べたように反覆突然変異誘発によって野生型 菌株からPhaffia rhodozyma突然変異体ATCC−74218(UBV−AX1 ),ATCC−74219(UBV−AX2),ATCC−74220(UBV −AX3)およびATCC−74221(UBV−AX4)を発生させた。図1 はUBV−AX2,UBV−AX3およびUBV−AX4の遺伝歴を示す。UB V−AX1は7回の突然変異誘発後に分離された。 実施例2:新菌株の培養 表1,2および3のデータから、この発明のPhaffiaの菌株は、種々の大きさ の発酵容積において、高固形分細胞に生育し、かつ多量のアスタキサンチンを生 成することがわかる。文献の中には、アスタキサンチンと総カロテノイドとが識 別されておらず、したがってアスタキサンチンの実際の量は報告された値よりも かなり小さいものがある。後記の表中のアスタキサンチンの値はアスタキサンチ ンのHPLC定量によるものである。14l発酵 14lのVirticulture発酵槽(Virtis Corporation,ニューヨーク州,Gardin er)内に、1.5lの適当な生育培地中に活発に生育している約30g(乾量基 準)の培養菌を接種する。固化ブロスの典型的な配合は次の通りである。 始動条件は毎分8標準リットル(SLPM)の通気および500rpmの撹拌であ る。pHは、試薬級水酸化アンモニウム(NH4OH)を3倍に希釈した液75 0mlで5.5に調節する。必要に応じて食品級の消泡剤を添加する。発酵の全般 にわたりグルコースの濃度が1リットル当り5グラム未満(g/l)、好ましく は0.1ないし2.5g/lとなるような比率で培養菌に1750gのグル コース(イリノイ州,Summit-Argo,CPC International製 CereloseTM)を50 重量%溶液として与える。溶解酸素は撹拌と風量で20%から90%飽和に調節 する。UBV−AX3およびUBV−AX4についての前記発酵の結果を表1に 示す。 2,000lの発酵 下記の約700lのブロスを含有する2,000lのIF2000 New Brunswick S cientific発酵槽(New Brunswick Scientific Corporation,ニュージヤージー 州,Edison)内に、適当な生育培地120l中に活発に生育している約3.6kg (乾量基準)の培養菌を接種する。 始動条件は700SLPMの通気および100rpmの撹拌である。pHは無水 アンモニアで5.5に調節する。必要に応じて食品級の消泡剤を添加する。グル コースが発酵ブロス中に5g/lを超えるまで、好ましくは0.1〜2.5g/ lまで蓄積しないような速度で、培養菌に未精製の高デキストローズコーンシラ ップ(Cargill Incorporated,アイオワ州,Eddyville)の45重量%溶液80 0kgを与える。溶解酸素は撹拌と風量によって、20%ないし70%飽和になる ように調節する。発酵終了時のブロスの容積は約1,500lである。UBV− AX2についての発酵の結果を表2に示す。 40,000lの発酵 4,000lの適当な生育培地中に活発に生育している約3.6kg(乾量基準 )の培養菌を40,000lの発酵槽に接種する。固化ブロスの典型的な配合は 次の通りである。 始動条件は8,000SLPMの通気および40rpmの撹拌である。pHは無 水アンモニアによって5.5に調節する。必要に応じて食品級の消泡剤を添加す る。グルコースが発酵ブロス中に5g/l以上、好ましくは0.1〜2.5g/ lまで蓄積しないような速度で、未精製の高デキストローズコーンシラップ(Ga rgill Incorporated,アイオワ州,Eddyville)の42重量%溶液17,000k gを培養菌に与える。溶解酸素は撹拌と通気によって20%から70%飽和に調 節される。UBV−AX1についての発酵の結果を表3に示す。 実施例3.菌株の説明:コロニーの形態 2%グルコース、0.5%Tastonetm−154(Universal Foods Co.酵母エ キス)、および1.5%寒天を含有する2〜4週間経過した画線プレートについ て新菌株のコロニーの形態を観察した。 UBV−AX1:十分に分離したコロニーは直径が4〜5mmである。培養菌の 中に若干のコロニーの大きさの不均一性が存在する。小さいコロニーの大きさは 1mmから3mmにわたる。これら小さいコロニーの中には、コロニー集団の残りの ものより色の黒いものがある。コロニーの縁は完全であるが、若千のコロニーは 不規則な縁を示すものがある。これは一般に3〜4週間後に現われる。コロニー は凸面で若干突起している。色は紅橙色で、突起中央部は色が濃い。コロニーの 外観はつや消状である。コロニーが密集している場合、とくに古いプレートでは しわの寄っているコロニーもある。3〜4週間後に、コロニーの色は濃紅色にな る。時折細胞のローン(lawn)に黄色ないし橙色の淡色のコロニーの見られるこ とがある。これらのローンは粒状の外観を呈する。 UBV−AX2:十分に分離したコロニーは直径が4〜5mmである。若干のコ ロニーの大きさの不均一性が存在し、ときどき小さいコロニーが見られる。コロ ニーの縁は完全である。コロニーは凸面で若干突起しており、外観上光沢がある 。色は紅−橙色で、とくに密集している場合には隆起中央部の色が濃い。若干の コロニーの縁にはときどきでこぼこが見られる。3〜4週間後には、コロニーは 依然として光沢があり、濃紅色を呈する。細胞のローンは滑らかで光沢のある状 態を保っている。淡色のコロニーがないことはこの菌株の着色の遺伝子が極めて 安定であることを示す。 UBV−AX3:コロニーの形態が、グルコース/酵母エキスのブロス中で生 育6日後にとくに、不均質である場合がある。グルコース/酵母エキスプレート 上での10日後のコロニーの大きさは、直径が1.5mmから3mmに及ぶ。色は紅 色から橙色にわたる。概して、小さいコロニーは大きいコロニーよりも濃紅色で ある。 UBV−AX4:グルコース/酵母エキスプレート上での2週間後のコロニー は直径が2〜3mmである。コロニーの縁は完全であるが、少数のコロニーは波形 の縁を示す。コロニーの色は濃紅−橙色である。コロニーは光沢があり、密集し ている場合にはとくに円錐形状を呈する。3週間後、コロニーの外観は底部が平 らになっているように見える。コロニー中央部の色は周辺部よりも紅昧が濃い。 コロニーの縁は完全状態を保つ。 実施例4:菌株の説明:顕微鏡的外観 2%グルコース、0.5%Tastone tm−154の中で6日間生育させた新菌株 について細胞の顕微鏡的外観を観察した。 UBV−AX1(図2および3):細胞は単独かまたは時折短かい連鎖を有す る対状をなす。細胞はだ円形ないし卵形である。細胞は紅味を帯びた褐色である 。若干の細胞は脂質の小滴を有する細胞質を欠いている。粒状でやや着色してい る細胞が見られる。中には多形態性形状のものも見られる。時折短突起形状の細 胞が存在する。 UBV−AX2(図4および5):細胞は単独かまたは対をなす。母細胞の同 じ端部に2個の芽状突起のある細胞が通常である。細胞は偏だ円形ないし球形で ある。明らかに着色した紅褐色の細胞が多い。粒状を呈し着色した細胞質を有す る細胞がかなり一般的である。時折大きくて濃く着色した円い「厚膜胞子状」の 構造物が見られる。該構造物は厚膜胞子の肥厚した細胞壁を欠いている。 UBV−AX3(図6および7):細胞は単独か、対もしくは短連鎖または3 ないし6個の細胞の小凝縮塊をなす。多形態性形状のものが見られる。明らかに 着色している細胞が多い。該細胞中の細胞質は粒状に見える。 UBV−AX4(図8および9):細胞は単独か、対または短連鎖をなす。多 形態性形状のものが見られる。若干の細胞は紅褐色粒状の細胞質を有する。若干 の細胞は紅色の結晶性構造物を有するように思われる。ある細胞では脂質の小滴 が極めて明瞭である。 実施例5:菌株の説明:細胞の大きさ 表4に、2%グルコースおよび0.5%Tastone tm−154中で6日間生育さ せた新菌株の細胞の大きさを示す。 実施例6:低強度光線照射によるアスタキサンチン生成の増大 表5に暗黒が振とうフラスコ中の顔料生成を阻害することを示す。Phaffiaは 、2%グルコースおよび0.5%酵母エキスを有する200rpmで振とうするフ ラスコ内で21℃で6日間生育させた。 実施例7:コーンシラップ加水分解物 コーンシラップ加水分解物(DE=95)およびコーンシラップ部分加水分解 物(DE=63)を混合して、グルコースならびにかなりの量のマルトース、マ ルトトリオースおよび高級重合糖のような種々の高級糖類を含有する飼料物質を つくる。これらの糖類すなわち多糖類は、グルコースが激減するまで同化されな い。前記2種類のコーンシラップの75:25混合物は、グルコースが約78% でマルトースが10%の飼料(DEは約87)をつくる。 表6のデータから、20lの発酵槽でコーンシラップ加水分解物(DE=95 )およびコーンシラップ部分加水分解物(DE=63)の75:25混合物を用 いると、コーンシラップ加水分解物(DE=95)のみを用いた場合よりもUB V −AX1は著しく多量のアスタキサンチンを生成することがわかる。 実施例8:成熟中のアスタキサンチン生成に及ぼすグリセロールの影響 ほとんどPhaffia菌株の場合に、生育が停止した後もアセタキサンチンの合成 は続いている。したがって、アスタキサンチンをPhaffiaの二次代謝産物とみな す人もいる。我々は、主炭素源(グルコース)が用いられた後の非生育期の間に 、Phaffiaにグリセロールを加えるとカロテノイド合成が刺戟されることを見出 した。HPLC分析の結果は、グルコースとグリセロールが共に存在する場合に は、グルコースが優先的に用いられ、グルコースが激減した後に初めてグリセロ ールが用いられることを示す。次表でわかるように、グルコースとともにグリセ ロールを包含させると我々のPhaffia菌株のアスタキサンチン収率は著しく向上 する。グリセロールが唯一の炭素源である場合には該菌株の生育は極めて劣悪と なる。 表7は、2%グルコースおよび0.5%酵母エキスを有する振とうフラスコ内 で、連続低強度光線に6日間曝露すると、Phaffia rhodozymaのアスタキサンチ ン生成量がグリセロールによって大幅に増加することを示す。 実施例9:成熟中の緩徐給餌 表8のデータは、エネルギー源を連続的に給餌するかしないかが成熟に及ぼす 影響を示す。発酵は20lのChemap発酵槽内で、UBV−AX1および実質的に 前記の標準発酵形式を用いて行った。事例1の場合には、細胞の生育速度が低下 したので、発酵を停止した。事例2では、細胞の生育速度が低下したのでエネル ギ源の給餌を停止して、細胞を72時間成熟させた。事例3の場合には、酵母の 生育速度が低下したのでエネルギー源給餌速度を最高給餌速度の25%に下げ、 緩徐給餌を行いながら細胞を72時間成熟させた。 実施例10:サケ類の顔料源としての新菌株の評価 この実施例は、Phaffia rhodozymaの新菌株を添加物として、飼料に加えると 、サケ科魚類を効果的に着色させることを示す。この実施例は、また、この発明 の菌株は破壊を必要とせずに、アスタキサンチンをサケ類に利用しうることも示 す(Binkowsky,SedmakおよびJolly.1993.Aquaculture Magaine.3月/4月 :54−59、この明細書に参考資料として収録)。 実質的に前記のように2,000lの発酵槽でPhaffia菌株を生育させた。細 胞は、遠心分離によって15〜22%固形分に濃縮して乾燥した。飼料は Zeigler Bros.Inc.(ペンシルベニア州,Gardners)で加工した。新Phaffia r hodozymaまたは合成アスタキサンチン(5% Carophyll Pink,Hoffmann-LaRoch e)を前記 #1/8 Trout Growerペレット化飼料中に包含させた。 地方の商業マス養殖業者からニジマス(Onchorhynchus mykiss,Shasta strai n)を入手した。実験条件および実験対照食餌に順応させた後、マスを別々の実 験タンク(1タンク当り28匹)に移した。実験タンクは約250リットルの水 量があり(直径76センチメートル;高さ56cm)、水の平均流量は毎分6.5 リットルであった。 全体的に、実験に用いた方法および食餌は、ほとんどの商業生産マスが育成さ れている温度に近い10℃で最適に近いマスの生育が得られるように設計されて いる。実験終了までには、残っているマスはほぼマーケットサイズであった。 4,8および12週間目に、1タンク当り6匹の魚を無作為に取り出して、生 育程度および顔料の量を調べた。魚は頭部に一撃を加えて気絶させ、全長を測定 し、汚れをぬぐい取って乾燥した後重量を測定し、さらに各魚は腹部大動脈を切 断して峡部を切り開いた。魚は冷水で血を洗い出した後、各魚から2枚の皮付き 切身を切り取った。各サンプリングから得られる情報に基づき、タンクの生物量 を再計算し、各タンクが1日当りの飼料中の概算生物量の1.5%を受け入れる ように、飼料支給量を調節した。 切身を処理して、魚の湿潤重量当りのカロテノイド含量を求めた。切身の種々 の部分からプールした肉約15gを均質化し、均質化した肉0.2gの試料を室 温下で30分間1mlのアセトンで抽出して肉のカロテノイドを遊離させた。次に カロテノイドをヘキサン:酢酸エチル(容量比1:1)で分配させて、「顔料抽 出およびアスタキサンチン分析」という表題の項で前述したように、総カロテノ イドおよびアスタキサンチン含量を測定した。 飼料のペレットは乳鉢と乳棒で粉砕した。粉砕ペレットの精秤した部分(0. 05g)を室温で30分間ジメチルスルホキシド(DMSO)で処理してカロテ ノイドを抽出した。DMSO抽出カロテノイドを次に「顔料抽出およびアスタキ サンチン分析」という表題の項で前述したように定量した。この方法は実験試行 を通じて飼料の分析に使用した。 我々の新規Phaffia酵母(1つは完全な細胞で他は粉砕または破壊した細胞) を含有する食餌を与えたニジマスの生育および着色を無着色食餌を与えたニジマ スおよび合成アスタキサンチンを含有する食餌を与えたニジマスと比較した。 図10でわかるように、4グループすべての魚の重量増加を、84日間の試験 期間中にほぼ240gから380gに成長した魚について比較した。この研究か ら、前記のレベルで食餌に加えた完全かまたは破壊されたPhaffia酵母は、対照 魚飼料と同等かまたはすぐれた嗜好性および消化性を示すことがわかる。84日 間の魚の全般的な解剖学的調査によって、4つの処理グループの間には差異がな いことがわかった。 アスタキサンチンを欠いた食餌(食餌D)を与えたニジマスの肉のカロテノイ ド含量は給餌の0日および84日後において同等の低い量を示し、本研究の基礎 食餌が魚肉に沈着させるかもしれないカロテノイドを全く欠いていることを示し ている。給餌84日後には、魚に与えたPhaffiaおよび合成アスタキサンチンの 肉中のカロテノイド含量は同じであった(図11)。4グループすべての魚は8 4日の試験期間中同等の速度で着色した。 実施例11:サケ類を着色させるPhaffia製品の新規配合物の評価 この実施例は、エトキシキン、レシチンおよびベニバナ油を混合したPhaffia 細胞の配合物がサケ科魚肉にアスタキサンチン沈着を増大させることを示す。 Phaffiaを2,000lの発酵槽で実質的に前記のように生育させた。細胞は 遠心分離によって15〜22%固形分に濃縮して乾燥した。エトキシキン、レシ チンおよびベニバナ油は乾燥前に酵母クリームに加えた。飼料はZeigler Bros. Inc.(ペンシルベニア州,Gardners)で加工した。処理および無処理のPhaffia を#1/8Trout Growerペレット化飼料に包含させた。 地方の商業マス養殖業者からニジマス(Onchorhynchus mykiss,Shasta strai n)を入手した。実験条件および実験対照食餌に順応させた後、マスを別々の実 験タンク(1タンク当り14匹)に移した。実験タンクは約650lの水量があ り(直径120cm;高さ56cm)、水の平均流量は毎分11リットルであった。 全体的に、実験に用いた方法および食餌は、ほとんどの商業生産マスが育生さ れている温度に近い10ないし12℃で最適に近いマスの生育が得られるように 設計されている。実験終了までには、マスは平均300gから平均650gに成 長した。魚を実験タンクに分ける前に無作為に15匹の魚をサンプリングして基 線重量、長さおよび肉色のデータを調べた。63日後に1タンク当り10匹の魚 、93日後に1タンク当り14匹の魚を無作為に取り出して、実施例10に述べ たように生育程度および顔料の量を調べた。同様に、実施例10の方法を用いて 、切身(肉の湿潤重量当りのカロテノイド含量を求めるため)および飼料ペレッ トを処理した。 レシチンおよびベニバナ油を含有および含有しないPhaffia酵母を含有する食 餌を与えられたベニマスの生育および着色を比較した。食餌Aは2,000ppm のエトキシキンで処理したPhaffiaを含有した。食餌Bは2,000ppmのエトキ シキンおよび2.5%の大豆レシチンで処理したPhaffiaを含有した。食餌Cは 2,000ppmのエトキシキン、2.5%の大豆レシチンおよび2.5%のベニ バナ油で処理したPhaffiaを含有した。 表9のデータからわかるように、給餌93日後には、エトキシキン、大豆レシ チン、およびベニバナ油で処理したPhaffiaを含有する食餌を与えられた魚がも っとも良く着色した。 前記実施例によって、この発明をかなり詳細に述べたけれども、該詳細は説明 のためのものである。当業者によって、請求の範囲に記載したこの発明の精神お よび範囲から逸脱せずに、多くの変化や修正を行うことが可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI C12R 1:645) (C12P 23/00 C12R 1:645) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG ,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN, TD,TG),AT,AU,BB,BG,BR,CA, CH,CZ,DE,DK,ES,FI,GB,HU,J P,KP,KR,LK,LU,MG,MN,MW,NL ,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE, SK,UA (72)発明者 ジョリー,セツコ・オー アメリカ合衆国ウィスコンシン州53217, グレンデール,ウエスト・クローバーヌッ ク・レーン 820 (72)発明者 セドマック,ジョゼフ・ジェイ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53005, ブルックフィールド,ジェームズ・ストリ ート 13955 (72)発明者 スカートラッド,トーマス・ジェイ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53051, メノモニー・フォールズ,ダブリュー 15873・カントリーサイド・ドライヴ・エ ヌ76 (72)発明者 ワシルスキー,ジョン・エム アメリカ合衆国ウィスコンシン州53005, ブルックフィールド,ウエストウッド・コ ート 3820

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.4重量パーセントを上回る酵母固形分を含有する、少なくとも約1,50 0リットルという容積の栄養素培地において、適当な条件で培養するとき、酵母 乾燥固形分を基準に少なくとも約3,000ppmのアスタキサンチンを産生するP haffia rhodozyma菌株。 2.酵母乾燥固形分が6重量パーセントを上回る請求項1の菌株。 3.栄養素培地の容積が少なくとも30,000リットルである請求項2の菌 株。 4.酵母乾燥固形分を基準に少なくとも約4,000ppmのアスタキサンチン を産生する請求項3の菌株。 5.4重量パーセントを上回る酵母固形分を含有する、少なくとも約1,50 0リットルという容積の栄養素培地において、適当な条件で培養するとき、酵母 乾燥固形分を基準に少なくとも約3,000ppmという量のアスタキサンチンを 産生する能力を保持しているATCC−74218,ATCC−74219,A TCC−74220およびATCC−74221として寄託されている菌株、な らびにその突然変異体および誘導体より成る群から選ばれる請求項1の菌株。 6.菌株が、(i)急速にその細胞が数を増して、アスタキサンチンを産牛し 、かつエネルギー源が所定のレベルを上回るほどは培地に蓄積されないような速 度で菌株に給送される生育期に続き(ii)細胞数の増加は減じるが、アスタキサ ンチンの産生は生育期間中の速度と少なくとも同等の速度で継続する成熟期を経 験するようなレベルに、培養の少なくとも一部が終るまで保たれる急速に代謝さ れるエネルギー源を含有する栄養素培地において、適当な条件で菌株の細胞を培 養することを含むPhaffia rhodozyma菌株からアスタキサンチンを生成させる改 良発酵法において、成熟期を延長させることを含む改良法。 7.菌株を光源に曝露することによって成熟期を延長させる請求項6の方法。 8.光源が、発酵ブロス1キロリットル当り約100ワットを下回る光を菌株 に与える請求項7の方法。 9.露光が成熟期の初めから発酵が終るまで実質的に継続する請求項8の方法 。 10.光源が約250から700ナノメートルの間の波長の光を菌株に与える請 求項9の方法。 11.生育期の終りに、菌株への急速に代謝されるエネルギー源の給送速度を低 下させることによって、成熟期を延長させる請求項6の方法。 12.生育期の終りに菌株にエネルギー源を給送した速度の僅か約50%にエネ ルギー源の給送速度を低下させる請求項11の方法。 13.エネルギー源がグルコースである請求項12の方法。 14.成熟期の初めに、急速に同化されるエネルギー源を、徐々に同化されるエ ネルギー源で置き換えることによって成熟期を延長させる請求項6の方法。 15.急速に代謝されるエネルギー源がグルコースであり、徐々に代謝されるエ ネルギー源がグリセロール;糖みつやコーンシラップ中に存在するグルコース、 スクロースや他の多糖類の重合形態;一価アルコール類;およびカルボン酸類よ り成る群から選ばれる請求項14の方法。 16.徐々に代謝されるエネルギー源が、発酵の生育期の間、急速に代謝される エネルギー源とともに菌株に給送される請求項15の方法。 17.徐々に代謝されるエネルギー源が、急速に代謝されるエネルギー源の給送 停止後に菌株に給送される請求項15の方法。 18.請求項6の方法でつくったアスタキサンチン。 19.請求項7の方法でつくったアスタキサンチン。 20.請求項11の方法でつくったアスタキサンチン。 21.請求項14の方法でつくったアスタキサンチン。 22.請求項1の菌株からつくったPhaffia rhodozyma酵母クリーム。 23.請求項22の酵母クリームからつくった乾燥生成物。 24.可食酸化防止剤、食用油、および可食乳化剤を含む請求項23の乾燥生成 物。 25.乾燥生成物の重量を基準に、酸化防止剤の濃度が約0.02ないし約2重 量パーセントの間、油の濃度が約0.1ないし約10重量パーセントの間、およ び乳化剤の濃度が約0.1ないし約10重量パーセントの間である請求項24の 乾燥生成物。 26.酸化防止剤が、エトキシキン、ビタミンE、アスコルビルパルミテート、 ブチル化ヒドロキシアニソール、およびブチル化ヒドロキシトルエンより成る群 から選ばれる請求項25の乾燥生成物。 27.油がベニバナ油、コーン油、ヒマワリ油、大豆油、および前記油の2種以 上の混合物より成る群から選ばれる請求項26の乾燥生成物。 28.乳化剤が大豆レシチンおよびソルビタンエステル類より成る群から選ばれ る請求項27の乾燥生成物。 29.酵母細胞の過半数が破壊されていない請求項23の乾燥生成物。 30.酵母クリームを噴霧乾燥またはドラム乾燥して調製した請求項29の乾燥 生成物。 31.酵母細胞の過半数が破壊されている請求項23の乾燥生成物。 32.酵母細胞が微粉砕されている請求項31の乾燥生成物。 33.請求項23の乾燥生成物を含む動物飼料。 34.請求項24の乾燥生成物を含む動物飼料。 35.動物飼料の重量を基準に、約0.1ないし約10重量パーセントの間の該 乾燥生成物を含む請求項34の動物飼料。 36.動物飼料の重量を基準に、約1ないし約3重量パーセントの間の該乾燥生 成物を含む請求項34の動物飼料。 37.サケ科魚類、甲殻類およびタイ科魚類より成る群から選ばれる動物用に配 合された請求項35の動物飼料。 38.動物の飼養法において、請求項23の飼料を動物に与えることを含む方法 。 39.動物が、サケ科魚類、甲殻類およびタイ科魚類より成る群から選ばれる請 求項38の方法。
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