JPH08508885A

JPH08508885A - アスタキサンチンを過剰に生成するｐｈａｆｆｉａｒｈｏｄｏｚｙｍａ菌株、その培養方法および動物飼料中への使用

Info

Publication number: JPH08508885A
Application number: JP6523097A
Authority: JP
Inventors: ジェイコブソン，ガンナード・ケイ; ジョリー，セツコ・オー; セドマック，ジョゼフ・ジェイ; スカートラッド，トーマス・ジェイ; ワシルスキー，ジョン・エム
Original assignee: ユニヴァーサル・フーズ・コーポレーション
Priority date: 1993-04-19
Filing date: 1993-08-13
Publication date: 1996-09-24
Also published as: AU5008693A; US6015684A; NO954052D0; NO954052L; NO325466B1; US5466599A; US6413736B1; NZ255742A; WO1994023594A1; US5922560A; US20030049241A1; AU688280B2; EP0708604A1; EP0708604A4

Abstract

(57)【要約】４パーセント、好ましくは６パーセントを上回る酵母乾燥固形分を含有する、少なくとも約１，５００リットルという容積の栄養素培地で培養するとき、酵母乾燥固形分を基準に３，０００ppmを上回るアスタキサンチンを生成するPhaffiarhodozyma菌株が述べられている。該菌株や他の菌株を、酵母細胞を低強度光線に曝露するか、急速に代謝されるエネルギー源、たとえばグルコースを該細胞に徐々に与えるか、または急速に代謝されるエネルギー源を徐々に代謝されるエネルギー源、たとえばグリセロールで置換えるような１種以上の種々の方法によって、発酵の成熟期を延長させることを含む改良発酵法によって培養する。該菌株の細胞を動物飼料、とくにサケ科魚類の飼料に包含させて、該動物および該動物からつくった製品の紅色着色を付与するかまたは向上させる。

Description

【発明の詳細な説明】アスタキサンチンを過剰に生成するＰＨＡＦＦＩＡＲＨＯＤＯＺＹＭＡ菌株、その培養方法および動物飼料中への使用発明の背景この発明はアスタキサンチンに関する。１つの態様では、この発明は酵母細胞がつくるアスタキサンチンに関し、また別の態様では、この発明は、自然界に存在する一般的なPhaffia rhodozyma酵母細胞よりも多くのアスタキサンチンを生成するPhaffia rhodozyma酵母細胞の突然変異体菌株をつくって、培養する方法に関する。さらに別の態様では、この発明は、該酵母細胞からつくった生成物の、種々の動物飼料の飼料補足物としての使用に関する。鮮紅色は、ある種の食品、とくに、サケ、タイ類、マス、小エビ、ロブスターや多くの他の海産動物が消費者に好まれるために極めて重要である。酸素化カロテノイドアスタキサンチン（３，３′−ジヒドロキシ−６，６−カロテン−４，４′−ジオン）が該水生動物の紅色の原因である。アスタキサンチンは該動物の特有の色の原因となる以外に、これら海産動物の生命における重要な栄養上の役割りを果す（Torrissen，1989，Proc.，Third Int．Symp．on Feeding and Nutr ．in Fish，Toba Aug．28-Sept．1，Japan，pp.387-399，Meyers and Chen，198 2，World Aquaculture Society，Special Publication No.3，pp.153-165）。これらの参考書は、この明細書に参考資料として収録してある。このカロテノイドは、また、他の動物の肉や製品、ならびに他の食品、たとえば鳥肉や卵、種々の乳製品、軽食品等を着色するのにも有効である。アスタキサンチンは水生界に存在するもっとも豊富なカロテノイドである。水生動物は、陸生動物と同様に、その多くは食餌中に存在するカロテノイド化合物を蓄積するけれども、アスタキサンチンや他のカロテノイドを合成することはできない。該動物の中には、甲殻類のように、あるカロテンを、アスタキサンチンが主な化合物を形成する酸素化型のカロテノイド（キサントフィルと呼ぶ）に転換させることができるものもいる。しかし、サケ科魚類や紅タイ類は、他のカロテノイド化合物をアスタキサンチンに変えることはできないにしても、食餌中のアスタキサンチンを蓄積している。したがって、サケ類やタイ類およびそれらからつくった製品中に存在するアスタキサンチンは食餌源から直接得られるものでなければならない。植物は、海生のミクロ藻類やPhaffia rhodozymaのような特別の酵母を含めて世界中でのカロテノイドの主要源である。前記のように、カロテノイドは動物によって新に生合成されない。しかし、動物は、一般に、直接または間接に利益を享受するある種のカロテノイドを必要とし、該カロテノイドは食餌源から得られる。ある種のカロテノイドから得られる大抵の動物にとっての必須物質の例はビタミンＡおよびロドプシンである。海洋界では、甲殻類のような食物連鎖の短かい動物は、植物界からミクロ藻類や他のカロテノイド含有生物を食べて、多量に存在するカロテノイド化合物を自然代謝プロセスによってアスタキサンチンに変える。アスタキサンチンは、さらにこれらアスタキサンチン生成動物の体内に貯えられる。野生のサケ科魚類や紅ダイ類は食餌の重要な部分を占める甲殻類や他のアスタキサンチン含有生物からアスタキサンチンを獲得する。囲の中で生育したサケ類や紅ダイ類の場合には、魚を育てるのに用いる飼料は、該魚のこの重要な天然成分の食餌源とするためにアスタキサンチンを補わなければならない。現在では、このカロテノイド化合物源とするために、サケ類や紅ダイ類を養殖して育てるために準備した飼料には合成アスタキサンチンを添加している。場合によっては、サケ類や紅ダイ類の飼料中のアスタキサンチンの代りに合成カンタキサンチン（アスタキサンチンに極めて近い酸素化カロテノイド化合物）を使用することがあるが、この化合物は魚体内では天然に広く存在するアスタキサンチンのようには働らかない。養殖業界からは食餌用アスタキサンチンの天然資源に対する需要が多い。養殖魚用に調査された食餌用カロテノイドの天然資源にはオキアミ、イセエビ、甲殻類加工副産物、藻類や高等植物がある。しかし、これら天然資源は、商業的に実行しうるにはあまりにも高価であり、かつ入手可能性および確実性の点で十分ではない。紅色酵母のPhaffia rhodozymaは、樹液から単離され、かつその紅色はアスタキサンチンと判明しているので、アスタキサンチンの天然資源として業界から多大の注目を受けている（Miller．YoneyamおよびSoneda，1976，Int．J．Syst．B acteriol．26：286-291．Andrewes，PhaffおよびStarr，1976，Phytochem．15： 1003-1007）。Phaffia rhodozymaが１９７７年に、まず、サケ科魚類を着色する実験に用いられた（Johnson，ConklinおよびLewis，1977，J．Fish，Res．Board ．Can．34：2417-2421，Johnson，VillaおよびLewis，1980，Aquaculture，20： 123-134）。養殖用カロテノイド顔料源としてのPhaffia rhodozymaの考えられる利点は、必須栄養素（たとえばタンパク質、脂質およびビタミンＢ類）に富む天然物であり、かつアスタキサンチンを含有するということである（Johnson，Vil laおよびLewis，1980，Aquaculture，20：123-134）。しかし、Phaffia rhodozy maの天然の隔離集団は、アスタキサンチンをほとんど生成しないので（概して、１００ないし３００ppm）養殖の実用的または経済的な顔料源ではない（Torriss en，HardyおよびShcarer，1989，Reviews in Aauatic Science 1：209-225，Joh nsonおよびAn，1991，CRC Crit，Rev．Biotech．11：297-326）。もしもPhaffia 菌株を水生動物や他の考えられる食品（動物系ないしは他のもの）を着色する経済的に実施可能な飼料添加物としようとするならば、アスタキサンチンを過剰に生成する菌株を開発しなければならない。このパラグラフに示した参考書はいずれもこの明細書に参考資料として収録してある。天然に存在する「野生型」Phaffiaの突然変異体が、野生型の酵母よりも多量のアスタキサンチンを生成可能なようだと文献に記載されている（Internationa l Publication No．WO 88/08025（International Application No．PCT/DK88/00 068）；EPO Publication No．0 438 182 A1 （EPO App1ication No．91900682.3 ）；EPO Publication No．54 024 A2（EPO Application No．91106436.8）；Int ernational Publication No．WO 91/02060（International Application No．PC T/US90/00558）；EPO Publication No．0 474 347 A1（EPO Application No．91 306489.5）およびEPO Publication No．0 427 405 A1（EPOApplication No．903 11254.8）これらはすべてこの明細書に参考資料として収録してある）。該菌株は特定条件下では、野生型の隔離集団よりも多量のアスタキサンチンを生成するといわれる。しかし、この突然変異体菌株は生物量濃度の比較的低い場合にのみ多量のアスタキサンチンを生成する。生物量濃度が比較的高い場合には、該突然変異体菌株は役に立つほど多くはない少量のアスタキサンチンしか生成しない。現在までのところでは、合成アスタキサンチンと経済的に十分に競合するだけのアスタキサンチンを生成しうるPhaffia菌株は報告されていない。商業的に実施可能な菌株は文献に記載されている菌株よりも実質的に多量のアスタキサンチンを生成しなければならない。経済的に実施可能なアスタキサンチン製造法を開発するためには、大容積、たとえば１，５００リットル（ｌ）以上の栄養素培地において、４重量％を上回る、好ましくは６重量％を上回る酵母固形分（dys）に対して、３，０００ppmを上回る、好ましくは４，０００ppmを上回るアスタキサンチンを生成する必要がある。ここで使用する「酵母固形分重量％」または簡単に「酵母固形分」とは、この明細書に参考資料として収録されているＡ．Ｏ．ＡＣ．第１４版（１９８４年）公定分析法第１０，２１５−１０，２２５節に記されている方法によって求めた清浄な固形分のことである。商業的アスタキサンチン生産に適するPhaffia rhodozyma菌株を開発する必要性のほかに、大型発酵槽におけるアスタキサンチンの生成をできるだけ多くする Phaffia rhodozymaの培養方法も開発する必要がある。Phaffiaの生育および大型発酵槽におけるアスタキサンチンの製造法を扱っている文献は極く僅かしか得られない（International Publication No．WO 88/08025（International Applica tion No.PCT/DK88/00068）、およびEPO Publication No．0454 024 A2（EPO App lication No．91106436.8）、いずれもこの明細書に参考資料として収録してある）。これらに報告されている発酵法は、経済的に実施可能な商業規模の発酵法に必要とされるよりも著しく少ない酵母固形分およびアスタキサンチン量をもたらす。酵母細胞からアスタキサンチンを生成させる種々の要素が改善を必要とするだけでなく、動物の肉および動物製品にアスタキサンチンを吸収、沈着させる要素も改善を必要とする。魚体へのカロテノイドの吸収および沈着は種々の要因、すなわち、遺伝現象、大きさ、時期、性、顔料給送期間、環境因子、および食餌の組成によって影響される（Torrissen，HardyおよびShearer：1989：Reviews in Aquatic Science．1：209-225（この明細書に参考資料として収録））。 Phaffiaまたはカロテノイド製品の配合に関しては種々の報告がある（Inter-n ational Publication No．WO 88/08025（International Application No．PCT/D K88/00068），EPO Pbulication No．0 474 347 A1（EPO Application No．91306 489.5），EPO Publication No．0 454 024 A2（EPO Application No．91106436. 8）、ならびにJapanese Patent Application 57-206342，2238855および90 JP-2 85090を例示するが、いずれもこの明細書に参考資料として収録してある）。これらの報告では、乾燥中のみならずさらに魚の飼料に加工中顔料を保護するためにPhaffia製品が配合された。前記のために、Phaffia配合物に種々の酸化防止剤および安定剤が加えられた。サケ科魚類の体温はその生息する水の温度、たとえば一般に０ないし１４℃に等しい。これは該魚類の体温が１０℃よりも低くなることがあり、時折は１０℃ になることを意味する。Phaffia中のアスタキサンチンは油滴中に濃縮されている。Phaffia油は融点が６４℃のパルミチン酸（１６：００）を約１３％、融点が１６℃のオレイン酸（１８：ｌｎ９）を約３２％含んでいる。このような高融点の脂肪酸のために、Phaffia油は１０℃近くで凝固する。このために、Phaffia 油が凝固する１０℃を下回る温度では魚にPhaffiaアスタキサンチンを包含させることが難しい。発明の概要この発明の１つの態様において、我々は、適当な条件下で、少なくとも約１，５００ｌの栄養素培地の発酵容積において生育させるとき、４重量％を上回る、しばしば６重量％を上回る酵母乾燥固形分に対して、３，０００ppmよりも多い。しばしば４，０００ppmよりも多いアスタキサンチンを産生させるPhaffia rho dozymaの新菌株を発生させて、分離した。該Phaffia菌株は養殖および食品業界にとって、商業生産規模で、経済的にアスタキサンチンを生成させることができる。該Phaffia菌株のあるものは１９９３年、４月６日に、MarylandのRockville にあるAmerican Typeの微生物株保存機関にＡＴＣＣ−７４２１８（ＵＢＸ−ＡＸ１），ＡＴＣＣ−７４２１９（ＵＢＶ−ＡＸ２），ＡＴＣＣ−７４２２０（ＵＢＸ−ＡＸ３）、およびＡＴＣＣ−７４２２１（ＵＢＶ−ＡＸ４）という番名で保管された。この発明の別の態様では、我々は、高酵母固形分および多量のアスタキサンチンが得られるPhaffia rhodozyma細胞の培養法を発見した。概して、該方法は、生育期間中の細胞数の増加という点、および成熟期間中の細胞内におけるアスタキサンチンの蓄積の増大および定常化という点から見て生物の生育を促進させる特別の発酵条件をもたらすことも含む。とりわけ、該方法は発酵の生育および成熟期の間、酵母細胞を光源に曝露し、さらに／または発酵性糖、たとえばグルコースの給送速度を調節するか、もしくは酵母細胞に、徐々に代謝されるエネルギー源、たとえばグリセロールを与えることによって成熟期の間のアスタキサンチンの生成を増大させかつ活発にすることを含む。この発明の別の態様では、我々は、アスタキサンチンをサケ類、タイ類、甲殻類や他の動物に利用するために、この発明のPhaffia菌株を破壊する必要のないことを見出した。未破壊の細胞内のアスタキサンチンは乾燥、貯蔵や飼料調製プロセスの間、一層安定である。この発明のさらに別の態様では、我々は、Phaffia製品の新規配合物が魚類へのアスタキサンチンの沈着を増大することを見出した。この配合物は未破壊Phaf fia細胞、植物油または低凝固点植物油混合物、乳化剤、および酸化防止剤の混合物である。図面の簡単な説明図１はこの発明の３種のPhaffia突然変異体菌株の遺伝歴を示す。図２−９は種々の突然変異体菌株の外観を示す顕微鏡写真である図１０は飼養試験過程全般にわたるニジマスの重量増加を示す。図１１は図１０と同じ飼養試験過程全般にわたるニジマスの着色を示す。発明の詳細な記述突然変異誘発連続的突然変異誘発に続く、すぐれたアスタキサンチン生成を示す突然変異体菌株の適切な選択によって、アスタキサンチンを過剰に生成する酵母菌株を得ることができる。該酵母細胞はPhafria属のものが好ましく、Phaffia rhodozyma種のものがさらに好ましい。出発点の野生型酵母細胞菌株は、世界中のさまざまな微生物株保有機関、たとえばATCCやCentraalbureau voor Schimmelcultures（ CBS）に保管されているものを含む。一般に、所望の突然変異体菌株を得るには２回以上の連続的突然変異誘発ラウンドを行う必要がある。酵母細胞に遺伝的変化を誘発させることができる任意の薬剤または非薬剤（たとえば紫外線）を突然変異誘発物として用いることができる。該剤は単独または相互に組合せて用いることができ、該薬剤は純品のまま、または溶剤とともに使用することができる。化学的突然変異誘発物質を用いる突然変異誘発実験計画では、一般に突然変異誘発物質を緩衝化した量の細胞内に入れ、十分に混合し、さらに管を絶えず穏やかに撹拌しながら室温で１ないし１２時間培養する。培養後、反応混合物を寒天培地プレート上に直接置く。寒天の組成はさまざまであるが、該して、該組成物はグルコース（または他の炭素源）、酵母エキス（Universal Foods Coorporati onから入手できるような）、寒天、ならびに顔料形成および／または細胞生育を阻害する遮断剤を含んでいる。細胞は、通常殺菌した５ミリメートル（mm）のガラスビーズとともに振ることによって寒天表面に均等に分布させる。次にプレートを逆にして好ましくは低強度光線を照射して、約２１℃で６〜１０日間培養する。突然変異誘発物が非薬剤である突然変異誘発実験計画の場合にも同様の生育法を用いる。多量のアスタキサンチンを生成する突然変異体のスクリーニングプレートおよび振とうフラスコにおける初期スクリーニング培養期間後、突然変異が与えられた親菌株よりも肉眼的によく着色して見える酵母のコロニーを集めて、新しい寒天プレート（突然変異が与えられた親菌株を生育させるのに用いたものと同じ組成のものが多い）上で二次培養する。同一条件下で６〜１０日間、さらに培養した後、甚だしく着色し続ける新しい隔離集団を、フラスコ、たとえばグルコースと酵母エキスとの混合物１０mlを含有する５０mlのフラスコ内に接種する。次に隔離集団を一般に、前記培養と同じ条件でさらに６〜１０日間培養するが、この度は、毎分約２００回転（rpm）で作動する振とう機上で培養する。この培養期間後、少量（たとえば０．２ml）を採ってカロテノイド含量およびアスタキサンチン含量の合計を測定する。すぐれたアスタキサンチン生成能力を示す菌株が、小バッチの発酵でさらにスクリーニングを行う候補者であって、次の突然変異誘発またはスクリーニングに必要となるまで、概して、適当な培地、たとえば１５容量％のグリセロール中に−８０℃で凍結貯蔵する。この貯蔵法はスクリーニング工程後または単に生成菌株を保存する場合に用いることができる。小バッチの発酵におけるスクリーニング５０mlフラスコレベルでの適当なアスタキサンチン生成突然変異体を選択した後、約１．５ｌの栄養素培地を含有する２ｌの発酵槽（たとえば、ニューヨーク州，GardinerのVirtis Corp．のOmni-Culture Fermentors）内で通常、突然変異体の性能をスクリーニングする。このレベルにおける一般的なスクリーニング法では、グルコースと酵母エキスとの混合物を３０ml含有する２５０mlのフラスコに、試験すべき酵母細胞菌株の凍結ストックから採った突然変異体酵母細胞１００〜２５０μlをそれぞれ接種する。次にこれらのフラスコを絶えず光を当てながら２０〜２２℃で３日間、２００ rpmで振とうする。次に、これら細胞培養菌を少量（１５〜２０ml）用いて発酵槽内に接種する。これら２ｌの発酵槽の発酵容積は通常、同化可能な形の種々のビタミンおよびミネラルを補足した１．５ｌの濃縮グルコース酵母エキス培地である。典型的なこれらビタミン類およびミネラル類は硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸第二鉄アンモニウム、硫酸銅、イノシトール、ピリドキシン塩酸塩、チアミン、パントテン酸カルシウム、ビオチン等である。グリコースおよび酵母エキスを含むこれらの物質の組合せおよび濃度は便宜的に変えることができる。必要ならば、消泡剤および／または他の添加剤を培地の中に包含させるかまたは培地とともに用いることもできる。培地を含む発酵槽をオートクレーブで殺菌する。培地のｐＨは通常４．５ないし７に保ち、温度は１５ないし２４℃に維持する。培地には、一般に、濾過し、殺菌した空気を散布し、また絶えず撹拌する（たとえば、７００rpm）。発酵は、概して４〜６日間継続し、かつ定期的にサンプリングして細胞の生育およびアスタキサンチンの生成状態を調べる。適当な生育程度およびアスタキサンチン生成を示す菌株が流加発酵レベルでのスクリーニングの候補者である。流加発酵におけるスクリーニング小バッチ発酵でのアスタキサンチンを過剰に生成する突然変異体の確認後、突然変異体は、さらに、１４ｌ，２０ｌ，２５０ｌ、および２，０００ｌの発酵槽で、急速生育速度、高固形分生成、および高アスタキサンチン生成量についてスクリーニングを行う。一般に、菌株は、発酵槽内で、１５℃から２４℃の温度範囲で、アンモニア水、水酸化ナトリウムまたはその両者を用いて調節した約４．５から７にわたるpH範囲において増殖させる。所望の生育速度を保つように、必要に応じて撹拌および通気を調節する。発酵槽に詰めた培地は小型発酵槽で用いたものと組成的に類似し、すなわち、培地はグルコース（または他の適当な炭素源）、酵母エキス、ビタミン類、ミネラル類および他の添加剤を含み、すべては同化可能な形をしているが、正確な処方は小型発酵槽で用いたものとは異なるかもしれないし、恐らくそうであろう。消泡剤や他の加工助剤も必要に応じて使用することができる。培養は、所望の細胞密度が得られるまで、バッチ発酵として行ってもよいし、またはグルコース（または他の適当な炭素源）の供給を直ちに始めてもよい。この供給は、最良の酵母生育速度およびアスタキサンチン生成を得るために、必要に応じて調節される。アンモニアまたは尿素として、補足的な窒素を発酵に供給することができる。 Phaffia rhodozymaの培養この発明のPhaffia菌株は初めは急速な生育を示すが、高細胞濃度に近づくにつれて、たとえば６重量％を上回る生物量固形分になると漸次遅くなる。一般的な発酵では、アスタキサンチンの生成速度は、初期にはPhaffia細胞の生育速度よりも遅いが、最後には（発酵の後期の間）アスタキサンチン生成速度が細胞の生育速度を上回る。我々はこの後期を「成熟期」と呼んでいる。我々は、成熟期の初期段階の間、アスタキサンチン生成速度が最高であることを見出した。良好なアスタキサンチン生成発酵を得るために、我々は、成熟期の初期段階の間に生じるアスタキサンチンの高生成速度を持続または高める３つの方法を開発した。この増進成熟期の間、アスタキサンチン濃度は標準成熟期の少なくとも２倍、しばしば３倍以上増大する。第１の方法は、成熟期の間、とくにその初めからアスタキサンチン生成速度が著しく低下しはじめる成熟期の時点まで、酵母細胞を光源、好ましくは連続低強度光に曝露することである。 AnおよびJohnson（Antonie van Leeuwenhoek．1991．57：191-203、この明細書に参考資料として収録）は高強度の光がPhaffiaによる生育およびカロテノイド生成を阻害することを示した。Evansら（EPO Publication No．0 427 405 A1 ，EPO Application No．90311254.8）は暗黒内よりも日中の方がPhaffiaの菌株はよく行動することを示している。いずれの研究も寒天プレート上で生育させた Phaffiaを使用した。我々も、AnおよびJohnsonと同様に、連続蛍光（正規の実験室照明）が振とうフラスコ内のPhaffiaの顔料収率を低減させることを認め、また、Evansと同様に、我々も暗黒がある種のPhaffia菌株のカロテノイド生成を抑制することを知った。しかし、我々は、また、低強度、好ましくは連続蛍光、すなわち発酵ブロス１キロリットル当り約１００ワット未満、好ましくは約２５ワット未満の光が液体培地内で生育されるある種のPhaffia菌株のカロテノイド生成を実際に促進することも認めた。該菌株にはAmerican Type微生物株保有機関に保管されているＡＴＣＣ−７４２１８，ＡＴＣＣ−７４２１９，ＡＴＣＣ−７４２２０およびＡＴＣＣ−７４２２１という数番号を有するものも含まれている。我々は、また、流加発酵の間にこのような光源を菌種に与えるときに、良好なアスタキサンチン生成の得られることも知った。光は特定の波長に限定されないが、２５０から７００nmの光、とくに可視光が好ましい。発酵槽が金属または他の不透明な物質でできているような場合には、１個以上のガラス（または類似の半透明物質）の穴を通して光を入れることができ、一方、酵母細胞を含む栄養素培地は絶えず、穴の前を循環する。また、発酵ブロスを、光を通す管を経て戻り回路に圧入してから発酵槽に戻すこともできる。いずれの場合にも、光に曝露する表面積は極めて小さいので、高強度光、たとえば１５w/Kl以上を放出する光を使用することができる。第２に、酵母細胞に制御量の、多糖類に比して、迅速に代謝されるエネルギー源、たとえばグルコースまたはスクロースを与える。生育期の間、酵母細胞はできるだけ速やかに、このエネルギー源、一般にはグルコースが与えられる。ただし該エネルギー源は栄養素培地にかなりの程度には蓄積しないものとする。この速度は酵母細胞菌株、栄養素培地の組成、発酵実験計画、および類似の要因によって異なる。培地内のエネルギー源の蓄積は、一般に、生育期が終りつつあって、成熟期が始まりつつあるという信号である。所望の酵母固形分が得られた後で、エネルギー源の蓄積前に、エネルギー源の給送速度を、生育期間中の最高給送速度の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約３０％に低下させる。エネルギー源のこの減速給送期間中は、酵母細胞がアスタキサンチンを生成し続けるが、酵母細胞の数の増大、すなわち細胞密度の増加は制約される。この期間を、細胞が経済的に望ましい速度ではもはやアスタキサンチンを生成しなくなるまで続ける。成熟期の間のアスタキサンチンの蓄積を最大にするために、エネルギー源給送速度を段階的または連続的に低下させることができる。たとえば、成熟期の始めには、エネルギー源給送速度を５０％低下させることができ、さらにある時間後、一般的には１２ないし２４時間後に、さらに５０％低下させることができる。第３の方法は、酵母細胞にグルコースに比べて徐々に代謝されるエネルギー源を、生育および／または成熟期の間に、与えることである。このエネルギー源すなわち成熟延長剤には酵母細胞によって徐々に代謝させることができる物質がほとんど含まれる。グリセロール；一般に糖みつやある種のコーンシラップ中に存在するグルコース、スクロースや他の多糖類の重合体；メタノール、エタノール等のような種々のアルコール類；およびコハク酸、グルタミン酸、マレイン酸等のような種々の有機酸が典型的な延長剤である。この方法の１つの態様では（エネルギー源の減速給送法のように）、該延長剤は、エネルギー源（たとえばグルコース）の蓄積が栄養素培地に検知されるときに、酵母細胞に与えられ、さらに、細胞のアスタキサンチン生成が望ましい速度で続くような量および方法で与えられる。このアスタキサンチン生成速度が遅くなると、それに応じて細胞に給送する延長剤の量を減少させる。正確な量および延長剤給送速度は菌株、発酵実験計画等の事情によって変化する。この方法の別の態様では、徐々に代謝される延長剤を生育期の間、エネルギー源飼料の一部として、またはそれに加えて酵素細胞に与えることができる。この場合には、酵母細胞は、まず急速に代謝されるエネルギー源、たとえばグルコースを減らし、このエネルギー源の消費速度が遅くなると、これは成育期が終りつつあって、成熟期が始まりつつあることを示す。この時点で、栄養素培地へのエネルギー源の添加を止め、培地に残留する急速に代謝されるエネルギー源が使い果されると、酵母細胞が残留する徐々に代謝されるエネルギー源を代謝させ始める。該残留する徐々に代謝されるエネルギー源は必要に応じて、前記の別の物質で補うことができる。いずれの形式においても、成熟延長剤の使用は、他の２つの延長法と同様にこの期間を延長させる。さらに、これらの方法は相互に組合せて使用することができ、一般には連続光法を給送法の１つと組合せて使用する。成熟期の初期段階は（単位容積当り単位時間当りのアスタキサンチン生成量、たとえばmg／ｌ／hrで測定した）、アスタキサンチン生成速度が遅くなるまで続く。これは通常生育期終了後２ないし４日間存在する。速度はいうまでもなく連続体であって、最大値から低下しはじめたある時点において、この期の初期段階が終り、成熟期が経済的に望ましくなるまで続いて、該期を終える。酵母細胞の回収および生成物の調製 Phaffia酵母を純粋な培養発酵生成物として製造する。発酵原料は、プロセスへの有効利用性および適合性に基づいて多数の売り手から選ばれる。Phaffia rh odozymaの生育に資するための主成分には高デキストローズ当量（ＤＥ）のコーンシラップ（または同等の発酵性糖源）、酵母エキス、アンモニア、無機リン酸塩類、および硫酸マグネシウムがある。これら主成分以外に、多数の微量養素、たとえば微量金属およびビタミン類が必要である。これら栄養素はすべて、飼料や食料用酵母の製造を含めて、一般に商業発酵法で用いられている。各成分は、 Phaffia酵母がアスタキサンチンの最高収率を示すように、最適化される。発酵中の発泡は食品に許容される消泡剤の添加によって制御する。発酵は使用前に清浄にし、殺菌した清潔な培養発酵槽で行われる。発酵プロセス中に発酵槽に加えられる栄養素はすべて使用前に殺菌する。この発明に示すPhaffia酵母の製造は流加発酵からなる。他の発酵法は、必要があれば使用することができる。発酵中の栄養素の添加は、Phaffia酵母生物量およびアスタキサンチンのいずれをも急速に生成させるように最適化される。発酵中、多くの条件が制御かつ維持される。該条件の中には培地の酸度、発酵温度および通気の程度がある。発酵は、通常、アスタキサンチンの生成が商業的に望ましいレベルを下回るときに停止し、一般的には培養物（すなわち発酵ブロス）を普通の方法で発酵槽から冷凍貯蔵容器に移すことによって終り、遠心分離か濾過による濃縮化の準備をする。連続的遠心分離または濾過装置は発酵ブロスの予備濃縮に使用する。発酵ブロスをこれらの装置に通して、酵母濃縮物（すなわち酵母クリーム）を冷凍酵母クリーム貯蔵タンクに移す。エトキシキン、ビタミンＥ、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）またはアスコルビルパルミテートのような可食酸化防止剤；植物油、たとえばコーン油、ベニバナ油、ヒマワリ油、大豆油等のような食用油；および大豆レシチンまたはソルビタンエステル類のような可食乳化剤をこの段階で酵母クリームに加えることができる。ここで使用する「可食」という用語はヒトまたは動物の消費が許容される物質を意味する。これは加工および輸送中にアスタキサンチンを保護するのに役立ち、さらにまた魚肉への顔料の沈着をよくする。油、乳化剤および酸化防止剤は、Phaffia酵母のプロセス中の都合のよいときに加えることができる。１つの態様では、油または油混合物、乳化剤および１種以上の酸化防止剤を相互に混合した後、混合物をブロス濃縮物（酵母クリーム）と混合し、乾燥し、包装して輸送する。別の態様では、油、乳化剤および酸化防止剤を、酵母クリームの乾燥後に酵母クリームに添加する。さらに別の態様では、添加剤の１種または２種を、乾燥前に酵母クリームと混合し、一方、残りの添加剤は、乾燥後に、酵母クリームと混合する。最終乾燥物の総重量に対して、油または油混合物は約０．１ないし１０重量％を占め、乳化剤は約０．１ないし１０重量％を占め、酸化防止剤は約０．０２ないし２重量％を占める。酵母クリームは、乾燥前に、適当なアスタキサンチン含量、通常は飼料酵母（ Universal Foods Corporation製Yeaco^TM-20または同等品）の添加により製品１キログラム当り３，０００、４，０００または５，０００ミリグラム（mg／kg）となるように標準化する。標準化製品は、次に適当な手段、たとえば噴霧乾燥、ドラム乾燥等によって乾燥して最後に、一般に２０または２５kgのヒートシールしたポリライニング箱に収める。包装は光、酸素および水分から製品を保護するように設計されている。この発明の１つの態様では、酵母クリームを通常の設備および方法を用い、細胞の相当数、好ましくは、過半数が、該方法によって破壊しないよう、すなわち細胞が大部分の球形を保持するように乾燥する。我々は、壊れていない酵母細胞が、消費する動物に、壊れた細胞と同じか、またはほぼ同程度に有効にアスタキサンチンを与えることを認めた。この発明の別の態様では、酵母クリームを、乾燥生成物中の細胞のほとんどが壊れるかまたはばらばらになる、すなわち細胞がもはやほとんど球形を保たないように、細胞の破壊を促進させるやり方で乾燥する。このような壊れた細胞が望ましく、しかも乾燥プロセスによっては得られない場合には、細胞を微粉砕工程にかけるかまたは細胞を破壊する酵素処理を行うことができる。下記実施例はこの発明のある特定態様を説明するためのものである。とくに断らなければ、部および百分率はすべて重量単位である。特定態様顔料抽出およびアスタキサンチン分析 Sedmak．WeersingheおよびJollyがBiotechnol．Techniques 4：107-112（１９９０年７月）（この明細書に参考試料として収録）に報告した通りにアスタキサンチン含量を測定する。酵母細胞を１２×１００mm試験管中で脱イオン水４mlを用いて２回洗う。洗浄および水分傾しゃ後、洗浄した細胞ペレットの入った試験管をさかさにして水を切る。次に、管内面をティッシュペーパーで拭って大部分の水分を除去する。ついで、各試験管に５５℃に予熱した０．５mlのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ミズリー州，St，Louis．Sigma Chemical Co.）を加える。試験管を２０〜３０秒（sec）渦巻状に撹拌し、さらに０．１mlの０．０２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を入れ、次に加える１mlの有機溶剤中にカロテノイドを分配させる。アスタキサンチンの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に適合させるために、１mlのヘキサン：酢酸エチル（５０：５０容量基準、ＨＰＬＣ級）を使用する。次に試験管を３０〜４０秒間渦巻状に撹拌して、水相と有機相とを混合させる。卓上型臨床用遠心機で３分間遠心分離を行って両相を分離させる。有機相を取り出して、４８０nmの吸光度（Ａ₄₈₀）から有機相の着色カロテノイド含量ンチンを用いる測定に基づく）を用いて計算する。次に、アスタキサンチン含量はＨＰＬＣによって求める。ＨＰＬＣ分析用試料は、ヘキサン：酢酸エチル（５０：５０容量単位）で希釈した後氷酢酸を用いて０．１％酢酸として、濾過してから注入する。カラムはAlltech（イリノイ州，D eerfield）のNucleosil １００シリカ５ミクロン、Alltechガードカラム付２５０×４．６mmステンレス鋼カラムである。溶離溶剤はヘキサン：酢酸エチル（５０：５０容量単位）で氷酢酸は含まない。溶離剤は４７６nmでモニターする。次に合成アスタキサンチンの基準の位置の曲線の下方の面積からアスタキサンチン百分率を計算する。次にアスタキサンチン濃度は次のように計算する発酵ブロスml中の総カロテノイドμg ＝（Ａ₄₈₀／２，１５０）×１０⁴×希釈係数発酵ブロスml中のアスタキサンチンμg ＝（発酵ブロスml中の総カロテノイドμg ×ＨＰＬＣにより求めたアスタキサンチン百分率％）÷１００酵母ｇ中のアスタキサンチンμg ＝発酵ブロスml中のアスタキサンチンμg÷酵母乾燥固形分g／ml 実施例１：突然変異体菌株の発生突然変異誘発という表題の節で述べたように反覆突然変異誘発によって野生型菌株からPhaffia rhodozyma突然変異体ＡＴＣＣ−７４２１８（ＵＢＶ−ＡＸ１），ＡＴＣＣ−７４２１９（ＵＢＶ−ＡＸ２），ＡＴＣＣ−７４２２０（ＵＢＶ −ＡＸ３）およびＡＴＣＣ−７４２２１（ＵＢＶ−ＡＸ４）を発生させた。図１はＵＢＶ−ＡＸ２，ＵＢＶ−ＡＸ３およびＵＢＶ−ＡＸ４の遺伝歴を示す。ＵＢＶ−ＡＸ１は７回の突然変異誘発後に分離された。実施例２：新菌株の培養表１，２および３のデータから、この発明のPhaffiaの菌株は、種々の大きさの発酵容積において、高固形分細胞に生育し、かつ多量のアスタキサンチンを生成することがわかる。文献の中には、アスタキサンチンと総カロテノイドとが識別されておらず、したがってアスタキサンチンの実際の量は報告された値よりもかなり小さいものがある。後記の表中のアスタキサンチンの値はアスタキサンチンのＨＰＬＣ定量によるものである。１４ｌ発酵１４ｌのVirticulture発酵槽（Virtis Corporation，ニューヨーク州，Gardin er）内に、１．５ｌの適当な生育培地中に活発に生育している約３０ｇ（乾量基準）の培養菌を接種する。固化ブロスの典型的な配合は次の通りである。始動条件は毎分８標準リットル（ＳＬＰＭ）の通気および５００rpmの撹拌である。ｐＨは、試薬級水酸化アンモニウム（ＮＨ₄ＯＨ）を３倍に希釈した液７５０mlで５．５に調節する。必要に応じて食品級の消泡剤を添加する。発酵の全般にわたりグルコースの濃度が１リットル当り５グラム未満（ｇ／ｌ）、好ましくは０．１ないし２．５ｇ／ｌとなるような比率で培養菌に１７５０ｇのグルコース（イリノイ州，Summit-Argo，CPC International製 Cerelose^TM）を５０重量％溶液として与える。溶解酸素は撹拌と風量で２０％から９０％飽和に調節する。ＵＢＶ−ＡＸ３およびＵＢＶ−ＡＸ４についての前記発酵の結果を表１に示す。２，０００ｌの発酵下記の約７００ｌのブロスを含有する２，０００ｌのIF2000 New Brunswick S cientific発酵槽（New Brunswick Scientific Corporation，ニュージヤージー州，Edison）内に、適当な生育培地１２０ｌ中に活発に生育している約３．６kg （乾量基準）の培養菌を接種する。始動条件は７００ＳＬＰＭの通気および１００rpmの撹拌である。ｐＨは無水アンモニアで５．５に調節する。必要に応じて食品級の消泡剤を添加する。グルコースが発酵ブロス中に５ｇ／ｌを超えるまで、好ましくは０．１〜２．５ｇ／ｌまで蓄積しないような速度で、培養菌に未精製の高デキストローズコーンシラップ（Cargill Incorporated，アイオワ州，Eddyville）の４５重量％溶液８００kgを与える。溶解酸素は撹拌と風量によって、２０％ないし７０％飽和になるように調節する。発酵終了時のブロスの容積は約１，５００ｌである。ＵＢＶ− ＡＸ２についての発酵の結果を表２に示す。４０，０００ｌの発酵４，０００ｌの適当な生育培地中に活発に生育している約３．６kg（乾量基準）の培養菌を４０，０００ｌの発酵槽に接種する。固化ブロスの典型的な配合は次の通りである。始動条件は８，０００ＳＬＰＭの通気および４０rpmの撹拌である。ｐＨは無水アンモニアによって５．５に調節する。必要に応じて食品級の消泡剤を添加する。グルコースが発酵ブロス中に５ｇ／ｌ以上、好ましくは０．１〜２．５ｇ／ｌまで蓄積しないような速度で、未精製の高デキストローズコーンシラップ（Ga rgill Incorporated，アイオワ州，Eddyville）の４２重量％溶液１７，０００k gを培養菌に与える。溶解酸素は撹拌と通気によって２０％から７０％飽和に調節される。ＵＢＶ−ＡＸ１についての発酵の結果を表３に示す。実施例３．菌株の説明：コロニーの形態２％グルコース、０．５％Tastone^tm−１５４（Universal Foods Co．酵母エキス）、および１．５％寒天を含有する２〜４週間経過した画線プレートについて新菌株のコロニーの形態を観察した。ＵＢＶ−ＡＸ１：十分に分離したコロニーは直径が４〜５mmである。培養菌の中に若干のコロニーの大きさの不均一性が存在する。小さいコロニーの大きさは１mmから３mmにわたる。これら小さいコロニーの中には、コロニー集団の残りのものより色の黒いものがある。コロニーの縁は完全であるが、若千のコロニーは不規則な縁を示すものがある。これは一般に３〜４週間後に現われる。コロニーは凸面で若干突起している。色は紅橙色で、突起中央部は色が濃い。コロニーの外観はつや消状である。コロニーが密集している場合、とくに古いプレートではしわの寄っているコロニーもある。３〜４週間後に、コロニーの色は濃紅色になる。時折細胞のローン（lawn）に黄色ないし橙色の淡色のコロニーの見られることがある。これらのローンは粒状の外観を呈する。ＵＢＶ−ＡＸ２：十分に分離したコロニーは直径が４〜５mmである。若干のコロニーの大きさの不均一性が存在し、ときどき小さいコロニーが見られる。コロニーの縁は完全である。コロニーは凸面で若干突起しており、外観上光沢がある。色は紅−橙色で、とくに密集している場合には隆起中央部の色が濃い。若干のコロニーの縁にはときどきでこぼこが見られる。３〜４週間後には、コロニーは依然として光沢があり、濃紅色を呈する。細胞のローンは滑らかで光沢のある状態を保っている。淡色のコロニーがないことはこの菌株の着色の遺伝子が極めて安定であることを示す。ＵＢＶ−ＡＸ３：コロニーの形態が、グルコース／酵母エキスのブロス中で生育６日後にとくに、不均質である場合がある。グルコース／酵母エキスプレート上での１０日後のコロニーの大きさは、直径が１．５mmから３mmに及ぶ。色は紅色から橙色にわたる。概して、小さいコロニーは大きいコロニーよりも濃紅色である。ＵＢＶ−ＡＸ４：グルコース／酵母エキスプレート上での２週間後のコロニーは直径が２〜３mmである。コロニーの縁は完全であるが、少数のコロニーは波形の縁を示す。コロニーの色は濃紅−橙色である。コロニーは光沢があり、密集している場合にはとくに円錐形状を呈する。３週間後、コロニーの外観は底部が平らになっているように見える。コロニー中央部の色は周辺部よりも紅昧が濃い。コロニーの縁は完全状態を保つ。実施例４：菌株の説明：顕微鏡的外観２％グルコース、０．５％Tastone ^tm−１５４の中で６日間生育させた新菌株について細胞の顕微鏡的外観を観察した。ＵＢＶ−ＡＸ１（図２および３）：細胞は単独かまたは時折短かい連鎖を有する対状をなす。細胞はだ円形ないし卵形である。細胞は紅味を帯びた褐色である。若干の細胞は脂質の小滴を有する細胞質を欠いている。粒状でやや着色している細胞が見られる。中には多形態性形状のものも見られる。時折短突起形状の細胞が存在する。ＵＢＶ−ＡＸ２（図４および５）：細胞は単独かまたは対をなす。母細胞の同じ端部に２個の芽状突起のある細胞が通常である。細胞は偏だ円形ないし球形である。明らかに着色した紅褐色の細胞が多い。粒状を呈し着色した細胞質を有する細胞がかなり一般的である。時折大きくて濃く着色した円い「厚膜胞子状」の構造物が見られる。該構造物は厚膜胞子の肥厚した細胞壁を欠いている。ＵＢＶ−ＡＸ３（図６および７）：細胞は単独か、対もしくは短連鎖または３ないし６個の細胞の小凝縮塊をなす。多形態性形状のものが見られる。明らかに着色している細胞が多い。該細胞中の細胞質は粒状に見える。ＵＢＶ−ＡＸ４（図８および９）：細胞は単独か、対または短連鎖をなす。多形態性形状のものが見られる。若干の細胞は紅褐色粒状の細胞質を有する。若干の細胞は紅色の結晶性構造物を有するように思われる。ある細胞では脂質の小滴が極めて明瞭である。実施例５：菌株の説明：細胞の大きさ表４に、２％グルコースおよび０．５％Tastone ^tm−１５４中で６日間生育させた新菌株の細胞の大きさを示す。実施例６：低強度光線照射によるアスタキサンチン生成の増大表５に暗黒が振とうフラスコ中の顔料生成を阻害することを示す。Phaffiaは、２％グルコースおよび０．５％酵母エキスを有する２００rpmで振とうするフラスコ内で２１℃で６日間生育させた。実施例７：コーンシラップ加水分解物コーンシラップ加水分解物（ＤＥ＝９５）およびコーンシラップ部分加水分解物（ＤＥ＝６３）を混合して、グルコースならびにかなりの量のマルトース、マルトトリオースおよび高級重合糖のような種々の高級糖類を含有する飼料物質をつくる。これらの糖類すなわち多糖類は、グルコースが激減するまで同化されない。前記２種類のコーンシラップの７５：２５混合物は、グルコースが約７８％でマルトースが１０％の飼料（ＤＥは約８７）をつくる。表６のデータから、２０ｌの発酵槽でコーンシラップ加水分解物（ＤＥ＝９５）およびコーンシラップ部分加水分解物（ＤＥ＝６３）の７５：２５混合物を用いると、コーンシラップ加水分解物（ＤＥ＝９５）のみを用いた場合よりもＵＢＶ −ＡＸ１は著しく多量のアスタキサンチンを生成することがわかる。実施例８：成熟中のアスタキサンチン生成に及ぼすグリセロールの影響ほとんどPhaffia菌株の場合に、生育が停止した後もアセタキサンチンの合成は続いている。したがって、アスタキサンチンをPhaffiaの二次代謝産物とみなす人もいる。我々は、主炭素源（グルコース）が用いられた後の非生育期の間に、Phaffiaにグリセロールを加えるとカロテノイド合成が刺戟されることを見出した。ＨＰＬＣ分析の結果は、グルコースとグリセロールが共に存在する場合には、グルコースが優先的に用いられ、グルコースが激減した後に初めてグリセロールが用いられることを示す。次表でわかるように、グルコースとともにグリセロールを包含させると我々のPhaffia菌株のアスタキサンチン収率は著しく向上する。グリセロールが唯一の炭素源である場合には該菌株の生育は極めて劣悪となる。表７は、２％グルコースおよび０．５％酵母エキスを有する振とうフラスコ内で、連続低強度光線に６日間曝露すると、Phaffia rhodozymaのアスタキサンチン生成量がグリセロールによって大幅に増加することを示す。実施例９：成熟中の緩徐給餌表８のデータは、エネルギー源を連続的に給餌するかしないかが成熟に及ぼす影響を示す。発酵は２０ｌのChemap発酵槽内で、ＵＢＶ−ＡＸ１および実質的に前記の標準発酵形式を用いて行った。事例１の場合には、細胞の生育速度が低下したので、発酵を停止した。事例２では、細胞の生育速度が低下したのでエネルギ源の給餌を停止して、細胞を７２時間成熟させた。事例３の場合には、酵母の生育速度が低下したのでエネルギー源給餌速度を最高給餌速度の２５％に下げ、緩徐給餌を行いながら細胞を７２時間成熟させた。実施例１０：サケ類の顔料源としての新菌株の評価この実施例は、Phaffia rhodozymaの新菌株を添加物として、飼料に加えると、サケ科魚類を効果的に着色させることを示す。この実施例は、また、この発明の菌株は破壊を必要とせずに、アスタキサンチンをサケ類に利用しうることも示す（Binkowsky，SedmakおよびJolly．1993．Aquaculture Magaine．３月／４月：５４−５９、この明細書に参考資料として収録）。実質的に前記のように２，０００ｌの発酵槽でPhaffia菌株を生育させた。細胞は、遠心分離によって１５〜２２％固形分に濃縮して乾燥した。飼料は Zeigler Bros．Inc．（ペンシルベニア州，Gardners）で加工した。新Phaffia r hodozymaまたは合成アスタキサンチン（５％ Carophyll Pink，Hoffmann-LaRoch e）を前記 ^#１／８ Trout Growerペレット化飼料中に包含させた。地方の商業マス養殖業者からニジマス（Onchorhynchus mykiss，Shasta strai n）を入手した。実験条件および実験対照食餌に順応させた後、マスを別々の実験タンク（１タンク当り２８匹）に移した。実験タンクは約２５０リットルの水量があり（直径７６センチメートル；高さ５６cm）、水の平均流量は毎分６．５リットルであった。全体的に、実験に用いた方法および食餌は、ほとんどの商業生産マスが育成されている温度に近い１０℃で最適に近いマスの生育が得られるように設計されている。実験終了までには、残っているマスはほぼマーケットサイズであった。４，８および１２週間目に、１タンク当り６匹の魚を無作為に取り出して、生育程度および顔料の量を調べた。魚は頭部に一撃を加えて気絶させ、全長を測定し、汚れをぬぐい取って乾燥した後重量を測定し、さらに各魚は腹部大動脈を切断して峡部を切り開いた。魚は冷水で血を洗い出した後、各魚から２枚の皮付き切身を切り取った。各サンプリングから得られる情報に基づき、タンクの生物量を再計算し、各タンクが１日当りの飼料中の概算生物量の１．５％を受け入れるように、飼料支給量を調節した。切身を処理して、魚の湿潤重量当りのカロテノイド含量を求めた。切身の種々の部分からプールした肉約１５ｇを均質化し、均質化した肉０．２ｇの試料を室温下で３０分間１mlのアセトンで抽出して肉のカロテノイドを遊離させた。次にカロテノイドをヘキサン：酢酸エチル（容量比１：１）で分配させて、「顔料抽出およびアスタキサンチン分析」という表題の項で前述したように、総カロテノイドおよびアスタキサンチン含量を測定した。飼料のペレットは乳鉢と乳棒で粉砕した。粉砕ペレットの精秤した部分（０．０５ｇ）を室温で３０分間ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理してカロテノイドを抽出した。ＤＭＳＯ抽出カロテノイドを次に「顔料抽出およびアスタキサンチン分析」という表題の項で前述したように定量した。この方法は実験試行を通じて飼料の分析に使用した。我々の新規Phaffia酵母（１つは完全な細胞で他は粉砕または破壊した細胞）を含有する食餌を与えたニジマスの生育および着色を無着色食餌を与えたニジマスおよび合成アスタキサンチンを含有する食餌を与えたニジマスと比較した。図１０でわかるように、４グループすべての魚の重量増加を、８４日間の試験期間中にほぼ２４０ｇから３８０ｇに成長した魚について比較した。この研究から、前記のレベルで食餌に加えた完全かまたは破壊されたPhaffia酵母は、対照魚飼料と同等かまたはすぐれた嗜好性および消化性を示すことがわかる。８４日間の魚の全般的な解剖学的調査によって、４つの処理グループの間には差異がないことがわかった。アスタキサンチンを欠いた食餌（食餌Ｄ）を与えたニジマスの肉のカロテノイド含量は給餌の０日および８４日後において同等の低い量を示し、本研究の基礎食餌が魚肉に沈着させるかもしれないカロテノイドを全く欠いていることを示している。給餌８４日後には、魚に与えたPhaffiaおよび合成アスタキサンチンの肉中のカロテノイド含量は同じであった（図１１）。４グループすべての魚は８４日の試験期間中同等の速度で着色した。実施例１１：サケ類を着色させるPhaffia製品の新規配合物の評価この実施例は、エトキシキン、レシチンおよびベニバナ油を混合したPhaffia 細胞の配合物がサケ科魚肉にアスタキサンチン沈着を増大させることを示す。 Phaffiaを２，０００ｌの発酵槽で実質的に前記のように生育させた。細胞は遠心分離によって１５〜２２％固形分に濃縮して乾燥した。エトキシキン、レシチンおよびベニバナ油は乾燥前に酵母クリームに加えた。飼料はZeigler Bros． Inc．（ペンシルベニア州，Gardners）で加工した。処理および無処理のPhaffia を^#１／８Trout Growerペレット化飼料に包含させた。地方の商業マス養殖業者からニジマス（Onchorhynchus mykiss，Shasta strai n）を入手した。実験条件および実験対照食餌に順応させた後、マスを別々の実験タンク（１タンク当り１４匹）に移した。実験タンクは約６５０ｌの水量があり（直径１２０cm；高さ５６cm）、水の平均流量は毎分１１リットルであった。全体的に、実験に用いた方法および食餌は、ほとんどの商業生産マスが育生されている温度に近い１０ないし１２℃で最適に近いマスの生育が得られるように設計されている。実験終了までには、マスは平均３００ｇから平均６５０ｇに成長した。魚を実験タンクに分ける前に無作為に１５匹の魚をサンプリングして基線重量、長さおよび肉色のデータを調べた。６３日後に１タンク当り１０匹の魚、９３日後に１タンク当り１４匹の魚を無作為に取り出して、実施例１０に述べたように生育程度および顔料の量を調べた。同様に、実施例１０の方法を用いて、切身（肉の湿潤重量当りのカロテノイド含量を求めるため）および飼料ペレットを処理した。レシチンおよびベニバナ油を含有および含有しないPhaffia酵母を含有する食餌を与えられたベニマスの生育および着色を比較した。食餌Ａは２，０００ppm のエトキシキンで処理したPhaffiaを含有した。食餌Ｂは２，０００ppmのエトキシキンおよび２．５％の大豆レシチンで処理したPhaffiaを含有した。食餌Ｃは２，０００ppmのエトキシキン、２．５％の大豆レシチンおよび２．５％のベニバナ油で処理したPhaffiaを含有した。表９のデータからわかるように、給餌９３日後には、エトキシキン、大豆レシチン、およびベニバナ油で処理したPhaffiaを含有する食餌を与えられた魚がもっとも良く着色した。前記実施例によって、この発明をかなり詳細に述べたけれども、該詳細は説明のためのものである。当業者によって、請求の範囲に記載したこの発明の精神および範囲から逸脱せずに、多くの変化や修正を行うことが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ (72)発明者ジョリー，セツコ・オーアメリカ合衆国ウィスコンシン州53217, グレンデール，ウエスト・クローバーヌック・レーン 820 (72)発明者セドマック，ジョゼフ・ジェイアメリカ合衆国ウィスコンシン州53005, ブルックフィールド，ジェームズ・ストリート 13955 (72)発明者スカートラッド，トーマス・ジェイアメリカ合衆国ウィスコンシン州53051, メノモニー・フォールズ，ダブリュー 15873・カントリーサイド・ドライヴ・エヌ76 (72)発明者ワシルスキー，ジョン・エムアメリカ合衆国ウィスコンシン州53005, ブルックフィールド，ウエストウッド・コート 3820

Claims

【特許請求の範囲】１．４重量パーセントを上回る酵母固形分を含有する、少なくとも約１，５００リットルという容積の栄養素培地において、適当な条件で培養するとき、酵母乾燥固形分を基準に少なくとも約３，０００ppmのアスタキサンチンを産生するP haffia rhodozyma菌株。２．酵母乾燥固形分が６重量パーセントを上回る請求項１の菌株。３．栄養素培地の容積が少なくとも３０，０００リットルである請求項２の菌株。４．酵母乾燥固形分を基準に少なくとも約４，０００ppmのアスタキサンチンを産生する請求項３の菌株。５．４重量パーセントを上回る酵母固形分を含有する、少なくとも約１，５００リットルという容積の栄養素培地において、適当な条件で培養するとき、酵母乾燥固形分を基準に少なくとも約３，０００ppmという量のアスタキサンチンを産生する能力を保持しているＡＴＣＣ−７４２１８，ＡＴＣＣ−７４２１９，ＡＴＣＣ−７４２２０およびＡＴＣＣ−７４２２１として寄託されている菌株、ならびにその突然変異体および誘導体より成る群から選ばれる請求項１の菌株。６．菌株が、（ｉ）急速にその細胞が数を増して、アスタキサンチンを産牛し、かつエネルギー源が所定のレベルを上回るほどは培地に蓄積されないような速度で菌株に給送される生育期に続き（ii）細胞数の増加は減じるが、アスタキサンチンの産生は生育期間中の速度と少なくとも同等の速度で継続する成熟期を経験するようなレベルに、培養の少なくとも一部が終るまで保たれる急速に代謝されるエネルギー源を含有する栄養素培地において、適当な条件で菌株の細胞を培養することを含むPhaffia rhodozyma菌株からアスタキサンチンを生成させる改良発酵法において、成熟期を延長させることを含む改良法。７．菌株を光源に曝露することによって成熟期を延長させる請求項６の方法。８．光源が、発酵ブロス１キロリットル当り約１００ワットを下回る光を菌株に与える請求項７の方法。９．露光が成熟期の初めから発酵が終るまで実質的に継続する請求項８の方法。 10．光源が約２５０から７００ナノメートルの間の波長の光を菌株に与える請求項９の方法。 11．生育期の終りに、菌株への急速に代謝されるエネルギー源の給送速度を低下させることによって、成熟期を延長させる請求項６の方法。 12．生育期の終りに菌株にエネルギー源を給送した速度の僅か約５０％にエネルギー源の給送速度を低下させる請求項１１の方法。 13．エネルギー源がグルコースである請求項１２の方法。 14．成熟期の初めに、急速に同化されるエネルギー源を、徐々に同化されるエネルギー源で置き換えることによって成熟期を延長させる請求項６の方法。 15．急速に代謝されるエネルギー源がグルコースであり、徐々に代謝されるエネルギー源がグリセロール；糖みつやコーンシラップ中に存在するグルコース、スクロースや他の多糖類の重合形態；一価アルコール類；およびカルボン酸類より成る群から選ばれる請求項１４の方法。 16．徐々に代謝されるエネルギー源が、発酵の生育期の間、急速に代謝されるエネルギー源とともに菌株に給送される請求項１５の方法。 17．徐々に代謝されるエネルギー源が、急速に代謝されるエネルギー源の給送停止後に菌株に給送される請求項１５の方法。 18．請求項６の方法でつくったアスタキサンチン。 19．請求項７の方法でつくったアスタキサンチン。 20．請求項１１の方法でつくったアスタキサンチン。 21．請求項１４の方法でつくったアスタキサンチン。 22．請求項１の菌株からつくったPhaffia rhodozyma酵母クリーム。 23．請求項２２の酵母クリームからつくった乾燥生成物。 24．可食酸化防止剤、食用油、および可食乳化剤を含む請求項２３の乾燥生成物。 25．乾燥生成物の重量を基準に、酸化防止剤の濃度が約０．０２ないし約２重量パーセントの間、油の濃度が約０．１ないし約１０重量パーセントの間、および乳化剤の濃度が約０．１ないし約１０重量パーセントの間である請求項２４の乾燥生成物。 26．酸化防止剤が、エトキシキン、ビタミンＥ、アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、およびブチル化ヒドロキシトルエンより成る群から選ばれる請求項２５の乾燥生成物。 27．油がベニバナ油、コーン油、ヒマワリ油、大豆油、および前記油の２種以上の混合物より成る群から選ばれる請求項２６の乾燥生成物。 28．乳化剤が大豆レシチンおよびソルビタンエステル類より成る群から選ばれる請求項２７の乾燥生成物。 29．酵母細胞の過半数が破壊されていない請求項２３の乾燥生成物。 30．酵母クリームを噴霧乾燥またはドラム乾燥して調製した請求項２９の乾燥生成物。 31．酵母細胞の過半数が破壊されている請求項２３の乾燥生成物。 32．酵母細胞が微粉砕されている請求項３１の乾燥生成物。 33．請求項２３の乾燥生成物を含む動物飼料。 34．請求項２４の乾燥生成物を含む動物飼料。 35．動物飼料の重量を基準に、約０．１ないし約１０重量パーセントの間の該乾燥生成物を含む請求項３４の動物飼料。 36．動物飼料の重量を基準に、約１ないし約３重量パーセントの間の該乾燥生成物を含む請求項３４の動物飼料。 37．サケ科魚類、甲殻類およびタイ科魚類より成る群から選ばれる動物用に配合された請求項３５の動物飼料。 38．動物の飼養法において、請求項２３の飼料を動物に与えることを含む方法。 39．動物が、サケ科魚類、甲殻類およびタイ科魚類より成る群から選ばれる請求項３８の方法。