NO325466B1 - Astaxantin produserende stamme av Phaffia rhodozyma, fremgangsmate for astaxantin produksjon derfra, gjaerpasta, tort gjaerfaststoff og dyrefor produsert derfra, samt fremgangsmate for a mate et dyr - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører stammer av Phaffia rhodozyma, gjærpasta, tørt gjærfaststoff og dyrefor produsert derfra, samt en forbedret fermenteringsfremgangsmåte for produksjon av astaxantin fra en stamme av Phaffia rhodozyma,

og en fremgangsmåte for å mate et dyr.

1 et aspekt vedrører oppfinnelsen astaxantin som produseres av gjærceller, mens i et annet aspekt vedrører oppfinnelsen fremgangsmåter til produksjon og dyrking av mutante stammer av Phaffia rhodozyma- g\ æTce\\ er som produserer astaxantin i større grad enn de typiske Phaffia rftocfozyma-gjærceller som finnes i naturen. I nok et annet aspekt vedrører oppfinnelsen anvendelse av produkter som fremstilles fra disse gjærceller, i form av et kosttillegg i forskjellige dyrefor.

En distinkt rød farge er av primær betydning for forbrukernes aksept av disse næringsmiddelprodukter, særskilt akvatiske, spiselige dyr slik som laks, flekkpagell, ørret, reke, hummer og mange andre marine dyr. Det oksygenerte karotenoid astaxantin (S.S-dihydroksy-IJ.G-karoten-^-dion) er ansvarlig for disse vanndyrs røde farge. I tillegg til å være ansvarlig for disse dyrs karakteristiske farge, spiller astaxantin en kritisk rolle for ernæringen i disse marine dyrs liv (Torrissen, 1989. Proe. Third Int. Symp. on Feeding and Nutr. in Fish, Toba Aug. 28 - Sept. 1, Japan, side 387-399, Meyers og Chen, 1982. World Aquaculture Society, Special Publication nr. 3, side 153-165). Disse henvisningen medtas heri under henvisning. Dette karotenoid er også egnet for å tilføre pigmentering til kjøtt og produkter av andre dyr, samt til øvrige næringsmidler, d.v.s. fjærfe og egg, forskjellige meieri-produkter, hurtigmat og liknende.

Astaxantin er det karotenoid med rikest forekomst i den akvatiske verden. I likhet med landdyr, kan vanndyr generelt ikke syntetisere astaxantin eller noe annet karotenoid, selv om mange av disse dyr akumulerer karotenoid-forbindelse som

foreligger i deres dietter. Noen av disse dyr, slik som krepsdyr, kan omdanne noen karotener til oksygenerte former av karotenoider (kalt xantophyller) hvorav astaxantin er den dominerende forbindelse som dannes. Imidlertid akkumulerer laksefisker og rød flekkpagell dietetisk astaxantin selv om disse fisker ikke kan omdanne noen annen karotenoid-forbindelse til astaxantin. Derfor må det astaxantin som foreligger i laksefiske og flekkpageller, samt i produkter som produseres fra disse fisker, stamme direkte fra dietetiske kilder.

Planter, inklusive marine mikroalger og spesielle gjærsorter slik som Phaffia rhodozyma, er den primære kilde til karotenoid-forbindelsene i verden. Som bemerket i det foregående biosyntetiseres ikke karotenoider de novo av dyr. Imidlertid, krever dyr generelt visse karotenoider fra hvilke de direkte og indirekte drar fordel, og disse karotenoider oppnås fra dietetiske kilder. Eksempler på substanser som er essensielle for de fleste dyr og som stammer fra visse karotenoider er vitamin A og synspurpur. I den marine verden vil dyr som er langt nede i nærings-kjeden, slik som krepsdyr, spise mikroalger og andre karotenoid-holdige organismer fra planteverden, og for en stor del omdanne de foreliggende karotenoid-forbindelser til astaxantin ved hjelp av naturlige metaboliske prosesser. Astaxantinet lagres deretter i disse astaxantinproduserende dyrs kropp.

Vilt oppvokste laksefisker og rød flekkpagell oppnår sitt astaxantin fra krepsdyrene og andre astaxantinholdige organismer som utgjør en viktig andel av deres diett. I tilfellet med innheiningsdyrkede laksefisker og rør flekkpagell, må det for som benyttes til produksjon av disse fisker supleres med astaxantin for å frembringe en dietetisk kilde for denne viktige naturlige bestanddel i disse fisker. For tiden tilføres syntetisk astaxantin til for som prepareres for produksjon av laksefiske og rød flekk-

pagell i akvakultur til frembringelse av en kilde for denne karotenoide-forbindelse.

I noen tilfeller benyttes syntetisk cantaxantin (en oksygenert karotenoid-forbindelse som er i meget nær slekt med astaxantin) i stedet for astaxantin i for for laksefisker og rør flekkpagell, men denne forbindelse fungerer ikke så godt i disse fisker som det i naturen dominerende astaxantin.

Naturlige kilder for dietetisk astaxantin er sterkt etterspurt av akvakulturindustrien. Naturlige kilder for dietetiske karotenoider som har vært undersøkt for oppdrettsfisk inkluderer krill, kreps, biprodukter fra krepsdyrbearbeiding, alger og høyere planter. Imidlertid tenderer disse naturlige kilder til å være for kostbare fremstillingsmessig sett og av begrenset tilgjengelighet og pålitelighet til å være kommersielt levedyktige.

Den røde gjær, Phaffia rhodozyma, har mottatt stor oppmerksomhet fra industrien som en naturlig kilde for astaxantin siden den ble isolert fra sevje, og den røde farge ble identifisert som astaxantin (Miller, Yoneyama og Soneda. 1976. Int. J. Syst. Bacteriol. 26:286-291, Andrewes, Phaff og Starr. 1976. Phytochem. 15:1003-1007). I 1977 ble Phaffia rhodozyma for første gang vist å pigmentere laksefisker (Johnson, Conklin og Lewis. 1977. J. Fish. Res. Board. Can. 34:2417-2421, Johnson, Villa og Lewis. 1980. Aquaculture. 20:123-134). De potensielle fordeler med Phaffia rhodozyma som en kilde for karotenoide pigmenter for akvakultur er at det er et naturlig produkt som er rikt på essensielle næringsmidler (d.v.s. protein, lipider og B-vitaminer) og at den inneholder astaxantin (Johnson, Villa og Lewis. 1980. Aquaculture. 20:123-134). Imidlertid produserer naturlige isolater av Phaffia rhodozyma så lite astaxantin (typisk 100 til 300 ppm) at de ikke er praktiske eller økonomiske pigmentkilder for akvakulturer (Torrissen, Hardy og Shearer. 1989. Reviews in Aquatic Science 1:209-225, Johnson og An. 1991. CRC Crit. Rev. Biotech. 11:297-326). Dersom Phaffira-stammer skal være et økonomisk egnet foradditiv til farging av vanndyr, eller eventuelt annet potensielt næringsmiddel (dyr eller annet), må i såfall astaxantin-overproduserende stammer utvikles. Hver av de henvisninger som siteres i dette avsnitt medta heri under henvisning.

Mutanter av naturlig forekommende Phaffia av "vill type" er i litteraturen beskrevet som å være i stand til å generere høyere astaxantin-nivåer enn gjær av vill type (internasjonal kunngjøring nr. WO88/08025 (internasjonalt søknadsnr. PCT(DK88/00068), EPO kunngjøring nr. 0438182A1 (EPO søknadsnr. 91900682.3), EPO kunngjørings nr. 0454024A2 (EPO søknadsnr. 91106436.8), internasjonalt kunngjøringsnummer WO91/02060 (internasjonalt søknadsnr. PCT/US90/00558), EPO kunngjøringsnr. 0474347A1 (EPO søknadsnr. 91306489.5) og EPO kunn-gjøringsnr. 0427405A1 (EPO søknadsnr. 90311254.8), som alle medtas heri under henvisning. Disse stammer rapporteres å, under bestemte betingelser, produsere høyere nivåer av astaxantin enn isolater av vill type. Imidlertid produserer disse mutante stammer høyere astaxantin-nivåer utelukkende ved relativt lave biomassekonsentrasjoner. Ved relativt høye biomassekonsentrasjoner, produserer disse mutante stammer utelukkende lave astaxantin-nivåer, hvilke ikke er høye nok til å være praktiske.

Andre eksempler på rapporterte Pfta/F/a-stammer fremlegges i EP 0427405, EP 0474347, Gentles et al., 1991, The Progressive Fish Culturist. Vol. 53, s. 1-6, EP 0438182, EP 0454024 og WO 8808025. Disse stammene er utviklet ved bruk av andre metoder og forskjellige villstammer av Phaffia rhodozyma, og produserer ikke astaxantin på det nivået og ved den hastighet eller det volum som er nødvendig for kommersialisering av produktet.

Til nå er ingen av de rapporterte PharT/a-stammer i stand til å produsere astaxantin effektivt nok til økonomisk og konkurrere med syntetisk astaxantin. Kommersielt levedyktige stammer må produsere astaxantin i vesentlig høyere nivåer enn stammer som rapporteres i litteraturen. For å utvikle en levedyktig prosess for produksjon av astaxantin, bør en stamme produsere over 3.000 ppm, med fordel over 4.000 ppm astaxantin, basert på tørt gjær-faststoff ved over 4 vekt-%, med fordel over 6 vekt-%, tørt gjær-faststoff (dys) i et stort volum av næringsmiddelmedium, d.v.s. 1.500 liter eller mer. Ved anvendelse heri er "vekt-% tørt gjær-faststoff' eller ganske enkelt "tørt gjær-faststoff' vasket fast stoff bestemt ved den metode som er beskrevet i Official Metjod of Analysis, A.O.A.C. utgave nr. 14 (1984) avsnittene 10.215-10.225, som medtas heri under henvisning.

Ved siden av behovet for å utvikle en egent stamme av Phaffia rhodozyma for kommersiell astaxantin-produksjon, behøves det også for dyrking av Phaffia rhodozyma å utvikle fremgangsmåter som maksimaliserer astaxantin-produksjonen i store gjæringskar. Det foreligger utelukkende et begrenset antall litteraturkilder som behandler dyrkningen av Phaffia og produksjonsprosesser for astaxantin i store gjæringskar (internasjonal kunngjøring nr. WO88/08025 (internasjonal søknad nr. PCT/DK/88/00068), og EPO kunngjøring nr. 0454024A2 (EPO søknad nr. 91106436.8) som begge medtas heri under henvisning). Disse rapporterte gjæringsprosesser gir signifikant lavere gjær-faststoff og astaxantin-nivåer enn hva som kreves for en økonomisk lededyktig gjæringsprosess i kommersiell skala.

Ikke bare de forskjellige elementer i produksjon av astaxantin fra gjærceller krever forbedring, men det samme gjelder elementer av astaxantin-absorbsjon og avleiring i animalt kjøtt og animalske produkter. Karotenoid-absorbsjon og avleiring i fisk påvirkes av forskjellige faktorer: genetikk, størrelse, alder, kjønn, varighet av pigmenttilførsel, miljømessige faktorer, og kostsammensetning (Torrissen, Hardy og Shearer: 1989: Reviews in Aquatic Science, 1:209-225, som medtas heri under henvisning).

Det er tilgjengelig forskjellige rapporter vedrørende utformingen av Phaffia- eller karotenoid-produkter (internasjonal kunngjøring nr. WO88/08025 (internasjonal søknad nr. PCT/DK88/00068), EPO kunngjøring nr. 0474347A1 (EPO søknad nr. 91306489.5), EPO kunngjøring nr. 0454024A2 (EPO søknad nr. 91106436.8), og japanske patentsøknader nr. 57-206342, 2238855 og 90 JP-285090 tas med som eksempel, og medtas alle heri under henvisning). I disse rapporter ble Phaffia-produkter utformet for å beskytte pigmentene under tørking såvel som under påfølgende bearbeiding til fiskefor. Forskjellige antioksydanter og stabilisatorer ble for disse formål tilsatt til Pha/f/a-preparatene.

Laksefiskenes kroppstemperatur svarer til temperaturen i det vann hvori de oppholder seg, d.v.s. generelt 0-14 °C. Dette betyr at disse fiskers kroppstemperatur kan være, og er vanligvis, lavere enn 10 °C. Astaxantin er i Phaffia konsentrert i oljedråper. Phaffia- o\\ e inneholder ca. 13 % palmitinsyre (16:00) med et smeltepunkt på 64 °C, og ca. 32 % oljesyre (18:1n9) med et smeltepunkt på 16 °C. P.g.a. disse fettsyrer med høyt smeltepunkt, størkner P/iaifffa-olje nær 10 °C. Dette gjør det vanskelig for fisker å inkorporere Pfta/F/a-astaxantin ved vann-temperaturer under 10 °C, ved hvilke P/iaff/a-oljen størkner.

Således er stammen i følge den foreliggende oppfinnelsen kjennetegnet ved at stammen velges fra gruppen bestående av ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, ATCC- 74221, stammer som har alle kjennetegn tilhørende ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, eller ATCC- 74221, og mutanter derav som har samme eller bedre evne til å produsere astaxantin som ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, eller ATCC- 74221.

Videre er gjærpastaen og det tørre gjærfaststoffet i følge den foreliggende oppfinnelsen kjennetegnet ved at stammen velges fra gruppen bestående av ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, ATCC-74221, stammer som har alle egenskaper av ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220 eller ATCC-74221, og mutanter derav som har samme eller bedre evne av å produsere astaxantin. Det tørre gjærfaststoffet kan omfatte den nevnte gjærpastaen, og likeledes er dyreforet! følge den foreliggende oppfinnelsen kjennetegnet ved at det omfatter det tørre gjærfaststoffet.

Således er fermenteringsfremgangsmåten i følge den foreliggende oppfinnelsen kjennetegnet ved d at fremgangsmåten omfatter dyrkning av stammens celler under egnede betingelser i et næringsmedium inneholdende en raskt metabolisert energikilde som i løpet av minst en del av dyrkningen holdes på et slikt nivå at stammen opplever (i) en vekstfase under hvilken dens celler øker hurtig i antall og produserer astaxantin, og under hvilken energikilden tilføres stammen med en . hastighet slik at den ikke akkumuleres i mediet over et forutbestemt nivå, fulgt av (ii) en modningsfase under hvilken økningen i antall celler minsker men astaxantin produksjonen fortsetter ved en hastighet minst like stor som hastigheten under

vekstfasen, idet modningsfasen er forlenget av det følgende:

a) redusering og opprettholdelse av den eksterne tilførselshastigheten av den raskt metaboliserte energikilden på et nivå som ikke er høyere enn omtrent 50 % av

hastigheten den nevnte energikilden var tilført stammen ved slutten av vekstfasen;

b) stansing av den eksterne tilførselen av den raskt metaboliserte energikilde, og erstatting derav, med en ekstern kilde av en langsomt metabolisert

energikilde, eller;

c) eksponering av stammen ovenfor en lyskilde, hvori lyskilden bidrar med lys til stammen på et nivå på mer enn 15 W pr. kilo liter gjæringsveske, men mindre

enn omtrent 100 W pr. kilo liter gjæringsveske, og hvori stammen er eksponert for lyskilden fra begynnelsen av modningsfasen til avslutningen av gjæringsprosessen.

Videre er fremgangsmåten for å mate et dyr i følge den foreliggende oppfinnelsen kjennetegnet ved at den omfatter å forsyne dyret med nevnte for.

Ytterligere utførelser av oppfinnelsen beskriver i underkravene, det vil si krav 2, 4-13, 15, 17-28, 30-32, 34, 36-42, 44-46 og 48-49.

I en utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelse, er det utviklet og isolert nye stammer av Phaffia rhodozyma som produserer over 3.000 ppm, ofte mer enn 4.000 ppm, astaxantin basert på tørt gjær-faststoff ved over 4 vekt-%, ofte mer enn 6 vekt-%, tørt gjær-faststoff ved dyrking under egnede betingelser og i et fungerende volum av næringsmiddelmedium på minst ca. 1.500 liter. Disse Pftaff/a-stammer kan produsere astaxantin på en økonomisk måte i en kommersiell produksjonsskala for akvakultur- og næringsmiddelindustrien. Visse av disse Pha/f/a-stammer ble deponert hos The American Type Culture Collection i Rockville, Maryland den 6. april 1993 under betegnelsene ATCC-74218 (UBV-AX1), ATCC-74219 (UBV-AX2), ATCC-74220 (UBV-AX3), og ATCC-74221 (UBV-AX4).

I en annen utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelse er det oppdaget fremgangsmåte til dyrking av Phaffia rhodozyma- ceWer som produserer høye nivåer av gjær-faststoff og av astaxantin. I hovedsak inkluderer disse fremgangsmåter frembringelse av spesielle gjæringsbetingelser som fremmer veksten av organismen når det gjelder en økning i antall celler under vekstfasen, og når det gjelder en forbedret og stabil akumulering av astaxantin i cellene under en modningsfase. Nærmere bestemt inkluderer disse fremgangsmåter eksponering av gjærcellene, i løpet av gjæringens vekst- og modningsfaser, overfor en lyskilde, og/eller forlengelse og stimulering av astaxantin-dannelsen under modningsfasen ved styring av tilførselshastigheten for fermenterbart sukker, eksempelvis glykose, eller ved å forsyne gjærcellene med energikilder som metaboliseres langsomt, eksempelvis glyserol.

I en annen utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelse, er det oppdaget at Pftaff/a-stammene ifølge den foreliggende oppfinnelse ikke behøver sprenges for å gjøre astaxantin tilgjengelig for laksefisker, flekkpagell, krepsdyr og andre dyr. Astaxantin i usprengte celler er mer stabilt under tørking, lagring og forbearbeidingsprosesser.

I nok en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er det oppdaget at en ny utforming av Pftaff/a-produkt øker astaxantin-avlæringen i fisker. Denne utføring er en blanding av usprengte Phaff/a-celler, vegitabilsk olje eller en blanding av vegitabilske oljer med et lavt stivningspunkt, en emulgator, og en antioksydant.

Figur 1 viser den genetiske historie for tre av Phaff/a-mutantstammene ifølge

den foreliggende oppfinnelse.

Figur 2- 9 viser mikrofotografier av forskjellige mutante stammers utseende.

Figur 10 viser vektøkningen for regnbueørret i løpet av et foringsforsøk.

Figur 11 beskriver pigmenteringen av regnbueørret i løpet av foringsforsøket fra figur 10.

MUTAGENESE

Astaxantin-overproduserende gjærstammer kan oppnås ved (flere) påfølgende mutasjoner fullt av egnet utvelgelse av mutante stammer som demonstrerer

overlegen astaxantin-produksjon. Med fordel er gjærcellene av familien Phaffia, og med større fordel av arten Phaffia rhodozyma. Utgangspunktets gjærcellestammer av vill type inkluderer de som er deponert hos de forskjellige kultursamlinger rundt i verden, eksempelvis ATCC og Sentralbyrå for Schimmelcultures (CBS). Det er typisk nødvendig å utføre to eller flere påfølgende runder med mutagenese til oppnåelse av de ønskede mutantstammer.

Et hvert kjemisk eller ikke kjemisk (eksempelvis ultrafiolett (UV) stråling) middel som er i stand til å indosere genetisk endring av gjærcellen kan benyttes som mutagen. Disse midler kan benyttes alene eller i kombinasjon med hverandre, og de kjemiske midler kan benyttes som de er eller med et løsningsmiddel.

I disse mutageneseprosedyrer som benytter et kjemisk mutagen, føres mutagenet vanligvis inn i et bufret volum med celler som er grundig blandet, og deretter inkuberes rørende ved romtemperatur i 1 til 12 timer under kontinuerlig forsiktig agitering. Etter inkuberingen overføres reaksjonsblandingen direkte til skåler med agarmedium. Sammensetningen av agaren kan variere, men sammensetningen inkluderer typisk glykose (eller annen karbonkilde), gjærekstrakter (lik de som er tilgjengelige fra Universal Foods Corporation), agar og et screening-middel som inhiberer pigmentdannelse og/eller cellevekst. Cellene fordeles jevnt over agaroverflaten, vanligvis ved å ryste med sterile 5 mm glassperler. Platene inverteres deretter og inkuberes ved ca. 21 °C i 6 -10 dager under belysning med et fortrinnsvis kontinuerlig svakt lys. Liknende dyrkingsteknikker benyttes for disse mutageneseprotokoller hvori mutagenet ikke er et kjemikalie.

SCREENING MED HENSYN PÅ MUTANTER MED HØY

ASTAXANTIN- PRODUKSJON

Innledningsvis screening på skåler og i rystekolber

Etter inkuberingsperioden, blir de gjærkolonier som for det menneskelige øye synes bedre pigmentert enn den mutagenerte foreldrestamme oppsamlet og subkultivert videre på nye agarskåler (ofte med sammensetning lik den som ble benyttet for å dyrke den mutagenerte foreldrestamme). Etter en ytterligere inkubasjonsperiode på 6-10 dager undre like betingelser, blir de nye isolater som fortsetter å være kraftig pigmentert inokulert inn i kolber, eksempelvi 50 ml kolbe inneholdende 10 ml av en blanding av glykose og gjærekstrakt. Isolatene inkuberes deretter typisk i ytterligere 6-10 dager under betingelser som likner de tidligere inkuberinger, men denne gang på en rystemaskin som drives ved ca. 200 omdreininger pr. minutt. Etter denne inkubasjonsperiode tas det ut en alikvot (eksempelvis 0,2 ml) og det totale karotenoid-innhold og astaxantin-innhold bestemmes. De stammer som fremviser forbedrede evner til å produsere astaxantin er kandidater for ytterligere screening i en gjæring med liten sats, og lagres typisk ved frysing i et egnet medium, eksempelvis 15 volum-% glyserol ved minus 80 °C, inntil de behøves til den neste mutagenese eller screening. Denne lagringstekning kan benyttes etter hvert av screenings-trinnene eller for ganske enkelt å opprettholde produksjonsstammer.

Screening i en gjæring med liten sats

Etter utvelgelsen av egnede astaxantin-produserende mutanter på nivået med 50 ml kolber, screenes vanligvis mutanter videre med hensyn på ytelse i 2 I gjæringskar (eksempelvis Omni-Culture Fermentors, Virtis Corp., Gardiner, New York) som inneholder omtrent 1,5 I næringsmedium. I en typisk screening-prosedyre på dette nivå, blir 250 ml kolber som inneholder 30 ml av en blanding av glykose og gjærekstrakt hver for seg inokulert med 100 - 250 yl mutante gjærceller som tas fra en nedfrosssen beholdning av den stamme gjærceller som skal testes. Disse kolber rystes deretter ved 200 rpm/min ved 20 - 22 °C under kontinuerlig lys i tre dager. Alikvoter av disse cellekulturer (15-20 ml) benyttes deretter for inokulering i gjæringskarene.

Arbeidsvolumet i disse 2 I gjæringskar er vanligvis 1,5 I av et beriket medium med glykose og gjærekstrakt supplert med forskjellige vitaminer og mineraler i assimilerbar form. Typisk for disse vitaminer og mineraler er ammoniumsulfat, kaliumfosfat, magnesiumsulfat, sinksulfat, ferriammoniumsulfat, kobbersulfat, inositol, pyridoxin-hydroklorin, tiamin, kalsium pantotenat, biotin og liknende. Kombinasjonene og konsentrasjonene av disse materialer, inklusive glykosen og gjærekstrakten, kan variere etter behov. Om ønsket kan et skumdempende middel og/eller øvrige additiver også inkorporeres i eller benyttes sammen med mediet.

Gjæringskaret med dets medium steriliseres ved autoklavering. Medienes pH holdes vanligvis mellom 4,5 og 7, og temperaturen mellom 15 - 24 °C. Mediet blir vanligvis luftet med filtersterilisert luft (eksempelvis 2 l/min) og agiteres kontinuerlig (eksempelvis 700 rpm/min). Gjæringene varer typisk 4 - 6 dager og det tas periodisk prøve med hensyn på cellevekst og astaxantin-produksjon. Stammer som fremviser egnede vekstnivåer og astaxantin-produksjon er kandidater for screening ved nivået med matet satsvis gjæring.

Screening i en matet satsvis gjæring

Etter identifisering av astaxantin-overproduserende mutanter i små satsvise

gjæringer, screenes mutantene videre med hensyn på stor veksthastighet, høy fast stoffproduksjon og astaxantin-produksjon på høye nivåer i 14 I, 20 I, 250 I og 2.000 I gjæringskar. Typisk propageres stammene i gjæringskar over et pH-område på ca. 4,5 - 7 styrt med vandig ammoniakk, natriumhydroksid eller begge ved et tempera-turområde på 15 - 24 °C. Agitering og lufting justeres som nødvendig til opprettholdelse av ønskede veksthastigheter. De medier med hvilke gjæringskarene lastes likner komposisjonsmessig de som benyttes i de små gjæringskar, d.v.s. de inneholder glykose (eller annen egnet karbonkilde), gjærekstrakter, vitaminer, mineraler og andre additiver, alle i assimilerbar form, selv om den nøyaktige oppskrift kan og sannsynligvis vil avvike fra den som benyttes for de små gjæringskar. Skumdempende middel og andre bearbeidingsmiddler kan benyttes som ønsket.

Dyrkningen kan utføres som en satsvis gjæring inntil en ønsket celletetthet oppnås, eller tilførselen av glykose (eller annen egnet karbon-kilde) kan startes straks. Denne tilførsel justeres ettersom det er nødvendig for å oppnå den beste gjærvekst-hastighet og astaxantinproduksjon. Ytterligere nitrogen kan tilføres gjæringskarene i form av ammoniak eller uria.

Dyrking av Phaffia rhodozyma

Pfra/f/a-stammene ifølge den foreliggende oppfinnelse fremviser innledningsvis rask vekst som gradvis avtar idet de nærmer seg en høy cellekonsentrasjon, eksempelvis større enn 6 vekt-% biomassefaststoff. I en typisk gjæring, er hastigheten for astaxantindannelse innledningsvis langsommere enn Phaff/a-cellenes veksthastighet, men til slutt (i løpet av gjæringens senere fase) overskrider astaxantin-dannelsens hastighet celleveksthastigheten. Ifølge den foreliggende oppfinnelse er denne senere fase betegnet "modningsfasen". Ifølge oppfinnelsen er det fremmet at astaxantinproduksjonen er høyest under modningsfasens tidlige trinn.

For å oppnå bedre astaxantin-produserende gjæringer, er det ifølge oppfinnelsen utviklet tre tilnærminger til opprettholdelse eller økning av den høye hastighet av astaxantin-produksjon som opptrer under modningsfasens tidlige trinn. I løpet av denne forbedrede modningsfase, øker astaxantin-produksjonen sammenliknet med den vanlige modningsfase minst to ganger, ofter tre ganger eller mer. Den første teknikk er å eksponere gjærcellene for en lyskilde, med fordel et kontinuerlig lys av lav intensitet, under modningsfasen, særskilt fra dennes begynnelse til det punkt i fasen hvor astaxantin-produksjonens hastighet begynner å minske signifikant.

An og Johnson (Antonie van Leeuwenhoek. 1991. 57:191-203, som medtas heri under henvisning) indikerte at lys av høy intensitet inhiberer vekst og karotenoid-produksjon av Phaffia. Evans, et al. (EPO publikasjon nr. 0427405A1, EPO Søknad nr. 90311254.8) indikerer at Pha/f/a-stammer gjør det bedre i dagslys enn i mørket. Begge studier benyttet Phaffia dyrket på agarplater. I likhet med An og Johnson, ble det ifølge oppfinnelsen funnet at kontinuerlig fluoriserende lys (regulært laboratorielys) reduserte pigmentutbyttene av Phaffia i rystekolber, og i likhet med Evans ble det funnet at mørket inhiberer karotenoid-utvikling i noen Pfta/if/a-stammer. I midlertid ble det ifølge oppfinnelsen også funnet av et lite intenst, med fordel kontinuerlig fluoriserende lys, d.v.s. mindre enn ca. 100, med fordel mindre enn ca. 25 watt pr. kiloliter gjæringsvæske, faktisk fremmer karotenoid-produksjon i noen Phaffia- stammer ved dyrking i væskeformede medier. Disse stammer inkluderer de som er deponert hos American Type Culture Collection og bærer betegnelsene ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220 og ATCC-74221. Det er ifølge oppfinnelsen også funnet at bedre astaxantin-produksjon oppnås når disse stammer forsynes med en lyskilde under matet satsvis gjæring. Lyset begrenses ikke til noen bestemt bølgelengde, men lys av 250 - 700 nm, særskilt synlig lys, foretrekkes. Under de omstendigheter ved hvilke gjæringskaret er konstruert av metall eller et annet opakt materiale kan lyset gjøres tilgjengelig gjennom en eller flere åpninger av glass (eller liknende gjennomskinnelig materiale) mes det næringsmedium som inneholder næringscellene kontinuerlig sirkuleres forbi åpningen(e). Gjæringsvæske kan også pumpes i en returkrets gjennom et lysgjennomsiktig rør og returneres til gjæringskaret. I begge disse tilfeller kan et høyintenst lys, eksempelvis et lys som leverer mer enn 15 watt/kiloliter benyttes siden utelukkende et relativt lite overflateareal eksponeres for lyset.

For det andre forsynes gjærcellene med en kontrollert mengde av en i forhold til polysakkarid hurtig metabolisert energikilde, eksempelvis glykose eller sucrose.

I løpet av vekstfasen mates gjærcellene med denne energikilde, typisk glykose, så raskt som mulig med den forutsetning at det ikke i noen vesentlig grad akumuleres i næringsmediet. Denne hastighet vil variere med gjærcellestammen, nærings-mediets sammensetning, gjæringsprosedyren, og liknende faktorer. Akumuleringen av energikilden i mediet er generelt et signal om at vekstfasen avsluttes og modningsfasen begynner.

Etter at ønsket gjærfaststoff er oppnådd og forut for akumuleringen av energikilden, reduseres tilførselshastigheten for energikilden til minst ca. 50 %, med fordel minst ca. 40 %, med større fordel minst 30 % av den maksimale tilførselshastighet under vekstfasen. I løpet av denne periode med redusert tilførsel av energikilde, fortsetter gjærcellene å produsere astaxantin, men veksten i antallet gjærceller, d.v.s. veksten i celletetthet, begrenses. Denne periode tillates å fortsette inntil cellene ikke lenger produserer astaxantin ved en økonomisk ønskverdig hastighet.

For å maksimalisere akumuleringen av astaxantin under modningsfasen, kan til— førselshastigheten for energikilden reduseres på en trinnvis eller kontinuerlig måte. Eksempelvis når modningsfasen begynner, kan tilførselshastigheten for energikilden reduseres med 50 % og etter et bestemt tidsrom, typisk 12-24 timer, kan den reduseres 50 % en gang til.

Den tredje teknikk er å mate gjærcellene med en i forhold til glykose langsomt metabolisert energikilde under vekst- og/eller modningsfasen. Disse energikilder eller modningsforlengere inkluderer de fleste materialer som langsomt kan metaboliseres av en gjærcelle. Glyserol, polymeriserte former av glykose, sucrose og andr polysakkarider som typisk finnes i molasse og bestemte stivelsessiruper, forskjellige alkoholer slik som metanol, etanol etc. og forskjellige organiske syrer slik som ravsyre, glutaminsyre, maleinsyre etc. er eksempel på disse forlengere.

I en utførelsesform av denne teknikk (og i likhet med teknikken med redusert tilførsel av energikilden), mates disse forlengere til gjærcellene på det tidspunkt akumulering av energikilden (eksempelvis glykose) påvises i næringsmediet, og de mates i en mengde og på en måte slik at cellenes astaxantin-produksjon fortsetter ved en ønskelig hastighet. I det denne produksjonshastighet for astaxantin minsker, reduseres den mengde forlenger som mates til cellene tilsvarende. De nøyaktige mengder og hastigheten forforlengertilførselen vil variere med stammen, gjæringsprosedyren og liknende betraktninger.

I en annen utførelsesform av den foreliggende teknikk kan disse langsomt metaboliserte forlengere mates til gjærcellene under vekstfasen som en del av eller i tillegg til tilførselen av energikilden. Under disse omstendigheter vil gjærcellene først utmatte den-hurtig metaboliserte energikilde, eksempelvis glykose, og idet deres hastighet for forbruk av denne energikilde minsker, signalerer dette at vekstfasen avsluttes og modningsfasen begynner. På dette tidspunkt stoppes tilførselen av energikilden til næringsmediet og idet den gjenværende hurtig metaboliserte energikilde i mediet uttømmes, vil gjærcellene begynne å metabolisere de gjenværende langsomt metaboliserte energikilder. Disse gjenværende langsomt metaboliserte energikilder kan om ønsket suppleres med ytterligere materialer som beskrevet i det foregående.

Bruken av modningsforlengere vil i begge formater forlenge denne periode på en måte som likner de to andre forlengelsesteknikker. Dessuten kan disse teknikker benyttes i en hver kombinasjon med hverandre og typisk benyttes teknikken med kontinuerlig lys i kombinasjon med en av tilførselsteknikkene.

Modningsfasens tidlige trinn fortsetter inntil astaxantinets produksjonshastighet minsker (som målt i produksjonen av astaxantin pr. volumenhet pr. tidsenhet, eksempelvis mg/l/time). Dette opptrer vanligvis 2 - 4 dager etter at vekstfasen er avsluttet. Hastigheten endres selvfølgelig på en kontinuerlig måte og ved et eller annet punkt etter at den begynner å minske fra maksimum, er de tidligere trinn av denne fase over og forsettelsen av modningsfasen blir økonomisk uønsket og den avsluttes.

GJÆRCELLEUTVINNING OG PRODUKTPREPARERING

Phaffia- g\ ær produseres i form av et rent kulturgjæringsprodukt. Gjærings-råmaterialer utvelges fra et antall leverandører basert på tilgjengelighet og egnethet i prosessen. Hovedkomponentene for dyrking av Phaffia rhodozyma inkluderer stivelsessirup med høy dextroseekvivalent (DE) (eller ekvivalent kilde for fermenter-bare sukkere), gjærekstrakt, ammoniak, uorganiske fosfater og magnesium sulfat. I tillegg til disse hovedkomponenter kreves det et antall mikronæringsstoffer, slik som spormetaller og vitaminer. Alle disse næringsmidler benyttes vanligvis i kommersielle gjæringsprosesser, inklusive fremstillingen av gjær til for og mat. Hver komponent optimaliseres til generering av det maksimale utbytte av astaxantin fra Phaffia- g] ær. Skumming under gjæringen styres ved tilsats av for næringsmidler godkjente skumdempere.

Fermenteringen utføres i rene kulturgjæringskar som har vært rengjort og sterilisert før anvendelsen. Alle næringsmidler som tilsettes til gjæringskarene under gjæringsprosessen steriliseres før anvendelse.

Den produksjon av Phaffia- g\ ær som beskrives i denne oppfinnelse består av en matet satsvis gjæring. Andre gjæringsteknikker kan benyttes om ønsket. Tilsatsen av næringsmidler under gjæringen optimaliseres til oppnåelse av hurtig produksjon både av Phaffia- g] ærens biomasse og av astaxantin.

Under gjæringen styres og fastholdes et antall betingelser. Disse inkluderer mediets surhetsgrad, gjæringstemperaturen og luftningsgraden.

Gjæringen avsluttes vanligvis når astaxantin-produksjonen faller under et kommersielt ønskelig nivå, og den avsluttes typisk ved at kulturen (d.v.s. gjæringsvæsken fra gjæringskaret ved hjelp av enhver egnet anordning overføres til et nedkjølt lagringskar i påvente av konsentrering ved sentrifugering eller filtrering. Kontinuerlige sentrifuge- eller filtreringsenheter benyttes til denne eliminere konsentrering av gjæringsvæsken. Gjæringsvæsken føres gjennom disse enheter, og gjærkonsentratet (d.v.s. gjærkremen) overføres til en nedkjølt lagringstank for gjæringskrem.

En spiselig antioksydant, slik som etoksykin, vitamin E, butylet hydroksyanisol (BHA), butylet hydroksytoluen (BHT), eller ascorbyl palmitat; en spiselig olje slik som vegitabilsk olje, eksempelvis maisolje, saflorolje, solsikkeolje, soyaolje etc; og en spiselig emulgator, slik som soyabønne-lecitin eller sorbintanestere, kan på dette trinn tilsettes gjærkremen. Ved anvendelsen heri betyr "spiselig" et materiale som er godkjent til menneskers eller dyrs inntak. Dette tjener til å beskytte astaxantinet under bearbeiding og transport samt forbedrer også pigmentdeponeringen i fiskekjøtt.

Oljen, emulgatoren og antioksydanten kan tilsettes på ethvert hensiktsmessig tidspunkt i løpet av bearbeidingen av Phaff/'a-gjær. I en utførelsesform blir oljen, eller blandingen av oljer, emulgator (gjær), og en eller flere antioksydanter blandet med hverandre, og deretter blandes blandingen med væskekonsentratet (gjærkremen), tørkes og pakkes for transport. I en annen utførelsesform tilsettes oljen, emulgatoren og antioksydanten til gjærkremen etter at den er tørket. I nok en annen utførelsesform blir en eller to av additivene blandet med gjærkremen før tørking, mens det/de gjenværende additiv(er) blandes med gjærkremen etter at den er tørket. Oljen eller oljeblandingen utgjør ca. 0,1 -10 vekt-%, emulgatoren(e) utgjør ca. 0,1 -10 vekt-% og antioksydanten ca. 0,2 - 2 vekt-% basert på det ferdige tørre produkts totalvekt.

Forut for tørking normaliseres kremen til et passende astaxantin-innhold, vanligvis på 3.000, 4.000 eller 5.000 mg pr. kilo produkt (mg/kilo) ved hjelp av tilsats av bakergjær (feed yeast) (Yeaco™-20 produsert av Universal Foods Corporation eller tilsvarende).

Det normerte produkt tørkes deretter ved en egnet anordning, eksempelvis spraytørking, trommeltørking etc, og pakkes eventuelt, typisk i enten 20 eller 25 kilos varmeforseglede, multiforede esker. Pakningene er utformet for å beskytte produktet fra lys, oksygen og fuktighet.

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tørkes gjærkremen ved anvendelse av konvensjonelt utstyr og teknikker, slik at et vesentlig antall, med fordel et stort flertall av cellene ikke sprenges ved prosessen, d.v.s. slik at cellene beholder hoveddelen av deres kuleform. Det er ifølge oppfinnelsen funnet at uoppdrevne gjærceller frembringer astaxantin til de dyr som spiser dem like effektivt, eller nær like effektivt som opprevne celler.

I en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tørkes gjærkremen på en måte som fremmer sprenging av cellene slik at de fleste cellene i det tørkede produkt er opprevne eller fragmenterte, d.v.s. cellene beholder ikke lenger deres hovedsakelige kuleform. Dersom slike opprevne celler ønskes og ikke frembringes ved tørkeprosessen, kan cellene i såfall underlegges et oppmålingstrinn eller en enzymatisk behandling hvori cellene rives opp.

De følgende eksempel er illustrerende for visse bestemte utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse. Om ikke annet er oppgitt er alle andeler og prosentandeler vektmessige.

BESTEMTE UTFØRELSESFORMER

Pigmentekstrasjon og astaxantin-analyse

Astaxantin-innhold bestemmes som rapportert av Sedmak, Weerasinghe og Jolly i Jolly. 1990. Biotechnol. Techniques 4:107-112, som medtas heri under henvisning.

Gjærcellene vaskes to ganger i 12 x 100 mm prøverør med 4 ml deionisert vann. Etter vasking og ekantering av vannet, blir de prøverør som inneholder de vaskede cellepelleter snudd slik at vannet renner av. Innsidene av rørene tørkes deretter med papirhåndkle til fjerning av mesteparten av vannet fra røret. Til hvert rør tilsettes deretter 0,5 ml dimetylsulfoxid (DMSO) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) forvarmet til 55 °C. Rørene blir virvelagitert i 20 - 30 sekunder og 0,1 ml 0,02 M natriumfosfat (pH 7,0) tilsettes deretter for å fordele karotenoidene i 1 ml i det følgende tilsatte organiske løsningsmiddel. For kompatibilitet med høyytelses væskekromatografi (HPLC) -analyse av astaxantin benyttes 1 ml hexanenetylacetat (50:50 volumbasis, HPLC-kvalitet). Rørene blir deretter virvelagitert i 30 - 40 sekunder for å blande den vandige og den organiske fase. Fasene blir deretter separert ved sentrifugering i 3 minutter i en klinisk benke-sentrifuge. Den organiske fase fjernes og den organiske fases pigmenterte karotenoid-innhold bestemmes fra apsorbsjonen ved 480 nm (A480). Samlede karotenoider beregnes ved anvendelse av ekstinksjonskoeffisienten (E1% = 2,150 (basert på bestemmelser ved anvendelse 1cm av autentisk syntetisk astaxantin).

Astaxantin-innholdet bestemmes deretter ved HPLC. Prøver for HPLC-analyse fortynnes i hexanenetylacetat (50:50 volumbasis), og deretter endres til 0,1 % eddiksyre med iseddik og filtrering forut for injeksering. Kolonnen er en Alltech (Deerfield, IL, USA) Nucleosil 100 silica 5 p, 250 x 4,6 mm rustfri stålkolonne med en Alltech vernekolonne. Det eluerende løsningsmiddel er hexaner:etyacetat (50:50 volumbasis) uten iseddik. Eluanten følges ved 476 nm. Prosentinnholdet astaxantin beregnes deretter fra arealet under kurven ved posisjonen for en syntetisk astaxantin-standard.

Astaxantin-konsentrasjonen beregnes deretter som følger:

Totalt karotenoid i yig/ml gjæringsvæske

= (A480/2.150 x 104 x fortynningsfaktor

Astaxantin i pg/ml gjæringsvæske

= (totalt karotenoid i yg/ml gjæringsvæske

x % astaxantin bestemt ved HPLC) 100

Astaxantin i jjg/g gjær

= astaxantin i jag/ml gjæringsvæske -r g

tørrgjærfaststoff/ml

EKSEMPEL 1: UTVIKLING AV MUTANTSTAMMER

Phaffia rhocfozyma-mutanter ATCC-74218 (UBV-AX1), ATCC-74219 (UBV-AX2), ATCC-74220 (UBV-AX3) og ATCC-74221 (UBV-AX4) ble utviklet fra stammer av vilttype ved hjelp av gjentatt mutagenese som beskrevet i avsnittet med tittel mutagenese. Figur 1 illustrerer den genetiske historie for UBX-AX2, UBX-AX3 og UBV-AX4. UBV-AX1 ble isolert etter syv mutageniseringer.

EKSEMPEL 2: DYRKING AV NYE STAMMER

Data i tabell 1, 2 og 3 viser at P/?ar7/a-stammene ifølge den foreliggende oppfinnelse vokser frem til høye nivåer av cellefaststoff og frembringer høye nivåer av astaxantin i arbeidsvolumer av forskjellige størrelser. I noen av litteraturen adskilles ikke astaxantin fra samlede karotenoider, og dermed er det faktiske nivået av astaxantin betydelig lavere enn det rapporterte. Astaxantin-verdiene i tabellene i et følgende er basert på HPLC-kvantifiseringer av astaxantin.

14 I GJÆRING

Ca. 30 g (tørr basis) aktivt voksende kultur i 1,5 liter egnet dyrkningsmedium inoculeres inn i et 14 liters Virticulture gjæringskar (Virtis Corporation, Gardiner, NY, USA). En typisk utforming av den ferdige væske er:

Oppstartingsbetingelsene er en lufting på 8 standard litere pr. minutt (SLPM) og agitering 500 rpm/min. PH styrets til 5,5 med 750 ml 1:3 fortynning av ammonium-hydroksid, NH40H av reagenskvalitet. Skumdemper av næringsmiddelkvalitet tilsettes etter behov. Kulturen tilføres 1.750 g glykose (Cerelose™, CPC International, Summit-Argo, ILL, USA) i form av en 50 vekt-% løsning ved en hastighet slik at glykosekonsentrasjonen er under 5 g pr. liter, med fordel mellom 0,1 og 2,5 g pr. liter i løpet av gjæringen. Oppløst oksygen styres ved agitering og luftstrøm til mellom 20 % og 90 % metting. Resultatene av slike gjæringer med UBV-AX3 og 4 presenteres i tabell 1:

2.000 I GJÆRING

Ca. 3,6 kg (tørr basis) av en aktivt voksene kultur i 120 liter egnet vekstmedium inoculeres inn i et 2.000 liters IF2000 New Brunswick Scientific gjæringskar (New Brunswick Scientific Corporation, Edison, New Jersey, USA) som inneholder ca. 700 liter av den væske som beskrives i det følgende:

Oppstartingsbetingelsene er 700 SLPM lufting og agitering 100 rmp/min. PH styres til 5,5 med vannfri ammoniakk. Skumdemper av næringsmiddelkvalitet tilsettes etter behov. Kulturen tilføres 800 kg av en 45 vekt-% løsning av uraffiert stivelselssirup med høyt dextrose-innhold (Cargill Incorporated, Eddyville, Iowa, USA) ved en slik hastighet at glykose ikke akkumuleres i fermenteringsvæsken i større grad enn 5 g/liter, med fordel til 0,1 - 2,5 g/liter. Oppløst oksygen styres ved agitering og luftstrøm til mellom 20 % og 70 % metning. Ved gjæringens avslutning er væskevolument omtrent 1.500 liter. Resultatene av en slik gjæring med UBV-AX2 er presentert i tabell 2.

40.000 I GJÆRING

Ca. 160 kg (tørr basis) aktivt voksende kultur i 4.000 liter egnet dyrkningsmedia inoculeres i et 40.000 liter gjæringskar. En typisk utforming av den ferdige væske er:

Oppstartingsbetingelsene er 8.000 SLPM lufting og agitering 40 rmp/min. PH styres til 5,5 med vannfri ammoniakk. Skumdemper av næringsmiddelskvalitet tilsettes etter behov. Kulturen tilføres 17.000 kg 42 vekt-% løsning av uraffinert stivelsessirup med høyt dextrose-innhold (Cargill Incorporated, Eddyville, Iowa, USA) ved en slik hastighet at glykose ikke akkumulerer i gjæringsvæsken i større grad enn 5 g/liter, med fordel 0,1 - 2,5 g/liter. Oppløst oksygen styres ved agitering og luftstrøm til 20 - 70 % metning. Resultatene av en slik gjæring med UBV-AX1 er presentert i tabell 3:

EKSEMPEL 3. STAMMEBESKRIVELSE: KOLONIMORFOLOGI

Kolonimorfologi av de nye stammer ble observert på 2-4 uker gamle besøkne skåler som inneholdt 2 % glykose, 0,5 % Tastone™-154 (Universal Foods Co. Yeast Extract) og 1,5 % agar.

UBV-AX1: Godt isolerte kolonier har diameter 4-5 mm. Det eksisterer noen grad av hetrogenitet i kolonistørrelse innen kulturen. Mindre kolonier spenner i størrelse fra 1-3 mm. Noen av disse mindre kolonier kan være mørkere i farge enn resten av kolonipopulasjonen. Kolonikantene er hele, men noen kolonier fremviser uregel-messige kanter. Dette blir typisk etter 3-4 uker. Koloniene er konvekse til svakt skjoldbukkeformede. Fargen er rødoransje, mørkere ved det hevede sentre. Kolonifinnishen er matt. Ved tett vekst fremstår noen av koloniene som rynkete, spesielt på eldre plater. Etter 3-4 uker er kolonifargen mørkerød. Lysere kolonier, gule i farge, kan leilighetsvis ses i plener av celler. Disse plener kan ha et konet utseende.

UBV-AX2: Godt isolerte kolonier har diameter 4-5 mm. Noen hetrogenitet i kolonistørrelse foreligger, og ses leilighetsvis ved mindre kolonier. Kolonikantene er hele. Koloniene er konvekse til svakt skjoldbukkelformede og blanke i utseende. Fargene er rødoransje, mørkere ved de hevede sentre, spesielt ved overbefolkning. Leilighetsvise uregelmessigheter kan ses ved noen kolonikanter. Etter 3-4 uker er koloniene fremdeles blanke og mørkerøde. Plener av celler er fortsatt jevne og blanke. Mangelen på svakere fargede kolonier indikerer at genene for pigmentering i denne stamme er meget stabile.

UBV-AX3: Kolonimorfologien kan være hetrogen, spesielt etter 6 dagers vekst i glykose/gjærekstraktvæske. Etter 10 dager på glykose/gjærekstraktskåler, spenner koloniene i størrelse fra 1,5-3 mm diameter. Fargene spenner fra rødt til oransje. Mindre kolonier er typisk mørkere røde enn de større koloniene.

UBV-AX4: Etter to uker på glykose/gjærekstraktskåler, er koloniene 2-3 mm i diameter. Kolonikantene er hele, selv om et lite antall kolonier kan fremvise rundtakkede kanter. Kolonifargen er mørk rødoransje. Koloniene er blanke, og har en konisk profil, spesielt ved overbefolkning. Etter 3 uker fremviser koloniprofilen utflating ved basis. Kolonisenterets farge er mørkere rød enn utkanten. Kolonikantene forblir hele.

EKSEMPEL 4: STAMMEBESKRIVELSE: MIKROSKOPISK UTSEENDE

Mikroskopisk utseende av cellene ble observert på nye stammer dyrket i 2 % glykose, 0,5 % Tastone™-154 i 6 dager.

UBV-AX1 (figurene 2 og 3): Cellene er enkle eller i par med tilfeldige korte kjeder. Cellene er elipseformede til piggformede. Cellene er rødaktig gyldenbrune. Noen celler mangler cytoplasma med lipid-dråper. Celle med granulære, svakt pigmenterte former kan ses. Noen pleomorfe fasonger kan også ses. Tilfeldige tilspisset formede celler forekommer.

UBV-AX2 (figurene 4 og 5): Cellene er enkle eller parvise. Celle med to knopper på den samme side av en morcelle er vanlige. Cellene har form av fra elypser som er flattrykt ved polene til kuler. Mange celler er opplagt pigmentert rørbrune. Celler med granulært fremstående, pigmentert cytoplasma er ganske vanlig. Tilfeldige forstørrede, sterkte pigmenterte, avrunnede "chlamydosporeliknende" strukturer kan ses. Strukturene mangler chlamydosporene fortykkede cellevegger.

UBV-AX3 (figurene 6 og 7): Cellene er enkle, parvise, korte kjeder eller små klumper på 3 - 6 celler. Pleomorfe former kan ses. Mange celler er tydelig pigmenterte. Cytoplasmaet i disse celler fremstår som granulært.

UBV-AX4 (figurene 8 og 9): Cellene er enkle eller parvise eller korte kjeder. Pleomorfe former kan ses. Noen celler har rødbrunt granulært cytoplasma. Noen celler synes å ha rør-crystalinske strukturer forekommende. Lipiddråper er meget fremstående i noen celler.

EKSEMPEL 5: STAMMEBESKRIVELSE: CELLESTØRRELSE

Tabell 4 viser cellestørrelser av de nye stammer som ble dyrket i 2 % glykose og 0,5 % Tastone™-154 i 6 dager.

EKSEMPEL 6: FORBEDRING AV ASTAXANTIN-PRODUKSJON VED EKSPONERING OVENFOR LYS AV LAV INTENSITET

Tabell 5 rapporterer at mørke inhiberer pigmentproduksjonen i rystekolber. Phaffia ble dyrket i rystekolber med 2 % glykose og 0,5 % gjærekstrakt ved 200 rpm/min ved 21 °C i 6 dager.

EKSEMPEL 7: HYDROLYSERT MAISSIRUP

Hydrolysert maissirup (DE=95) og en delvis hydrolyser! maissirup (DE=63) blandes til frembringelse av et tilførselsmateriale som inneholder glykose og signifikante nivåer av forskjellige høyere sukkere slik som maltose, maltotriose og høyere polymiserte sukkere. Disse sukkere eller polysakkarider metaboliseres ikke inntil glykosen er utmattet. En 75:25 blanding av disse to stivelsessiruper frembringer en tilførsel av ca. 78 % glykose og 10 % maltose (ca. DE=87).

Data i tabell 6 viser at UBV-AX1 produserer signifikant høyere astaxantin-nivåer i et 20 I gjæringskar med en 75:25 blanding av en hydrolysert maissirup (DE=95) og en delvis hydrolysert maissirup (DE=63) enn med en hydrolysert maissirup (DE=95) alene.

EKSEMPEL 8: GLYCEROLEFFEKT PÅ ASTAXANTIN-PRODUKSJONEN UNDER MODNING

For de fleste Phaffia- stammer fortsetter astaxantin-syntesen etter at veksten har stoppet. Av noen betraktes derfor astaxantin som en sekundær metabolitt i Phaffia. Det er i følge oppfinnelsen funnet at tilsatsen av glyserol til Phaffia stimulerer karotenoidsyntese under fasen uten vekst etter at den primære karbonkilde (glykose) er oppbrukt. HPLC-analyse indikerer at dersom glykose og glyserol forligger sammen, blir glykosen fortrinnsvis benyttet og glyserolen benyttes etter glykose-utmatning. Slik det ses i de følgende tabeller, forbedrer inkludering av glyserol sammen med glykose i stor grad astaxantin-utbyttet i Pha/ffa-stammene ifølge oppfinnelsen. Disse stammer vokser meget dårlig dersom glyserol er den eneste karbonkilde.

Tabell 7 viser at nivået av astaxantin-produksjon for Phaffia rhodozyma i stor grad økes ved glyserol i rystekolber med 2 % glykose og 0,5 % gjærekstrakt i kontinuerlig lys av lav intensitet i løpet at 6 dager.

EKSEMPEL 9: LANGSOM TILFØRSEL UNDER MODNING

Dataene fra tabell 8 viser effekten på modning med og uten en kontinuerlig tilførsel av energikilden. Gjæringene ble utført i 20 liters Chemap gjæringskar med UBV-AX1 og det vanlige gjæringsformat i det vesentlige som beskrevet i det foregående. I tilfelle 1, ble gjæringen avsluttet idet cellenes veksthastighet minsket.

I tilfellet 2 ble tilførselen av energikilden stoppet idet celleveksthastigheten minsket og cellene ble tillatt å modne i 72 timer. I tilfellet 3 ble energikildens tilførsels-hastighet redusert til 25 % av den maksimale tilførselshastighet idet gjærens veksthastighet minsket og cellene ble tillatt å modne i 72 timer med langsom tilførsel.

EKSEMPEL 10: EVALUERING AV DE NYE STAMMER SOM EN KILDE TIL PIGMENT FOR LAKSEFISK

Dette eksempel demonstrerer at de nye Phaffia rhodozyma- stammeT pigmenterer laksefiskkjøtt effektivt ved tilsats i for i form av et additiv. Dette eksempel viser også at stammene ifølge den foreliggende oppfinnelse ikke må sprenges for å gjøre astaxantin tilgjengelig for laksfisk (Binkowsky, Sedmak og Jolly. 1993. Aquaculture Magazine. March/April:54-59, som medtas heri under henvisning.

PftafT/a-stammen ble dyrket i et 2.000 liters gjæringskar i det vesentlige på en måte som beskrevet i det foregående. Cellene ble konsentrert til 15 - 22 % faststoff ved sentrifugering og tørket. Tilførselen - eller foret ble bearbeidet av Zeigler Bros. Inc., Gardners, PA, USA. Den nye Phaffia rhodozyma eller syntetisk astaxantin (5 % Carophyll Pink, Hoffmann-LaRoche) ble inkorporert inn i deres nr. 1/8 Trout Grower pelletert for.

Regnbueørret ( Onchorhynchus mykiss, Shasta-stammen) ble anskaffet fra en lokal kommersiell ørrertoppdretter. Etter aklimatisering til laboratoriebetingelser og en eksperimentell kontrolldiett, ble ørreten flyttet inn i separate forsøkstanker (28 fisker pr. tank). Forsøkstankene rommet ca. 250 liter vann (75 cm diameter, 56 cm standrør) og hadde en gjennomsnittlig strømningshastighet på 6,5 liter vann/minutt.

Kollektivt ble de prosedyrer og dietter som ble benyttet i eksperimentene utformet for å resultere i nær optimal vækst av ørret ved 10 °C, den omtrentlige temperatur ved hvilken mesteparten av den kommersielt produserte ørret oppdrettes. Ved avslutningen av forsøket, var den gjenværende ørret omtrent av markedsstørrelse.

Ved 4, 8 og 12 uker ble 6 fisker pr. tank tilfeldig fjernet til bestemmelse av veksthastigheter og pigmentnivåer. Fisken ble svimeslått ved et slag til hodet. Total lengde ble målt, vekt etter avtørring ble bestemt og deretter ble hver enkelt fiske kuttet tvers over isthmus med avskjæring av den ventrale aorta. Fisken ble tillatt å blø ut i kjølig vann og deretter ble to fileter med skinnet på tatt fra hver fisk. Med den informasjon som ble anskaffet fra hver prøvetaking, ble tankens biomasse beregnet på nytt og forrasjonene justert slik at hver tank mottok 1,5 % av dens estimerte biomasse i for pr. dag.

Filetene ble bearbeidet til bestemmelse av karotenoid-innhold pr. våt vekt fiskekjøtt. Ca. 15 g fiskekjøtt som var sammenslått fra forskjellige partier på en filet ble homogenisert og 0,2 g prøver av homogenisert fiskekjøtt ble ekstrahert med 1 ml aceton i 30 minutter ved romtemperatur til frigjøring av kjøtt-karotenoider. Karotenoidene ble deretter fordelt i hexanes.etylacetat (1:1 volummessig) og det totale karotenoid- og astaxantin-innhold ble bestemt som beskrevet i det foregående i avsnittet med tittelen PIGMENT EKSTRAKSJON OG ASTAXANTIN-ANALYSE.

Forpelleter ble knust med en morter og pestil. Et nøyaktig utveid parti (0,05 g) av de knuste pelleter ble behandlet med dimetylsulfoksid (DMSO) i 30 minutter ved romtemperatur til estraksjon av karotenoidene. De DMSO-ekstraherte karotenoider ble deretter konfisert som beskrevet i det foregående under avsnittet med tittelen PIGMENT ESTRAKSJON OG ASTAXANTIN-ANALYSE. Denne prosedyre ble benyttet for foranalyse i alle de eksperimentelle forsøk.

Veksten og pigmenteringen av regnbueørret som ble tilført dietter inneholdende den ifølge oppfinnelsen nye Phaffia- g\ ær (en med hele celler, den andre oppmalte eller sprengte celle) ble sammenliknet både med regnbueørret tilført en upigmentert diett og med regnbueørret som var tilført en diett inneholdende syntetisk astaxantin.

Slik det kan ses i figur 10 var vektøkningen for alle fire grupper fisk sammenlignbar

med fisk som vokste fra omtrent 240 g til 380 g i løpet av den 84 dagers testperiode. Denne studie indikerer at hel eller sprengt Phaffia- g\ ær tilsatt til dietten i nivåer som i det foregående gir samme eller bedre aksept og fordøyelighet som kontrollfiskeforet. Grov anatomisk undersøkelse av fisken etter 84 dager indikerte at det ikke fantes forskjeller mellom de fire behandlingsgrupper.

Innholdet av karotenoid i fiskekjøtt fra regnbueørret som var tilført den diett som manglet astaxantin (diett D) var på det samme lave nivå ved 0 og 84 dager hvilket indikerer at basisdietten for disse studier faktisk manglet ethvert karotenoid som kunne vært deponert i fiskekjøttet. Detter 84 dagers tilførsel, var innholdet av karotenoid i fiskekjøttet fra fisk tilført Phaffia og syntetisk astaxantin det samme (figur 11). Alle fire grupper fisk ble farget i sammenlignbar grad i løpet av den 84 dagers testperiode.

EKSEMPEL 11: EVALUERING AV EN NY UTFORMING AV PHAFFIA- PRODUKT FOR PIGMENTERING AV LAKSEFISK

Dette eksempel demonstrerer at et produkt av Phaffia- ceWer blandet med etoksykin, lecitin og saflorolje øker astaxanting-avlæringen i laksefisks fiskekjøtt.

Phaffia ble dyrket i et 2.000 liters gjæringskar i det vesentlige som beskrevet i det foregående. Cellene ble konsentrert til 15 - 22 % faststoff ved sentrifugering og tørket. Etoksykin, lecitin og saflorolje ble tilsatt til gjærkremen forut for tørking. Foret ble bearbeidet av Zeigler Bros. Inc., Gardners, PA, USA. Den behandlede og ubehandlede Phaffia ble inkorporert i dere nr. 1/8 Trout Grower pelletert for.

Regnbueørret { Onchorhynchus mykiss, Shasta-stammen) ble anskaffet fra en lokal kommersiell ørretoppdretter. Etter aklimatisering til laboratorie-betingelser og en eksprementell kontrolldiett, ble ørreten flyttet over i separate forsøkstanker (14 fisker pr. tank). Forsøkstankene fommet omtrent 650 liter vann (120 cm diameter, 56 cm standrør) og hadde en gjennomsnitlig strømningshastighet på 11 liter vann/minutt.

Kollektivt ble de prosedyrer og dietter som ble benyttet i forsøkene utformet for å resultere i nær optimal vekst av ørret ved 10-12 °C, den omtrentlige temperatur ved hvilken mesteparten av kommersielt produsert ørret oppdrettes. Ved forsøkets avslutning hadde ørreten vokst fra et gjennomsnitt på 300 g til et gjennomsnitt på 650 g. 15 fisker ble tilfeldig uttatt til bestemmelse av nullpunktvekten, lengden og fiskekjøttets fargedata før adskillelsen av fisk til de forskjellige forsøkstankter. Etter 63 dager ble 10 fisker pr. tank og etter 93 dager 14 fisker pr. tank tilfeldig fjernet til bestemmelse av veksthastigheter og pigmentnivåer på samme måte som beskrevet i eksempel 10. På liknende måte ble prosedyrene fra eksempel 10 benyttet til bearbeiding av filetene (til bestemmelse av karotenoid-innholdet pr. netto vekt fiskekjøtt, og av pelletene med for.

Veksten og pigmenteringen av regnbueørret som ble tilført dietter inneholdende Phaffia- g\ ær med og uten lecitin og saflorolje ble sammenliknet. Diett A inneholdet Phaffia behandlet med 2.000 ppm etoksykin. Diett B inneholdt Phaffia behandlet med 2.000 ppm etoksykin og 2,5 % solyalecitin. Diett C inneholdt Phaffia behandlet med 2.000 ppm etoksykin, 2,5 % soyalecitin og 2,5 % saflorolje.

Slik det kan sees i fra data i tabell 9, var, etter 93 dagers tilførsel, den fisk som var tilført dietten inneholdende Phaffia behandlet med etoksykin, soyalecitin og saflorolje best pigmentert.

Selv om den foreliggende oppfinnelse her beskrevet meget detaljert ved hjelp av de foregående eksempler, er slike detaljer tatt med som en illustrasjon. Mange variasjoner og modifikasjoner kan utføres av fagfolk uten avvik fra ideen og rekke-vidden av den foreliggende oppfinnelse slik denne er beskrevet i de vedlagte krav.

Claims (49)

1. Stamme av Phaffia rhodozyma, karakterisert ved at stammen velges fra gruppen bestående av ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, ATCC- 74221, stammer som har alle kjennetegn tilhørende ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, eller ATCC- 74221, og mutanter derav som har samme eller bedre evne til å produsere astaxantin som ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, eller ATCC- 74221.

2. Stamme i samsvar med krav 1, karakterisert ved at stammen produserer astaxantin med en hastighet større eller lik 2.513 ug/l/time.

3. Forbedret fermenteringsfremgangsmåte for produksjon av astaxantin fra en stamme av Phaffia rhodozyma, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter dyrkning av stammens celler under egnede betingelser i et næringsmedium inneholdende en raskt metabolisert energikilde som i løpet av minst en del av dyrkningen holdes på et slikt nivå at stammen opplever (i) en vekstfase under hvilken dens celler øker hurtig i antall og produserer astaxantin, og under hvilken energikilden tilføres stammen med en hastighet slik at den ikke akkumuleres i mediet over et forutbestemt nivå, fulgt av (ii) en modningsfase under hvilken økningen i antall celler minsker men astaxantin produksjonen fortsetter ved en hastighet minst like stor som hastigheten under vekstfasen, idet modningsfasen er forlenget av det følgende: a) redusering og opprettholdelse av den eksterne tilførselshastigheten av den raskt metaboliserte energikilden på et nivå som ikke er høyere enn omtrent 50 % av hastigheten den nevnte energikilden var tilført stammen ved slutten av vekstfasen; b) stansing av den eksterne tilførselen av den raskt metaboliserte energikilde, og erstatting derav, med en ekstern kilde av en langsomt metabolisert energikilde, eller; c) eksponering av stammen ovenfor en lyskilde, hvori lyskilden bidrar med lys til stammen på et nivå på mer enn 15 W pr. kilo liter gjæringsveske, men mindre enn omtrent 100 W pr. kilo liter gjæringsveske, og hvori stammen er eksponert for lyskilden fra begynnelsen av modningsfasen til avslutningen av gjæringsprosessen.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at den langsomt metaboliserte energikilden er valgt fra gruppen som består av polymeriserte former av glukose, sukrose og andre polysakkarider som finnes i melasse og maissirup, monohydroksyalkoholer, karboksylsyrer, og glyserol.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at lyskilden bidrar med lys til stammen ved av en bølgelengde på mellom omtrent 250nm og 700nm.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 5, karakterisert ved at eksponeringen til lyskilden er vesentlig kontinuerlig.

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 5, karakterisert ved at eksponeringen til lyskilden er vesentlig ikke-kontinuerlig.

8. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at den raskt metaboliserte energikilden er glukose.

9. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at den raskt metaboliserte energikilden er glukose, og den langsomt metaboliserte energikilden er valgt fra en gruppe som består av glyserol; polymeriserte former av glukose, sukrose og andre polysakkarider som finnes i melasse og maissirup; monohydroksyalkoholer; og karboksylsyrer.

10. Fremgangsmåte i samsvar med krav 9, karakterisert ved at den langsomt metaboliserte energikilden tilføres stammen sammen med den raskt metaboliserte energikilden under fermenteringens vekstfase.

11. Fremgangsmåte i samsvar med krav 9, karakterisert ved at den langsomt metaboliserte energikilden tilføres stammen etter avslutning av tilførsel av den raskt metaboliserte energikilden.

12. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at stammen er valgt fra en gruppe som omfatter Phaffia rhodozyma ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, ATCC-74221 og mutanter derav som beholder evnen til å produsere astaxantin.

13. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at stammen er valgt fra en gruppe som omfatter: Phaffia rhodozyma ATCC-74218, Phaffia rhodozyma ATCC-74219, Phaffia rhodozyma ATCC-74220, Phaffia rhodozyma ATCC-74221, mutanter av Phaffia rhodozyma ATCC-74218 som beholder evnen til å produsere astaxantin og fremme karotenoid produksjon, mutanter av Phaffia rhodozyma ATCC-74219 som beholder evnen til å produsere astaxantin og fremme karotenoid produksjon, mutanter av Phaffia rhodozyma ATCC-74220 som beholder evnen til å produsere astaxantin og fremme karotenoid produksjon, og mutanter av Phaffia rhodozyma ATCC-74221 som beholder evnen til å produsere astaxantin og fremme karotenoid produksjon.

14. Gjærpasta produsert fra en stamme Phaffia rhodozyma gjærceller, karakterisert ved at stammen velges fra gruppen bestående av ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, ATCC-74221, stammer som har alle egenskaper av ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220 eller ATCC-74221 , og mutanter derav som har samme eller bedre evne av å produsere astaxantin.

15. Gjærpasta i samsvar med krav 14, karakterisert ved at stammen av Phaffia rhodozyma gjærceller velges fra gruppen bestående av Phaffia rhodozyma ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, og ATCC-74221.

16. Tørt gjærfaststoff, karakterisert ved at det produseres fra gjærpastaen ifølge krav 14 eller 15.

17. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 16, karakterisert ved at det tørre gjærfaststoff ytterligere omfatter en spiselig antioksidant, en spiselig olje, eller en spiselig emulgator.

18. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 16, karakterisert ved at konsentrasjonen av den spiselige oksidant, basert på den totale vekt til den tørre gjærfaststoff, ligger mellom omtrent 0,02 vekt% og omtrent 2 vekt%.

19. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 16, karakterisert ved at konsentrasjonen av den spiselige oljen, basert på den totale vekt til den tørre gjærfaststoff, ligger mellom omtrent 0,1 vekt% og omtrent 10 vekt%.

20. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 16, karakterisert ved at konsentrasjonen av den spiselige emulgator, basert på den totale vekt til den tørre gjærfaststoff, ligger mellom omtrent 0,1 vekt% og omtrent 10 vekt%.

21. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 16, karakterisert ved at den spiselige antioksidant velges fra gruppen bestående av etoksiquin, vitamin E, ascorbyl palmitat, butylert hydroksianisol, og butylert hydroksitoluen.

22. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 17, karakterisert ved at den spiselige olje velges fra gruppen bestående av saflortistelolje, maisolje, solsikkeolje, soyaolje, og blandinger av to eller flere av disse oljer.

23. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 17, karakterisert ved at den spiselige emulgator velges fra gruppen bestående av soyalecitin og sorbittestere.

24. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 16, karakterisert ved at et vesentlig flertall av Phaffia rhodozyma gjærceller i den tørre gjærfaststoff er hele.

25. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 16, karakterisert ved at den tørre gjærfaststoff prepareres ved forstøvningstørking eller trommeltørking av gjærpastaen.

26. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 16, karakterisert ved at et vesentlig flertall av Phaffia rhodozyma gjærceller i den tørre gjærfaststoff er brutt.

27. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 16, karakterisert ved at det tørre gjærfaststoff knuses.

28. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 16, karakterisert ved at Phaffia rhodozyma gjærcellene har blitt utsatt for enzymbehandling.

29. Dyrefor, karakterisert ved at det omfatter det tørre gjærfaststoff ifølge krav 16.

30. Dyrefor i samsvar med krav 29, karakterisert ved at det inneholder mellom omtrent 0,1 vekt% og omtrent 10 vekt% av det tørre gjærfaststoff, basert på vekten av dyreforet.

31. Dyrefor i samsvar med krav 30, karakterisert ved at det inneholder mellom omtrent 1 vekt% og omtrent 3 vekt% av det tørre gjærfaststoff, basert på vekten av dyreforet.

32. Dyrefor i samsvar med krav 29, karakterisert ved at dyreforet formuleres for et dyr som velges fra gruppen bestående av salmonidae fisk, krebsdyr, og sparidae fisker.

33. Fremgangsmåte for å mate et dyr, karakterisert ved at den omfatter å forsyne dyret med foret ifølge krav 29.

34. Fremgangsmåte i samsvar med krav 33, karakterisert ved at dyret velges fra gruppen bestående av salmonidae fisk, krebsdyr, og sparidae fisker.

35. Tørt gjærfaststoff produsert fra en stamme av Phaffia rhodozyma gjærceller, karakterisert ved at den velges fra gruppen bestående av ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, ATCC-74221, hvor stammene har alle egenskaper av ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220 eller ATCC-74221, og mutanter derav som har samme eller bedre evne av å produsere astaxantin.

36. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 35, karakterisert ved at stammen Phaffia rhodozyma gjærceller velges fra gruppen bestående av Phaffia rhodozyma ATCC-74218, ATCC-74219, ATCC-74220, og ATCC-74221.

37. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 35 eller krav 36, karakterisert ved at det tørre gjærfaststoff ytterligere omfatter en spiselig antioksidant, en spiselig olje, eller en spiselig emulgator.

38. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 37, karakterisert ved at (i) den spiselige antioksidant velges fra gruppen bestående av etoksiquin, vitamin E, ascorbyl palmitat, butylert hydroksianisole, og butylert hydroksitoluen; (ii) den spiselige olje velges fra gruppen bestående av saflortistelolje, maisolje, solsikkeolje, soyaolje, og blandinger av to eller flere av disse oljer; og at (iii) den spiselige emulgator velges fra gruppen bestående av soyalecitin og sorbitanestere.

39. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 37, karakterisert ved at et vesentlig flertall av Phaffia rhodozyma gjærceller i det tørre gjærfaststoff er hele.

40. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 37, karakterisert ved at et vesentlig flertall av Phaffia rhodozyma gjærceller i det tørre gjærfaststoff er brutt.

41. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 37, karakterisert ved at det tørre gjærfaststoff knuses.

42. Tørt gjærfaststoff i samsvar med krav 37, karakterisert ved at Phaffia rhodozyma gjærcellene har blitt utsatt for enzymbehandling.

43. Dyrefor, karakterisert ved at det omfatter det tørre gjærfaststoff ifølge krav 37.

44. Dyrefor i samsvar med krav 43, karakterisert ved at det omfatter mellom omtrent 0,1 vekt% og omtrent 10 vekt% tørr gjærfaststoff, basert på vekten av dyreforet.

45. Dyrefor i samsvar med krav 44, karakterisert ved at det omfatter mellom omtrent 1 vekt% og omtrent 3 vekt% tørr gjærfaststoff, basert på vekten av dyreforet.

46. Dyrefor i samsvar med krav 43, karakterisert ved at det er formulert for et dyr som velges fra gruppen bestående av salmonidae fisk, krebsdyr, og sparidae fisker.

47. Fremgangsmåte for å mate et dyr, karakterisert ved at dyret forsynes med foret ifølge krav 43.

48. Fremgangsmåte i samsvar med krav 47, karakterisert ved at dyret velges fra gruppen bestående av salmonidae fisk, krebsdyr, og sparidae fisker.

49. Kjøtt fra dyr, karakterisert ved at dyret er foret med et tørt gjærfaststoff ifølge krav 16 eller 37.