BR112016011083A2

BR112016011083A2 - métodos de alimentar animais com massa celular de fermentação

Info

Publication number: BR112016011083A2
Application number: BR112016011083-8A
Authority: BR
Inventors: Stephanie Block; Paul Hanke; Michael Cecava; James Lindquist; Travis Nelson; Leif Solhein
Original assignee: Archer-Daniels-Midland Company
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2020-09-08
Also published as: MX2016006390A; CA2930871A1; US20160286832A1; CL2016001169A1; NZ720244A; CN105916384A; EP3068235A4; EP3068235A1; AU2014348514A1; AU2014348514B2; WO2015073770A1

Abstract

MÉTODOS DE ALIMENTAR ANIMAIS COM MASSA CELULAR DE FERMENTAÇÃO. Métodos de alimentar animais são divulgados. O método inclui alimentar uma massa celular rompida a um animal em uma quantidade de pelo menos 0,5 % da dieta do animal. A massa celular pode ser rompida usando rompimento enzimático, químico, ou físico. A massa celular rompida pode ser usada como uma fonte de proteína para o animal.

Description

“MÉTODOS DE ALIMENTAR ANIMAIS COM MASSA CELULAR DE FERMENTAÇÃO REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S.

No 61/904.536, depositado em 15 de Novembro de 2013, os conteúdos da totalidade do qual são incorporados por esta referência.

CAMPO TÉCNICO

[002]A presente invenção refere-se geralmente a alimentações para animais, mais particularmente, a presente invenção refere-se a métodos de alimentar massas celulares a animais.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003]A produção de aminoácidos tais como ácido glutâmico, L-arginina, treo- nina, ou lisina resulta em uma fração rica em aminoácidos que é usada como uma fonte de aminoácidos em food, feed, produtos farmacêuticos, e aplicações industri- ais. Alguns aminoácidos são produzidos usando Corynebacterium glutamicum em um processo de fermentação descontínuo, descontínuo alimentado, ou contínuo. Em um processo, uma vez que a concentração de aminoácido no caldo de fermentação atinge um nível desejado, o pH do caldo de fermentação é reduzido para um pH en- tre 3,5 a 4,5 usando um ácido, tal como ácido sulfúrico. O caldo de fermentação é em seguida aquecido até temperaturas entre 55 e 65 °C de modo a inativar a cultura de produção usada na fermentação. O produto de aminoácido primário depois pode ser removido e a biomassa remanescente é um material com alto teor de proteína em um estado aquoso, diluído, tal como menos do que 15 % de sólidos.

[004]A massa celular de Corynebacterium glutamicum e outras massas celu- lares recuperadas de esquemas de processamento convencionais têm valor de ali- mentação limitado como massas de fermentação com baixo teor de sólidos. O valor da alimentação de tal massa celular de Corynebacterium glutamicum e outras mas-

sas celulares também é limitado por constituintes celulares indigeríveis, a presença possível de frações anti-nutricionais na parede celular, um desequilíbrio da composi- ção de proteína, ou combinações de qualquer um de tais fatores. Estas limitações restringem o uso de tais massas celulares a taxas de alimentação baixas (isto é, menos do que 5 % de uma alimentação diária) e potencialmente proíbe o uso de tais massas celulares em rações formuladas para o crescimento rápido de animais que requerem alimentações altamente digeríveis. O que são necessários são processos para produzir massas celulares de fermentação melhoradas para o uso em alimen- tações para animais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005]Em cada uma de suas várias formas de realização, a presente invenção satisfaz estas necessidades e divulga processos que são capazes de melhorar a aceitabilidade e digestibilidade de massas celulares, assim, melhorando o uso de tais massas celulares como ingredientes de alimentação.

[006]Em uma forma de realização, um método de alimentar um animal inclui alimentar uma massa celular rompida ao animal em uma quantidade de pelo menos 0,5 % da dieta do animal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[007]A FIG. 1 mostra uma forma de realização de uma esquemática de pro- cessamento de um processo de fermentação que pode ser uma fonte da massa ce- lular da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[008]A presente invenção divulga novos métodos de modificar biomassas para o uso como alimentação animal. Em uma forma de realização, um método de alimentar um animal compreende romper uma massa celular obtida de uma fermen- tação, produzindo assim uma massa celular rompida e alimentar a massa celular rompida a um animal em uma quantidade de pelo menos 0,5 % da dieta do animal.

Em uma forma de realização, o rompimento pode ser realizado em uma massa celu- lar obtida de um processo de fermentação e em uma outra forma de realização, célu- las integrais do processo de fermentação podem ser separadas do processo de fer- mentação para produzir a massa celular.

[009]Em uma forma de realização, a massa celular da presente invenção pode ser uma biomassa de fermentação usada para produzir um aminoácido (por exemplo, lisina, treonina, metionina), um ácido orgânico (por exemplo, ácido láctico, ácido cítrico, ácido glutâmico, fumarato, malato, succinato), uma vitamina, um bio- combustível (por exemplo, etanol), um lipídeo, um suplemento nutricional, um pre- cursor químico, riboflavina, biotina, xantana, astaxantana, ácido eicosapentanoico, ácido docosaexanoico, ou outro produto de fermentação comercialmente disponível.

Em uma outra forma de realização, a massa celular pode compreender um organis- mo tal como um fungo, uma bactéria, uma levedura, ou uma alga. Em uma outra forma de realização, a massa celular pode ser de uma origem de Corynebacterium, uma origem de Brevibacterium, uma origem de Lactococcus, uma origem de Baci- llus, uma origem de Candida, uma origem de Saccharomyces, uma origem de As- pergillus, uma origem de Schizosaccharomyces, uma origem de Escherichia, uma origem de Rhizopus, uma origem de Torulaspora, uma origem de Yarrowia, uma ori- gem de Brettanomyces, uma origem de Zygosaccharomyces, uma origem de Acti- nomycetes, uma origem de Dietzia, origem de Bifidobacterium, ou combinações de qualquer um destes.

[010]A massa celular pode ser rompida por uma variedade de métodos inclu- indo, mas não limitados a, métodos de rompimento enzimático, químico, e/ou físico.

Em uma forma de realização, a massa celular pode ser rompida usando ajuste de pH, aquecimento, ou uma combinação destes. Em uma outra forma de realização, a massa celular pode ser rompida usando tratamento enzimático, impacto, ou uma combinação destes realizados em células integrais na massa celular, onde tais tra-

tamentos seriam úteis em pH neutro. Processos realizados em células vivas podem ser úteis visto que nenhuma etapa de matança anterior seria necessária depois da fermentação. Entretanto, em uma outra forma de realização, os processos de romper células da presente invenção também podem ser realizados em massas celulares submetidas a etapas de matança incluindo, mas não limitadas a, ajuste de pH (por exemplo, acidificação) e/ou tratamento térmico. Uma vez que a massa celular é rompida, ela pode ser alimentada a um animal como um alimento para animais líqui- do com alto teor proteico ou subsequentemente seca e alimentada como um ingre- diente alimentício seco. Várias enzimas podem ser usadas para romper massas ce- lulares. Enzimas que podem ser usadas incluem, mas são limitadas a, lisozima, mu- tanolisina, protease, xilanase, hemicelulose, muramidase, amidase, peptidoglicano hidrolase, transglicosilase lítica, peptidase, carboxipeptidase, e/ou outras enzimas usadas em alimentações para animais para digestão de proteína ou carboidrato.

[011]Em uma outra forma de realização, a massa celular pode ser rompida usando vários métodos de rompimento mecânico ou físico. Tais métodos incluem, mas não são limitados a, sonificação, homogeneização, impacto, batimento com pé- rolas, gradiente de alta pressão, gradiente osmótico, aquecimento em autoclave, aquecimento, congelamento, congelamento/descongelamento, prensa francesa, al- calização, acidificação, tratamento com um tensoativo, tratamento com um agente quelante, ou combinações de qualquer um destes. Tais métodos de rompimento físi- co melhoram o valor das massas celulares sem processar ainda para extrair consti- tuintes celulares. Essencialmente, o rompimento da massa celular integral sem re- mover quaisquer constituintes melhora a recuperação global de nutrientes digestí- veis que podem ser alimentados aos animais, assim, reduzindo a presença de quaisquer correntes residuais.

[012]Impacto refere-se à colisão de células com esferas sólidas em um sis- tema agitado, fechado e também pode ser referido como batimento com pérolas.

Batimento com pérolas é frequentemente usado em esquemas de processamento para liberar frações intercelulares em solução para extração subsequente. Batimento com pérolas também pode ser usado para produzir frações de parede celular que permanecem em frações insolúveis, onde as frações insolúveis podem ser concen- tradas por centrifugação ou precipitação.

[013]A massa celular rompida pode ser submetida a processamento adicio- nal. Em uma forma de realização, a massa celular rompida pode ser seca. O proces- so de secagem pode incluir, sem limitação, secagem por pulverização, secagem por tambor, ou outro processo de secagem conhecido. Em uma forma de realização al- ternativa, a massa celular rompida pode ser usada em uma forma líquida, uma pasta úmida, uma forma evaporada concentrada, uma forma centrifugada, ou usada sem ser seca.

[014]Em uma forma de realização, a massa celular rompida pode ser densi- ficada. Tipos de densificação incluem, mas não são limitados a, passar a massa ce- lular rompida através de um moinho de pelota ou outro tipo de compressão para densificar a massa celular rompida.

[015]As massas celulares rompidas podem ser alimentadas a uma variedade de animais incluindo, mas não limitados a peixe, aves domésticas, suíno, ruminan- tes, bovinos, ou outro animal comercialmente promovido. A massa celular rompida pode ser usada como uma fonte de proteína para alimentar o animal e alimentada em quantidades variando de 0,5 a 20 % em peso, 1 a 15 % em peso, ou 2 a 10 % em peso da dieta do animal.

[016]Os exemplos não limitantes, exemplares seguintes são fornecidos para descrever ainda mais as formas de realização apresentadas aqui. Aqueles tendo habilidade comum na técnica avaliarão que variações destes Exemplos são possí- veis dentro do escopo da invenção.

Exemplo 1. Métodos para aumentar o teor de proteína solúvel da massa ce-

lular.

[017]Uma série de experimentos laboratoriais foi iniciada para investigar mé- todos de processamento voltados para romper a estrutura celular da massa de fer- mentação de Corynebacterium glutamicum. A ruptura das células libera material ce- lular solúvel em solução e a proteína solubilizada pode ser medida indiretamente por técnicas espectrofotométricas que medem a ligação da proteína com um corante. O ensaio de Bradford mede a reação da proteína com corante Azul de Coomassie, e este ensaio foi usado para determinar os efeitos de vários métodos de processamen- to sobre o rompimento celular.

[018]Células de Corynebacterium glutamicum foram coletadas depois da produção de lisina e remoção de lisina subsequente. As células foram tratadas com 0,1 % de lisozima em uma solução aquosa de 10 a 15 % de sólidos por 10 a 14 ho- ras a 30 °C e secas. As células tratadas com enzima foram avaliadas em testes de digestação de topo de bancada e depois de aumentadas em escala em um experi- mento de alimentação animal.

[019]Métodos de preparação. Cerca de 1 galão de células foi obtido de uma fermentação de produção de lisina depois da filtração UF. As células tiveram um pH nativo de cerca de 3,1 e um pH de 3,05 depois da lavagem (como descrito aqui). A lavagem incluiu enxaguar as células 2 vezes com água destilada. Para o primeiro enxágue, as células foram centrifugadas em 8.000 rpm, centrifugadas em 10.800 x G por 10 minutos, e o líquido foi vertido. As células foram recolocadas em suspensão.

Para o segundo enxágue, as células foram centrifugadas em 5.000 rpm, centrifuga- das em 4.225 x G por 10 minutos, e o líquido foi vertido. As células foram recoloca- das em suspensão e armazenadas em um refrigerador até processamento adicional.

[020]As células foram submetidas a uma variedade de tratamentos e a eficá- cia dos tratamentos foi determinada medindo-se a liberação da proteína das células em solução. Os tratamentos são listados e descritos na Tabela 1.

Tabela 1. Condições de processamento do Exemplo 1. Tratamento de processamento Descrição lisozima (lisozima de marca L-6876, Lote Enzima 65H7025, disponível da Sigma, St. Louis, MO) solução em solução de Tris a 0,01 aquecido em autoclave 20 minutos em ajuste de Autoclave Líquido, 120 °C em 19 PSI pressão de célula de 10.000, repetido duas ve- Prensa francesa zes Sonificador de Branson 450. 35 % de rendimento Sonificação para uma amplitude de onda de 40 a 125 mí- crons. Ajustar o pH para 7 usando tampão de Tris no ajuste de pH pH 8. Usados aprox. 4 mL de Tris com ~ 20 mL de células. pérolas de 0,2 a 0,3 mícron. 1 minuto até 10 mi- impacto nutos. 3 x - usando gelo seco e acetona até o congela- Congelamento/Descongelamento mento e banho de água até o descongelamento de aproximadamente 4 mL de células.

[021]Vários processos de romper células foram realizados como descrito na Tabela 2, junto com os resultados dos vários processos usando um ensaio de Brad- ford.

Tabela 2. Resultados de várias condições de processamento para o Exem- plo 1. OD das células OD em ID da amostra Branco rompidas (menos o 595 Branco) Nativa 0,447 0,4006 0,0464 Nativa + aquecida em autoclave 0,6032 0,4006 0,2026 Nativa + 4 min. de sonificação 0,466 0,4006 0,0508 Nativa + enzima (pH 4,5) + impacto 0,9548 0,4006 0,5396 Nativa + enzima (pH 4,5) + dodecil sulfato 0,963 0,4006 0,5478 de sódio (SDS; detergente) Nativa + 10 min. impacto 0,5395 0,4006 0,1243 Nativa + 1 min. 40 s. de sonificação 0,5017 0,4006 0,0865 Nativa + enzima (1 h.) 0,7114 0,4006 0,3108 Nativa + enzima (4,5 h.) 0,8014 0,4006 0,3862

Nativa + congelamento/descongelamento 0,4264 0,4006 0,0258 Nativa (pH 7) 0,6449 0,4152 0,2443 Nativa + prensa francesa 0,5298 0,4152 0,1146 Nativa + 10 % de SDS 0,4689 0,4152 0,0537 Lavada (pH 3,0 - 4,0) 0,4224 0,4152 0,0218 Lavada + aquecida em autoclave 0,6896 0,4152 0,289 Lavada (pH 7) 0,7311 0,4152 0,3305 Lavada + 4 min. de sonificação (pH 3,0 a 0,4573 0,4152 0,0421 4,0) Lavada + enzima (pH 4,5) + batimento com 1,1139 0,4152 0,6987 pérolas Lavada + enzima (pH 4,5) + SDS 1,0907 0,4152 0,6755 Lavada + 10 min. de impacto 0,4331 0,4152 0,0179 Lavada + 1 min. 40 s. de sonificação 0,4259 0,4152 0,0107 Lavada + enzima (1 h.) 0,8624 0,4152 0,4618 Lavada + enzima (4,5 h.) 0,9215 0,4152 0,5063 Lavada + congelamento/descongelamento 0,4091 0,4152 0,0085 Lavada + Prensa francesa 0,4565 0,4152 0,0413 Lavada + 10 % de SDS 0,4384 0,4152 0,0232

[022]Este exemplo demonstrou que as várias formas de processos de rom- pimento levam à liberação da proteína a partir das células e em solução. O detergen- te, enzima, ou rompimento mecânico aumentou a liberação da proteína mais do que a sonificação, congelamento/descongelamento, ou o uso de alta pressão (prensa francesa). Com base nos resultados do Exemplo 2, parece que os processos usando enzimas e/ou rompimento mecânico foram os processos mais eficazes para o rom- pimento das células.

Exemplo 2. Métodos de processamento para aumentar a digestibilidade da proteína.

[023]Uma série de estudos foi conduzida para romper a integridade celular de células de Corynebacterium glutamicum depois da produção de lisina e remoção de lisina. A massa celular de fermentação foi tratada com lisozima e submetida a impacto mecânico em várias combinações. A Figura 1 mostra uma esquemática dos métodos de processamento que foram testados. O rompimento da estrutura celular foi indiretamente medido usando um ensaio enzimático de pepsina in vitro comu-

mente usado para avaliar a digestibilidade da proteína de ingredientes de alimenta- ção. Valões de digestibilidade de pepsina maiores (%) indicam digestibilidade au- mentada e utilidade nutricional potencialmente melhorada.

[024]Como mostrado na Tabela 3, a massa celular de Corynebacterium que foi seca sem ter sido primeiro processada por exposição enzimática ou impacto teve digestibilidade baixa. A prática do rompimento mecânico aumentou a digestibilidade de pepsina das células em pelo menos 19 unidades percentuais, não obstante de se a massa celular de partida foi submetida a uma etapa de matança (calor + ácido) e não obstante do equipamento usado para produzir a massa celular seca. A adição de enzima e a combinação de enzimas aumentaram a digestibilidade da massa celu- lar, mas a um grau menor quando comparado com o impacto. A combinação de en- zima e impacto aumentou a digestibilidade das células. O impacto (isto é, batimento com pérolas) descrito aqui foi realizado usando um Premier Mill, modelo #SM15 com pérolas de zircônio tendo um tamanho entre 0,87 mm e 1,0 mm. O impacto foi feito em uma velocidade máxima de 278 RPM e o material foi processado em uma taxa média de 1 litro por minuto. Além disso, células que foram mortas usando calor e ácido foram expostas a um tratamento de base usando óxido de cálcio a um pH de 10 e depois voltou-se para neutro usando ácido láctico. Estes células tratadas com base também tiveram digestibilidade aumentada. As células, depois de serem desa- tivadas por calor e tratamento com ácido, foram rompidas usando homogeneização de alta pressão. As células foram homogeneizadas usando um homogeneizador de alta pressão onde a pressão foi 1000 Bar e caiu até a atmosférica. As células foram processadas duas vezes através do homogeneizador em uma taxa de 3,75 litros por minuto. O rompimento das células usando homogeneização também aumentou a digestibilidade celular como avaliado usando o ensaio de digestibilidade de pepsina.

Tabela 3. Digestibilidade da massa celular de Corynebacterium submetida a vários métodos de processamento para produzir um ingrediente alimentício seco. Material de teste Digestibilidade de pepsina

(%) Células mortas, secas por pulverização 38,8 Células mortas, secas por tambor 38,2 Células não mortas, secas por pulverização 36,8 Células não mortas, secas por tambor 35,5 Células mortas, secas por pulverização, impactadas 61,8 Células mortas, secas por tambor, impactadas 66,7 Células não mortas, secas por pulverização, impacta- 68,7 das Células não mortas, secas por tambor, impactadas 66,8 Células mortas, tratadas com enzima, secas por pulve- 66,1 rização Células mortas, tratadas com enzima, secas por tambor 54,9 Células não mortas, tratadas com enzima, secas por 45,5 pulverização Células não mortas, tratadas com enzima, secas por 60,7 tambor Células mortas, tratadas com base 70,0 Células homogeneizadas 57,5 Células mortas, tratadas com enzima dupla (protease e 43,1 lisozima) Exemplo 3. Experimento de alimentação de aquicultura.

[025]O propósito deste estudo foi medir a resposta do crescimento de dietas comercialmente praticáveis alimentadas com peixe-gato de canal em que uma prote- ína vegetal (por exemplo, farinha de soja) foi substituída com massa celular de Corynebacterium que foi rompida e produzida por várias formas de realização da presente invenção.

[026]Um epxerimento de crescimento de dez semanas foi conduzido com peixe-gato de canal juvenil (peso inicial médio de 11,93 + 0,076 g) para determinar a resposta do peixe a ser alimentado com produtos de massa celular da presente in- venção. A dieta basal foi formulada para conter 32 % de proteína, 5 % de lipídeo, e foi modelada depois de formulações de alimentação comerciais. As massas celula- res processadas e secas da presente invenção foram substituídas em 5 ou 10 % da dieta, e farinha de soja substituída em uma base de proteína. Alimentações foram fabricaedas sob condições laboratoriais e armazenadas sob resfriamento até que necessário, e depois alimentadas até a saciedade usando uma porcentagem fixa de peso corpóreo através dos tratamentos. Formulações de dieta são apresentadas na Tabela 4. Na conclusão do epxerimento de crescimento pesos finais, razão de con- versão da alimentação (FCR) e sobrevivência foram determinados. O experimento de alimentação foi concluído na décima semana e os dados do experimento de ali- mentação são apresentados na Tabela 5.

[027]As dietas de estudo foram preparadas em um laboratório de alimenta- ção usando práticas padrão. Ingredientes secos pré-moídos e óleo foram misturados em um misturador de alimentos (Hobart Corporation, Troy, OH, USA) por 15 min.

Água quente foi combinada na mistura para atingir uma consistência apropriada para peletização. Cada dieta foi peletizada por pressão usando uma máquina para moer carne e um molde de 3 mm. Depois da peletização, as dietas foram secas a um teor de umidade de 8 a 10 % e armazenadas a 4 °C.

[028]A dieta basal foi designada para conter cerca de 32 % de proteína e cerca de 5 % de lipídeo usando principalmente fontes de proteína à base de planta.

A dieta continha 4 % de farinha de peixe savelha para garantir a palatabilidade das dietas através dos níveis de substituição. Todas as dietas foram formuladas para satisfazer as necessidades nutricionais do peixe-gato de canal I. punctatus. A dieta basal foi modificada para produzir 11 dietas com o mesmo nível de proteína, mas com níveis incrementais (0, 5, e 10 %) das biomassas processadas da presente in- venção. Farinha de soja foi removida em uma base iso-nitrogenosa conforme as massas celulares processadas da presente invenção foram adicionadas e amido de milho foi usado como um enchedor. Óleo de peixe foi ajustado para manter níveis de lipídeo similares através das dietas.

[029]Peixe-gato de canal juvenil (peso inicial médio 11,93 + 0,076 g) foi alea- toriamente estocado em aquários de 75 L em 15 peixes por aquário. Os aquários individuais foram unidades modulares em serviço por um sistema de recirculação de água interno de 2.500 L. Houve quatro réplicas para as dietas 1 a 7 (nível de inclu- são de 10 %, basal) e três réplicas para cada dieta que continha massas celulares particulares em 5 % de inclusão (dietas 8 a 11). A temperatura da água foi mantida em torno de 28 °C usando um aquecedor de 3.600 W submerso. Oxigênio dissolvido foi mantido perto da saturação usando pedras difusoras em cada aquário e o tanque de sucção usando uma linha de ar comum foi conectado a um soprador de ar rege- nerativo. Oxigênio dissolvido e temperatura da água foram medidos duas vezes por dia usando um medidor de oxigênio/temperatura digital YSI-55 (disponível da YSI Corporation, Yellow Springs, Ohio, USA) enquanto pH, nitrogênio amoniacal total (TAN), e nitrito-N foram medidos uma vez por semana. O pH da água foi medido in- termitentemente por um medidor de pH eletrônico (caneta de pH disponível da Fis- her Scientific, Cincinnati, Ohio, USA). Nitrogênio amoniacal e nitrito-N totais foram medidos usando os métodos descritos por Solorzano (1969) e Parsons et al. (1985), respectivamente. O período de exposição à luz foi ajustado a 14 h de luz e 10 h de escuridão. Dietas foram oferecidas ao peixe em 4,5 a 6,0 % de BW diariamente, de acordo com o tamanho do peixe e divididas em duas alimentações iguais. Os peixes foram pesados semana sim, semana não. A ração para alimentação foi calculada com base na % de peso corpóreo e foi constante para todos os intervalos de tempo do tratamento. A quantidade de alimentação oferecida por tanque foi ajustada toda semana com base no crescimento e observação da resposta da alimentação. No final do estudo de crescimento, os peixes foram contados e o grupo pesado para determinar o ganho de peso, sobrevivência, e razão de conversão da alimentação.

[030]Os dados deste exemplo foram submetidos a uma análise de uma via de variância para determinar as diferenças significantes (P < 0,05) entre os meios de tratamento. Teste t de Dunnett foi usado para comparar meios de tratamento indivi- duais para o meio de dieta de controle. O teste de faixa múltipla de Student-Neuman

Keuls também foi usado para distinguir as diferenças significantes entre meios de tratamento e contrastes pareados foram testados para o nível de inclusão de 10 % da massa celular. Análises estatísticas foram conduzidas usando o sistema SAS pa- ra windows (disponível da SAS Institute, Cary, NC).

[031]As dietas de estudo são mostradas nas Tabelas 4A e 4B onde a massa celular de Corynebacterium, produzida sob diferentes condições de processamento descritas aqui, foi incluída na dieta nos níveis indicados (5 % e 10 %). O desempe- nho do peixe deste exemplo é mostrado na Tabela 5. Os dados mostram que a mas- sa celular de Corynebacterium produzida de acordo com a presente invenção sem processamento adicional (#1, células mortas secas por pulverização; 10 % de inclu- são) levou a uma redução estatisticamente significante no desempenho do peixe.

Todas as condições de processamento da presente invenção realizadas na massa celular de Corynebacterium resultaram em pesos de peixe finais que foram mais al- tos do que o peixe alimentado com as células não processadas. A melhora na mas- sa celular resultou em desempenho do peixe que foi similar àquele dos peixes de controle. Estes dados mostram que o processamento de células resultou em uma utilidade melhorada.

Tabela 4A. Composição de dietas oferecidas ao peixe-gato. Di- Ingrediente, eta Dieta 2 Dieta 3 Dieta 4 Dieta 5 Dieta 6 % de Dieta 1 Farinha de 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 peixe Farinha de 41,0 26,50 26,80 26,30 25,80 26,10 soja 0 Farinha de 15,0 caroço de 15,00 15,00 15,00 15,00 15,00 0 algodão Óleo de pei- 2,05 1,66 1,92 2,11 2,09 1,97 xe Amido de 0,15 5,04 4,48 4,79 5,31 5,13 milho

10,00 10,00 10,00 10,00 Células Células Células Células 10,00 não mor- Massa celu- impacta- não mor- mortas, Células tas, im- lar de das, trata- tas, trata- tratadas não mor- pactadas, Corynebac- 0,00 das com das com com enzi- tas, secas tratadas teria enzima, enzima, ma, secas por pulve- com enzi- (tratamento) secas por secas por por pulve- rização ma, secas pulveriza- pulveriza- rização por pulve- ção ção rização 10,0 Trigo integral 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 0 25,0 Milho 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 0 Pré-mistura de minerais 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 traços Pré-mistura 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 de vitaminas 25 % de vi- 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 tamina C Fosfato de cálcio dibá- 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 sico Cloreto de 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 colina

Tabela 4B.

Composição de dietas oferecidas ao peixe-gato.

Ingrediente, % Dieta 7 Dieta 8 Dieta 9 Dieta 10 Dieta 11 de Dieta Farinha de 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 peixe Farinha de 25,40 33,80 33,70 33,40 33,20 soja Farinha de caroço de al- 15,00 15,00 15,00 15,00 15,00 godão Óleo de peixe 2,09 1,85 2,08 2,07 2,07 Amido de mi- 5,71 2,55 2,42 2,73 2,93 lho Massa celular 10,00 5,00 5,00 5,00 5,00 de Coryne- Células Células Células não Células não Células bacteria mortas se- impacta- mortas, se- mortas, im- mortas, se- (tratamento) cas por das, trata- cas por pactadas, cas por pulveriza- das com pulveriza- tratadas pulveriza- ção enzima, ção com enzi- ção secas por ma, secas pulveriza- por pulveri- ção zação Trigo integral 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 Milho 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 Pré-mistura de minerais 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 traços Pré-mistura 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 de vitaminas 25 % de vita- 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 mina C Fosfato de cálcio dibási- 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 co Cloreto de 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 colina

Tabela 5. Resposta do crescimento de peixe-gato de canal durante o expe-

rimento de alimentação deste exemplo.

Razão de con- Células de Peso % de versão da ali- Corynebacterium % de células final ganho mentação (FCR) % de sobre- processadas da processadas do de (alimentação vivência presente inven- na dieta peixe peso oferecida/ganho ção de peso) Controle 0 62,3 420 1,21 96 Células mortas secas por pulve- 10 50,2 321 1,45 67 rização Células mortas, tratadas com en- 10 59,9 401 1,25 97 zima, secas por pulverização Células não mor- tas, impactadas, 10 60,5 409 1,23 98 tratadas com en-

zima, secas por pulverização Células não mor- tas, secas por 10 55,7 372 1,28 100 pulverização Células não mor- tas, tratadas com 10 62,3 422 1,22 90 enzima, secas por pulverização Células não mor- tas, impactadas, tratadas com en- 10 64,2 436 1,19 92 zima, secas por pulverização Células mortas secas por pulve- 5 57,4 383 1,27 96 rização Células não mor- tas, impactadas, tratadas com en- 5 65,3 442 1,18 84 zima, secas por pulverização Células não mor- tas, secas por 5 62,4 424 1,20 89 pulverização Células não mor- tas, impactadas, tratadas com en- 5 65,6 452 1,19 73 zima, secas por pulverização Significância (va- 0,0075 0,0106 0,0101 0,185 lor de P) Exemplo 4. Estudo de alimentação de aquicultura.

[032]Este exemplo investigou o crescimento de peixe-gato de canal alimen- tado com dietas contendo massas celulares de Corynebacteria que foram processa- das por vários métodos da presente invenção. Um estudo de crescimento de 10 se- manas foi conduzido com peixe-gato de canal juvenil (peso inicial médio de 6,08 + 0,16 g) para determinar a resposta do peixe aos produtos de massa celular proces-

sada da presente invenção. A dieta basal foi formulada para conter cerca de 36 % de proteína, cerca de 6 % de lipídeo, e foi modelada depois de formulações de ali- mentação comerciais. As massas celulares processadas da presente invenção foram substituídas em 5 ou 10 % da dieta e substituídas com farinha de soja em uma base de proteína. As alimentações foram feitas sob condições laboratoriais e armazena- das sob resfriamento até que necessário. Por todo o epxerimento de crescimento, intensidades de alimentação foram alvejadas perto da saciedade usando uma por- centagem fixa de peso corpóreo através de tratamentos. Na conclusão do estudo de crescimento, pesos finais, razão de conversão da alimentação (FCR; alimentação oferecida/ganho de peso), e sobrevivência foram determinados. Na conclusão de 10 semanas, os peixes foram pesados e o desempenho foi avaliado.

[033]A dieta basal foi designada para conter cerca de 36 % de proteína e cerca de 6 % de lipídeo usando principalmente fontes de proteína à base de planta.

A dieta continha 4 % de farinha de peixe savelha para garantir a palatabilidade das dietas através dos níveis de substituição. Todas as dietas foram formuladas para satisfazer as necessidades nutricionais do peixe-gato de canal I. punctatus. A dieta basal foi modificada para produzir 10 dietas com o mesmo nível de proteína, mas com níveis incrementais (0, 5, e 10 %) das massas celulares processadas da pre- sente invenção. Farinha de soja foi removida em uma base iso-nitrogenosa conforme as massas celulares processadas da presente invenção foram adicionadas e amido de milho foi usado como um enchedor. Óleo de peixe foi ajustado para manter níveis de lipídeo similares através das dietas. As dietas deste exemplo foram preparadas usando práticas padrão. Ingredientes secos pré-moídos e óleo foram misturados em um misturador de alimentos (disponível da Hobart Corporation, Troy, OH, USA) por 15 min. Água quente foi combinada na mistura para atingir uma consistência apro- priada para peletização. Cada dieta foi peletizada por pressão usando uma máquina para moer carne e um molde de 3 mm. Depois da peletização, dietas foram secas a um teor de umidade de 8 a 10 % e armazenadas a 4 °C.

[034]Peixe-gato de canal juvenil (peso inicial médio de 6,08 + 0,16 g) foi ale- atoriamente estocado em aquários de 75 L que foram componentes modulares de um sistema de recirculação interno de 2.500 L com 15 peixes estocados por aquário.

Cada dieta foi oferecida a quatro grupos de réplica de peixes. Neste sistema, a tem- peratura da água foi mantida em torno de 28 °C usando um aquecedor de 3.600 W submerso (disponível da Aquatic Eco-Systems Inc., Apopka, Florida, USA). Oxigênio dissolvido foi mantido perto da saturação usando pedras difusoras em cada aquário e o tanque de sucção usando uma linha de ar comum conectada a um soprador de ar regenerativo. Oxigênio dissolvido e temperatura da água foram medidos duas ve- zes por dia usando um medidor de oxigênio/temperatura digital YSI-55 (disponível da YSI corporation, Yellow Springs, Ohio, USA) enquanto pH, nitrogênio amoniacal total (TAN), e nitrito-N foram medidos uma vez por semana. O pH da água foi medido in- termitentemente por um medidor de pH eletrônico (caneta de pH disponível da Fis- her Scientific, Cincinnati, Ohio, USA). Nitrogênio amoniacal total e nitrito-N foram medidos usando os métodos descritos por Solorzano (1969) e Parsons et al. (1985), respectivamente. O período de exposição à luz foi ajustado para 14 h de luz e 10 h de escuridão. Dietas foram oferecidas aos peixes em 3,5 a 5,0 % de BW diariamente de acordo com o tamanho do peixe e divididas em duas alimentações iguais. Os pei- xes foram pesados semana sim, semana não. A ração para alimentação oferecida foi calculada com base em uma porcentagem de peso corpóreo e foi mantida cons- tante durante cada intervalo de uma semana e a ração para alimentação depois foi ajustada toda semana com base no crescimento e observação da resposta da ali- mentação. No final do epxerimento de crescimento, peixes foram contados e o grupo pesado para determinar o ganho de peso, sobrevivência, e razão de conversão da alimentação.

[035]Neste exemplo, o principal aquecedor falhou, que pode não ser imedia-

tamente substituído. Para manter as temperaturas da água, aquecedores individuais foram instalados em dois tanques por tratamento para mitigar as temperaturas bai- xas. Devido a problemas do aquecedor individual, vários aquários tiveram taxas de mortalidade altas e foram excluídos do estudo. Consequentemente, para alguns tra- tamentos existem apenas 3 réplicas.

[036]Análises estatísticas foram conduzidas usando o sistema SAS para windows (disponível da SAS Institute, Cary, NC). Dados foram submetidos a uma análise de uma via de variância para determinar as diferenças significantes (P < 0,05) entre os meios de tratamento. Teste t de Dunnett foi usado para comparar ca- da tratamento com a dieta de referência. O rendimento de SAS para o teste de faixa múltipla de Student-Neuman Keuls foi usado para distinguir as diferenças significan- tes entre os meios de tratamento e contrastes pareados foram realizados para 10 % de nível de inclusão de cada produto.

[037]A composição das dietas alimentadas ao peixe neste exemplo são apresentadas nas Tabelas 6A e 6B. Os resultados de crescimento deste exemplo são apresentados na Tabela 7.

Tabela 6A. Composição de dietas de estudo alimentadas ao peixe-gato. Ingrediente, % Dieta Dieta 2 Dieta 3 Dieta 4 Dieta 5 de Dieta 1 Farinha de pei- 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 xe Farinha de soja 50,50 35,48 33,24 35,37 34,05 Proteína de 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 glúten de milho Óleo de peixe 3,46 3,20 3,50 3,20 3,35 Amido de milho 0,44 5,72 7,49 5,83 7,00 10,00 10,00 10,00 10,00 Massa celular Células mor- Células não Células mor- Células não de Corynebac- 0 tas, impacta- mortas, im- tas, secas mortas, se- teria das, secas pactadas, por pulveri- cas por pul- (tratamento) por pulveri- secas por zação verização zação pulverização Trigo integral 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00

Milho 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 Pré-mistura de 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 minerais traços Pré-mistura de 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 vitaminas 25 % de vita- 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 mina C Fosfato de cál- 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 cio dibásico Cloreto de coli- 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 na

Tabela 6B.

Composição de dietas de estudo alimentadas ao peixe-gato.

Ingrediente, % Dieta 6 Dieta 7 Dieta 8 Dieta 9 Dieta 10 de Dieta Farinha de 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 peixe Farinha de 35,28 33,48 43,00 41,90 42,95 soja Proteína de glúten de mi- 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 lho Óleo de peixe 3,43 3,52 3,33 3,48 3,33 Amido de mi- 5,69 7,20 3,07 3,93 3,12 lho 10,00 10,00 5,00 Células Células não 5,00 5,00 Células Massa celular mortas, tra- mortas, tra- Células Células não mortas, im- de Coryne- tadas com tadas com mortas, se- mortas, se- pactadas, bacteria enzima, enzima, cas por cas por secas por (tratamento) secas por secas por pulveriza- pulveriza- pulveriza- pulveriza- pulveriza- ção ção ção ção ção Trigo integral 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 Milho 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 Pré-mistura de minerais 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 traços Pré-mistura 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 de vitaminas 25 % de vita- 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 mina C

Fosfato de cálcio dibási- 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 co Cloreto de 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 colina

Tabela 7. Resposta do crescimento de peixe-gato de canal durante 10 se-

manas de epxerimento de crescimento.

Razão de con- Células de Peso % de versão da ali- Corynebacterium % de células final ganho mentação (FCR) % de sobre- processadas da processadas do de (alimentação vivência presente inven- na dieta peixe peso oferecida/ganho ção de peso) Controle 0 34,80 486 1,62 100 Células mortas secas por pulve- 10 25,59 321 2,12 100 rização Células não mor- tas, secas por 10 28,89 375 1,95 98 pulverização Células mortas, impactadas, se- 10 26,01 325 2,06 100 cas por pulveri- zação Células não mor- tas, impactadas, 10 19,31 214 2,83 100 secas por pulve- rização Células mortas, tratadas com 10 30,00 387 1,89 100 enzima, secas por pulverização Células não mor- tas, tratadas com 10 21,69 259 2,43 100 enzima, secas por pulverização Células mortas secas por pulve- 5 31,18 407 1,72 97 rização Células não mor- 5 31,78 433 1,76 100 tas, secas por pulverização Células mortas, impactadas, se- 5 33,97 463 1,67 100 cas por pulveri- zação Significância (va- 0,0001 0,0001 0,0001 0,6151 lor de P)

[038]Neste exemplo, as células mortas secas por pulverização resultaram em desempenho de crescimento mais baixo de peixe-gato de canal quando incluí- das em 10 % da dieta. Todas as modificações da massa celular original de acordo com a presente invenção levaram a uma melhora numérica no desempenho de crescimento quando incluídas em 5 % da dieta comparado à regressão linear entre 0 % e 10 % de células mortas secas por pulverização. A alimentação das células não mortas, tradadas por impacto resultou em menos desempenho de crescimento. É possível que estes resultados fossem devido à degradação do material orignial du- rante o processamento retardado. Células não mortas foram mantidas em pH neutro e o material seco subsequente resultou em desempenho de crescimento mais baixo do que o material morto que passou pelo mesmo processamento. Isto pode indicar uma perda potencial no valor da alimentação da massa celular não morta se ela for mantida por períodos de tempo prolongados antes da secagem. Portanto, em uma forma de realização, células vivas devem ser processadas a outras etapas no es- quema de processamento dentro de 12 horas. Quando considerando células que foram mortas por ajuste de pH e tratamento térmico antes do processamento, houve um aumento observado no peso final para todos os materiais de célula processada quando as células foram mortas.

Exemplo 5. Estudo de alimentação de aves domésticas.

[039]Este exemplo avaliou o desempenho de crescimento de pintinhos ali- mentados com rações contendo a massa celular de Corynebacterium que foi subme- tida a vários processos de tratamento de acordo com a presente invenção. O estudo usou 500 pintinhos New Hampshire x Columbian (peso inicial médio d 8 pós- incubação: 78,1 g). O estudo foi conduzido dos dias 8 a 29 pós-incubação (ensaio de 21 d) com 25 tratamentos, cinco réplicas por tratamento, e 4 pintinhos por réplica.

Pesos dos cercados foram coletados semanalmente, e a entrada de alimentação e conversão de alimentação foram registradas na mesma relação. No final do estudo, uma ave por cercado foi aleatoriamente selecionada para coleta sanguínea para avaliar parâmetros de patologia clínica. As amostras foram submetidas à análise de patologia clínica. Peso do fígado (absoluto) e peso do fígado como uma porcenta- gem de peso corpóreo também foram determinados em uma ave por cercado (isto é, a mesma ave aleatoriamente selecionada para coleta sanguínea).

[040]Dados foram analisados usando SAS como um ANOVA de 1 via com uma correção de Bonferroni, com dieta sendo a única variável dependente no mode- lo. Portanto, houve vários exemplos onde o efeito principal da dieta foi significante, mas a separação de meios corrigidos por Bonferroni não exibiu nenhuma diferença entre os tratamentos (por exemplo, resultados de ganho:alimentação para 2 perío- dos). Isto foi considerado coerente considerado a diferença entre a taxa de erro com respeito ao experimento e com respeito à comparação com um grande número de tratamentos reapresentados no projeto do experimento.

[041]Neste exemplo, as aves domésticas foram alimentadas com a dieta ba- sal apresentada na Tabela 8. A massa celular de Corynebacterium processada de acordo com várias formas de realização desta invenção foi adicionada às dietas ba- sais no consumo de milho e farinha de soja na dieta basal. Com a adição de massa celular de Corynebacterium processada de acordo com várias formas de realização desta invenção, as dietas foram ajustadas para manter as dietas contendo 240 g de CP/kg de dieta, 12,3 a 27,8 g de lisina/kg de dieta, e 2857 a 3131 kcal de energia metabolizável/kg de dieta. CP refere-se à proteína bruta.

Tabela 8. Dieta basal deste exemplo. Ingrediente Concentração (g/kg)

Milho 615,60 Farinha de soja 239,40 Óleo de soja 82,08 Sal 5,47 Pedra calcária 19,15 Fosfato de dicálcio 27,36 Pré-mistura de vitaminas 2,74 Pré-mistura de minerais 2,05 DL-Metionina 2,74 Cloreto de colina 2,74 Bacitracina 0,68

[042]As diferentes massas celulares de Corynebacterium processadas de acordo com várias formas de realização desta invenção usadas neste exemplo são apresentadas na Tabela 9. Dieta de estu- Teor de massa ce- Processo realizado em massa celular do No lular (%) 1 0 Padrão 2 0 Lisina moderada 3 0 Lisina alta 4 1,25 Seca por pulverização, morta 5 2,5 Seca por pulverização, morta 6 5 Seca por pulverização, morta 7 10 Seca por pulverização, morta 8 1,25 Seca por pulverização, impactada, morta 9 2,5 Seca por pulverização, impactada, morta 10 5 Seca por pulverização, impactada, morta 11 10 Seca por pulverização, impactada, morta 12 1,25 Seca por tambor, impactada, morta 13 2,5 Seca por tambor, impactada, morta 14 5 Seca por tambor, impactada, morta 15 10 Seca por tambor, impactada, morta Seca por pulverização, tratada com lisozima, 16 2,5 morta Seca por pulverização, tratada com lisozima, 17 5 morta Seca por pulverização, tratada com lactato de 18 1,25 cálcio, morta Seca por pulverização, tratada com lactato de 19 2,5 cálcio, morta

Seca por pulverização, tratada com protease e 20 2,5 lisozima, morta Seca por pulverização, tratada com protease e 21 5 lisozima, morta Seca por pulverização, tratada com protease e 22 10 lisozima, morta 23 2,5 Seca por pulverização, homogeneizada, morta 24 5 Seca por pulverização, homogeneizada, morta 25 10 Seca por pulverização, homogeneizada, morta

[043]As dietas para os tratamentos de estudo usadas neste exemplo e pre- paradas usando as várias massas celulares de Corynebacterium tratadas da presen- te invenção como segue. Em cada um dos vários tratamentos de dieta, a massa ce- lular de Corynebacterium foi adicionada à dieta basal no consumo de milho e farinha de soja como debatido aqui. O tratamento de estudo 2 foi calculado para conter 19,7 g de lisina/kg da dieta, que dividem a diferença em concentrações de lisina entre as dietas de estudo tendo as concentrações mais baixas (Dieta de estudo 1) e mais altas (Dieta de estudo 25) de lisina de dieta. A adição de HCl de L-lisina ao tratamen- to de estudo 2 foi calculada para conter 238,6 g de CP/kg, mas o N contribuído pelo HCl de L-lisina não foi considerado para este cálculo. O tratamento de estudo 3 foi calculado para conter 25,0 g de lisina/kg da dieta que foi equivalente à quantidade de lisina no tratamento de estudo 25 que teve a concentração mais alta de lisina de dieta. A adição de HCl de L-lisina ao tratamento de estudo 3 foi calculada para con- ter 238,6 g de CP/kg, mas o N contribuído pelo HCl de L-lisina não foi considerado para este cálculo.

[044]As dietas de estudo foram como segue: Dieta de estudo 1 dieta basal de milho-farinha de soja da Tabela 8 (controle); Dieta de estudo 2 dieta basal + 6,9 g/kg de HCl de L-lisina (controle de lisina médio); Dieta de estudo 3 dieta basal + 13,9 g/kg de HCl de L-lisina (controle de lisi- na alto);

Dieta de estudo 4 dieta basal + 12,5 g/kg de massa celular morta, seca por pulverização;

Dieta de estudo 5 dieta basal + 25,0 g/kg de massa celular morta, seca por pulverização;

Dieta de estudo 6 dieta basal + 50,0 g/kg de massa celular morta, seca por pulverização;

Dieta de estudo 7 dieta basal + 100,0 g/kg de massa celular morta, seca por pulverização;

Dieta de estudo 8 dieta basal + 12,5 g/kg de massa celular morta, impacta-

da, seca por pulverização;

Dieta de estudo 9 dieta basal + 25,0 g/kg de massa celular morta, impacta-

da, seca por pulverização;

Dieta de estudo 10 dieta basal + 50,0 g/kg de massa celular morta, impacta-

da, seca por pulverização;

Dieta de estudo 11 dieta basal + 100,0 g/kg de massa celular morta, impac-

tada, seca por pulverização;

Dieta de estudo 12 dieta basal + 12,5 g/kg de massa celular morta, impacta-

da, seca por tambor;

Dieta de estudo 13 dieta basal + 25,0 g/kg de massa celular morta, impacta-

da, seca por tambor;

Dieta de estudo 14 dieta basal + 50,0 g/kg de massa celular morta, impacta-

da, seca por tambor;

Dieta de estudo 15 dieta basal + 100,0 g/kg de massa celular morta, impac-

tada, seca por tambor;

Dieta de estudo 16 dieta basal + 25,0 g/kg de massa celular morta, tratada com lisozima, seca por pulverização;

Dieta de estudo 17 dieta basal + 50,0 g/kg de massa celular morta, tratada com lisozima, seca por pulverização; Dieta de estudo 18dieta basal + 12,5 g/kg de massa celular morta, tratada com lactato de cálcio, seca por pulverização; Dieta de estudo 19 dieta basal + 25,0 g/kg de massa celular morta, tratada com lactato de cálcio, seca por pulverização; Dieta de estudo 20 dieta basal + 25,0 g/kg de massa celular morta, tratada com protease e lisozima, seca por pulverização; Dieta de estudo 21 dieta basal + 50,0 g/kg de massa celular morta, tratada com protease e lisozima, seca por pulverização; Dieta de estudo 22 dieta basal + 100,0 g/kg de massa celular morta, tratada com protease e lisozima, seca por pulverização; Dieta de estudo 23 dieta basal + 25,0 g/kg de massa celular morta, homoge- neizada, seca por pulverização; Dieta de estudo 24 dieta basal + 50,0 g/kg de massa celular morta, homoge- neizada, seca por pulverização; Dieta de estudo 25 dieta basal + 100,0 g/kg de massa celular morta, homo- geneizada, seca por pulverização.

[045]Dietas de estudo 1 a 3 representam tratamento típico para variações de tratamento observadas em estudos de aves domésticas. Dietas de estudo 1 a 3 es- tão dentro de formulações de dieta padrão e sua única diferença foi a adição de lisi- na para equiparar o nível de lisina na dieta de estudo tendo a quantidade mais alta de lisina (isto é, dieta de estudo 25). Níveis crescentes de massas celulares não pro- cessadas estavam em dietas de estudo 4 a 7 onde o desempenho de crescimento as aves domésticas não diferiu das dietas de controle, mas houve uma redução sig- nificante na eficiência de alimentação (razão de ganho:alimentação) pelo fim do es- tudo. Os processos de modificar as massas celulares tais como tratamentos por im- pacto (dietas 8 a 15), com lisozima (dietas 16 e 17), e o uso de hidróxido de cálcio para elevar o pH e depois ácido láctico para reduzir o pH durante o processamento (dietas 18 e 19) todos resultaram em desempenho do pintinho que foram equivalen- tes às dietas de controle. Os processos de aplicação de protease e lisozima não res- tauraram o desempenho do pintinho (dietas 20 a 22) visto que o desempenho do pintinho foi similar nestas dietas às massas celulares não processadas. Entretanto, é possível que a aplicações de protease e lisozima possam ter sofrido de contamina- ção microbiana que pode ter afetado os resultados. O uso de um homogeneizador de estágio duplo para romper as células (dietas 23 a 25) também não afetou o de- sempenho conforme o desempenho do pintinho foi similar nestas dietas quando comparado às dietas de massa celular não processada.

Tabela 11A. Desempenho de pintinhos alimentados com dietas contendo quantidades variadas de massas celulares de Corynebacteria. Dieta de 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 estudo Ganho de peso corpó- reo, g/pinti nho 14 14 142 137 136 142 140 131 139 139 138 140 143 d1a8 1a 8a ab abc abc ab abc bc abc abc abc abc ab b b d 8 a 179 184 181 18 196 179 178 191 184 197 184 19 190 15 a a a 6a a a a a a a a 3a a d 15 a 215 217 214 21 224 216 199 219 214 198 203 22 220 22 a a a 7a a a ab a a ab ab 6a a 54 d 1 a 541 538 531 563 535 501 549 537 533 527 56 552 5a 22 ab ab ab ab ab b ab ab ab ab 7a ab b Entra- da de ali-

men- tação, g/pinti nho 19 194 192 182 200 194 202 192 191 194 196 18 197 d1a8 1a ab ab b ab ab ab ab ab ab ab 3b ab b 26 26 d8a 259 254 257 278 265 278 253 287 253 263 264 5a 7a 15 ab ab ab ab ab ab ab ab ab ab ab b b 39 38 d 15 a 372 378 373 399 400 417 396 360 383 390 392 4a 5a 22 ab ab ab ab ab a ab ab ab ab ab b b d1a 85 83 838 824 813 876 859 897 841 838 831 849 853 22 0 5 Ga- nho: ali- men- tação, g/kg 74 733 715 754 714 718 645 726 727 713 713 82 726 d1a8 1a abc abc ab abc abc bcd abc abc abc abc 3a abc b d8a 70 72 692 725 714 706 675 646 772 658 777 701 719 15 0 5 d 15 a 55 58 587 573 579 562 540 479 554 604 517 521 560 22 4 7 64 622 620 d1a 646 653 661 642 559 655 640 642 67 648 1a abc abc 22 ab ab ab ab cd ab ab ab 9a ab b d d Peso do 17, 18, 17, 19, 17, 17,8 16, 17, 19, 17, 17,6 19, 19, fígado, 78 12 47 81 40 3 01 25 57 87 7 20 18 g Peso do 2,8 2,8 2,9 3,0 3,3 2,7 2,8 2,8 2,9 2,7 2,8 fígado, 2,82 2,74 4 1 6 9 3 4 0 0 3 5 1 % de

BW

Tabela 11B. Desempenho de pintinhos alimentados com dietas contendo quantidades variadas de massas celulares de Corynebacteria. Va- lor SE de

M P Dieta de 14 Mis- do estudo 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 tu- mo ra- de- do lo glo bal Ganho de peso corpó- reo, g/pintinh o 14 13 14 14 14 14 14 13 <0, 15 137 12 145 d1a8 4a 9a 8a 4a 3a 1a 3a 3b 3,18 00 1a abc 4c ab b bc b b b bc b c 01 <0, 19 18 18 19 19 188 18 17 13 20 186 16 d 8 a 15 6,62 00 4a 2a 7a 2a 7a a 8 a 8 a 8b 2 a a 6b 01 20 20 20 20 0,0 d 15 a 22 21 22 21 218 22 16 217 5a 6a 5a 1a 7,70 00 22 3a 4a 6a 7a a 0a 7b a b b b b 4 56 53 56 55 54 55 52 55 <0, 542 42 549 50 11,5 d 1 a 22 0a 4a 1a 9a 6a 0a 4a 0a 00 ab 8c ab 0b 2 b b b b b b b b 01 Entrada de ali- menta- ção, g/pintinh o 20 19 20 20 20 20 19 <0, 21 194 21 213 21 d1a8 0a 1a 3a 1a 6a 1a 6a 4,75 00 0a ab 0a a 6a b b b b b b b 01 d 8 a 15 27 25 26 29 25 264 35 25 23 26 264 26 20,2 0,2

2a 6a 1a 8a 5a ab 7a 7a 6b 3a ab 2a 4 65 b b b b b b b b 4 38 39 37 39 39 37 38 0,0 d 15 a 41 378 33 403 42 13,6 7a 7a 2a 6a 0a 6a 8a 31 22 4a ab 8b ab 0a 0 b b b b b b b 3 0,0 88 83 86 88 85 95 83 78 84 89 27,1 d 1 a 22 837 881 69 6 4 1 0 1 3 4 4 7 8 5 6 Ga- nho:alim entação, g/kg 72 72 73 71 71 704 69 69 73 61 <,0 58 684 21,9 d1a8 0a 7a 0a 7a 9a abc 4b 9b 0a 7c 00 9d bcd 3 bc bc bc bc bc d cd cd bc d 1 0,0 71 71 71 65 77 61 69 58 77 63 36,2 d 8 a 15 711 703 17 3 0 8 1 6 0 1 4 6 5 9 9 0,0 d 15 a 53 55 57 59 51 56 54 49 52 48 23,8 576 539 08 22 8 5 0 5 6 3 8 3 5 1 5 2 63 64 65 63 64 59 62 65 623 55 <0, 648 54 14,0 d 1 a 22 2a 2a 2a 6a 2a 3b 8a 0a abc 8c 00 ab 6d 2 bc b b bc b cd bc b d d 01 16 16 0,7 Peso do 17, 18, 17, 20, 17, 19, 19, 17, 18, 18, ,3 ,2 1,04 09 fígado, g 54 15 23 36 99 21 71 45 98 82 0 3 9 Peso do 0,2 fígado, 2,8 2,8 2,7 2,8 2,8 2,9 2,8 2,9 2, 2,7 2,8 2, 0,12 84 % de 5 0 9 8 8 7 4 0 83 5 3 69 6

BW Exemplo 6. Experimento de alimentação de aves domésticas.

[046]Este estudo avaliou o desempenho de crescimento de pintinhos alimen- tados com massa celular de Corynebacterium processada por vários métodos da presente invenção. Formulações de dieta basal são apresentadas na Tabela 12 e os processos aplicados à massa celular são apresentados na Tabela 13. O impacto foi feito com um Premier Mill, modelo #SM15, tendo pérolas de zircônio entre 0,87 e 1,0 mm em uma velocidade máxima de 278 RPM. O material foi processado através do moinho em uma taxa média de 1 litro/minuto.

[047]Neste experimento, 260 pintinhos New Hampshire x Columbian com um peso inicial médio em 7 dias pós-incubação de 81,9 g foram usados. O estudo foi conduzido durante os dias 7 a 27 pós-incubação (ensaio de 21 d); houve 13 trata- mentos e 5 réplicas por tratamento e 4 pintinhos por réplica. Pesos dos cercados foram coletados semanalmente, e a entrada de alimentação e a conversão de ali- mentação foram registradas na mesma relação. Na conclusão do estudo, todas as aves foram submetidas à eutanásia por asfixia com CO2. Os resultados do desem- penho são apresentados na Tabela 14.

Tabela 12. Dieta basal alimentada aos pintinhos. Ingrediente Nível g/kg Nível de concentração g/kg Milho 446,5 536,5 Farinha de soja 279,70 336,10 Óleo de soja 60,00 72,1 Sal 4,00 4,8 Pedra calcária 14,00 16,8 Difosfato de cálcio 20,00 24,0 Pré-mistura de vitaminas 2,00 2,4 Pré-mistura de minerais 1,50 1,8 HCl de L-lisina 0,00 0 DL-metionina 2,00 2,4 Cloreto de colina 2,00 2,4 Bacitracina 0,50 0,6 Total 832,20 1000,0

[048]Os dados foram analisados como um ANOVA de 1 via com os meios separados usando LSMEANS ajustado por Tukey’s, com dieta sendo a única variá- vel dependente do modelo.

Tabela 13. Tratamentos de dieta. Dieta de estudo Teor de massa celular o Processo realizado em massa celular N (%) 1 0 Dieta basal (controle) 2 5 Seca por pulverização, morta 3 10 Seca por pulverização, morta 4 5 Seca intensamente, morta

5 10 Seca intensamente, morta 6 5 Seca por tambor, morta 7 10 Seca por tambor, morta Seca por pulverização, impactada, 8 5 morta Seca por pulverização, impactada, 9 10 morta 10 5 Seca intensamente, impactada, morta 11 10 Seca intensamente, impactada, morta 12 5 Seca por tambor, impactada, morta 13 10 Seca por tambor, impactada, morta

[049]Massas celulares foram adicionadas às dietas basais no consumo de milho e farinha de soja, que foram ajustadas para manter dietas contendo 240 g de CP/kg de dieta, 19,8 g de lisina/kg de dieta, e 2946 a 3106 kcal de energia metaboli- zável/kg de dieta.

Tabela 12A. Desempenho de pintinhos alimentados com massa celular de Corynebacterium. Dieta de estudo No Resposta variável 1 2 3 4 5 6 7 Contagem das 20 20 20 20 20 20 20 aves, inicial Contagem das 20 20 20 20 20 20 20 aves, final Peso corpóreo, ini- 82 82 82 82 82 82 82 cial g Peso corpóreo, final 621ab 617ab 546c 626ab 589abc 619ab 578bc g Ganho de peso corpóreo, g/pintinho/dia d1a7 20 18 18 20 19 19 18 d 7 a 14 25a 25a 21b 25a 23ab 25a 23ab d 14 a 21 32ab 33ab 27c 32ab 31abc 33ab 30bc d 1 a 21 26abc 25abc 22d 26abc 24bcd 26abc 24cd Entrada de alimen- tação, g/pintinho/dia d1a7 29 28 30 29 29 28 28 d 7 a 14 43 43 45 46 45 41 41 d 14 a 21 56 57 56 58 60 55 56 d 1 a 21 42 42 44 45 45 41 42

Ganho:alimentação, g/kg d1a7 682abc 658abc 584c 680abc 631bc 700ab 632abc d 7 a 14 588ab 585ab 479c 549abc 525bc 604ab 565ab d 14 a 21 581ab 581ab 489e 558abc 512cd 591a 537bcd d 1 a 21 606abc 599abc 507e 581bcd 542de 619ab 567cd abcde Meios dentro de uma fileira com sobrescrito diferente são estatistica-

mente diferentes P < 0,05

Tabela 12B.

Desempenho de pintinhos alimentados com massa celular de

Corynebacterium.

Dieta de estudo No Valor SEM de P Mistura- do Mo- Resposta variável 8 9 10 11 12 13 do delo Global Peso inicial, g 82 82 82 82 82 82 0,7670 1,0000 639 634a <0,000 Peso final, g a 624ab 631ab 622ab b 620ab 11,9955 1

Ganho de peso corpóreo, g/pintinho/d d1a7 20 20 20 20 20 20 0,5239 0,0067 <0,000 d 7 a 14 26a 26a 26a 25a 26a 25a 0,5106 1 <0,000 d 14 a 21 34a 32ab 33ab 32ab 33a 32ab 0,6857 1 <0,000 d 1 a 21 27a 26abc 26ab 26abc 26ab 26abc 0,4680 1

Entrada de ali- mentação, g/pintinho/d d1a7 27 29 29 30 28 28 0,7214 0,1115 d 7 a 14 42 42 41 42 41 42 1,2627 0,0805 d 14 a 21 56 56 55 56 57 56 1,3248 0,5320 d 1 a 21 42 42 42 43 42 42 0,8453 0,1059 Ga- nho:alimentação, g/kg 735 680ab 662ab 707a d1a7 a 690ab c c b 693ab 21,0995 0,0010 620 630a <0,000 d 7 a 14 a 618a 628a 607ab b 602ab 16,7638 1 600 <0,000 d 14 a 21 a 573ab 594a 572ab 588a 567ab 10,0325 1 636 614ab 603ab 628a 606ab <0,000 d 1 a 21 a c 625ab c b c 10,2338 1 abcde Meios dentro de uma fileira com sobrescrito diferente são estatistica- mente diferentes P < 0,05

[050]Quando a massa celular não processada foi incluída em dietas em 10 %, o desempenho de crescimento foi diminuído (dietas 3, 5, e 7). Reduções signifi- cantes em ganho:alimentação também foram observadas como um resultado de ali- mentar 10 % de massa celular, não obstante da tecnologia de secagem. O uso de impacto (dietas 8 a 13) demonstrou um alívio da redução tanto em desempenho quanto em ganho:alimentação.

Exemplo 7. Efeito de alimentar massa celular de Corynebacterium ao suíno.

[051]Um total de 96 porcos (6,8 ± 0,3 kg de peso corpóreo (BW); ~28 dias de idade) foi usado em um projeto de bloqueio completo randomizado com 4 tratamen- tos de dieta. Os blocos foram 6 categorias de BW iniciais. A unidade de estudo foi um cercado com 2 porcos castrados e 2 leitoas por cercado. Cada tratamento teve 6 réplicas de blocos.

[052]Os tratamentos de dieta usados foram um controle positivo que foi uma dieta para viveiro típica de acordo com padrões industriais e o controle positivo com quantidades variadas de massa celular de Corynebacterium presente em 5 %, 7,5

%, e 10 %.

[053]Variáveis de resposta incluíram desempenho do porco e alguns parâ- metros sanguíneos. O desempenho do porco foi medido como BW, ganho de peso (ADG), entrada de alimentação (ADFI), e razão de ganho para alimentação (G:F).

Peso corpóreo e desaparecimento da alimentação foram registrados nos dias 0, 7, 15, 21, 28 e 35. O ADG e ADFI foram calculados por cercado em uma base diária de porco, e expressados como média diária por porco. Dados de desempenho foram analisados e relatados em unidades métricas.

[054]Os parâmetros de soro sanguíneo seguintes foram medidos em 2 por- cos por cercado no dia 35: albumina, nitrogênio ureico no sangue (BUN), cálcio, co- lesterol, creatinina fosfocinase (CPK), creatinina, globulina, glicose, lactato desidro- genase, fósforo, potássio, glutâmico oxaloacético transaminase sérica (SGOT; tam- bém conhecido como aspartato aminotransferase ou AST), sódio, e proteína sérica total.

[055]As dietas foram formuladas para satisfazer ou exceder as necessidades nutricionais do porco (Swine NRC, 2012), e para fornecer concentrações similares de energia metabolizável (ME) e nutrientes através de todos os tratamentos de dieta.

As formulações de dieta incluíram concentrações mínimas de Lys, Ca e P; uma ra- zão de Lys para ME; e razões mínimas de Ile, Met, aminoácidos S, Thr, Trp e Val a Lys (National Swine Nutrition Guide, 2010). Aminoácidos foram fornecidos em uma base digestível ilíaca padronizada (SID). Dietas não incluíram antibióticos, pre-, ou probióticos. Todas as dietas estavam na forma de pelota. O programa de alimenta- ção incluiu 3 fases de 7, 14 e 14 dias, respectivamente, para as fases 1, 2 e 3.

[056]Os porcos usados foram PIC fêmea C29 × macho 337. Os porcos fo- ram desmamados e movidos nas instalações de pesquisa em torno de 21 dias de idade, e depois foram dados 7 dias de período de adaptação antes de começar o experimento. Uma dieta comercial foi alimentada a todos os porcos durante este tempo. Sete dias depois do desmame (cerca de 28 dias de idade), os porcos foram pesados e randomizados a tratamentos de dieta; isto foi considerado dia 0 do estu- do.

[057]No dia 35 (último dia do estudo), 1 porco castrado e 1 leitoa por cerca- do foram aleatoriamente selecionados para coletar uma amostra sanguínea. As amostras foram coletadas por intermédio de venipuntura jugular, a seguir da se- quência de bloqueio de 1 a 6. Amostras foram mantidas em gelo durante a coleta, e processadas para obter soro. Amostras de soro foram congeladas em torno de -10 °C e enviadas ao laboratório para análise. Três porcos foram removidos do estudo devido à mortalidade nos dias 13, 20 e 22. Um destes porcos pertenceu ao trata- mento 1, e os outros 2 porcos ao tratamento 4. Estes porcos foram previamente tra- tados quanto aos problemas respiratórios não relacionados aos tratamentos de di- eta.

[058]Os dados deste estudo foram analisados como um projeto de bloqueio completo randomizado, usando o procedimento MIXED de SAS. Bloqueio foi usado como um efeito aleatório no modelo. A análise de resíduos para os dados de de- sempenho mostrou distribuição normal e nenhum animal fora do cercado foi detec- tado. Análise de dados sanguíneos de resíduos mostrou 16 registros (2 % do total) como animais fora do cercado (3 vezes a distância interquartílica além do primeiro e terceiro quartil), e foram excluídos da análise. A análise de animais fora do cercado por distância interquartílica como uma referência usa tanto uma medição de escala quanto pontos de localização que não são facilmente influenciados por observações extremas. As 4 variáveis seguintes tiveram que ser transformadas para obter distri- buição normal dos dados: BUN (x3), CPK (x-1), globulina e SGOT (x-2). Dados trans- formados foram analisados usando o procedimento GLIMMIX de SAS, seguindo o mesmo projeto experimental; estes meios de tratamento e seus erros padrão foram transformados reversos às suas unidades originais para relatar propósitos. Análises polinomiais lineares, quadráticas, e cúbicas foram incluídas para avaliar o efeito de aumentar as inclusões de massa celular de Corynebacterium de dieta. Comparações aos pares foram incluídas para comparações de tratamento individuais.

[059]O desempenho do porco (BW, ADG, ADFI, e G:F) neste estudo mos- trou uma resposta dependente de dose negativa à inclusão crescente de massa ce- lular de Corynebacterium de dieta (efeito linear, P < 0,001) durante os 35 dias no estudo como mostrado na Tabela 13.

Tabela 13. Desempenho cumulativo do porco do dia 0 ao dia 35.

Inclusão de massa celular de Corynebacterium de dieta 10 Item 0% 5% 7,5 % % EM ADG, 0,61 0,567 0,532 0,47 kg/d* 6a ab b 4c ,021 ADFI, 0,80 0,784 0,733 0,68 kg/d* 8a ab bc 2c ,030 G:F, 763a 724b 726b 695c g/kg* * Efeito linear, P<0,001. abc Dentro de fileiras, meios de tratamento com sobrescrito diferente diferem (P<0,05).

[060]Como mostrado na Tabela 14, a inclusão da massa celular de Coryne- bacterium da presente invenção em 5 % da dieta reduziu (P<0,01) ADG dos dias 0 a 7 em 24 %, quando comparado aos porcos alimentado com a dieta de controle (0 % de massa celular de Corynebacterium), mas nenhuma outra diferença foi detectada em ADG entre porcos alimentados com a dieta de controle vs. 5 % de massa celular de Corynebacterium. Ao contrário, a inclusão de massa celular de Corynebacterium em 7,5 % ou 10 % da dieta reduziu (P<0,05) ADG em toda fase do estudo, quando comparado a porcos alimentados com a dieta de controle. O ADFI entre porcos ali- mentados 0 vs. 5 % da massa celular de Corynebacterium não diferiu. Entretanto, entre estes 2 tratamentos, G:F cumulativa em todo ponto no tempo foi mais baixa (P>0,01) em porcos alimentados com 5 % da massa celular de Corynebacterium.

Doses maiores (7,5 ou 10 %) de massa celular de Corynebacterium de dieta reduzi- ram ainda mais o ADFI e G:F, quando comparado a porcos alimentados com a dieta de controle.

Tabela 14. Meios LS de desempenho do porco neste exemplo. Treatment number 1 2 3 4 Overall trt Contrast p-values Pairwise p-values

SEM Corynebacterium cell mass 0% 5% 7.5% 10% p-values Linear Quadratic Cubic 1 vs 2 1 vs 3 1 vs 4 2 vs 3 2 vs 4 3 vs 4 Body weights, kg day 0 6.9 6.8 6.8 6.9 0.3 day 7 9.7 9.0 8.9 8.7 0.4 0.001 <0.001 0.189 0.448 0.002 0.001 <0.001 0.869 0.289 0.366 day 15 13.3 12.3 12.0 11.4 0.6 0.001 <0.001 0.946 0.626 0.016 0.003 <0.001 0.429 0.025 0.114 day 21 17.1 15.8 15.2 14.3 0.7 0.001 <0.001 0.756 0.939 0.038 0.003 <0.001 0.235 0.015 0.156 day 28 22.5 20.9 19.9 18.8 0.9 <0.001 <0.001 0.559 0.981 0.016 <0.001 <0.001 0.101 0.002 0.071 day 35 28.7 26.6 25.4 23.9 1.0 <0.001 <0.001 0.553 0.907 0.010 <0.001 <0.001 0.113 0.002 0.050 Weight gain, kg/hd/d days 0-7 0.406 0.308 0.302 0.270 0.023 0.001 <0.001 0.338 0.440 0.004 0.002 <0.001 0.844 0.199 0.271 days 7-15 0.446 0.421 0.390 0.331 0.022 0.002 <0.001 0.093 0.830 0.337 0.036 <0.001 0.209 0.002 0.030 days 15-21 0.615 0.585 0.518 0.478 0.035 0.033 0.006 0.420 0.586 0.517 0.049 0.009 0.159 0.032 0.394 days 21-28 0.764 0.724 0.680 0.614 0.026 <0.001 <0.001 0.113 0.934 0.141 0.006 <0.001 0.113 0.001 0.025 days 28-35 0.895 0.820 0.791 0.734 0.027 0.005 0.001 0.735 0.713 0.064 0.015 0.001 0.457 0.036 0.146 days 7-21 0.518 0.492 0.445 0.392 0.025 0.003 <0.001 0.154 0.812 0.369 0.021 0.001 0.121 0.003 0.086 days 0-21 0.481 0.430 0.397 0.351 0.023 0.002 <0.001 0.465 0.904 0.078 0.007 <0.001 0.231 0.009 0.100 days 21-35 0.763 0.716 0.670 0.613 0.024 0.001 <0.001 0.243 0.970 0.123 0.006 <0.001 0.133 0.003 0.063 days 7-35 0.670 0.632 0.590 0.528 0.022 0.000 <0.001 0.116 0.930 0.151 0.006 <0.001 0.120 0.001 0.026 days 0-35 0.616 0.567 0.532 0.474 0.021 0.000 <0.001 0.228 0.771 0.061 0.004 <0.001 0.178 0.002 0.029 Feed intake, kg/hd/d days 0-7 0.436 0.406 0.375 0.371 0.024 0.105 0.018 0.907 0.596 0.290 0.043 0.032 0.282 0.222 0.878 days 7-15 0.600 0.570 0.541 0.486 0.029 0.010 0.002 0.226 0.823 0.338 0.067 0.002 0.342 0.012 0.081 days 15-21 0.761 0.759 0.694 0.645 0.037 0.042 0.012 0.176 0.575 0.968 0.133 0.015 0.143 0.017 0.270 days 21-28 0.996 0.971 0.905 0.877 0.038 0.012 0.002 0.398 0.399 0.473 0.018 0.004 0.075 0.016 0.438 days 28-35 1.305 1.242 1.174 1.110 0.041 0.007 0.001 0.448 0.815 0.213 0.017 0.001 0.183 0.016 0.211 days 7-21 0.668 0.651 0.607 0.552 0.032 0.015 0.003 0.164 0.865 0.611 0.083 0.003 0.200 0.009 0.123 days 0-21 0.591 0.569 0.529 0.491 0.028 0.019 0.003 0.291 0.780 0.478 0.055 0.004 0.196 0.018 0.210 days 21-35 1.029 1.002 0.936 0.884 0.035 0.005 0.001 0.211 0.586 0.464 0.021 0.001 0.090 0.006 0.182 days 7-35 0.904 0.879 0.823 0.764 0.033 0.003 0.001 0.138 0.755 0.459 0.027 0.001 0.112 0.003 0.095 days 0-35 0.808 0.784 0.733 0.682 0.030 0.005 0.001 0.171 0.749 0.444 0.028 0.001 0.122 0.005 0.117 Gain:feed, g/kg days 0-7 929 758 802 726 24 <0.001 <0.001 0.158 0.028 <0.001 0.002 <0.001 0.217 0.366 0.042 days 7-15 744 739 719 682 14 0.028 0.009 0.113 0.939 0.816 0.223 0.007 0.318 0.012 0.086 days 15-21 811 768 742 742 19 0.076 0.013 0.568 0.669 0.138 0.024 0.025 0.357 0.367 0.985 days 21-28 768 747 754 701 16 0.022 0.009 0.178 0.171 0.307 0.473 0.004 0.752 0.033 0.018 days 28-35 687 662 673 661 11 0.253 0.115 0.552 0.262 0.092 0.352 0.085 0.414 0.965 0.391 days 7-21 777 754 731 711 11 0.003 <0.001 0.490 0.749 0.153 0.008 0.001 0.139 0.012 0.215 days 0-21 815 755 748 715 11 0.000 <0.001 0.726 0.305 0.002 0.001 0.001 0.675 0.024 0.056 days 21-35 742 715 716 693 7 0.001 <0.001 0.760 0.153 0.010 0.013 0.001 0.909 0.028 0.022 days 7-35 742 720 717 691 7 0.001 <0.001 0.381 0.258 0.037 0.021 0.001 0.771 0.010 0.019 days 0-35 763 724 726 695 7 0.000 <0.001 0.871 0.083 0.002 0.003 0.001 0.849 0.013 0.009 ADM Animal Nutrition Research - S13101

[061]Como mostrado na Tabela 15, nenhuma diferença foi detectada entre tratamentos para os parâmetros sanguíneos seguintes: cálcio, fósforo, creatina fos- focinase, glicose, lactato desidrogenase, e proteína total. Quando comparada contra porcos alimentados com a dieta de controle, a inclusão da massa celular de Coryne- bacterium em 5 % da dieta reduziu (P<0,001) nitrogênio ureico no sangue, e a mag-

nitude desta diferença aumentou conforme níveis crescentes da massa celular de Corynebacterium foram alimentados. Ao contrário, porcos alimentados com 5 % de massa celular de Corynebacterium tiveram mais colesterol (P<0,01), mas doses maiores de massa celular de Corynebacterium não o aumentaram mais. A concen- tração de creatinina sérica diminuiu (P<0,01) em porcos alimentados com 7,5 ou 10 % de massa celular de Corynebacterium, ao passo que albumina, potássio e sódio diminuíram (P<0,05) apenas em porcos alimentados com 10 % de massa celular de Corynebacterium, quando comparado àqueles alimentados sem a mesma. Entretan- to, todos os constituintes sanguíneos estavam dentro de faixas normalmente obser- vadas.

Tabela 15. Meios LS de parâmetros sanguíneos. Treatment number 1 2 3 4 Overall trt Contrast p-values Pairwise p-values

SEM Corynebacterium cell mass 0% 5% 7.5% 10% p-values Linear Quadratic Cubic 1 vs 2 1 vs 3 1 vs 4 2 vs 3 2 vs 4 3 vs 4 Body weights, kg day 0 6.9 6.8 6.8 6.9 0.3 day 7 9.7 9.0 8.9 8.7 0.4 0.001 <0.001 0.189 0.448 0.002 0.001 <0.001 0.869 0.289 0.366 day 15 13.3 12.3 12.0 11.4 0.6 0.001 <0.001 0.946 0.626 0.016 0.003 <0.001 0.429 0.025 0.114 day 21 17.1 15.8 15.2 14.3 0.7 0.001 <0.001 0.756 0.939 0.038 0.003 <0.001 0.235 0.015 0.156 day 28 22.5 20.9 19.9 18.8 0.9 <0.001 <0.001 0.559 0.981 0.016 <0.001 <0.001 0.101 0.002 0.071 day 35 28.7 26.6 25.4 23.9 1.0 <0.001 <0.001 0.553 0.907 0.010 <0.001 <0.001 0.113 0.002 0.050 Weight gain, kg/hd/d days 0-7 0.406 0.308 0.302 0.270 0.023 0.001 <0.001 0.338 0.440 0.004 0.002 <0.001 0.844 0.199 0.271 days 7-15 0.446 0.421 0.390 0.331 0.022 0.002 <0.001 0.093 0.830 0.337 0.036 <0.001 0.209 0.002 0.030 days 15-21 0.615 0.585 0.518 0.478 0.035 0.033 0.006 0.420 0.586 0.517 0.049 0.009 0.159 0.032 0.394 days 21-28 0.764 0.724 0.680 0.614 0.026 <0.001 <0.001 0.113 0.934 0.141 0.006 <0.001 0.113 0.001 0.025 days 28-35 0.895 0.820 0.791 0.734 0.027 0.005 0.001 0.735 0.713 0.064 0.015 0.001 0.457 0.036 0.146 days 7-21 0.518 0.492 0.445 0.392 0.025 0.003 <0.001 0.154 0.812 0.369 0.021 0.001 0.121 0.003 0.086 days 0-21 0.481 0.430 0.397 0.351 0.023 0.002 <0.001 0.465 0.904 0.078 0.007 <0.001 0.231 0.009 0.100 days 21-35 0.763 0.716 0.670 0.613 0.024 0.001 <0.001 0.243 0.970 0.123 0.006 <0.001 0.133 0.003 0.063 days 7-35 0.670 0.632 0.590 0.528 0.022 0.000 <0.001 0.116 0.930 0.151 0.006 <0.001 0.120 0.001 0.026 days 0-35 0.616 0.567 0.532 0.474 0.021 0.000 <0.001 0.228 0.771 0.061 0.004 <0.001 0.178 0.002 0.029 Feed intake, kg/hd/d days 0-7 0.436 0.406 0.375 0.371 0.024 0.105 0.018 0.907 0.596 0.290 0.043 0.032 0.282 0.222 0.878 days 7-15 0.600 0.570 0.541 0.486 0.029 0.010 0.002 0.226 0.823 0.338 0.067 0.002 0.342 0.012 0.081 days 15-21 0.761 0.759 0.694 0.645 0.037 0.042 0.012 0.176 0.575 0.968 0.133 0.015 0.143 0.017 0.270 days 21-28 0.996 0.971 0.905 0.877 0.038 0.012 0.002 0.398 0.399 0.473 0.018 0.004 0.075 0.016 0.438 days 28-35 1.305 1.242 1.174 1.110 0.041 0.007 0.001 0.448 0.815 0.213 0.017 0.001 0.183 0.016 0.211 days 7-21 0.668 0.651 0.607 0.552 0.032 0.015 0.003 0.164 0.865 0.611 0.083 0.003 0.200 0.009 0.123 days 0-21 0.591 0.569 0.529 0.491 0.028 0.019 0.003 0.291 0.780 0.478 0.055 0.004 0.196 0.018 0.210 days 21-35 1.029 1.002 0.936 0.884 0.035 0.005 0.001 0.211 0.586 0.464 0.021 0.001 0.090 0.006 0.182 days 7-35 0.904 0.879 0.823 0.764 0.033 0.003 0.001 0.138 0.755 0.459 0.027 0.001 0.112 0.003 0.095 days 0-35 0.808 0.784 0.733 0.682 0.030 0.005 0.001 0.171 0.749 0.444 0.028 0.001 0.122 0.005 0.117 Gain:feed, g/kg days 0-7 929 758 802 726 24 <0.001 <0.001 0.158 0.028 <0.001 0.002 <0.001 0.217 0.366 0.042 days 7-15 744 739 719 682 14 0.028 0.009 0.113 0.939 0.816 0.223 0.007 0.318 0.012 0.086 days 15-21 811 768 742 742 19 0.076 0.013 0.568 0.669 0.138 0.024 0.025 0.357 0.367 0.985 days 21-28 768 747 754 701 16 0.022 0.009 0.178 0.171 0.307 0.473 0.004 0.752 0.033 0.018 days 28-35 687 662 673 661 11 0.253 0.115 0.552 0.262 0.092 0.352 0.085 0.414 0.965 0.391 days 7-21 777 754 731 711 11 0.003 <0.001 0.490 0.749 0.153 0.008 0.001 0.139 0.012 0.215 days 0-21 815 755 748 715 11 0.000 <0.001 0.726 0.305 0.002 0.001 0.001 0.675 0.024 0.056 days 21-35 742 715 716 693 7 0.001 <0.001 0.760 0.153 0.010 0.013 0.001 0.909 0.028 0.022 days 7-35 742 720 717 691 7 0.001 <0.001 0.381 0.258 0.037 0.021 0.001 0.771 0.010 0.019 days 0-35 763 724 726 695 7 0.000 <0.001 0.871 0.083 0.002 0.003 0.001 0.849 0.013 0.009 ADM Animal Nutrition Research - S13101 O efeito negativo da massa celular de Corynebacterium sobre o desempenho do porco diminuiu com o passar do tempo. Por exemplo, a inclusão de dieta de massa celular de Corynebacterium na dose mais baixa (5 %) teve um efeito negativo inicial sobre ADG e G:F (dias 0 a 7), mas nenhuma outra diferença foi detectada entre por- cos alimentados com 0 vs. 5 % de massa celular de Corynebacterium durante os períodos de tempo individuais seguintes, dias 7 a 15, 15 a 21, 21 a 28, e 28 a 35.

Similarmente, a diferença relativa no desempenho entre porcos alimentados com 0 vs. 10 % de massa celular de Corynebacterium diminuiu com o passar do tempo. De fato, nenhuma diferença entre tratamentos foi detectada em G:F dos dias 28 a 35.

Como as especificações nutricionais de massa celular de Corynebacterium foram derivadas de espécies de rápido crescimento, é possível que a concentração de qualquer um, ou tanto aminoácidos ME quanto SID tenha sido superestimada. Por- cos de viveiro são muito sensíveis a concentrações de energia e aminoácidos na dieta, principalmente por causa das limitações físicas para a entrada de alimentação.

Uma diluição tanto dos aminoácidos ME quanto SID na dieta, conforme mais massa celular de Corynebacterium foi incluída, pode ajudar a explicar os efeitos sobre os parâmetros de desempenho e sanguíneos.

[062]Este exemplo indicou que concentrações crescente de massa celular de Corynebacterium de dieta reduziram o desempenho do porco em uma forma de- pendente de dose. A redução na taxa de crescimento foi conduzida por perda na eficiência de alimentação, e em um grau menor por entrada de alimentação reduzi- da; estes efeitos foram reduzidos conforme os porcos amadureceram. Tratamentos de dieta também afetaram alguns parâmetros sanguíneos. Estes resultados sugerem que as especificações nutricionais de massa celular de Corynebacterium foram pos- sivelmente superestimadas para porcos, visto que eles foram derivados da pesquisa de espécie de rápido crescimento.

Exemplo 8. Efeito de alimentar massa celular de Corynebacterium a peixes.

[063]Um estudo de alimentação de 8 semanas foi realizado para avaliar a resposta de tilapia alimentada com produtos de biomassa de lisina (isto é, massa celular de Corynebacterium). As dietas de estudo incluíram as massas celulares pro-

cessadas da presente invenção (processadas como descrito na Tabela 16) em 10 % de peso seco, 87 % de peso seco de uma formulação de peixe-gato comercial (dis- ponível da Rangen, Inc. of Angelton, TX) tendo 32 % de proteína bruta, e 3 % de peso seco de carboximetil celulose. A massa celular, a formulação de peixe-gato comercial, e a carboximetil celulose foram completamente misturadas na forma seca, água foi adicionada, a farinha resultante foi processada através de uma máquina para moer carne para produzir pelotas de 3 mm, e as pelotas foram secas por ar for- çado até menos do que 10 % de umidade em peso.

[064]O estudo foi conduzido em aquários de 38 L oeprando em um modo de recirculação usando Oreochromis niloticus jovem, de crescimento rápido com um peso médio inicial de 4,2 g/peixe. A temperatura foi mantida a 28 °C, +/- 1 °C, condi- cionando-se ar ambiente. Uma taxa de fluxo de água através do sistema de cultura foi suficiente para manter a qualidade de água ideal. Um sistema de filtração de areia também foi usado para remover o material particulado e resíduos nitrogenosos foram removidos com um biofiltro. Aeração suplementar foi usada para manter níveis de oxigênio dissolvido próximos à saturação e outros parâmetros de qualidade da água foram rotineiramente monitorados para mantê-los em níveis aceitáveis. Um ciclo de luz/escuridão de 12 h/12 h foi mantido com luzes fluorescentes controladas por temporizadores.

[065]Cada estudo de dieta foi alimentado a grupos em triplicata de 15 peixes por aquário em uma taxa que se aproxima da saciedade aparente duas vezes diari- amente por 8 semanas. Ganho de peso (% de peso inicial), eficiência de alimenta- ção, e sobrevivência foram monitorados pesando-se em grupo os peixes toda sema- na por todo o estudo.

[066]No final do estudo, os peixes foram pesados. Três peixes por aquário foram usados para obter uma amostra de plasma mista por tanque e as amostras de plasma foram analisadas quanto o painel de animal pequeno de medições químicas.

Três peixe adicionais por aquário foram usados para dissecar sua amostra hepática de modo a medir o índice hepatossomático (razão de peso do fígado/peso corpóreo) como conhecido na técnica.

[067]Para os estudos deste exemplo, procedimentos estatísticos apropriados foram aplicados usando o modelo linear geral do sistema de análise estatística. Os aquários/tanques individuais foram a unidade básica de observação para toda a aná- lise estatística. Os resultados deste estudo e como a massa celular de Corynebacte- rium alimentada ao peixe foi processada são mostrados na Tabela 16.

Tabela 16. Razão da eficiên- Ganho cia de alimentação Índice Hepatos- Sobrevivência Dieta de pe- (gramas ganha- somático (%) (%) so (%) dos/gramas ali- mentados) Controle (formulação co- 301 0,54 2,31 84 mercial) Células secas por pulverização, 304 0,51 2,23 80 mortas + contro- le Células secas por tambor, mor- 332 0,54 2,24 73 tas + controle Células secas por tambor, não 247 0,45 2,10 84 mortas + contro- le Células secas por pulverização, 303 0,51 2,30 82 rompidas, mor- tas + controle Células secas por tambor, 316 0,53 2,49 76 rompidas, mor- tas + controle Células secas 331 0,57 1,93 93 por tambor, rompidas, não mortas + contro- le Células secas por pulverização, tratadas com 313 0,51 2,26 78 enzima, mortas + controle Células secas por tambor, tra- tadas com enzi- 339 0,55 2,25 84 ma, mortas + controle Células secas por tambor, tra- tadas com enzi- 256 0,46 2,22 78 ma, não mortas + controle Valor de P 0,295 0,040 0,256 0,406 PSE 15,7 0,01 0,07 3,2

[068]A presente invenção foi descrita com referência a certas formas de rea- lização exemplares e ilustrativas, composições e usos destas. Entretanto, será reco- nhecido por pessoas tendo habilidade comum na técnica que várias substituições, modificações ou combinações de qualquer uma das formas de realização exempla- res podem ser feitas sem divergir do escopo da invenção. Assim, a invenção não é limitada pela descrição das formas de realização exemplares e ilustrativas, mas pre- ferivelmente, pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de alimentar um animal CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: alimentar uma massa celular rompida a um animal em uma quantidade de pelo menos 0,5% da dieta do animal, compreende ainda romper a massa celular obtida de um processo de fer- mentação, produzindo assim a massa celular rompida, em que romper a massa celular compreende uma ação de rompimento físico selecionada a partir do grupo que consiste em sonificação, homogeneização, impac- to, batimento com pérolas, gradiente de alta pressão, aquecimento em autoclave, aquecimento, congelamento, congelamento/descongelamento, prensa francesa, al- calinização, acidificação, tratamento com um tensoativo, tratamento com um agente quelante ou combinações de qualquer um destes.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a massa celular compreende células de uma origem de Corynebacterium.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal é um peixe.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em aves domésticas, suí- no e um ruminante.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda separar células integrais de um processo de fermentação, produzindo assim a massa celular.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a ação compreende o tratamento enzimático.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a ação compreende o tratamento enzimático e o tratamento físico.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento físico compreende aquecimento, ajuste de pH ou uma combinação destes.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda secar a massa celular rompida.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a densificação da massa celular rompida.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a massa celular rompida é alimentada ao animal em uma quantidade de 0,5 a 20% em peso da dieta do animal.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a massa celular rompida é alimentada ao animal em uma quantidade de 1 a 15% em peso da dieta do animal.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a massa celular rompida é alimentada ao animal em uma quantidade de 2 a 10% em peso da dieta do animal.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a massa celular rompida é de um fungo, uma bactéria, uma levedura ou uma origem algácea.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a massa celular é de uma origem de Corynebacterium, uma origem de Brevi- bacterium, uma origem de Lactococcus, uma origem de Bacillus, uma origem de Candida, uma origem de Saccharomyces, uma origem de Aspergillus, uma origem de Schizosaccharomyces, uma origem de Escherichia, uma origem de Rhizopus, uma origem de Torulaspora, uma origem de Yarrowia, uma origem de Brettano- myces, uma origem de Zygosaccharomyces, uma origem de Actinomycetes, uma origem de Dietzia, origem de Bifidobacterium ou combinações de qualquer uma des-

tas.