KR100431359B1 - 고농도의 아스타산틴을 생산하는 돌연변이 균주 파피아로도지마 및 이 균주의 발효 배양 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적색 천연 색소 아스타산틴(astaxanthin)을 고농도로 생성 및 축적하는 능력을 갖는 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma) S2 및 S2-3 변이주를 제공하는 것이다. 한편으로는 상기 변이주를 발효 배양시켜 고농도의 아스타산틴을 발효 생성하는 방법에 관한 것이다.

Description

고농도의 아스타산틴을 생산하는 돌연변이 균주 파피아 로도지마 및 이 균주의 발효 배양 방법{Mutant of Phaffia rhodozyma producing astaxanthin and fermentation method thereof}

본 발명은 아스타산틴 생산성이 높은 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma) 돌연변이 균주, 이 균주의 분리방법 및 이 돌연변이주를 배양하여 아스타산틴 색소를 발효 제조하는 방법에 관한 것이다.

아스타산틴은 비타민 A의 전구물질인 베타카로틴으로 대표되는 카로티노이드에 속하는 물질로서, 자연계에 많이 분포되어 있으며 갑각류, 송어 및 연어의 주요색소이다. 연어, 송어, 새우등은 아스타산틴을 생합성할 수 없고, 먹이사슬에 의하여 섭취하게 된다. 따라서 이들을 양식하는 경우 사료에 색소를 첨가하여야 상품가치의 주요한 척도가 되는 착색효과를 볼 수 있다.

이 색소는 주홍색을 띠고 있으며 소비자의 눈길을 끌게 하고 좋은 향미를 제공할 뿐만 아니라 영양상의 중요한 역할을 한다. 카로티노이드는 동물뿐만 아니라 사람에게도 중요한 생리대사적 역할을 가지고 있는데 비타민 A의 전구체, 면역기능의 활성화, 산소 라디칼의 제거에 의한 암, 노화의 예방효과 등이 알려져 있다. 아스타산틴은 다른 카로티노이드나 토코페롤보다도 뛰어난 항산화 효과를 보이고 있는 것이 증명되어 식용색소로 뿐만 아니라 의약적으로도 중요한 용도를 지니는 것으로 전망된다.

아스타산틴을 생산하는 방법은 대체로 다섯가지 방법으로 분류할 수 있다.

첫번째 방법으로 현재 Hoffman LaRoche사에서 사용하고 있는 화학적 합성법은 산업적으로 응용, 생산되고 있으나 식품첨가제로서 화학물질의 안전성에 대한 규제강화와 천연 아스타산틴에 비해 저조한 흡수 때문에 천연 카로티노이드 생산방식이 선호되고 있다. 두번째는 게나 새우등 갑각류의 껍질로부터 생산하는 방법으로 높은 회분과 키틴 함량으로 사용에 제한을 받고 있으며 공해를 유발하는 큰 단점이 있다. 세번째 방법은 미세조류인 헤마토코커스 플루비알리스(Hamatococcus pluvialis)로부터의 생산으로 높은 수준의 아스타산틴(0.2∼2%)을 생산하지만 오랜 기간 동안 연못에서 배양해야 하고 생산 후에 색소를 균체로부터 추출해야 하는 점 및 거대한 연못이 필요하다는 문제점을 갖고 있다. 네번째 방법은 해양 미생물인 아그로박테리움(Agrobacterium)으로부터의 생산으로 현재는 이 미생물 자체로부터 생산하는 방식보다는 이의 유전자를 이용하여 사카로마이시스 세레비지에(Saccharomyces cerevisae)로부터 색소를 생산하는 방식을 시도하고 있다. 그러나 이 방법은 색소함량이 저조한 문제가 남아 있다. 마지막 다섯번째 방법은 붉은 효모 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma)로부터의 생산이다.

1970년대 초반 일본과 알래스카 산악지역에 낙엽수의 수액으로부터 발견되어, 그 붉은색이 아스타산틴으로 확인되어 지면서 산업적으로 주목 받아온 파피아 로도지마는 포도당과 다른 당들을 발효 시키고, 다른 카로티노이드 합성 효모와 비교하여 매우 호기성이며, 단백질, 지질, 비타민 B등 필수 영양분이 풍부하며, 주 카로티노이드로서 아스타산틴을 합성할 뿐만 아니라 효모자체가 물고기의 영양분이 되므로 효모로부터 색소를 추출할 필요가 없고 조류에 비하여 성장속도가 빠른 장점이 있다.

이와 같은 많은 장점들로 인해 현 기술 상태에서 천연색소로서의 아스타산틴의 가장 유리한 생산방법은 파피아 로도지마로부터의 생산방법으로 판단된다.

한편, 파피아 로도지마는 다른 효모에 비해 낮은 온도에서 자라기 때문에, 타 미생물에 비해 장기간의 배양이 필요하고, 많은 양의 아스타산틴 색소는 파피아 로도지마의 성장이 멈춘 뒤에 축적되어 배양 중 저온 유지와 산소 공급에 많은 비용이 소모되므로, 이에 따른 비용 감축 연구가 필요한 실정이다.

또한 파피아 로도지마 자연균주는 매우 적은 양의 아스타산틴(0.1∼0.3mg/g yeast)을 생산하기 때문에 산업적 사용에 있어 실용적, 경제적이지 못하므로, 색소를 대량 생산할 수 있는 돌연변이 균주 개발이 필요하다. 따라서, 지금까지 많은연구자들에 의하여 파피아 로도지마의 돌연변이 균주에 관한 연구가 진행되어왔으며, 또한 국내외에 이에 관한 특허들이 개시되어 있다.

그러나, 기존에 개시된 특허 균주들의 대부분이 상품화에 성공하지 못했는데, 그 이유는 먼저, 이들 돌연변이 균주들이 아스타산틴을 상업화하기에 충분할 정도로 대형 발효조에서 발효 배양이 어렵다는 점을 들 수 있으며 두번째로 또한 이들 파피아 로도지마 균주가 배양에 상당한 시간을 필요로 한다는 점과 세번째로는 돌연변이 균주의 대부분이 자연 균주보다 균체 수율이 떨어진다는 점을 들 수 있다.

일반적으로 자연 미생물의 돌연변이 균주는 연속적인 계대 배양시, 세대수가 진행되어감에 따라 자연 상태의 균주로 퇴행되는 성질을 갖고 있다. 이 때문에 소량의 플라스크 배양, 이에서 이어지는 소형 발효조, 그리고 대형 발효조로의 배양에서 세대수가 늘어가면서 중간에 자연 균주로 퇴행되는 현상이 발생한다.

이러한 현상은 굳이 대형 발효조를 사용하지 않더라도 소형 발효조에서 돌연변이 균주를 연속식 발효 배양 방법을 이용하여, 15일 이상 배양하면 원래의 자연 상태 균주로 퇴행되는지 관찰함으로써 쉽게 알 수 있다. 또한, 파피아 로도지마 야생 균주는 고온에서는 아스타산틴 색소 생산량이 떨어지고, 색소는 일단 균주가완전히 성장한 후에야 비로소 축적되므로, 상대적으로 생육이 늦어지는 저온 조건에서 오랫동안 배양해야만 한다. 따라서, 기타 효모 균주들보다 발효 생산에 더 많은 비용이 필요하므로 배양 시간의 단축이 절실한 실정이다. 또한 일반적으로 돌연변이 균주는 야생 균주 보다 생육도 더 늦고, 균체 수율도 더 낮다.

상기한 이유들로 인하여, 종래에 특허에 개시된 아스타산틴을 생산하는 파피아 로도지마 돌연변이 균주들은 상당수가 상업화에 성공하지 못했다.

따라서, 본 발명자들은 색소의 생산량이 증가되었을 뿐만 아니라, 위에서 언급한 문제점을 극복한 돌연변이 균주를 개발하게 되었다.

따라서 본 발명이 이루고자하는 기술적 과제는 아스타산틴을 대량 발효 생산할 수 있는 파피아 로도지마 돌연변이주를 개발한 것이다. 본 발명의 변이주는 연속적인 배양조건 하에서도 야생 균주형으로 퇴행되지 않으며, 발효 배양에 많은 시간을 소요하지 않고 높은 수율로 아스타산틴 색소를 생성시킬 수 있는 균주인 것이다.

도 1은 아스타산틴의 생합성 과정을 나타낸다.

도 2는 파피아 로도지마(ATCC-96594) (A) 및 본 발명의 돌연변이 균주 파피아 로도지마 S2(KCTC-0920BP) (B)의 400배 확대한 현미경 사진이다.

도 3은 파피아 로도지마 S2(KCTC-0920BP)에서 추출한 색소의 HPLC 분석도이다.

본 발명의 목적은 천연 아스타산틴 색소를 대량으로 생산하고, 안정성이 뛰어난 돌연변이 균주를 개발 제공하고, 상기 돌연변이 균주를 발효 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명은 파피아 로도지마 ATCC-96594 균주를 YM 액체배지에서 배양한 후 1-메틸-3-니트로-1-니트로소구아니딘(NTG)로 처리하여 효모를 98% 정도 사멸시킨 후, 생존한 효모를 YM(yeast-malto) 고체배지에 희석 도말 배양하여 생성된 콜로니 중 모균주 보다 성장이 빠르며 윤기가 있고 붉은색이 짙은 균주들을 선별하고, YM 고체배지에서 선별과정을 수회 반복하고 분리된 균주들을 YM 액체배지에서 4∼6일 동안 배양한 후, 균체량 및 총 카로티노이드 색소 함량을 측정하고 색소 생산성이 가장 높은 균주를 선별함을 특징으로 하는 아스타산틴을 고농도로 생성시키는 파피아 로도지마 변이주의 분리 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 방법에 의해 분리된 아스타산틴을 고농도로 생성시키는 파피아 로도지마 S2 변이주(KCTC-0920BP)와 파피아 로도지마 S2-3 변이주(KCTC-0921BP)를 제공하는 것이다.

한편 상기 파피아 로도지마 변이주를 질소 함량이 0.5%이상인 액체 발효배지에서 공기와 산소 비율을 20∼5 : 1로 혼합하여 4∼6vvm 통기속도로 흡입하면서 회분식으로 발효 배양시킴을 특징으로 하는 아스타산틴을 고농도 고수율로 발효 생성하는 방법을 제공하며, 이때 상기 발효배지는 포도당 5∼15g/L, 씨에스엘 8∼11g/L, 효모추출물 2∼4g/L, 인산제1칼륨, 황산마그네슘, 황산구리, 염화칼슘, 황산아연 등을 미량 포함하는 배지임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 개량된 돌연변이 효모 균주들은 다음과 같은 방법으로 분리될 수 있다.

파피아 로도지마 ATCC-96594 균주를 YM 액체배지(0.3% 효모추출물, 0.3% 맥아추출물, 0.5% 펩톤, 1.0% 포도당)에서 배양한 후 1-메틸-3-니트로-1-니트로소구아니딘(1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine(NTG))로 처리하여 효모를 사멸시킨다. 이때, NTG의 농도, 처리온도 및 처리시간에 따라 효모의 사멸률이 달라질 수 있으며, 사멸률에 따라 변이주를 얻는 확률이 달라지므로 이들 조건들을 적절히 조절하는데, 바람직하게는 사멸률이 98%가량이 되도록 조절한다. 생존한 효모를 YM(yeast-malto) 고체배지에 희석 도말한 후 배양하여 생성된 콜로니 중 모균주ATCC-96594 균주 보다 성장이 빠르며 윤기가 있고 붉은색이 짙은 균주들을 모두 선별한다. 순수한 콜로니를 얻기 위해 YM 고체배지에서 선별과정을 수회 반복한다. 이렇게 해서 얻은 균주들을 YM 액체배지에서 5일 동안 배양한 후, 균체량 및 총 카로티노이드 색소 함량을 측정하고 색소 생산성이 가장 높은 균주를 선별한다.

이렇게 선별된 균주들 중에서 본 발명 균주의 배양을 위해 특별히 고안된 발효배지 5L에서, 15일 이상 연속식 발효 배양을 실시하여, 배양 시간에 관계없이 균체 수율과 색소 함량이 감소하지 않는 안정성 높은 균주를 선별한다.

상기 과정을 거쳐 선별된 균주들은 각각 파피아 로도지마 S2, S2-3로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자은행에 2000년 12월 21일 파피아 로도지마 S2는 기탁번호 KCTC-0920BP호로, 파피아 로도지마 S2-3는 기탁번호 KCTC-0921BP호로 기탁하였다.

상기 효모의 건조균체 중량 측정 방법은 다음과 같다.

파피아 로도지마 돌연변이 균주를 YM 액체배지에서 5일 동안 배양하고, 배양액을 660nm에서 흡광도를 측정하고 흡광도와 건조균체 중량간의 관계식에 대입함으로써 구한다.

또한 상기의 균주에서의 총 카로티노이드 추출 및 정량 방법은 당해 분야에 공지된 여러가지 방법을 사용할 수 있으나, 본 발명에서는 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)로 세포벽을 파괴하고, 아세톤과 석유 에테르, 그리고, 20% 염화나트륨 용액을 차례로 가한 후, 3000rpm에서 5분간 원심분리한다. 그 상층액의 474nm에서의 흡광도를 측정하여, 세포내에 함유된 총색소를 정량하였다.

상기에서 얻은 흡광도와 균체 중량으로부터 1% 흡광계수 값을 이용하여, 존슨 등의 방법으로 총 카로티노이드를 정량할 수 있다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 본 발명이 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) 아스타산틴 고생산성 돌연변이 균주의 분리

아스타산틴 고생산성 돌연변이 균주는 다음과 같이 분리하였다.

아스타산틴 고생산성 돌연변이주 개발을 위해 YM배지에서 파피아 로도지마ATCC-96594 균주를 중간 대수기까지 배양하여 멸균수로 2회 세척한 후, pH 5.5의 0.1M 구연산 완충용액에 균체수가 2∼5×10⁷/ml이 되도록 현탁하였다. 돌연변이 유도물질인 NTG를 0.1mg/ml의 농도로 첨가하여, 20분간 현탁배양한 후, 멸균수 및 0.1M 인산 완충 용액(pH7.0)으로 각각 1회 세척하고, YM배지에 현탁하여 20℃에서 12∼16시간 배양한 뒤, 멸균수로 희석하여 도말하였다. 20℃에서 7∼15일간 배양후 모균주보다 더 붉은 색의 균주를 육안 관찰에 의해 선별하였고, 수차례의 계대배양 및 색소함량 확인에 의해 아스타산틴 고생산성 변이주를 분리하였다.

상기 방법에 의하여 분리된 돌연변이 균주들을 5L의 발효배지(L당 포도당 10g, 씨에스엘(CSL) 9.6g, 효모추출물 3g, 펩톤 5g, 인산제1칼륨 0.6g, 황산 마그네슘 0.5g, 황산구리 0.25g, 염화칼슘 0.15g, 황산아연 0.03g, 티아민 0.02g, 바이오틴 0.0001g 포함)에서 교반속도 300rpm, 20℃, pH 5.0이 되도록 조절하고, 5vvm의 속도로 공기를 공급하면서 15일 이상 배양하여, 이중 균체 수율과 색소 함량이 떨어지지 않는 균주를 선별해냄으로써 안정한 돌연변이주를 분리하였다.

분리된 돌연변이 균주 S2, S2-3는 모두 공히 최적 생육온도가 20℃이며, 최적 pH가 5.0이다. 또한, 배양 5일째에 총 카로티노이드 색소 함량이 최대가 된다. 아래 실시예 3에 표시된 방법으로 측정한 각 균주들의 균체 수율은 S2가 5.0g/L, S2-3이 4.8g/L이었다.

한편 본 발명의 변이주와 동시에 그 유사한 성질을 나타내는 변이주 X1과 X2도 분리하였는바 이들의 균체 수율은 X1이 4.6g/L, X2가 4.6g/L이며, 각각의 색소 함량은 S2 9.2 mg/g, S2-3 8.5 mg/g, X1 6.5 mg/g, X2 7.1 mg/g이었다. 그리고 이것은 모균주 파피아 로도지마 ATCC-96594에 비해 적어도 20배 이상의 색소 생산성을 보이는 것이다.

한편, 돌연변이 균주 S2는 연속식 발효 배양을 실시하였을 때, 1개월 이상 균체 수율과 색소 생산성이 일정하였으며, S2-3은 24일간, X1은 18일간, 그리고 X2는 19일간 일정하였다.

(실시예 2) 미생물 균주의 동정

본 발명의 변이주의 균학적 성질을 친주인 파피아 로도지마 ATCC-96594와 비교하여 결과를 다음에 나타내었다.

성질	파피아 로도지마 ATCC-96594	S2 변이주KCTC-0920BP	S2-3 변이주KCTC-0921BP
1. 영양 세포의 형태	타원형	타원형	타원형
2. 최적 생육온도	20℃	20℃	20℃
3. 탄수화합물의 이용
말토스	+++	++	+++
갈락토스	-	-	-
락토스	++	++	+
라피노스	++	++	++
자일로스	++	++	-
자일리톨	++	++	+
아라비노스	+	+	+
트레할로스	++	+	++
구연산	+	-	-

+++ : 매우 잘 이용함, ++ : 잘 이용함, + : 약간 이용함, - : 이용 못함

본 발명의 변이주들은 모균주 파피아 로도지마 ATCC-96594보다 세포 크기가 작고, 위 표에서와 같이 여러가지 당 종류 중 일부에 있어 이용도에 차이를 보인다.

(실시예 3) 회분식 배양

상기 균주의 회분식 배양 방법은 다음과 같다.

파피아 로도지마 S2 돌연변이 균주를 1000ml 3-배플 플라스크안의 100ml YM 액체배지에서 20℃, 교반속도 200rpm으로 3일 동안 진탕 배양하여 균을 활성화시킨 후, 50L의 발효배지(L당 포도당 10g, 씨에스엘(CSL) 9.6g, 효모추출물 3g, 펩톤 5g, 인산제1칼륨 0.6g, 황산 마그네슘 0.5g, 황산구리 0.25g, 염화칼슘 0.15g, 황산아연 0.03g, 티아민 0.02g, 바이오틴 0.0001g 포함)에서 3일에서 5일 동안, 배지 내의 당이 완전히 소모되었을 때까지 배양한다. 이때, 교반속도 300rpm, 배양온도 20℃ 및 pH 5.0을 유지하면서, 간헐적으로 소포제를 첨가한다.

이 때, 배지 내에 질소가 0.5%이상 포함되어 있어야 세포성장에 무리가 없으며, 발효조 내에 공기와 산소를 10 : 1의 비율로 섞어서 5vvm의 속도로 공급할 경우 공기만 공급했을 때보다 균체 수율이 증가하는 현상을 보인다.

본 발명의 S2균주는 회분 발효시 공기만 공급해 줄 때, 6g/L의 건조 균체 수율과 9.0 mg/g의 아스타산틴을 포함한 총 카로티노이드 색소 생산 수율을 갖고 있다.

(실시예 4) 균주의 건조 중량 측정 및 색소추출

파피아 로도지마 S2의 색소추출은 균주들을 YM배지에서 5일간 배양하여 멸균수로 2회 세척한 후 물기를 제거하였다. 여기에 디메틸설폭사이드 1ml, 아세톤 1ml, 석유 에테르 1ml, 20% 염화 나트륨 용액 1ml를 각각 순차적으로 첨가하여 잘 교반한 후 3000rpm에서 5분간 원심분리하고, 상등액을 취하여 474nm에서 흡광도를 측정하였다.

다음 식에 의해 총 카로티노이드 색소 함량을 구했다.

총카로티노이드(mg/g yeast) = (상등액의 부피 × 474nm에서의 흡광도) / (0.21 × 균주의 건조 중량)

균체의 건조 중량은 파피아 로도지마 돌연변이 균주를 YM 액체배지에서 5일 동안 배양하고, 배양액의 660nm에서 흡광도를, 흡광도와 건조중량간의 관계식에 대입함으로써 구한다.

흡광도와 건조 중량간의 관계식을 얻는 방법은 다음과 같다.

파피아 로도지마 돌연변이 균주를 YM 액체배지에서 5일 동안 배양한 배양액을 농도별로 희석하여, 각각을 660nm에서 흡광도를 측정하고, 남은 나머지의 일정량을 여과지로 걸러서 105℃에서 24시간 건조하여 건조중량을 측정하고, 앞서 측정한 660nm에서의 흡광도와 건조균체 중량간의 관계식을 구한다.

(실시예 5) 색소의 HPLC분석

파피아 로도지마 S2를 YM배지 25ml이 들어있는 250ml 용량의 3-배플 플라스크에 접종하고, 20℃에서 5일간 진탕 배양하였다. 배양된 세포로부터 상기 실시예 2에서와 같이 색소를 추출하고, 0.2마이크론 여과지를 이용하여, 색소샘플 20ul를 취해 HPLC분석을 하였다. 이때 이용된 조건은 다음과 같다; 컬럼 : 실리카 컬럼, 용매 : 헥산 : 아세톤 = 80 : 20, 용출속도 : 1ml/min, 검출흡광도 : 476nm.

아스타산틴 및 베타카로틴의 용출시각은 각각 8분, 4분이었다. 본 발명의 파피아 로도지마 S2는 총색소 중 80%이상의 아스타산틴 함량을 갖는다.

본 발명의 효과는 야생 균주에 비해 높은 색소 생산성(9.2mg/g yeast)을 지니는 파피아 로도지마 돌연변이주를 제공하는 것이다. 이는 모균주인 파피아 로도지마 ATCC-96594에 비해 적어도 10배 이상 증가한 것으로, 본 발명 균주는 종래 개시된 색소 고생산성 돌연변이 균주들에 비해 월등히 높은 안정성을 갖는다.

Claims (5)

1. 파피아 로도지마 ATCC-96594 균주를 YM 액체배지에서 배양한 후 1-메틸-3-니트로-1-니트로소구아니딘(NTG)로 처리하여 효모를 98% 정도 사멸시킨 후, 생존한 효모를 YM(yeast-malto) 고체배지에 희석 도말 배양하여 생성된 콜로니 중 모균주 보다 성장이 빠르며 윤기가 있고 붉은색이 짙은 균주들을 선별하고, YM 고체배지에서 선별과정을 수회 반복하고 분리된 균주들을 YM 액체배지에서 4∼6일 동안 배양한 후, 균체량 및 총 카로티노이드 색소 함량을 측정하고 색소 생산성이 가장 높은 균주를 선별함이 특징인, 아스타산틴을 고농도로 생성하는 파피아 로도지마 변이주의 분리 방법
2. 제 1항의 방법에 의해 분리된 아스타산틴을 고농도로 생성시키는 파피아 로도지마 S2 변이주(KCTC-0920BP)
3. 삭제
4. 제 2항 또는 제 3항의 파피아 로도지마 변이주를 질소 함량이 0.5%이상인 액체 발효배지에서 공기와 산소 비율을 20∼5 : 1로 혼합하여 4∼6vvm 통기속도로 흡입하면서 회분식으로 발효 배양시킴을 특징으로 하는 아스타산틴을 고농도 고수율로 발효 생성하는 방법
5. 제 4항에 있어서, 상기 발효배지는 포도당 5∼15g/L, 씨에스엘 8∼11g/L, 효모추출물 2∼4g/L, 인산제1칼륨, 황산마그네슘, 황산구리, 염화칼슘, 황산아연 등을 미량 포함하는 배지임을 특징으로 하는 아스타산틴의 발효 생성 방법