KR100923105B1

KR100923105B1 - 아스타잔틴 추출이 용이한 파피아 로도지마 돌연변이주 및그 추출법

Info

Publication number: KR100923105B1
Application number: KR1020070105744A
Authority: KR
Inventors: 최의성; 전은경
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-10-19
Filing date: 2007-10-19
Publication date: 2009-10-22
Also published as: KR20090040122A

Abstract

본 발명은 체내 아스타잔틴 함량이 높은 파피아 로도지마 돌연변이주 및 그들로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법에 관한 발명이다.

아스타잔틴, 파피아 로도지마, 추출

Description

아스타잔틴 추출이 용이한 파피아 로도지마 돌연변이주 및 그 추출법{ Phaffia rhodozyma mutant strain and method of producing astaxanthin using thereof}

본 발명은 아스타잔틴 함량이 높은 돌연변이 파피아 로도지마 균주 및 이들에서 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법에 관한 발명이다.

아스타잔틴 (astaxanthin)은 베타-카로틴의 양쪽의 벤젠고리에 하이드록실기와 케톤기가 부가되어 있는 3,3‘-디히드록시-β,β-카로틴-4,4’-디온 (3,3'-dihydroxy-β,β-carotene-4,4'-dione)으로서 카로티노이드의 일종이며, 연어, 송어 등 어류와 새우, 게 등 갑각류에서 발견되는 주홍색 색소이다. 동물의 경우 아스타잔틴 생합성능이 없기 때문에 음식물 섭취에 의존하며 양식 어류나 갑각류의 경우 먹이사슬에 의한 아스타잔틴 생성 미생물의 섭취가 제한되므로 사료에 첨가해 주어야만 아스타잔틴이 착색된 상품을 생산할 수 있다. 아스타잔틴은 어류나 갑각류의 착색에 사용될 뿐만 아니라 강력한 항산화 활성을 가지고 있기 때문에 다양한 생리활성을 나타낸다. 즉, 위궤양에 대한 보호효과, 항암 효과, 항염증 효과, 항당뇨 효과, 각막 보호 효과, 근육피로 회복 효과, 자외선(UVA)으로부터 피부 보호 효과, 항고혈압 효과, 항동맥경화 효과 등이 보고되고 있다(Hussein G 등, Astaxanthin, a carotenoid with potential in human health and nutrition. J. Nat. Prod. 69, 443-449 (2006)). 또한 면역 증강 및 면역조절 능력에 의하여 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 크론씨 병 등의 자가면역 질환의 치료 효과, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 감염 방지, 살모넬라 감염 방지 효과 등도 보고되고 있다(Higuera-Ciapara I 등, Astaxanthin: a review of its chemistry and applications. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 46, 185-196 (2006)).

최근에는 새로운 아스타잔틴 생성 미생물을 분리하기 위한 노력이 경주되고 있어 브레비박테리움(Brevibacterium), 마이코박테리움 락티콜라 (Mycobacterium lacticola) (Neils HJ and DeLeenheer AP, Microbial sources of carotenoid pigments used in food and feeds. J Appl. Bacteriol. 70, 181-191 (1991)), 아그로박테리움 아우렌티쿰(Agrobacterium aurantiacum), 알칼리게네스 종 PC-1(Alcaligenes sp. PC-1)(Yokoyama A 등, Production of astaxanthin by the marine bacterium Agrobacterium aurantiacum. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 1842-1844 (1994)), 파라코커스 마르쿠시(Paracoccus marcusii) (Harker M 등, Paracoccus marcusii sp. nov., an orange Gram-negative coccus. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 543-548 (1998)), 파라코커스 카로티파신스(Paracoccus carotinifaciens) (Tsubokura A 등, Paracoccus carotinifaciens sp. nov. a new aerobic Gram-negative astaxanthin-producing bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 277-282 (1999)), 파라코커스 종 MBIC 01143 균주(Paracoccus sp. strain MBIC 01143)(Misawa N 등, Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthetic gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level. J. Bacteriol. 177, 6575-6584 (1995)), 브레분디모나스 종 SD212 균주(Brevundimonas sp., strain SD212) (Yokoyama A 등, New trihydroxy-keto-carotenoids isolated from an astaxanthin-producing marine bacterium. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 1842-1844 (1996)), 파라코커스 해운대시스(Paracoccus haeundaensis) (Lee JH 등, Paracoccus haeundaensis sp. nov., a Gram-negative, halophilic, astaxanthin-producing bacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 1699-1702 (2004)) 등이 보고되고 있다. 또한 이들은 아스타잔틴을 효율적으로 재조합 생산하는데 필요한 유전자 클로닝을 위한 자원으로도 사용되고 있다(Sieiro C 등, Genetic basis of microbial carotenogenesis. Int. Micriobiol. 6, 11-16 (2003)).

아스타잔틴의 상업적 생산은 현재까지 주로 화학합성에 의존해 왔으나 (Ernst H, Recent advances in industrial carotenoid synthesis. Pure Appl. Chem. 74, 1369-1382 (2002)) 소비자의 천연물에 대한 욕구와 법적 규제로 인하여 미생물에 의한 생산법이 점차 각광을 받고 있다. 아스타잔틴의 생합성은 미생물에 서만 발견되며 산업적 생산이 가능한 미생물 시스템으로서 미세조류인 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)(Johnson EA Int. Microbiol. 6, 169-174 (2003)) 및 효모인 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma) 가 알려져 있다.(Bhosale P and Bernstein PS, Microbial xanthophylls. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68: 445-455 (2005)). 그러나 헤마토코커스 플루비알리스 등 미세조류의 배양은 장기간 배양과 오염 문제가 심각하며 고비용 공정을 요한다. 이에 반해 효모인 파피아 로도지마는 상대적으로 발효가 용이하고 저비용 공정이지만 세포당 아스타잔틴 함량이 저조하고 세포벽이 단단하여 소화흡수가 어려운 문제점을 가지고 있다. 야생형 파피아 로도지마 균주는 건조균체 그람 당 아스타잔틴 함량이 약 0.3-0.5 mg 정도로 상당히 낮다.

아스타잔틴은 균체를 전처리하지 않은 상태로 동물에 공급하면 무지개 송어 (rainbow trout), 난황, 바닷가재 등에 침착되는 것을 제외하고는 (Johnson EA 등, J. Fish. Res. Board Can. 34, 2417-2421 (1977), Aquaculture 20, 123-134 (1980)) 기타 동물의 육질, 난, 갑각에 잘 침착되지 않으므로(Johnson EA 등, J. Fish. Res. Board Can. 34, 2417-2421 (1977)) 물리, 화학적 혹은 생물학적 방법으로 전처리 하여야한다.

따라서 파피아 로도지마로부터 아스타잔틴을 효과적으로 추출하기 위한 방법에도 많은 연구가 이루어져 왔다. 파피아 로도지마의 아스타잔틴 함량을 증가시키 기 위하여 배지 성분을 통한 함량 증대 방법과(Kim SK 등, J Microbiol. 45, 128-132 (2007)) 전통적인 돌연변이 유발을 통한 고생산성 변이주를 개발하는 방법이(An GH 등, J. Biosci. Bioeng. 92, 121-125 (2001), Sun N 등, Int. J. Food Microbiol. 94, 263-267 (2004)) 알려져 있으며, 최근에는 유전공학적 기법을 사용하여 아스타잔틴 생합성에 관련되는 유전자를 증폭시키는 대사공학 기술도 개발되고 있다(Visser H 등, FEMS Yeast Res. 4, 221-231 (2003)).

한편, 아스타잔틴을 파피아 로도지마로부터 추출하는데 있어서 장애가 되는 세포벽을 파쇄하기 위한 방법으로 물리적, 화학적, 생물학적 방법들이 알려져 있는데, 물리적 방법으로는 일반적으로 미생물균체를 파쇄하는데 사용되는 호모게나이져(homogenizer)를 사용하여 약 70 MPa 이상의 압력으로 세포를 균질화하는 방법 등이 알려져 있고, 화학적인 방법으로는 주로 산처리 방법(An GH 등, Biotechnol. Lett. 25, 767-771, (2003))을 사용하며, 생물학적 처리 방법으로는 주로 글루카넥스(Glucanex, Novozyme 사)와 같은 세포벽을 용해하는 효소를 사용한다. 그러나 이러한 방법들은 여러 가지 단점을 보이는데, 호모게나이져(homogenizer) 사용법과 효소 사용법은 비용이 많이 들며, 산처리와 같은 화학적 방법은 0.2M 염산과 같은 강산을 사용하여 90℃ 내외의 고온에서 오랜 시간 처리하는 가혹한 조건으로 아스타잔틴의 파괴도 수반된다.

이에 본 발명자들은 야생형 균주에 비하여 아스타잔틴 함량이 높은 파피아 로도지마 균주를 얻기 위하여 돌연변이를 유발하여 아스타잔틴 함량이 높아진 파피 아 로도지마 변이주를 선별하던 중, 아스타잔틴 함량이 높을 뿐만 아니라 균체를 물리적, 화학적, 혹은 생물학적으로 전처리하지 않고 유기 용매만으로 아스타잔틴을 손쉽게 추출할 수 있는 변이주를 발견하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 야생형 파피아 로도지마 균주를 돌연변이시켜 아스타잔틴 함량이 높은 변이균주를 선별하여 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은, 아스타잔틴 함량이 높은 본 발명의 변이균주에서 아스타잔틴을 고효율로 추출하는 방법을 제공하는데 있다.

따라서 본 발명의 첫 번째 양태에서는, 파피아 로도지마 균주를 돌연변이시켜 아스타잔틴 함량이 높은 돌연변이주를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 야생형 파피아 로도지마 균주를 돌연변이 유발물질로 처리하여 아스타잔틴 함량이 높은 돌연변이주를 선별 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 모균주인 야생형 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma, ATCC 96594)를 배양하는 배지에 당업계에서 미생물의 돌연변이 유발에 널리 사용되고 있는 물질인 NTG (1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine)를 첨가하여 돌연변이를 유발시켰다. 상기의 방법으로 유발된 돌연변이에서 모균주보다 아스타잔틴 고유의 색인 진홍색을 더 띄는 콜로니를 선별한 후, 각각의 콜로니에서 아스타잔틴을 추출하여 HPLC(High Perfomance Liquid Chromotography)를 이용하여 정량분석하였다.

정량분석을 통하여 아스타잔틴 수율이 가장 높은 콜로니 2주를 선별하여 각각 M1 및 M2로 명명하였고, 이를 2007년 10월 10일 자로 국제기탁기관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 M1주는 수탁번호 KCTC11213BP로, M2주는 수탁번호 KCTC11214BP로 기탁하였다. 상기 M1 및 M2 변이주는 건조균체 1g 당 아스타잔틴의 함량이 각각 약 4.0 mg 및 5.2 mg으로서, 건조균체 1g 당 아스타잔틴의 함량이 0.18mg인 모균주인 야생형 파피아 로도지마 균주보다 아스타잔틴의 함량이 220배 이상 높은 균주이다(실시예 2 참조).

본 발명의 두 번째 양태에서는, 본 발명에 따른 상기의 아스타잔틴의 체내 함량이 높은 변이주를 종래의 물리적, 화학적, 혹은 생물학적 전처리과정 없이, 용이하게 유기용매만을 사용하여 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법을 제공한다. 바람직하게 상기 방법에서는, 식품에 사용가능한 용매인 에탄올을 사용하여 아스타잔틴을 추출할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기의 M1 및 M2 변이주, 그리고 대조군으로서 야생형 파피아 로도지마 균주를 YM 배지(리터당 이스트추출물 3g, 말트추출물 3g, 펩톤 5g, 포도당 10g)에 접종하여 5일간 배양하고, 상기 균주 각각을 원심분리하여 균체를 덮고 이에 에탄올을 첨가한 후, 실온에서 5시간동안 진탕하였다. 이를 원심분리하여 상층액을 취하고(1차 추출물), 상층액을 취하고 남은 세포 펠렛에 다시 에탄올을 첨가하여 상기 과정과 동일하게 실온에서 5시간 동안 진탕한 후 진탕액을 원심분리하여 상층액을 취하여(2차 추출물), 1차 및 2차 추출물에서 아스타잔틴의 함량을 측정하였다(실시예 3). 또한, M1, M2 변이주 및 야생형 균주를 종래의 방법에 따라 원심분리를 이용하여 세포를 수거하고 유리비드 및 아세톤을 첨가하여 비드 분쇄기(Bead Beater, Tomy사)에서 반복하여 파쇄하여 그로부터 추출되는 아스타잔틴의 함량도 측정하였다(실시예 2).

그 결과, 종래의 방법을 이용하였을 경우, 상기의 야생형, 그리고 M1 및 M2 변이주의 아스타잔틴의 총 아스타잔틴 함량은 각각 0.18, 4.0, 및 5.2 mg/g 건조균체였으며, 본 발명에 따른 에탄올을 이용한 추출법을 실시하였을 때에는 추출율은 각각 0.0 %, 40.1%, 및 42.8%였다. 즉, 야생형 균주의 경우, 에탄올을 이용한 추출법으로는 아스타잔틴을 전혀 추출할 수 없었던 반면, M1 및 M2 변이주의 경우는 40% 이상의 아스타잔틴 추출율을 보였고, 더욱이, 1차 추출과정에서 대부분의 아스타잔틴(M1의 경우, 40.1%중 32%, M2의 경우, 42.8% 중에서 35.3%)이 추출되어 나옴으로써, 에탄올에 의한 추출 효과가 상당히 높음을 보여주었다(표 1참조).

본 발명은 아스타잔틴의 체내 함량이 증대된 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma) 균주의 돌연변이주를 제공하고, 이들에서 아스타잔틴 추출의 효율을 증대시키는 방법을 제공함으로써, 갑각류의 착색 및 항암, 항염증, 항당뇨 등 다양한 효과를 나타내는 아스타잔틴을 안정적이고도 용이하게 공급할 수 있다.

실시예 1 : 돌연변이 유발

돌연변이 유발을 위한 모 균주(mother strain)로는 야생형 (wild type) 파피아 로도지마(ATCC 96594) 균주를 사용하였다. 균주의 액체 배양을 위한 배지로는 YM (리터당 이스트추출물 3g, 말트추출물 3g, 펩톤 5g, 포도당 10g) 배지를 사용하였고 평판 배양(plate culture)은 YM배지에 한천을 2% 되도록 첨가하여 사용하였다.

먼저 모 균주를 YM 배지를 사용하여 20℃에서 중간대수기(mid-log phase) 까지 진탕배양하고 멸균수로 2회 세척한 후 0.1M citrate 완충용액 (pH 5.5)에 현탁하였다. 여기에 돌연변이 유도물질인 NTG (1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine)를 0.1 mg/ml의 농도로 첨가하여 20℃에서 20분간 진탕한 후 멸균수 및 0.1M phosphate 완충용액 (pH 7.0)으로 각각 1회씩 세척하고 YM 배지에 현탁하여 20℃에서 12-16시간 동안 배양 후 멸균수로 희석하여 YM 플레이트에 도말하였다. 20℃에 서 5-10일 동안 배양 후 모 균주보다 진한 붉은색을 띄는 콜로니를 선별 분리하였다.

실시예 2 : HPLC 를 이용한 아스타잔틴 함량 분석

실시예 1에서 선별한 진한 붉은색을 띄는 돌연변이주들을 대상으로 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 각각의 균주에서의 아스타잔틴 함량을 조사하였다.

우선, 세포를 수거하여 유리 비드(glass bead)와 아세톤을 가한 후 비드 분쇄기(Bead Beater, Tomy 사)를 사용하여 파쇄하였고, 세포 내의 색소가 모두 추출되도록 여러 번 반복하여 수행한 후 감압 농축하였다. 감압 농축된 색소 추출물은 아세토나이트릴:메탄올:이소프로판올 (Acetonitrile:methanol :isopropanol) 90:6:4 로 혼합된 용매에 용해하였다. HPLC에 사용된 컬럼은 C18 역상 컬럼 (Ultrasphere ODS 4.6 mm X 25 cm, Beckman Coulter사, USA)을 사용하였고, 용출용매는 색소 추출물을 용해시킨 상기의 아세토나이트릴:메탄올:이소프로판올 90:6:4 혼합용매를 사용하였다. 유속은 1 ml/min 으로 하였고, 흡광도는 475 nm에서 감지하였다.

HPLC 결과, 아스타잔틴 함량이 가장 높은 변이주 2 개주를 선발할 수 있었고, 이들을 각각 M1 및 M2로 명명하였다. 상기의 방법에 따라 측정한 M1 및 M2 변이주의 건조균체당 아스타잔틴 함량은 각각 4.0 및 5.2 mg/g 으로서, 이는 야생형 모균주의 아스타잔틴 함량보다 220배 이상 높음을 알 수 있었다(표 1참조).

실시예 3 : M1 및 M2 변이주 내의 아스타잔틴의 에탄올에 의한 추출 효율 비교

M1 및 M2 변이주에 함유된 아스타잔틴의 에탄올에 의한 추출 효율을 야생형과 비교하여 정량적으로 측정하였다. 우선, 야생형과 M1, M2 변이주를 YM 배지를 사용하여 20℃에서 5일 동안 각각 배양하고 3000rpm에서 원심분리하여 균체를 얻은 후 증류수로 1번 세척하고 수분을 보유한 세포 형태의 균체를 얻었다. 이렇게 얻은 야생형 균주, M1 및 M2 균주의 수분을 보유한 세포 펠렛에 각각 10ml의 순수 에탄올을 첨가하여 실온에서 5시간 동안 진탕하고 원심분리하여 아스타잔틴이 추출된 상등액을 1차 추출물로 얻었다. 그 후 다시 세포 펠렛에 10ml의 순수 에탄올을 첨가하고 5시간 동안 실온에서 진탕하고 원심분리하는 과정을 반복하여 2차 추출물을 얻었다. 이렇게 얻은 추출물을 실시예 2에 기술한 방법대로 HPLC를 사용하여 각각의 추출물에서 아스타잔틴을 정량분석하였다. 또한 음성 대조군으로서는, 실시예 2에 기술한 아세톤/유리비드 방법으로만 세포 펠렛을 처리하여 얻은 추출물로 하여 HPLC로 정량분석하고 이를 100%로 하였다.

그 결과, 표 1에서 보는바와 같이, M1 및 M2 변이주의 아스타잔틴 총 추출율 은 각각 40.1% 및 42.8%에 달하였다. 특히, 1차 추출과정에서 대부분의 아스타잔틴(M1의 경우, 40.1%중 32%, M2의 경우, 42.8% 중에서 35.3%)이 추출되어 나옴으로써, 에탄올에 의한 추출 효과가 상당히 높음을 보여주었다. 이에 반해, 야생형 균주의 경우, 에탄올에 의한 1차 및 2차 추출과정에 의해서는 전혀 아스타잔틴이 추출되지 않았다.

파피아 로도지마 야생형 균주와 변이주의 에탄올에 의한 아스타잔틴 추출 효율 비교

	야생형 균주	M1 변이주	M2 변이주
총 아스타잔틴 함량 (mg/g 건조균체)	0.18	4.0	5.2
1차 에탄올 처리 시 아스타잔틴 추출율 (%)	0.0	32.0	35.3
2차 에탄올 처리 시 아스타잔틴 추출율 (%)	0.0	8.1	7.5
총 아스타잔틴 추출율 (%)	0.0	40.1	42.8

도 1은 파피아 로도지마(Paffia rhodozyma) 모 균주(좌측 플레이트)보다 진한 붉은색을 띄는 콜로니(우측)가 배양된 플레이트의 사진이다.

Claims

삭제
건조균체 1g 당 아스타잔틴 함량이 적어도 4 mg 이상이며, 물리화학적 또는 효소적 전처리를 하지 않고 유기용매 추출이 가능한, 파피아 로도지마(Paffia rhodozyma) 돌연변이주 M2 (KCTC11214BP).
a) 제2항의 균주를 배양하는 단계; 및

b) 배양된 세포에 유기용매를 첨가하여 추출액을 얻는 단계를 포함하는 아스타잔틴의 생산 방법.
제3항에 있어서, 상기 유기용매가 에탄올인 방법.
제3항에 있어서, 유기용매를 첨가하여 추출액을 얻는 단계는 실온에서 5시간동안 진탕하는 것인 방법.
제3항에 있어서, b)의 단계는 물리화학적 또는 효소적 전처리를 하지 않는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 아스타잔틴의 추출율이 40% 이상인 방법.