JP2008259452A - アスタキサンチン産生細菌、細菌培養物、アスタキサンチン含有組成物およびアスタキサンチンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】産生する組成物中に占めるアスタキサンチン含有量が35質量%以上であるエリスロバクター属;16SrDNAの塩基配列が、特定の塩基配列か、又はその塩基配列と96%以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクターJPCC M種;かかる細菌を培養して得られる細菌培養物;かかる細菌から採取された、アスタキサンチンを含有する組成物;エリスロバクター属に属する細菌を培養する工程を有するアスタキサンチンの製造方法であって、前記細菌が、産生される全色素中に占めるアスタキサンチン含有量が35質量%以上となるアスタキサンチン産生能を有するアスタキサンチンの製造方法。
【選択図】なし
Description
リー及びソー(Lee,Y.−K.and Soh,C.−W.)、「ジャーナル・オブ・ファイコロジー(J.Phycol.)」、米国、1991年、第27巻、第3号、p.575−577 フローレス-コテラら(Flores−Cotera,L.B.et al.)、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー(Appl.Microbiol.Biotechnol.)、米国、2001年、第55巻、第2号、p.341−347 ワンら(Wang,C.−W.et al.)、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnol.Bioeng.)、米国、1999年、第62巻、第3号、p.235−241 ヨコヤマら(Yokoyama et al.)、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー(Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry)、米国、1994年、第58巻、第10号、p.1842−1844 ペインら(Pane,L.et al.)、ジャーナル・オブ・バイオロジー・リサーチ(J.Biol.Res.)、米国、1996年、第22巻、p.303−308
請求項1に記載の発明は、産生する組成物中に占めるアスタキサンチン含有量が35質量%以上であるエリスロバクター(Erythrobacter)属である。
請求項2に記載の発明は、16SrDNAの塩基配列が、配列番号1に示す塩基配列か、又は配列番号1に示す塩基配列と96%以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクター(Erythrobacter)JPCC M種である。
請求項3に記載の発明は、産生する組成物中に占めるアスタキサンチン含有量が35質量%以上である請求項2に記載のエリスロバクター(Erythrobacter)JPCC M種である。
請求項4に記載の発明は、エリスロバクター(Erythrobacter)JPCC M種1436株である請求項2又は3に記載のエリスロバクター(Erythrobacter)JPCC M種である。
請求項5に記載の発明は、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌を培養して得られる細菌培養物である。
請求項6に記載の発明は、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌から採取された、アスタキサンチンを含有する組成物である。
請求項7に記載の発明は、エリスロバクター(Erythrobacter)属に属する細菌を培養する工程を有するアスタキサンチンの製造方法であって、前記細菌が、産生される全色素中に占めるアスタキサンチン含有量が35質量%以上となるアスタキサンチン産生能を有するアスタキサンチンの製造方法である。
<エリスロバクターJPCC M種1436株の獲得>
海洋環境やマングローブ林より採取した海砂、泥、水などからアスタキサンチンを産生する微生物の獲得を試みた。酵母エキスを5.0g/l、ペプトンを1.0g/l、グルコースを5.0g/lをとなるようにそれぞれ人工海水(千寿製薬)に添加して作製した寒天プレートに、100μlのサンプルを塗布した。
エリスロバクターJPCC M種1436株の同定は、株式会社テクノスルガに委託して実施した。そして取得した検体を用いて、「形態的性質」、「培養的性質」、「生理学的性質」、「糖類からの酸生成/ガス酸性」および「その他の生理学的性質」を確認し、「塩基配列」の同定および系統解析を行った。「形態的性質」を表1に、「培養的性質」を表2に、「生理学的性質」を表3に、「糖類からの酸生成/ガス酸性」を表4に、「その他の生理学的性質」を表5に、「16SrDNAの塩基配列」を配列番号1にそれぞれ示す。
また、(2)リトマス・ミルクでの培養条件、MRテスト、デンプンの加水分解、クエン酸の利用、無機窒素源の利用、カタラーゼ、オキシダーゼ、O−Fテスト(酸化/発酵)、糖類からの酸生成/ガス酸性については、文献「坂崎利一、吉崎悦郎、三木寛二:新細菌培地学講座・下,第二版.1998,近大出版,東京」を参考にした。
また、(3)硝酸塩の還元、脱窒反応、VPテスト、インドール産生、硫化水素の生成、ウレアーゼ活性、その他の生理学的性質については、「細菌同定キットAPI20E,(bioMerieux,France)」を使用した。
エリスロバクターJPCC M種1436株の16SrDNAを、公知の方法により同定した結果、配列番号1に示す塩基配列であることが判った。
解析ソフトウェアとしてCLUSTAL W(THOMPSON(J.D.),HIGGINS(D.G.) and GIBSON(T.J.),Nucleic Acids Research,1994,22:4673−4680.参照)、MEGA ver3.1(KUMAR,(S.),TAMURA,(K.) and NEI,(M.),Briefings in Bioinformatics,2004,5,150−163.参照)を用い、得られた16S rDNAの塩基配列を、アポロンDB細菌基準株データベース(株式会社テクノスルガ)、国際塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)から取得した塩基配列情報と照合して、分子系統解析を行った。その結果得られた分子系統樹を図1に示す。
そして、BLAST(ALTSCHUL,(S.F.),MADDEN,(T.F.),SCHAFFER,(A.A.),ZHANG,(J.),ZHANG,(Z.),MILLER,(W.),and LIPMAN,(D.J.),Nucleic Acids Research,1997,25:3389−3402.参照)を用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、検体の16SrDNAの塩基配列は、エリスロバクター ルテオラス(Erythrobacter luteolus)SW−109株の16SrDNAの塩基配列に対し、95.7%と最も高い相同性を示した。また、国際塩基配列データベースに対する相同性検索においても、エリスロバクター由来の16SrDNAの塩基配列に対し高い相同性を示した。このことから、検体は、エリスロバクター属に含まれる可能性が高いと考えられた。
そして分子系統解析の結果、検体は、エリスロバクター ルテオラスに最も近縁であることが示された。一般的に16SrDNAの塩基配列を用いた解析では、基準株に対し相同率が97%以上を示す場合、その検体は基準株と同種である可能性を考慮する必要があるが、本検体の16SrDNAと相同率97%以上の相同性を示す基準株由来の16SrDNAは検索されなかった。そして、エリスロバクターの基準種はエリスロバクター ロンガス(Erythrobacter longus)だが、検体およびエリスロバクター ルテオラスの形成するクラスターは、エリスロバクター ロンガスを中心とするエリスロバクターのクラスターとは系統的に異なることが示された。検体およびエリスロバクター ルテオラスの形成するクラスターにおける分岐のブートストラップ値は98%と非常に高いことから、これら細菌は、エリスロバクター ロンガスに代表されるエリスロバクターとは系統的に異なり、属レベルにおいてエリスロバクターに含まれない可能性もある。しかし、現段階でエリスロバクター ルテオラスがエリスロバクターに含まれていることを考慮すると、検体はエリスロバクターに含まれると考えるのが妥当である。
以上より、分子系統解析の結果、検体はエリスロバクター属の新種(エリスロバクターJPCC M種1436株)であると判断された。
本発明の細菌は、16SrDNAの塩基配列が、配列番号1に示す塩基配列か、又は配列番号1に示す塩基配列と96%以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクターJPCC M種の細菌を包含する。このような細菌は、エリスロバクターJPCC M種1436株と同種の株であると考えられるからである。16SrDNAの塩基配列が、配列番号1に示す塩基配列と96%以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクターJPCC M種の細菌には、例えば、エリスロバクターJPCC M種1436株の16SrDNAの塩基配列に対して、化学物質を作用させる手法や遺伝子組み換え等の公知の手法で変異を導入することで得られた細菌も包含される。
また、産生する組成物中に占めるアスタキサンチン含有量が35質量%以上であるエリスロバクター属に属する細菌も本発明の細菌である。後記するように、このような色素を高含有量で産生する細菌は、利用価値が高い。
本細菌を培養するための培地は、本細菌の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩、微量元素(ビタミン、微量金属)等を含むものであれば特に限定されない。
より具体的には、炭素源として、例えば、グルコース、シュークロース等の糖類、エタノールやグリセロールなどのアルコール類を挙げることができる。添加量は、添加する炭素源にもよるが、概ね0.5〜3.0質量%程度とすれば良い。
その他、本発明の効果を損なわない範囲において、培地にはその他の成分を含有させても良い。
本細菌の培養に用いる培地として、市販品を用いても良く、好ましいものとして、例えば、マリンブロス培地(Difco社製)が挙げられる。
培地のpHは、6.0〜8.0に調整することが好ましい。そして、培養温度は20〜35℃であることが好ましい。培養時間は特に限定されないが、通常、2〜4日であることが好ましい。培養法としては、震とう培養または通気培養が好ましい。そして、培養中に培地は撹拌することが好ましい。培地への植菌量は特に限定されないが、0.1〜5容量%であることが好ましい。
さらに、シリカゲルなどの充填剤、抽出に用いたものと同様の溶媒を用いて、カラムクロマトグラフィーによりアスタキサンチンを精製しても良い。
特にアスタキサンチンは、産生される全色素中の含有量が35質量%以上と高濃度である。また、通常のアスタキサンチン産生能を有する細菌が産生するアスタキサンチンは、ほとんどがトランス体であるのに対し、本細菌が産生するアスタキサンチンには、シス体が50質量%程度含まれている。したがって、本細菌から採取された組成物は、通常のアスタキサンチン産生能を有する細菌が産生する組成物よりも有用性が高い。
(エリスロバクターJPCC M種1436株の培養物からのアスタキサンチンを含むカロチノイド色素の分離)
エリスロバクターJPCC M種1436株の生育に必要な全ての栄養素を含むマリンブロス培地(Difco社製)を調製し、121℃で10分間滅菌処理した。次いで、1L三角フラスコにこの培地を250ml分取したのち、この株を5ml植菌して、150rpmで撹拌しながら30℃で3日間培養を行った。この培養液を遠心分離し、凍結乾燥を行い、0.5gの乾燥菌体を得た。この菌体にクロロホルム:メタノール=1:1(v:v)溶液を加えて色素を抽出後、シリカゲルをクロロホルム:メタノールの移動相に再懸濁させ、充填したオープンカラム(口径30mm、全長600mm)を用いて色素の分離を行った。
Claims (7)
- 産生する組成物中に占めるアスタキサンチン含有量が35質量%以上であるエリスロバクター(Erythrobacter)属。
- 16SrDNAの塩基配列が、配列番号1に示す塩基配列か、又は配列番号1に示す塩基配列と96%以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクター(Erythrobacter)JPCC M種。
- 産生する組成物中に占めるアスタキサンチン含有量が35質量%以上である請求項2に記載のエリスロバクター(Erythrobacter)JPCC M種。
- エリスロバクター(Erythrobacter)JPCC M種1436株である請求項2又は3に記載のエリスロバクター(Erythrobacter)JPCC M種。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌を培養して得られる細菌培養物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌から採取された、アスタキサンチンを含有する組成物。
- エリスロバクター(Erythrobacter)属に属する細菌を培養する工程を有するアスタキサンチンの製造方法であって、
前記細菌が、産生される全色素中に占めるアスタキサンチン含有量が35質量%以上となるアスタキサンチン産生能を有するアスタキサンチンの製造方法。
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