KR102042363B1 - 발효공법을 이용한 아스타잔틴과 가바를 동시에 함유하는 기능성 발효소재 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파라코커스 속 균주 및 유산균주를 혼합 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴(astaxanthin) 및 가바(GABA)의 동시 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 균주의 혼합 배양시 아스타잔틴 및 가바의 생산량이 증가되는 상승된 효과가 있고, 한 번의 발효공정에 의해 아스타잔틴 및 가바를 동시에 생산할 수 있어, 상기 발효물질이 필요한 식품 및 화장품 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

발효공법을 이용한 아스타잔틴과 가바를 동시에 함유하는 기능성 발효소재 제조방법{Method for producing functional fermented materials containing astaxanthin and GABA by fermentation methods}

본 발명은 파라코커스 속 균주 및 유산균주를 혼합 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴 및 가바의 동시 생산 방법; 파라코커스 속 균주 및 유산균주를 포함하는 아스타잔틴 및 가바의 동시 생산용 조성물; 및 파라코커스 속 균주 및 유산균주의 혼합 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.

카로티노이드(carotenoid)는 이소프레노이드 화합물(isoprenoid compounds)로서 자연계에서 C30, C40, C50 계열의 유용한 색소 군이다. 카로티노이드 중 아스타잔틴(astaxanthin; 3, 3'-dihydroxy-β, β-carotene-4, 4'-dione)은 C40 계열의 색소로써 인체 내에서 비타민 A 전구체, 항산화, 활성산소 소거작용, 암세포의 증식 억제작용 등의 생물학적 기능을 통하여 순환기 질환 및 성인병 등을 예방하는 효능을 가진 것으로 알려져 있다. 또한, 면역기능을 향상시켜 자외선 노출로부터 피부의 손상을 줄여주거나 멜라닌 생합성을 억제한다는 연구 결과가 보고됨으로써 유럽이나 미국에서 미용 소재로 각광을 받고 있다.

아스타잔틴은 산업적으로 색소증진 물질로 이용되고 있으며, 경제적 수요는 매년 15% 이상의 소비성장을 보이고 있어 전세계 주요 국가에서는 아스타잔틴을 생산할 수 있는 다양한 방법을 연구하고 있으며, 대표적으로는 화학 합성법, 갑각류 등에서의 추출법, 미생물에 의한 생선법이 있다.

화학 합성법은 스위스의 호프만-라로췌(F. Hoffman-LaRoche) 사에서 합성하여 시판하고 있으나, 화학합성으로 제조된 아스타잔틴은 천연 아스타잔틴에 비해 낮은 생체 흡수율을 보이고, 식품 첨가제로서의 안전성에 문제가 되고 있어 유럽의 일부 국가에서만 사용이 허가되는 등 적용성에 한계점을 가지고 있다.

갑각류 등에서의 추출법은 천연공급원으로서 게, 새우등이 이용되고 있으나 갑각류에서 추출된 아스타잔틴은 추출이 용이한 장점은 있으나 높은 회분과 키틴 함량으로 사용에 제한이 있을 뿐만 아니라 해양생물자원의 고갈로 인하여 천연공급원의 가격이 높아짐에 따라 수급에 문제가 있다.

한편, 가바는 단백질에서는 발견되지 않는 비-단백질성 아미노산의 일종으로 뇌나 척수에 존재하는 신경전달물질로 알려져 있으며, 혈류를 개선하고 뇌의 산소공급을 증가시켜 뇌의 대사촉진 및 뇌 기억을 증진시키는 뇌의 영양제로 알려져 있다. 또한, 글루탐산이 신경을 활성화시키는 것과 달리 신경활성을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 기능은 신경세포의 기능과 정보처리에 지대한 영향을 미치게 되며 흥분을 적절히 제어하여 비정상적인 과도한 뇌의 활성을 제어하는 역할을 한다.

일반적으로 알려진 가바의 효능에는 발작 또는 우울증 조절에 효과적이며, 알콜대사 촉진 및 혈압강하를 비롯한 간기능 강화, 비만예방, 갱년기 장애 개선, 스트레스 해소, 기억력 증진 등이 있다.

상기와 같이, 여러 생리활성의 기능성을 갖는 아스타잔틴과 가바는 천연의 원료로부터 수득하기에는 그 양이 미미하여 산업적으로 활용하기에는 그 생리활성 기능을 기대하기에는 역부족이다. 이러한 이유에서 아스타잔틴 및 가바의 생산을 증대시킬 수 있는 효과적인 방법이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-0431359호 한국등록특허 제10-1198865호

본 발명의 목적은 파라코커스 속 균주 및 유산균주를 혼합 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴(astaxanthin) 및 가바(GABA)의 동시 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 파라코커스 속 균주 및 유산균주을 포함하는 아스타잔틴(astaxanthin) 및 가바(GABA)의 동시 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 트립톤(triptone) 및 효모추출물(yeast extract)을 포함하는 파라코커스 속 균주 및 유산균주의 혼합 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파라코커스 속 균주 및 유산균주를 혼합 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴(astaxanthin) 및 가바(GABA)의 동시 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 파라코커스 속 균주는 파라코커스 해운댄시스(Paracoccus haeundaensis)인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유산균주는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)에서 선택되는 하나 이상의 균주인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 혼합 배양은 탈지유(skim milk), 트립톤(triptone), 효모추출물(yeast extract), 글루코오스(glucose), 염화나트륨(NaCl) 및 MSG(mono sodium glutamate)가 포함된 배지에서 수행되는 것일 수 있고, 상기 배지에서 탈지유(skim milk)는 1.0~2.0중량%, 트립톤(triptone)은 1.0~2.0중량%, 효모추출물(yeast extract)은 1.0~2.0중량%, 글루코오스(glucose)는 1.0~2.0중량%, 염화나트륨(NaCl)은 2.0~3.0중량%, MSG(mono sodium glutamate)는 0.5~1.0중량%로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 혼합 배양은 상기 혼합 배양은 배양 온도가 20~27 ℃이고, 교반속도가 120~160 rpm이며, 에어레이션(aeration)이 0.05 vvm인 조건에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 배양 온도가 25 ℃이고, 교반속도가 160 rpm이며, 에어레이션(aeration)이 0.05 vvm인 조건에서 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 혼합 배양은 48~72시간 동안 수행되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 파라코커스 속 균주 및 유산균주을 포함하는 아스타잔틴(astaxanthin) 및 가바(GABA)의 동시 생산용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 트립톤(triptone) 및 효모추출물(yeast extract)을 포함하는 파라코커스 속 균주 및 유산균주의 혼합 배양용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 트립톤이 1.0~2.0중량%, 효모추출물이 1.0~2.0중량%로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 탈지유(skim milk), 글루코오스(glucose), 염화나트륨(NaCl) 및 MSG(mono sodium glutamate)를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 탈지유가 1.0~2.0중량%, 글루코오스(glucose)가 1.0~2.0중량%, 염화나트륨이 2.0~3.0중량%, MSG가 0.5~1.0중량%로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 아스타잔틴 및 가바의 동시 생산 방법은 파라코커스 속 균주 및 유산균주를 혼합 배양함으로써 아스타잔틴 및 가바의 생산량이 증가되는 상승된 효과가 있고, 한 번의 발효공정에 의해 아스타잔틴 및 가바를 동시에 생산할 수 있어, 상기 발효물질이 필요한 식품 및 화장품 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 종균의 증균배양을 통한 전배양액의 제조, 본배양 배지의 제조 및 전배양액의 접종에 의한 발효공정을 통하여 제품화하는 공정에 대한 순서도이다.
도 2는 파라코커스 해운댄시스, 유산균주인 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 헬베티쿠스 또는 락토바실러스 사케이의 순수 배양에서의 배지 종류와 배양 조건에 따른 생육도를 분석한 결과이다.
도 3은 파라코커스 해운댄시스 및 유산균주인 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 헬베티쿠스 또는 락토바실러스 사케이의 혼합 배양에서의 배지 종류와 배양 조건에 따른 생육도를 분석한 결과이다.
도 4는 파라코커스 해운댄시스, 유산균주인 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 헬베티쿠스 또는 락토바실러스 사케이의 순수 배양 후, 아스타잔틴 및 가바의 생성량(단위: ppm)을 비교한 결과이다.
도 5는 파라코커스 해운댄시스 및 유산균주인 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 헬베티쿠스 또는 락토바실러스 사케이의 혼합 배양 후, 아스타잔틴 및 가바의 생산량(단위: ppm)을 비교한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 아스타잔틴 및 가바를 다량으로 함유하는 발효산물의 제품화 공정

본 발명에 따른 파라코커스 해운댄시스(Paracoccus haeunadensis) 및 유산균주를 혼합 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴 및 가바를 다량으로 함유하는 발효산물의 동시 생산 방법은 종균의 증균배양을 통한 전배양액의 제조, 본배양 배지의 제조 및 전배양액의 접종에 의한 발효공정을 통하여 제품화하는 공정을 포함하고 있다. 더욱 구체적으로는 발효균주인 파라코커스 해운댄시스와 유산균주(3종)의 종균(starter)을 제작하여 매 생산시 사용할 수 있도록 활성화된 상태로 동결하여 보관하는 종균제작 단계(A); 보관된 종균을 계대배양하여 증균하는 전배양 단계(B); 발효공정을 위한 본배양 배지를 제조하는 배지제조 단계(C); 제조된 본배양 배지에 전배양되어 증균된 종균을 접종하는 접종 단계(D); 접종 후, 최적 발효조건 하에서 배양하는 발효 단계(E); 발효 후, 종균을 사멸시키는 멸균 단계(F); 멸균된 발효액을 농축시키는 농축 단계(G); 농축된 배양액을 건조시키는 건조 단계(H); 건조된 발효산물을 분쇄하여 분말화 및 포장하는 포장 단계(I)로 이루어진다 (도 1).

상기 (A)와 (B)단계에서 사용할 수 있는 균주로는 아스타잔틴의 생성능을 갖는 미생물이면 가능하지만 본 발명에서는 파라코커스 해운댄시스를 사용하는 것이 가장 바람직하며, 유산균주로는 가바를 생성하는 균주면 사용이 가능하지만 바람직하게는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. (A)단계에서는 본 발명의 발효균주인 파라코커스 해운댄시스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 헬베티쿠스 및 락토바실러스 사케이의 발효에 필수적인 스타터(starter)의 보관용 스탁(stock)을 제조하는 단계로, 특정한 총균수까지 멸균된 영양배지에 발효균주를 배양한 후, 멸균된 50%의 글리세롤(glycerol)을 배양액에 대비하여 10%(v/v)를 첨가하여 혼합한 후, -80℃에 보관한다. 이 때, 총균수는 파라코커스 해운댄시스의 경우 600nm의 파장에서 흡광도(O.D: Optical Density) 1.8~2.0의 값을 나타내는 배양액을 사용하는 것이 바람직하며, 유산균주의 경우는 동일 파장에서 흡광도 1.5~1.8의 값을 나타내는 배양액을 취하여 보관용 스탁을 제작하는 것이 바람직하다.

상기 (B)의 단계는 (A)의 단계에서 제작되어 -80℃에 보관된 종균을 활성화시켜 증균하여 전배양하는 단계로, 발효단계 (E)에서 사용될 배지의 양에 대비하여 2~5%(v/v)가 되기까지 파라코커스 해운댄시스 및 유산균주를 각각 계대배양하는 것이 바람직하다. 사용하는 배지는 멸균된 영양배지이면 가능하나 주로 파라코커스 해운댄시스의 경우, LB broth를 사용하거나 skim milk 1.0~2.0% triptone 0.5~2%, yeast extract 0.2~1%, glucose 1.0~2.0%, NaCl 2~3%를 첨가하여 멸균한 배지를 사용하는 것이 바람직하며, 유산균주의 경우, MRS broth를 사용하거나 peptone 0.5~1.0%, beef extract 0.5~1.0%, yeast extract 0.5~1.0%, glucose 1.0~2.0%, NaCl 2.0~3.0%를 첨가하여 멸균된 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 전배양 단계 (B)에서의 배양 조건은 파라코커스 해운댄시스의 경우, 20~25℃의 범위에서 pore size가 0.2~0.45um인 필터를 채결하여 교반속도 120~160rpm으로 간접적으로 aeration하는 것이 바람직하지만, 교반은 하지 않더라도 동일 pore size의 필터를 통과하여 제균된 공기를 0.05vvm로 직접 aeration하면서 40~50rpm으로 교반하여 배양하는 것이 가장 바람직하다. 유산균주의 경우, 35~38℃의 범위에서 교반(120~160rpm) 또는 정치 배양하는 것이 바람직하다.

상기 (C)의 단계는 상기 (B)의 단계에서 전배양된 발효균주(파라코커스 해운댄시스 및 3종의 유산균주 중 선택되는 1종 이상)를 접종하여 발효하기 위한 배지를 제조하는 단계로, LB broth를 변형하여 확립된 배지(MLB : Modyfied LB broth)를 본 발명에 도입하였다. 구체적인 배지의 조성은 skim milk 1.0~2.0%, triptone 1.0~2.0%, yeast extract 1.0~2.0%, glucose 1.0~2.0%, NaCl 2.0~3.0%, MSG(mono sodium glutamate) 0.5~1.0%이며, 최종 발효산물인 아스타잔틴과 가바를 생산하기 위해서는 상기 배지조성을 필수적으로 첨가하는 것이 바람직하며, 그 외 영양성분(질소원, 탄소원 등)을 첨가하여 아스타잔틴 및 가바의 함량을 증대하는데 첨가할 수 있다. 본 단계에서는 배지의 조성물을 첨가하여 혼합한 후, 타 균에 의한 오염을 방지하기 위하여 멸균하는 단계를 필수적으로 포함하며, 멸균과정은 MLB 배지를 121℃까지 가열한 후, 15~20분 동안 유지함으로서 배지조성물의 혼합시 유입된 타 균을 완전히 사멸시키고, 다음 단계인 발효균주의 접종을 위하여 약 25℃까지 냉각한다.

상기 (D)의 단계는 상기 (C)의 단계에서 제조된 배지에 (B)의 단계에서 전배양된 발효균주를 접종하는 단계로, 접종하는 양(volume)은 상기 (C)의 단계에서 제조된 본배양 배지의 양(volume)에 대비하여 전배양된 배양액이 2~5%(v/v)가 되도록 각각 순차적으로 접종하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 대량배양을 위하여 5ton fermenter에 2.88~2.70ton의 본배양 배지를 제조하여 파라코커스 해운댄시스 전배양액 60~150L 및 3종의 유산균주 중에서 선택되는 1종의 유산균주를 60~150L를 접종하여 최종 volume이 3ton이 되도록 한다.

상기 (E)의 단계는 상기의 본 배양 배지에 전배양된 발효균주가 접종된 이후, 배지의 성분을 생리활성물질인 아스타잔틴과 가바로 전환시키는 발효단계로, 이를 위하여 발효공정 중에 최적발효조건을 유지하는 것이 중요하며, 발효조건은 20~28℃에서 0.05vvm으로 aeration하는 것이 바람직하다. 또한, 균등한 aeration을 위하여 40~50rpm으로 교반하는 것이 가장 바람직하다. 발효 중에 다량의 기포가 발생하기 때문에 이를 제거하기 위하여 경우에 따라 멸균 및 희석된 소포제를 사용할 수 있다. 발효공정에 소요되는 시간은 제한은 없으나, 보통 48~72시간이 소요되며, 이때의 아스타잔틴 및 가바의 함량은 건중량으로 각각 50~60ppm(ug/g), 1~2%(w/w)를 나타낸다. 즉 상기의 함량이 될 때까지 48~72시간 발효하는 것이 바람직하다.

상기 (F)의 단계는 발효가 완료된 이후, 발효공정에 대수적으로 증식한 발효균주를 사멸시키는 단계로, 상기 (C)의 단계에서 배지를 제조하기 위하여 멸균하는 과정과 동일하다. 즉, 발효가 완료된 발효액을 121℃까지 가열한 후, 15~20분 동안 유지함으로서 발효조성물 내의 발효균주를 완전히 사멸시키고, 다음 단계인 농축단계를 위하여 약 60℃까지 냉각시킨다.

상기 (G)의 단계는 다량의 아스타잔틴 및 가바를 함유하는 멸균된 발효액을 건조하기 위하여 농축하는 단계로, 발효액을 40~50brix까지 농축하는 것이 바람직하다.

상기 (H)의 단계에서는 농축된 발효액을 건조하는 단계로, 분무건조기, 진공건조기, 동결건조기 중 선택적으로 사용하여 건조하는 것이 바람직하다. 본 단계에서는 아스타잔틴과 가바의 함량을 희석하기 위하여 건조 전 또는 건조 후에 덱스트린 등의 부원료로 희석할 수 있다.

상기 (I)의 단계는 상기 (H)의 단계에서 건조된 발효산물을 분말화하기 위하여 분쇄(200mesh)하여 용량별로 포장하는 단계이다.

실시예 2. 순수 배양 및 혼합 배양에 의한 각 균주별 생육특성

본 발명자들은 아스타잔틴 생성균주로서 파라코커스 해운댄시스(Paracoccus haeunadensis) 및 가바 생성균주로 유산균주인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 또는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)의 생육 특성에 대하여 순수 배양 및 혼합 배양에서 확인하는 실험을 수행하였다.

순수 배양 및 혼합 배양을 위하여 -80℃에서 보관된 상기 4종의 발효균주(종균)를 상온에서 해동하였고, 계대 및 증균하기 위하여 멸균된 각 배지에 접종하였다(표 1 참조). 이 때, 순수 및 혼합 배양시 각 균주의 접종량과 총균수(cell mass)를 동일하게 하기 위하여 멸균된 배지를 이용하여 흡광도 값이 600nm의 파장에서 0.5±0.02가 되도록 희석하여 접종하였다. 각 균주의 접종량은 계대할 배지의 양에 대비하여 2~5%(v/v)가 되도록 접종하였다. 배양 온도는 파라코커스 해운댄시스의 경우, 25℃에서 pore size가 0.25um인 필터를 채결하여 120~160rpm으로 교반하였고, 유산균주의 경우, 25℃와 37℃에서 120~160rpm으로 교반하거나 정치배양 하였다. 각 균주별 사용된 배지는 영양배지로서 LB broth, MRS broth 및 앞서 설명된 MLB(modyfied LB broth)를 각각 사용하였다(표 1 참조).

순수 배양 및 혼합 배양과 관련하여 배지의 종류와 배양 조건에 따른 각 균주별 생육특성을 알아본 결과는 표 1, 도 2 및 도 3에 나타내었다. 결과에 따르면, 상기 4종의 균주는 배지 종류 및 배양 조건에 대하여 특이한 차이를 보이지 않았으며, 36시간 전후에서 대수적으로 증식하는 양상을 보였다. 이는 순수 배양 뿐만 아니라 혼합 배양시에도 유사한 결과를 도출하였으나, 혼합 배양시에는 혼합된 균주가 서로 상생하여 나타난 결과로 판단할 수는 없었다.

특이적으로 파라코커스 해운댄시스는 배양온도가 25℃일 경우에 양호한 생육도를 나타내었지만, 37℃에서는 생육도가 상대적으로 낮은 수준을 나타내었고 아스타잔틴 생성시 나타나는 붉은색의 배양액 특성이 나타나지 않았다. 이로써, 파라코커스 해운댄시스는 37℃의 배양온도에서 아스타잔틴을 생성하지 않음을 확인하였다.

Strains	Media (broth)	Temp. (℃)	Shaking (rpm)	Cell mass after culture (O.D 600nm )
				0hrs	12hrs	24hrs	36hrs	48hrs
P. haeundaensis	LB	25	160	0.023	0.122	0.527	1.955	2.132
	LB	37	160	0.023	0.078	0.322	0.784	1.201
	MLB	25	160	0.021	0.134	0.506	2.048	2.203
L. brevis	MRS	37	-	0.017	0.110	0.495	1.844	2.125
	MLB	37	-	0.016	0.109	0.544	1.952	2.111
	MLB	25	160	0.020	0.122	0.511	1.897	2.154
L. helveticus	MRS	37	-	0.017	0.124	0.548	1.925	2.224
	MLB	37	-	0.013	0.098	0.521	1.894	2.078
	MLB	25	160	0.013	0.097	0.490	1.977	2.112
L. sakei	MRS	37	-	0.018	0.128	0.612	2.012	2.145
	MLB	37	-	0.018	0.131	0.583	2.131	2.242
	MLB	25	160	0.016	0.126	0.549	2.094	2.136
P. haeundaensis + L. brevis	MLB	25	160	0.201	0.314	0.724	2.121	2.458
P. haeundaensis + L. helveticus	MLB	25	160	0.211	0.344	0.625	2.045	2.434
P. haeundaensis + L. sakei	MLB	25	160	0.232	0.322	0.698	2.313	2.164

실시예 3. 각 균주별 발효분말에 함유된 아스타잔틴 및 가바의 함량 분석

본 발명자들은 아스타잔틴 생성균주로서 파라코커스 해운댄시스(Paracoccus haeunadensis) 및 가바 생성균주로 유산균주인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 또는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)의 순수 배양 및 혼합 배양을 통해 아스타잔틴 및 가바의 생성된 함량을 분석하는 실험을 수행하였다.

종균의 활성화 및 접종 조건은 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 실시하였다. 배지는 MLB broth를 사용하였으며, 배양온도는 25℃, 교반속도는 160rpm, aeration은 0.05vvm, 발효기간은 24~48시간으로 동일한 조건으로 실시하였다.

발효를 시작하고 24시간(아스타잔틴 및 가바 함량 분석용 샘플 채취 시간)을 경과하여 48시간에 도달하였을 때, 순수 및 혼합 발효(배양)을 종료하였고, 각 균주의 조합에 의하여 발효된 발효분말(0시간, 24시간, 48시간 발효분말) 내의 아스타잔틴 및 가바의 함량을 분석하였다. 발효가 종료된 각각의 발효액을 멸균하여, 멸균된 발효액 100mL를 취하여 40 brix%까지 농축한 후, -80℃에서 급속 냉동하였고 이를 동결건조하여 분쇄한 분말을 아스타잔틴 및 가바의 함량분석에 사용하였다.

아스타잔틴의 함량을 분석하기 위하여 상기에서 준비된 각각의 발효분말 중에서 1mg을 취하여 90% acetone 1mL와 혼합한 후, 3분간 homogenizer를 이용하여 세포를 파쇄하였고. 파쇄된 액은 13,000rpm에서 2분간 원심 분리하였으며, 상층액을 취하여 주사기 필터(0.22 μm, nylon filter)를 이용해 여과함으로서 아스타잔틴을 비롯한 카로티노이드 계열의 모든 색소를 추출하였다. 각 발효분말의 추출액에 함유된 아스타잔틴 함량을 HPLC를 이용하여 분석하였다.

HPLC 분석은 Bio-rad (Hercules, CA, U.S.A.)사의 automated biologic HR system (#750-0047)을 이용하였다. Column은 Nova-Pak HR 6U C18 column (3.9×300 mm)이며, 40℃에서 분석하였다. 사용된 buffer의 조성은 14% 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 84% acetonitrile, 2% methanol (0~15 min), 68% methanol과 32% ethyl acetate (15~20 min)이며, Post-running은 10분간 이루어졌으며, Column 내 유속은 분당 1mL가 되게 하였다.

분리된 아스타잔틴은 photodiode array detector를 이용하여 최대흡수인 470nm에서 측정하여 표준물질과 비교 분석하였으며, 아스타잔틴 표준물질(astaxanthin standard)는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다.

또한, 동일한 HPLC 기기 및 컬럼을 이용하여 상기의 발효분말 내에 함유되어 있는 가바의 함량을 분석하였다. 보다 구체적으로는, 본 실시예를 통하여 각 균주별 조합에 의하여 제조된 발효분말 내에 존재하는 가바를 포함하는 아미노산을 OPA(O-phthaldealdehyde) 유도체로 치환하기 위해서 자동샘플러 유저 프로그램 반응 프로토콜 측정 방법을 이용하였고, 주입 프로그램 (inject program)에 따라 샘플은 OPA-3MPA(O-phthaldealdehyde-3-mercaptopropionic acid)로 유도하였으며, 분석 조건은 표 2에 나타내었다.

구 분	HPLC 분석 조건
주입량	10uL
컬럼온도	40℃
이동상 A	50mM 아세트산 나트륨, pH 6.5
이동상 B	아세토니트릴 : 메탄올 : 증류수 = 45 : 45 : 10 (부피비)
유속	1mL / min
검출기 파장	338nm

각 균주별 조합에 의한 발효분말에 함유된 아스타잔틴 및 가바의 함량을 분석한 결과는 표 3, 도 4 및 도 5에 나타내었다.

Strains	Concentration of Astaxanthin (ppm : ug/g)			Concentration of GABA (ppm : ug/g)
	0hrs	24hrs	48hrs	0hrs	24hrs	48hrs
P. haeundaensis	-	12.56	48.96	-	-	-
L. brevis	-	-	-	-	126.87	528.25
L. helveticus	-	-	-	-	262.34	492.66
L. sakei	-	-	-	-	157.73	572.41
P. haeundaensis + L. brevis	-	22.56	50.78	-	201.39	598.43
P. haeundaensis + L. helveticus	-	18.55	61.48	-	228.12	526.44
P. haeundaensis + L. sakei	-	26.18	58.24	-	234.31	591.77

표 3에서 나타낸 바와 같이, 순수 배양시 파라코커스 해운댄시스는 아스타잔틴을 24시간 발효시에는 12.56 ppm을 생산하였고, 48시간 발효시에는 48.96 ppm을 생산하는데 반하여, 가바는 생산하지 않는 것으로 나타났다. 유산균주의 경우 48시간 발효시 락토바실러스 브레비스는 528.25 ppm을 생산하였고, 락토바실러스 헬베티쿠스는 492.66 ppm을 생산하였으며, 락토바실러스 사케이는 572.41 ppm을 생산한 반면, 아스타잔틴은 전혀 생산하지 않는 것으로 나타났다.

그러나, 혼합 배양시에는 확연히 다른 양상의 결과를 도출할 수 있었으며, 구체적으로는 파라코커스 해운댄시스를 기준으로 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 헬베티쿠스 및 락토바실러스 사케이를 각각 혼합 배양한 경우, 아스타잔틴의 생산량은 48시간 발효시 각각 50.78 ppm, 61.48 ppm, 58.24 ppm이며, 가바의 생산량은 598.43ppm, 526.44ppm, 591.77ppm으로 나타났다. 이는 순수 배양에 의하여 생산된 아스타잔틴 및 가바의 함량보다 높은 값이다.

따라서, 본 발명자들은 파라코커스 해운댄시스 및 유산균주의 혼합 배양에 의하여 아스타잔틴 및 가바를 동시에 생산할 수 있으며, 순수 배양에 의한 것보다 아스타잔틴 및 가바의 생산량이 높아지는 상승된 효과를 있음을 확인하였다.

Claims (15)

1. 파라코커스 해운댄시스(Paracoccus haeundaensis); 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)에서 선택되는 하나 이상의 유산균주를 혼합 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴(astaxanthin) 및 가바(γ-aminobutyric acid; GABA)의 동시 생산 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 혼합 배양은 탈지유(skim milk), 트립톤(triptone), 효모추출물(yeast extract), 글루코오스(glucose), 염화나트륨(NaCl) 및 MSG(mono sodium glutamate)가 포함된 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 혼합 배양은 배양 온도가 20~27 ℃이고, 교반속도가 120~160 rpm이며, 에어레이션(aeration)이 0.05 vvm인 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 혼합 배양은 48~72시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 파라코커스 해운댄시스(Paracoccus haeundaensis); 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)에서 선택되는 하나 이상의 유산균주를 포함하는 아스타잔틴(astaxanthin) 및 가바(γ-aminobutyric acid; GABA)의 동시 생산용 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 트립톤(triptone) 1.0~2.0 중량%, 효모추출물(yeast extract) 1.0~2.0 중량%, 탈지유(skim milk) 1.0~2.0 중량%, 글루코오스(glucose) 1.0~2.0 중량%, 염화나트륨(NaCl) 2.0~3.0 중량% 및 MSG(mono sodium glutamate) 0.5~1.0 중량% 를 포함하는 파라코커스 속 균주 및 유산균주의 혼합 배양용 배지 조성물로서,
    상기 파라코커스 속 균주는 파라코커스 해운댄시스(Paracoccus haeundaensis)이고,
    상기 유산균주는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)에서 선택되는 하나 이상의 유산균주인 것을 특징으로 하는 파라코커스 속 균주 및 유산균주의 혼합 배양용 배지 조성물.
    
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