CN103667081B

CN103667081B - 一株番茄红素高产菌株及其应用

Info

Publication number: CN103667081B
Application number: CN201310659371.6A
Authority: CN
Inventors: 姚忠泽
Original assignee: CHANGZHOU BY YANG BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: CHANGZHOU BY YANG BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: CN103667081A

Abstract

本发明公开了一种番茄红素高产菌株及其应用，其分类命名为三孢布拉氏霉菌blakeslea？trispora？V-6515，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC？NO：M？2013583，本发明以亚硝基胍诱变，通过摇瓶发酵筛选获番茄红素产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，最终筛选出目标菌株V-6515，该菌株可较大幅度提高发酵产物中番茄红素组分并减少其他组分，且遗传稳定性良好。该菌株利用木薯粉为发酵碳源，在5L发酵罐中发酵产番茄红素产量可达1.82g/L，相对于原始出发菌株VR-5(-)提高了23.4%，可应用于工业生产并大幅度提高发酵单位，具有重大的经济应用价值。

Description

一株番茄红素高产菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种番茄红素高产菌株及其诱变方法与其在发酵生产番茄红素中的应用。

背景技术

类胡萝卜素是一类在水果和蔬菜中大量存在的化合物，由于其具有作为抗氧化剂和维他命a前体的性质，所以是广泛研究的主题。番茄红素有优越的生理功能，其抗氧化作用优于β-胡萝卜素，具有抗癌、防癌、活化免疫细胞的功能，广泛应用于食品、药品、化妆品和保健行业。

番茄红素是一种类胡萝卜素，其化学式C₄₀H₅₆，分子量为536.85。分子结构如下：

番茄红素具有化学合成和天然来源。化学合成由于合成途径中可能存在一些化学中间体杂质，因此近年来已经被大多数欧美国家所禁止，而天然来源的番茄红素则无此弊端。天然来源的番茄红素一般有三种生产方法，分别是天然植物提取、盐藻法和微生物发酵法生产。其中微生物发酵法生产番茄红素因不受环境条件限制、产量高、易于实现工业化生产而成为越来越多研究机构和厂家关注的对象。

国内外用于番茄红素生产的微生物菌种主要有红酵母，丝状真菌等，但最广泛用到的又以三孢布拉霉为多。因此越来越多科研机构和生产厂家将精力投入到改良和筛选三孢布拉霉的工作中。CN1920046公开了一种三孢布拉霉生产番茄红素的方法，通过三孢布拉霉正负菌混合的方法，发酵产生番茄红素。但由于正负菌需按比例混合发酵，在此过程中操作繁琐，且增加了染菌的风险。上述技术方案有待进一步提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一株三孢布拉氏霉菌，采用该菌发酵，无需添加阻断剂，无需正负菌需按比例混合发酵，即可发酵生产番茄红素，且产量较高。

本发明要解决的技术问题之二在于提供上述三孢布拉氏霉菌在发酵产番茄红素中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株番茄红素高产菌株，其分类命名为三孢布拉氏霉菌（blakesleatrispora）V-6515，已于2013年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCNO：M2013583。

本发明所述的番茄红素高产菌株三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515的诱变筛选方法是：将VR-5(-)为出发菌株，经亚硝基胍诱变后，通过摇瓶发酵筛选获得番茄红素产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出番茄红素产量高的目标菌株。

本发明菌株的形态学及生理生化学特征如下：

菌落在PDA培养基上为浅黄色，在好氧条件下生长，菌落个体大，圆形菌落，菌丝体厚，边缘整齐，质地均匀；适宜生长温度为27.5～28.5℃。适宜生长pH为7.0～7.2.

本发明所提供的番茄红素高产菌株的诱变方法，具体步骤如下：

(a)、单孢子悬浮液制备：将三孢布拉氏霉菌出发菌株孢子制成孢子悬液，镜检无细胞重叠。

(b)、为了获得番茄红素高产菌株，经过对比多种诱变方法，选用亚硝基胍(MNNG)诱变三孢布拉氏霉菌（blakesleatrispora）菌株的方法。从在液体培养基中的三孢布拉氏霉菌（blakesleatrispora）培养物中获得待诱变的细胞混悬液。在20℃和100rpm下，将10⁸细胞／ml在250ug／mlMNNG溶液的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH5.0中温浴60～120min，然后将诱变细胞在液体培养基中，26～30℃、100rpm下培养10小时。

(c)、诱变菌株的筛选：

筛选：将步骤(b)诱变得到的固体单菌落接入种子培养基，在培养温度26~30℃，200rpm摇床转速下扩大培养36～60h后，按5~15%(v/v)的接种量接入发酵培养基。26~30℃，200rpm摇床转速下培养60～84h后下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液测定发酵液中番茄红素含量。取发酵番茄红素含量最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a)~(c)，直至筛选出番茄红素产量高的目标菌株三孢布拉霉blakesleatrispora

步骤(b)中所用的固体平板培养基为：碳源2.0%~4.0%、氮源0.5%~1.5%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水，pH7.0~7.2；其中所述碳源为葡萄糖和木薯粉中的一种或两种的混合；所述氮源为麦芽浸粉和酵母膏中的一种或两种的混合。

步骤(c)中所用的种子培养基为：碳源3.0%~5.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.1%~0.4%，其余为水，pH7.0~7.2；其中所述碳源为葡萄糖和木薯粉中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。

步骤(c)中所用的发酵培养基为：碳源1.0%~3.0%、氮源2.0%~6.0%、无机盐0.1%~0.4%、植物油1.0%~4.0%、微量元素0.0001%~0.0004%，其余为水，pH7.0~7.2；其中所述碳源为葡萄糖、木薯粉中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合；所述植物油为玉米油、大豆油、花生油中的一种或几种混合物；所述的微量元素为维生素B1。

上述筛选出的三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515在发酵生产番茄红素中的应用。

具体步骤如下：

(1)、固体培养：将三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515接种于固体培养基上，培养温度为26~30℃，培养时间为36~60h；

(2)、种子培养：将步骤(1)固体培养的三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515接种到种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为20~50mL，培养温度为26~30℃，240~320rpm摇床转速下培养36~60h；

(4)、发酵培养：将步骤(2)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5~15%(v/v)，500mL培养瓶中装液量为35~65mL，26~30℃，在培养温度为26~30℃、240~320rpm摇床转速下培养36~60h后提高转速到400rpm，继续发酵60~84h。

其中，所述固体培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2.0%~4.0%、氮源0.5%~1.5%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水，pH7.0~7.2；其中所述碳源为葡萄糖和木薯粉中的一种或两种的混合；所述氮源为麦芽浸粉和酵母膏中的一种或两种的混合。

所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源3.0%~5.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.1%~0.4%，其余为水，pH7.0~7.2；其中所述碳源为葡萄糖和木薯粉中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。

所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源1.0%~3.0%、氮源2.0%~6.0%、无机盐0.1%~0.4%、植物油1.0%~4.0%、微量元素0.0001%~0.0004%，其余为水，pH7.0~7.2；其中所述碳源为葡萄糖、木薯粉中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合；所述植物油为玉米油、大豆油、花生油中的一种或几种混合物；所述的微量元素为维生素B1。

本发明有益效果：

本发明采用亚硝基胍诱变，最终筛选获得一株番茄红素高产菌株三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515，可较大幅度提高发酵产物中番茄红素组分且遗传稳定性好，菌株连续传代5次后效价并无明显变化。在5L发酵罐中，以廉价木薯粉为碳源替代葡萄糖等，通过提高转速到400rpm，发酵产番茄红素产量达到1.8g/L，相比原始出发菌株提高了23.4%，既符合降低成本的要求，又避免使用粮食作物作为原料进行工业生产。本技术采用单一菌种培养，直接发酵产生番茄红素，无需混合培养并加入阻断剂，操作简便，使得发酵过程易于控制，且将发酵成本和能耗进一步降低。本技术发明完全符合工业化番茄红素生产菌株的诱变和筛选需要，筛选得到的高产菌种可单独发酵产番茄红素，且并可应用于工业化发酵生产。另外具有重大的社会意义和经济价值。

附图说明

图1：实施例3发酵液中番茄红素色谱图，从图上可以看出，在此方法下产出的番茄红素含量高，并且发酵液中其他类胡萝卜素含量相对较低，这样易于后道分离提取。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1:本实施例说明将三孢布拉氏霉菌出发菌株进行诱变的方法。

以实验室保存的三孢布拉氏霉菌VR-5(-)为出发菌株，进行诱变，具体步骤如下：

(b)、为了获得番茄红素高产菌株，经过对比多种诱变方法，选用亚硝基胍(MNNG)诱变三孢布拉氏霉菌（blakesleatrispora）菌株的方法。从在液体培养基中的三孢布拉氏霉菌（blakesleatrispora）培养物中获得待诱变的细胞混悬液。在20℃和100rpm下，将10⁸细胞／ml在250ug／mlMNNG溶液的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH5.0中温浴60～120min，然后将诱变的孢子接种到固体培养基上，26～30℃，培养36h后获得分离的菌。

(c)、诱变菌株的筛选：

初筛：将步骤(b)诱变后固体培养基上得到的单菌落接至种子培养基中于26~30℃、240~320rmp摇床转速下扩大培养36~60h，以5~15%(v/v)的接种量接入发酵培养基，在26~30℃、240~320rpm摇床转速下培养36~60h后提高转速到400rpm，继续发酵60~84h。取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液测定发酵液中番茄红素含量。取发酵液番茄红素含量最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a)~(c)，如图1所示。最后筛选出番茄红素产量最高的目标菌株三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515。

步骤(b)中所用的固体培养基为：木薯粉3.0%，麦芽浸粉1.0%，琼脂粉1.5%，pH7.0~7.2，蒸馏水配置。

步骤(c)中所用的种子培养基为：木薯粉4.0%，黄豆饼粉2.0%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.05%，pH7.0~7.2，自来水配置。

步骤(c)中所用的发酵培养基为：木薯粉2.0%，黄豆饼粉4.0%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.05%，玉米油3.0%，维生素B₁0.0002%，pH7.0~7.2，自来水配置。

实施例2：本实施例说明突变株的传代稳定性。

本发明菌株三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515主要形态及生物学特征如下：

菌落在PDA培养基上为浅黄色，在好氧条件下生长，菌落个体大，圆形菌落，菌丝体厚，边缘整齐，质地均匀；适宜生长温度为27.5～28.5℃。适宜生长pH为7.0～7.2。

在以木薯粉为碳源的发酵培养基中，检测突变株三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515的传代稳定性，菌株传代发酵试验结果如表1所示：

表1高产突变菌株三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515稳定性试验

从实验结果可以看出，经过5次传代，突变菌株三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515的番茄红素产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。

实施例3：本实施例说明高产菌株三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515发酵生产番茄红素的工艺。

本实施例所用的培养基配方：

固体培养基为：木薯粉3.0%，麦芽浸粉1.0%，琼脂粉1.5%，pH7.0~7.2，蒸馏水配置。

种子培养基为：木薯粉4.0%，黄豆饼粉2.0%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.05%，pH7.0~7.2，自来水配置。

发酵培养基为：木薯粉2.0%，黄豆饼粉4.0%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.05%，玉米油3.0%，维生素B₁0.0002%，pH7.0~7.2，自来水配置。

将三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515接种于固体培养基上，培养温度为28℃，培养时间为48h；将固体培养的三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，280rpm转速下培养48h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为7.2，接种量为10%(v/v)，500mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28℃，220rpm摇床转速下培养48h后提高转速到400rpm，继续发酵72h。发酵产番茄红素产量为1.75g/L，相对于原始出发菌株提高了19.8%。

实施例4：本实施例说明高产菌株三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515发酵生产番茄红素的工艺。

本实施例所用的培养基配方：

固体培养基为：葡萄糖3.0%，麦芽浸粉1.0%，琼脂粉1.5%，pH7.0~7.2，蒸馏水配置。

将三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515接种于固体培养基上，培养温度为28℃，培养时间为48h；将固体培养的三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，280rpm转速下培养48h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为7.0，接种量为10%(v/v)，500mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28℃，220rpm摇床转速下培养48h后提高转速到400rpm，继续发酵72h。发酵产番茄红素产量为1.77g/L，相对于原始出发菌株提高了21.2%。

实施例5：本实施例说明高产菌株三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515发酵生产番茄红素的工艺。

本实施例所用的培养基配方：

将三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515接种于固体培养基上，培养温度为28℃，培养时间为48h；将固体培养的三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，280rpm转速下培养48h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为7.2，接种量为10%(v/v)，500mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28℃，220rpm摇床转速下培养48h后提高转速到400rpm，继续发酵72h。发酵产番茄红素产量为1.77g/L，相对于原始出发菌株提高了21.2%。

实施例6：本实施例说明高产菌株三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515发酵生产番茄红素的工艺。

本实施例所用的培养基配方：

将三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515接种于固体培养基上，培养温度为28℃，培养时间为48h；将固体培养的三孢布拉氏霉菌blakesleatrisporaV-6515培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，280rpm转速下培养48h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为7.0，接种量为10%(v/v)，500mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28℃，220rpm摇床转速下培养48h后提高转速到400rpm，继续发酵72h。发酵结束后检测发酵液中产番茄红素产量为1.82g/L，相对于原始出发菌株提高了23.4%。

实施例7：本实例说明发酵液中番茄红素产量的检测方法。

仪器设备：高效液相色谱仪、色谱工作站、离心机、超声清洗器、漩涡混合器、微量进样器、微孔滤膜、色谱柱为Agilent不锈钢柱（内装填料PLRS-S，10nm，长250nm，内径4.6mm）等。

试剂：色谱甲醇、四氢呋喃

检测条件：流动相为甲醇：四氢呋喃：水（70：:26:4）；流速为1.5mL·min^-1；检测波长为472nm，进样量20μL。

操作步骤

(1)标样的制备

准确称取番茄红素标准品0.05g(精确至0.0002g)溶于50mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。再用移液管取1mL至10mL容量瓶，色谱甲醇溶解，并定容至刻度，备用。

(2)样品制备

取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液经一定稀释后用微孔滤膜过滤后进行HPLC检测。

在上述条件下，待仪器稳定后注入标样溶液连续两针标样番茄红素峰面积相对变化小于1.5%后，再将制备好的样品进样检测。图1为标样及发酵液中番茄红素色谱图。

(3)计算方法

番茄红素产量（g/L）=(样品峰面积/标准品峰面积)×标准品浓度×稀释倍数。

Claims

1.一种番茄红素高产菌株，其分类命名为三孢布拉氏霉菌（blakesleatrispora）V-6515，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCNO：M2013583。

2.权利要求1所述的番茄红素高产菌株在发酵生产番茄红素中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的发酵生产番茄红素的方法包含如下步骤：

(1)、固体培养：将三孢布拉氏霉菌(blakesleatrispora)V-6515接种于固体培养基上，培养温度为26~30℃，培养时间为36~60h；

(2)、种子培养：将步骤(1)固体培养的三孢布拉氏霉菌(blakesleatrispora)V-6515接种到种子培养基中，培养温度为26~30℃，240~320rpm摇床转速下培养36~60h；

(3)、发酵培养：将步骤(2)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为按体积比5~15%接种，培养温度为26~30℃，240~320rpm摇床转速下培养36~60h后提高转速到400rpm，继续发酵60~84h。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述固体培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2.0%~4.0%、氮源0.5%~1.5%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水，pH7.0~7.2；其中所述碳源为葡萄糖和木薯粉中的一种或两种的混合；所述氮源为麦芽浸粉和酵母膏中的一种或两种的混合。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源3.0%~5.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.1%~0.4%，其余为水，pH7.0~7.2；其中所述碳源为葡萄糖和木薯粉中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源1.0%~3.0%、氮源2.0%~6.0%、无机盐0.1%~0.4%、植物油1.0%~4.0%、微量元素0.0001%~0.0004%，其余为水，pH7.0~7.2；其中所述碳源为葡萄糖、木薯粉中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合；所述植物油为玉米油、大豆油、花生油中的一种或几种混合物；所述的微量元素为维生素B1。