DE2739449A1 - Hydroxypatschulol, herstellungsverfahren und verwendung zur herstellung von patschulol-derivaten - Google Patents

Description

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22394*9

Patentanmeldung

Anmelder: F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. AKTIENGESELLSCHAFT 124-184 Grenzacherstraße Basel (Schweiz)

Titel:

Hydroxypatschulol, Herstellungsverfahren und Verwendung zur Herstellung von Patschulol-Derivaten

809812/0662

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1Α-Α9 742

2239449

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Patschulol-Derivaten und insbesondere die Hydroxylierung von Patschulol.

Patschulol ist ein natürlich vorkommender Alkohol, der zu einem erheblichen Anteil (35-40 %) in Patschuli-Öl vorhanden ist, wenn dieses durch Dampfdestillation der getrockneten Blätter von Pogostemon cablin Benth (syn. P. patchouli pellet var. suavis Hook) gewonnen wird. Patschulol besitzt die Struktur

und den systematischen Namen
1,6-methanonaphthalin-1-ol. Obwohl es in einer so großen Menge in Patschulolöl vorhanden ist, ist reines Patschulol ziemlich geruchlos.

Es hat sich kürzlich gezeigt, daß der Hauptgeruchsträger des Patschuli-Öls tatsächlich Norpatschulenol ist mit der Struktur

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II

d.h. 4a,5,6,7,β,8a-Hexahydro-8a,9,9-trimethyl-1,6-methanonaphthalin-1(2H)-ol (s.DT-OS 2 242 913 und "Recherches"-Roure Bertrand Dupont, Juli 1974, S. 8, 36 und 69).

Seit der Veröffentlichung der Struktur von Norpatschulenol und dessen Geruchseigenschaften wurden viele Versuche unternommen, um ein durchführbares Syntheseverfahren zu entwickeln. Eine kommerziell geeignete chemische Totalsynthese konnte jedoch noch nicht gefunden werden. Eine Teilsynthese ist angegeben in Tetrahedron letters Nr. 26, S. 2211-2214, 1975. Diese Synthese, die von Patschulol ausgeht, besitzt jedoch den erheblichen Nachteil, daß eine in-vivo Hydroxylierung von Patschulol erforderlich ist, bei der zwangsgefütterte Kaninchen oder Hunde angewandt werden müssen.

Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, daß trotz seiner ungünstigen biologischen Eigenschaften Patschulol durch bestimmte Mikroorganismen hydroxyliert werden kann, wodurch die Möglichkeit zu einer einfach durchführbaren Teilsynthese von Norpatschulenol eröffnet wird, ausgehend von dem in verhältnismäßig großer Menge vorhandenen Patschulol.

Es hat sich ferner gezeigt, daß die Hydroxylierung an verschiedenen Stellen des Patschulolmoleküls stattfinden kann, wodurch eine Reihe neuer Verbindungen zugänglich wird, die als Zwischenprodukte angewandt werden können, nicht nur zur Herstellung von Norpatschulenol sondern auch zur Herstellung von Patschulion und anderen verwandten Verbindungen.

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Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Hydroxylierung von Patschulol, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Patschulol unter wäßrigen aeroben Bedingungen in Gegenwart eines oxidierenden Mikroorganismus hydroxyliert. Der Mikroorganismus ist vorzugsweise ein Fungus (Pilz). Diese Hydroxylierung von Patschulol ist eine biologische Umwandlung (Bio-Umwandlung). Diese biologische Umwandlung kann mit Hilfe irgendeines Mikroorganismus durchgeführt werden, der imstande ist, eine Hydroxylierung von Patschulol an einer oder mehreren Stellungen in dem Molekül hervorzurufen.

Das entstehende Gemisch von hydroxylierten Patschulolen kann gegebenenfalls durch chemische oder physikalische Verfahren aufgetrennt werden. Derartige Verfahren umfassen die Bildung von chemischen Derivaten oder Dünnschicht- bzw. Ga s-Chromatographi e.

Die Hydroxylierung kann durchgeführt werden durch biologische Umwandlung von Patschulol in einer aerob wachsenden Kultur des entsprechenden Mikroorganismus in einem submersen Fermentationsverfahren. Das Patschulol kann günstigerweise zu dem gezüchteten Mikroorganismus in Form eines sehr feinteiligen Pulvers oder einer Emulsion oder als Lösung in einem geeigneten organischen Lösungsmittel zugegeben werden. Das bevorzugte Lösungsmittel hierfür ist Dimethylsulfoxid, obwohl andere organische Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol oder Aceton ebenfalls angewandt werden können.

Der Mikroorganismus wird günstigerweise vor der Anwendung für die erfindungsgemäße biologische Umwandlung gezüchtet und zwar in an sich bekannter Weise in einem wäßrigen Medium in Gegenwart der üblichen Nährsubstanzen, d.h. in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Dextrin, Maltose, Maisstärke, Melasse oder Glycerin, einer Stickstoffquelle, wie Maiswasser, Harnstoff, Pepton, Hefeextrakt, Sojamehl, Fleischextrakt, einer oder mehreren Aminosäuren oder einem Ammoniumsalz, anorganischen Salzen, wie

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Λ%

Magnesium-, Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Eisensalzen, und anderen Wachstumsbeschleunigern, wie Aminosäuren und Vitaminen. Es ist auch zweckmäßig, das gleiche Kulturmedium für die biologische Umwandlung anzuwenden, obwohl, wie später näher erläutert wird, die Zusammensetzung des Mediums für die tiologische Umwandlung wesentlich einfacher sein kann.

Es ist auch möglich, die biologische Umwandlung in Abwesenheit anderer Zusätze als des PatschuloLsund des anzuwendenden Mikroorganismus durchzuführen. Es ist Jedoch vorteilhaft, eine zusätzliche Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff als Nährsubstanz für den Mikroorganismus zuzusetzen, um die Lebensfähigkeit und metabolische Aktivität des Mikroorganismus solang wie möglich aufrechtzuerhalten. Die Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff wird vorzugsweise in einer Menge von ungefähr 5 bis 100 g, vorzugsweise 25 bis 50 g/l zugesetzt, und kann z.B. ein Zucker, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose oder Dextrin, oder eine andere Kohlenstoffquelle, wie Maisstärke, Melasse oder Glycerin sein. Mehr als 100 g der Kohlenstoffquelle pro 1 Nährmedium beeinflußt das Ergebnis nicht und ergibt keine anderen Vorteile als sie bei der Verwendung von 10 bis 100 g der Kohlenstoffquelle auftreten. Die Stickstoffquelle wird vorzugsweise in einer Menge von ungefähr 1 bis 20 g/l zugesetzt. Die Quelle für assimilierbaren Stickstoff kann z.B. Maisquellwasser, Harnstoff, Pep ton, Hefe extrakt, Fleischextrakt, Aminosäuren, Ammoniumsalze und ähnliches sein. Das Kulturmedium kann auch anorganische Salze, wie Magnesium-, Natrium-, Kalium-, Calcium- und/oder Eisensalze, andere das Wachstum beschleunigende Substanzen, wie Aminosäuren, Vitamine und ähnliches enthalten.

D_er pH-Wert, bei dem die biologische Umwandlung durchgeführt wird, liegt vorzugsweise im Bereich von 2 bis 10, besonders 3 bis 8, und diese V/er te werden üblicherweise ohne spezielle Zusätze erreicht. Gegebenenfalls kann der pH-Wert durch Zugabe von anorganischen oder organischen Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, Oxalsäure oder Propionsäure, oder Basen,

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wie Natriumhydroxid, oder durch Anwendung von Puffeäi{ 3evÄ^* Phosphat? Phthalat-oder Trispuffer jjfTris-Chydroxymethyl)-, aminomethan/ oder durch Zugabe eines Zuckers, wie Glucose, gesteuert werden. Die Temperatur, bei der die Fermentation durchgeführt wird, kann innerhalb weiter Grenzen variieren. Eine Temperatur von 15 bis 35°C, besonders 2k bis 32°C ist bevorzugt. Die Konzentration an Patschulol in dem Hydroxylierungsmedium sollte so gewählt werden, daß man eine optimale Ausbeute erhält. Die optimale Ausbeute muß nicht notwendigerweise die höchste Ausbeute sein, da diese manchmal bei sehr niederen Verdünnungen erzielt wird. In der Praxis kann die Konzentration an Patschulol günstigerweise 0,005 bis mehr als 2 Gew.-96 betragen und beträgt vorzugsweise 0,01 bis 1 Gew.-?6. Wenn die angewandte Konzentration zu gering ist, wird das Verfahren unwirtschaftlich, z.B. müssen die erforderlichen Reaktionsgefäße zur Bildung einer geeigneten Menge an Hydroxy-patschulol zu groß sein, während_ywenn die Konzentration zu hoch ist, kaum eine Reaktion stattfindet.

Die Zeit für die biologische Umwandlung variiert, je nach dem verwendeten Mikroorganismus, und kann z.B. 18 bis 144 Stunden betragen, liegt jedoch günstigerweise im Bereich von 18 bis 60 Stunden. In einigen Fällen wird die maximale Ausbeute jedoch erst bei ungefähr 120 Stunden erreicht.

Die biologische Umwandlung wird aerob durchgeführt, vorzugsweise unter Rühren, Schütteln oder mit Hilfe eines Belüftungsverfahrens. Um die Schaumbildung zu steuern, kann ein übliches Antischaummittel, wie ein Siliconöl, PoIyalkylenglykol-Derivate, Sojabohnenöl, oder ähnliches zugesetzt werden.

Der Zeitpunkt, zu dem das Vermischen des vorgezüchteten Mikroorganismus mit dem Patschulol stattfindet, kann von Bedeutung sein. Bei einigen Mikroorganismen fällt der pH-Wert anfangs um eine halbe bis eine Einheit. Wenn der pH-Wert wieder zu steigen beginnt und die Biomasse der Kultur zunimmt,

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ist der günstigsten Zeitpunkt, um das Patschulolsubstrat zuzusetzen. Änderungen des pH-Werts während der Vorkultur , können jedoch auch auftreten, in Abhängigkeit von dem verwendeten Mikroorganismus und dem verwendeten Medium. Wenn bestimmte Mikroorganismen verwendet werden, fällt der pH-Wert nicht während der gesamten Vorkultur, während es andere Mikroorganismen gibt, die zu einem pH-Abfall um soviel wie 2,5 Einheiten führen können.

Das erfindungsgemäße Hydroxylierungsverfahren kann nicht nur zur Hydroxylierung der 10-Stellung führen, sondern auch an anderen primären, sekundären und/oder tertiären Kohlenstoffatomen des Patschulols. Das Produkt kann ein Diol, Triol, Polyol usw. sein, abhängig von der Anzahl der eingeführten Hydroxylgruppen. Die Stellung und das Ausmaß der Hydroxylierung variieren mit dem verwendeten Mikroorganismus und den Bedingungen der biologischen Umwandlung.

Im folgenden sind hydroxylierte Patschulole angegeben, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten worden sind, zusammen mit ihren physikalischen Eigenschaften.

Decahydro-4,6a,9,9-tetramethy1-1,6-

inethanonaphthalin-l,10-diol (iin folgenden häufig bezeichnet als 10-1-iydroxy-patschulol)
Fp. 1O4;5-1O5,8°C

[a]^⁵ : -124° (c = 0,5 in CHCl₃)

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- sr-

/15

VIl

Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl-l,6-methanonaphthalin-l,4a-diol Fp. 118,0-120,O⁰C; [d^⁵= -69,3°(c = 0,501 in CHCl₃)

VIi a

Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl-l,6-methanonaphthalin-l,6-diol Fp. 116,5-117,0°C; [σ]^⁵ = -105° (c = 0.2 in CHCl₃)

VIII

Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl-l,6-methanonaphthalin-l,7-diol Fp. 109,5°C; [a]£⁵ = -87,2 (c = 1,00 in CHCl₃)

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Ai₉

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Ein Gemisch der endo- und exo-Epimeren von Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl-l,6-methanonaphthalin-l,8-diol Exo-isomer Fp. 158,1-158,4°C, Endo-isomer Fp. 195-196°C

Decahydro-4,8a,9, 9-tetramethyl-l,6-methanonaphthalin-1,6,8-triol Fp. 156-158°C [a]^⁵ = -61,5° (c = 0.333 in CHCl₃).

Die vorliegende Erfindung betrifft deswegen auch hydroxylierte Patschulole der allgemeinen Formel

in der 1 oder 2 der Reste R eine Hydroxygruppe bedeuten und die anderen ein Wasserstoffatom (mit Ausnahme von 10-Hydroxy patschulol).

Die Verbindungen der Formel IX sind von besonderem Wert, da sie durch Behandlung mit einer Säure nach dem folgenden Reaktionsschema umgewandelt werden können in Patschulion.

IX

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_ or _

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Bildung von Patschulol, das an dem 1O-Kohlenstoffatom hydroxyliert ist. Diese Verbindung ist besonders wertvoll für die anschließende Umwandlung in den wertvollen Duftstoff Norpatschulenol.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Patschulol-Derivaten der Formel

in der R die Gruppe -CHpOH oder -COOH bedeutet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Patschulol der Formel

unter wäßrigen aearoben Bedingungen in Gegenwart eines oxidierenden Mikroorganismus biologisch umgewandelt wird unter Bildung des Produktes der Formel III, in der R -CHpOH bedeutet (d.h. 1O-Hydroxypatschulol), dieses Produkt gegebenenfalls isoliert wird und gegebenenfalls die Verbindung der Formel III, in der R -CH₂OH bedeutet, oxidiert wird unter Bildung der Verbindung der Formel III, in der R -COOH bedeutet.

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- ye -AZ

Die oben angegebene mikrobiologische Hydroxylierung von Patschulol kann durchgeführt werden unter Anwendung irgendeines Mikroorganismus, der die gewünschte Oxidation in 10-Stellung des Patschulolmoleküls bewirkt. Eine große Anzahl von Mikroorganismen, besonders Pilzen,%aben sich als geeignet erwiesen, um die gewünschte Hydroxylierung durchzuführen, obwohl gleichzeitig andere Hydroxylierungen an anderen Stellungen des Patschulolmoleküls in einem mehr oder weniger starken Ausmaß, je nach der Art des Mikroorganismus stattfinden.

Nach Beendigung der biologischen Umwandlung kann das 10-Hydroxypatschulol aus der Fermentationsbrühe isoliert werden. Das kann durch irgendeine übliche physikalische oder chemische Trennmethode erreicht werden. Wenn man berücksichtigt, daß 10-Hydroxypatschulol in erster Linie vorgesehen ist als Zwischenprodukt für die weitere Umwandlung zu Norpatschulenol kann die Isolierung von 10-Hydroxypatschulol in reinem Zustand weder erforderlich noch erwünscht sein. Das Diol kann jedoch gegebenenfalls von dem Kulturmedium isoliert werden durch übliche Säulenchromatographie oder durch Bildung eines funktioneilen Derivats der primären Hydroxylgruppe in 10-Stellung. Dieses Derivat kann dann von hydroxyl!erten Patschuolen, in denen die Hydroxylgruppe sekundär oder tertiär ist, abgetrennt werden. Ein geeignetes Derivat wird mit Essigsäureanhydrid gebildet. Nach der Abtrennung kann die funktionelle Gruppe wieder entfernt werden.

Die Abtrennung von 10-Hydroxypatschulol kann auch bequem durchgeführt werden unter Anwendung eines Gegenstrom-Verteilungs-Verfahrens. Das kann erreicht werden unter Anwendung von nicht mischbaren Phasen, wie Chloroform-Tetrachloräthan als eine Phase, und Methanol (oder Äthanol)-Wasser als andere Phase.

10-Hydroxypatschulol der Formel

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ist ein wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung des Duftstoffes Norpatschulenol der Formel

zu dem es über die entsprechende Säure der Formel

Vl

'"COOH

umgewandelt werden kann.

../12

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Diese zuletzt genannte Umwandlung der Säure in Norpatschulenol kann durchgeführt werden durch oxidative Decarboxylierung nach dem in Tetrahedron Letters 1975 (26), S. 2211 angegebenen Verfahren. Die Herstellung der Verbindungen der Formeln V und VI sowie diese Verbindungen selbst sind in der DT-OS 2 529 603 beschrieben.

Die Oxidation des Diols der Formel V zu der Hydroxysäure der Formel VI kann durch irgendein geeignetes selektives Oxidationsverfahren für eine, primäre Hydroxylgruppe durchgeführt werden, z.B. unter Anwendung von Platinschwarz .

In den folgenden als Tabelle I bzw. Tabelle III bezeichneten Listen und in einigen der Beispiele sind ausgewählte Mikroorganismen angegeben, von denen sich gezeigt hat, daß sie unter Verwendung von Patschulol als Substrat den gewünschten Metaboliten, nämlich 10-Hydroxypatschulol ergeben. Es ist festzustellen, daß die folgenden Mikroorganismen allgemein auch Patschulol an anderen Stellungen als der 10-Stellung hydroxylieren und daß, um den gewünschten Metaboliten zu erhalten, eine Trennung durchgeführt werden muß. Diese Trennung kann durch DünnschichtChromatographie auf Silicagel unter Anwendung von Äther oder Äther-Chloroform-Gemischen, mit Hilfe üblicher Gegenstrom-Verteilungsverfahren oder unter Bildung eines funktioneilen Derivats, wie oben beschrieben, durchgeführt werden.

Für die in Tabelle I angegebenen biologischen Umwandlungen wurden die Mikroorganismen 24 Stunden vor der Zugabe von Patschulol gezüchtet und die eigentliche biologische Umwandlung 48 Stunden durchgeführt mit Ausnahme von 1 oder Fällen, wo sie 72 Stunden lang ablief.

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Es hat sich gezeigt, daß Mikroorganismen der folgenden Arten Patschulol hydroxylieren können und insbesondere, daß sie eine hohe Ausbeute an 1O-Hydroxypatschulol der Formel V ergeben:

Absidia, Arthrinium, Aspergillus, Aureobasidium, Beauveria, Botryodiplodia, Calonectria, Cephalosporium, Choanephora, Cochliobus, Cladosporium, Coniothyrium, Cunninghamella, Curvularia, Daldinia, Diplodia, Emerioellopsis, Euroticun, Fursariun, Gliocladium, Gliomastix, Glomerella, Gongorella, Gymnophilus, Kabatiella, Metaspaeria, Mortierella, Mucor,

Norcardia, Paecilomyces, Pellicularia, Penicillium, Pithomyces, Phoma, Rhizopus, Sesquicillium, Sporotrichum, Streptomyces, Thamnostylum, Trichoderma.

Obwohl aus den Tabellen I und III hervorgeht, daß eine sehr große Anzahl von Mikroorganismen (die obige Liste ist natürlich in keiner Weise erschöpfend) zu einem gewissen Teil das gewünschte 1O-Hydroxypatschulol liefern, ist es bevorzugt, einen Mikroorganismus zu verwenden der sowohl eine gute Ausbeute an 1O-Hydroxypatschulol, bezogen auf das PatschulolausgangsmaterM, liefert als auch ein günstiges Verhältnis von 10-Hydroxyverbindung zu Patschulol-Derivaten, die in anderen Stellungen als der 10-Stellung hydroxyliert sind. Derartige Mikroorganismen sind u.a.

Gliocladium roseum (NRRL 8194) (FERM P-3957) Glomerella rubicola (CBS 200.35)

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- Vt -

Calonectria decora (atcC 14767) Cephalosporin coremioides (NRRL 11003) (IFO 8579) Aspergillus oryzae (NRRL 11004) (IAM 3011)

Cladosporium sp. (NFiRL Y-11005) auch bezeichnet als Aureobasidium (IFO 6403).

Botryodiplodia theobramae (IFO-6469) Phoma sp. (FERM P-3798) Pithomyces chartarum var. Japonicum (FERM P-3828) Pithomyces niger nov. sp. (FERM P-3829) Pithomyces cynodontis (ATCC 26150) Penicillium rubrum (FERM P-3796) (NRRL 11055)

Paecilorayces carneus (FERM P-3797) (NRRL 11054) Pithomyces atroolivaceus (IFO 6651)

Aus der obigen Liste geht hervor, daß drei Stämme der Art Pithomyces zu einer besonders guten Ausbeute an 10-Hydroxy-Datschulol führen und die Verwendung von Mikroorganismen die-

ist
ser Arten daher erfindungsgemäß bevorzugt.

Hinterlegungsstelle

NRRL Northern Regional Research Laboratory of the US Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A.

ATCC American Type Culture Collection, Rockville,. Maryland, USA

IFO Institute of Fermentation, Osaka, Japan

../15

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IAM Institute of Applied Microbiology University of Tokyo,

Japan

CBS Centraal-Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland ETH Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich,

Switzerland
FERM Fermentation Research-Institute, Agency of Industrial

Science and Technology, Chiba, Japan.

Spezielle Organismen, die zu bestimmten anderen

hydroxyIierten Produkten in hohen Ausbeuten führen, sine

Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl- Gliocladium roseum l,6-methanonaphthalin-1,6-diol (NRRL 8194) (FERM P-3957)

Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl- Fusarium lycopersici l,6-methanonaphthalin-1,5-diol (NRRL 1985)

Decahydro-4,8a,9,9-tetramethy1-1,6-methanonaphthalin-1,8-diol

(endo-oder exo- Isomer)

Curvularia lunata (Auch als Curvularia falcata bekannt) (NRRL 2380)

Norcardia lurida (ΕΤΗ 24315)

Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl- Aspergillus niger 1,6-methanonaphthalin -1,6,8-triol (ATCC 11394)

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Zwei der Species der Art Pithomyces, die zu einer beson ders hohen Ausbeute an 10-Hydroxypatschulol führen, sind neu und sind gewonnen aus Erdproben in Japan. Diese Stämme sind Pithomyces chartarum var. Japonicum, jetzt hinterlegt unter Nr. FERM P-3828 und

Pithomyces niger nov. sp., jetzt hinterlegt unter Nr. FERM P.3829 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan.

Die Erfindung bezieht sich auch auf diese neuen Stämme und ihre mykologische und taxonomische Charakterisierung ist im folgenden im einzelnen angegeben:

Taxonomische Charakterisierung und Identifizierung der neuen Stämme FERM P-3828 und FERM P-3829

Die für die Taxonomie verwendeten Medien waren die folgenden:

	Tabelle 1
Medium A (Czapek-Dox)
Glucose	30 g
K2HPO4	ι g
MgSO4 7H2O	0,5 g
NaNO3	2 g
KCl	0,5 g
FeSO4	0,01 g
Agar	20 a /

20 g / 1 000 ml (pH 5_;6)

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Medium B ( KartoffeV-dextrose, Eiken.Co., Ltd,)

Kartoffel-extrakt "Eikoi' 200 g Glucose 20 g

Agar 15 g / /JOOO ml (pH 5,6)

Medium C (Malz-extralr t-A gar Medium)

Malz extrakt 20 g

Glucose 20 g

Pepton 1/0 g

Agar 20 g / -fOOO ml

Medium D (Hafermehl-Agar)

Difco ISP-fedium 3

Agar

22 g / 1 0j5%

Medium E (Sabouraid)

Pepton

Glucose Agar

10 g 20 g 10 g / 4^{000 ml}

Allgemeine Eigenschaften und gemeinsame Merkmale der beiden Stämme

Da Vorversuche unter Anwendung des Mediums A zeigten, daß beide Stämme fadenförmige Fungi Imperfecti waren, die im pH-Bereich von 5 bis 7 und im Temperaturbereich von 22 bis 30⁰C wuchsen, wurden alle Beobachtungen unter diesen Bedingungen durchgeführt durch Aufimpfen von Sporen in die Mitte von Petri-Schalen, um die Bildung von großen zusammenfließenden Kolonien zu ermöglichen. Die Mycel- und andere Färbungen wurden mit Hilfe des

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"Standard Color Manual" herausgegeben von Nippon Shikisai-Sha, Tokyo, Japan, bestimmt.

Kolonien der beiden Stämme breiteten sich an der Oberfläche der verschiedenen getesteten Agarnährböden, siehe Tabelle I oben, aus, olivgrün bis schwärzlich gefärbt je nach Nährboden und Alter der Kultur. Mycele, die aus 3 verschiedenen Hyphenarten bestanden, bildeten sich an der Oberfläche und entwickelten hyalines haariges weißes Luftmycel, im Falle des Stammes FERN P-3828 sehr reichlich, im Falle des Stammes FERM P-3829 etwas weniger. Die Konidienträger waren üblicherweise micronematös oder manchmal semi-makronematös und häufig mit den Konidien erzeugenden Zellen integriert. Die reifen Konidien traten einzeln auf, bildeten niemals Ketten, waren meist ellipsoid, warzige pleurogenöse Aleuriosporen in Mauerform mit sowohl Quer- wie Längssepten, strohfarben bis dunkelbraunfarben. Die Konidiogenesis war monoblastisch nach Ellis' Klassifikation (M.B. Ellis, Dermatiaceous Hyphomycetes, C.M.I. Kew, Surrey, 1971). Diese Eigenschaften zeigen deutlich, daß beide Stämme der Art Pithomyces BERKELEY and BROOME, 1873 (J. Linn. Soc, 14, 100, 1873) zugehören.

Beschreibung und Zuordnung der Arten zu Pithomyces Stamm FERM P-3828

Wachstumscharakteristika in verschiedenen Medien 1. Medium A

Nach 5 Tage langem Wachstum bei 27°C bildete die Kolonie ein filziges, über die Oberfläche ausgebreitetes Mycel mit einem Durchmesser von 41 bis 46 mm blaß-olivfarben und

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entwickelte ein weißliches Luftmycel von dem Rand nach der Mitte hin. Die Rückseiter war dunkelolivgrau bis schwärzlich. Konidien wurden am 4. bis 6. Tag der Kultur von dem leicht unregelmäßigenRan^ereich aus gebildet, der bei der gealterten Kultur dunkler bis schwärzlich wurde. Das Ausmaß der Konidienbildung war mittelmäßig. Es wurde wenig Sektorbildung beobachtet. Es bildete sich kein Ascocarp.

*) bzw.Unterseite

2. Medium B

Bei 7 Tage langem Wachstum auf Medium B bei 27°C erhielt man eine Kolonie mit einem Durchmesser von 54 bis 63 mm, die charakterisiertwar durch konzentrische kreisförmige Bänder, die schwärzlich bis olivgrau waren und ungleichmäßig mit schmetterlingsförmigen Sektoren von filzartigem Mycel bedeckt waren, das grauoliv war. Die Rückseite war oliv-schwarz mit konzentrischen kreisförmigen Bändern und einer gewissen Sektorbildung. Es wurde kein Ascocarp gebildet und die Konidienbildung war sehr reichlich, besonders am Rande der Kolonie nach 2-wöchigern Wachstum.

3. Medium C

Das Wachstum war ziemlich gut mit Bildung von filzartigen Kolonien mit einem Durchmesser von 71 bis 77 nun, die blaß-oliv bis olivbraun waren und reichlich Luftmycel bildeten. Ein Teil der Kolonie besaß einen blaßgefärbten filzartigen Sektor, während andere Sektoren dunkler waren und reich an Konidien bei älteren (14 bis 26 Tage) Kulturen. Die Rückseite war olivgrün bis olivschwarz mit radialen schwarzen Streifen.

4. Medium D

Das Wachstum war gut auf dem Medium und ergab nach 3 Tagen eine Kolonie mit einem Durchmesser von 40 mm und eine zusammenfließende Kolonie nach 14 Tagen. Das Substratmycel war olivgrün bis dunkelgrün und zeigte eine deutliche Sektorbildung. Weißliches filzartiges Luftmycel war reichlich im

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Mittelteil vorhanden. Außerhalb dieses Sektors war die Farbe etwas blasser, und es wurde ein konzentrisches kreisförmiges Muster beobachtet. Die Rückseite war dunkelgrünlich-schwarz oder blasser an den Rändern. Es war keine deutliche Konidienbildung zu beobachten.

5. Medium E

Das Wachstum war mäßig. Der Durchmesser der Kolonie nach 12 Tagen betrug 78 bis 80 mm. Die Kolonie war weißlichbraun und mit einem filzartigen weißlichen Luftmycel bedeckt. Der Rand der Kolonie war nicht glatt sondern ziemlich eingekerbt. Die Rückseite war rötlich-braun mit konzentrischen Ringen, die abwechselnd dunkel und blaß waren. Es gab keine merkliche Konidienbildung.

Physiologische Eigenschaften

Auf dem Medium A bildete der Stamm gute Kolonien bei 10 bis 37°C, wobei 25 bis 27⁰C die optimale Temperatur war. Bei 30⁰C betrug die Größe der Kolonie ungefähr 60 % derjenigen bei 27°C Über den pH-Bereich von 5,5 bis 7,0 zeigte das Wachstum keine drastischen Unterschiede.

Mikroskopische Beobachtungen
1. Konidien und Konidiophoren

Obwohl die Bildung und Reifung von Konidien in der Geschwindigkeit variierte, je nach verwendetem Medium, waren die reifen Konidien ziemlich gleichmäßig, sowohl in der Form als auch in der Größe. Unreife Konidien waren keulenförmig und mit Warzen besetzt. Ein Vergleich der reifen Konidien wurde auf dem Medium B durchgeführt. Db reifen Konidien waren dunkelbraun und gleichförmig ellipsoid. Wenn sie keulenförmig, pyramidenförmig oder nierenförmig waren, waren kaum Konidien zu beobachten. Alle reifen Konidien besaßen 2 bis 4 Quersepten, wobei am häufigsten Konidien mit

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3 transversalen Septen (Trennhäuten) beobachtet wurden. Nahezu alle besaßen auch 1 oder 2 längs oder schräge Septen. Die Konidien variierten nicht stark in der Größe und waren im Mittel 24 χ 14 /U . Einige isolierte Konidien trugen häufig einen Teil von konidiogenen Zellen, die hauptsächlich in die Konidiophoren integriert waren. Konidiophoren waren meist mikronematös und kurz, d.h. weniger als 10 /U lang. Nur ein oder einige Konidiophoren wuchsen entweder aus dem Hyphen oder dem Luftmycel.

2. Hyphen

In den Mycelien wurden drei deutlich verschiedene Arten von Hyphen beobachtet: 1. dicht pigmentiert, stark mit Septen versehen, manchmal mit Warzen besetzte Hyphen mit einer Breite von 4 bis 8 /u ; 2. dünnwandige, leicht pigmentierte, mit Septen versehene Hyphen von 3 bis θ /U , die auf verschiedenen Medien überaus reichlich vorhanden waren und 3. hyaline, dünne, wenig Septen enthaltende Hyphen mit einer Breite von "1 bis 3 /U , die weitgehend aus Luftmycel bestanden. Es zeigte sich, daß diese Hyphen manchmal zur Anastomosenbildung neigten.

Zuordnung der Arten für FERM P-3828

Die oben angegebenen Eigenschaften des Stammes zeigen, daß er Pithomyces chartarum, Pithomyces maydicus, Pithomyces flavus und Pithomyces sacchari ähnelt Er kann Jedoch leicht unterschieden werden von Pithomyces maydicus durch die Form der konidiogenen Zellen, der Konidiengröße und Anzahl von Quersepten bzw. Scheidewänden und von Pithomyces flavus durch die Tatsache, daß er eine oder mehrere Längsscheidewände enthält.

Der unmittelbare Vergleich mit Pithomyces chartarum und Pithomyces sacchari wurde durchgeführt durch eine Parallelkultur auf dem Medium B. In den Wachstumseigenschaften, der

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Größe und Form der reifen Konidien und Konidiophoren zeigte der Stamm FERM P-3828 deutliche Unterschiede gegenüber Pithomyces sacchari. Von Pithomyces chartarum unterschied er sich in der Farbe auf der Rückseite auf dem Medium A und in dem Sektorenmuster auf dem Medium B, ist jedoch sonst mit Pithomyces chartarum eng verwandt. Wenn die reifen Konidien dieser Stämme verglichen wurden, fanden sich Unterschiede in der Größe und Population (Häufigkeit) der nicht in Längsrichtung liegenden Septen neben den oben erwähnten Wachstumseigenschaften. Was jedoch die Konidiengröße und Septenanordnung betrifft, wird berichtet, daß innerhalb der Species Pithomyces chartarum, je nach dem Ort, Ursprung und Kulturbedingungen, beachtliche Unterschiede auftreten (J.M. Dingle: New Zeal. J. Agric. Res., 5» 49 (1962) ). Daher kann, wenn die großen Ähnlichkeiten in anderen Eigenschaften berücksichtigt werden, der Stamm FERM P-3828 nicht deutlich von Pithomyces chartarum unterschieden werden und wird daher als Pithomyces chartarum var. Japonicum bezeichnet, da er aus Bodenproben in Japan erhalten worden ist.

Beschreibung und Zuordnung von Arten zu Pithomyces-Stamm FERM P-3829

Wachstumseigenschaften auf verschiedenen Medien 1. Medium A

Das Wachstum war gut unter Bildung einer nicht flockigen Kolonie mit einem Durchmesser von 50 bis 70 mm nach 14 Tagen. Die Farbe der Kolonie war zunächst weißlich bis olivgrau und änderte sich dann in dunkelolivgrau und dann in schwärzlich nach 7 bis 8 Tagen. Der Kolonierand war verschwommen und teilweise vorspringend. Es gab nur wenige Luftmycelien, besonders im mittleren Teil der Kolonie. Die Mycelien waren jedoch· ziemlich dunkelgrün gefärbt, was den Eindruck eines Ringes vermittelte. Die Rückseite war ebenfalls

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- 22 -

dunkelolivgrün bis schwarz und zeigte das gleiche T*ing¥örmige Muster.

2. Medium B

Das Wachstum war gut und führte zu einer blaß-olivgrünlichen Kolonie mit einem Durchmesser von 30 mm am 5. Tag der Kultur. Später wurde die Kolonie dunkler und nach 12 Tagen nahezu schwarz unter Bildung von vielen ausgebreiteten und feuchten Konidien. Es fanden sich jedoch konzentrische kreisförmige Ringe, wobei die helleren Ringe weniger deutlich waren als im Falle von FERM P-3828. Zunächst war die Kultur gelblich bis olivgrün gefärbt. Sie enthielt weiße flockige Luftmycelien, die später nahezu verschwanden. Die Rückseite war ebenfalls dunkeloliv bis schwarz. Unterkolonien wurden häufig außerhalb der großen Hauptkolonie beobachtet, die selbst nach 19 Tage langer Kultur nicht miteinander verwuchsen.

3. Medium C

Das Wachstum war verhältnismäßig gut und führte zur Bildung einer Kolonie mit einem Durchmesser von 77 bis 82 mm nach 8 Tagen, die nach 12 Tagen zusammenfloß. Zu diesem Zeitpunkt war die Mitte der Kolonie dunkelolivgrau bis schwarz, während der Rand olivgrün war. Zunächst war die Kolonie blaß-olivgrün, wurde aber mit starker Konidienbildung vom 5. Tag der Kultur an dunkler. Die Rückseite war dunkelgrün bis schwarz. Es wurde keine Sektorbildung beobachtet.

4. Medium D

Das Wachstum war verhältnismäßig gut. Nach 7 Tagen wurde eine runde, leicht ausgebreitete Kolonie mit einem Durchmesser von 30 bis 40 mm beobachtet. Weiße Flocken von Mycel fanden sich nur am Rand der Kolonie. Zunächst (nach 3 bis 4 Tagen) war die Kolonie grün. Sie wurde dann jedoch dunkler und am 12. Tag der Kultur nahezu schwarz. Die Rückseite war ebenfalls schwärzlich, wobei zu einem früheren Zeitpunkt der Kultur ein radiales Muster von dunkleren Bändern beobachtet wurde. Die

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2739U9

Konidienbildung war beachtlich.

5. Medium E

Das Wachstum war gut und führte zur Bildung einer Kolonie mit einem Durchmesser von 75 mm nach 12 Tagen. Die Kolonie war braun bis dunkelbräunlich-grau und besaß etwas leicht ausgebreitetes opakes weißes Luftmycel am Rand der Kolonie. Später wurde die Kolonie dunkler. Die Rückseite war ähnlich gefärbt. Es wurde keine Sektorbildung beobachtet. Die Bildung von Konidien fand spät statt und zwar nach 8 bis 10 Tagen.

Physiologische Eigenschaften

Der Stamm wächst in einem Temperaturbereich von 22 bis 37°C, wobei ein optimales Wachstum bei ungefähr 24 bis 28⁰C auftritt. Änderungen des pH-Werts schienen einen geringen Einfluß auf die Wachstumsgeschwindigkeit zu haben. Die größten Kolonien wurden jedoch bei einem pH-Wert von 5>4 bis 5»6 erhalten.

Mikroskopische Untersuchung
1. Konidien und Konidiophoren

Die Konidien waren mauerförmig und besaßen Quer-als auch Längssepten, sie hatten eine bräunliche bis dunkelbraune Farbe und waren vom sogenannten Aleuriosporen-Typ. Unreife Konidien waren etwas länglich ellipsoid und warzig. Die reifen Konidien waren polymorph, wobei die ellipsoide Form überwog. Es war jedoch auch ein beachtlicher Anteil von nierenförmigen und pyramidenförmigen Konidien vorhanden. Die mittlere Größe betrug 27x16 /U und war damit etwas geringer als bei Pithomyces cynodontis. In den meisten Fällen waren 3 Quersepten vorhanden, obwohl die Anzahl von 2 bis 5 variierte. Der größte Teil der untersuchten reifen Konidien besaß auch Längssepten. Die Konidiophoren waren im allgemeinen ähnlich wie diejenigen von FERM P-3829 integriert in konidiogenen Zellen, und aufgrund der geringen Anzahl von Hyalinhyphen entwickelten sie sich oft direkt von dicken pigmentierten Hyphen.

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- .25 -

2. Hyphen

Es waren drei Arten von Hyphen vorhanden, aber dünne transparente hyaline Hyphen waren auf allen untersuchten Medien nicht so reichlich vorhanden wie es bei den anderen beiden dickeren, gut pigmentierten Hyphen mit einer Breite von 5x10 yu der Fall war. Die zuletzt Genannten waren etwas warzig oder stachelig und bildeten häufig Anastomosin.

Zuordnung der Arten für FERM P-5829

Die Konidien-Morphologie-Eigenschaften des Stammes erinnern stark an Pithomyces cynodontis, besonders in der Form, Verteilung und Größe und in gewissem Ausmaß an diejenigen von Pithomyces chartarum, bezüglich der Quersepbenverteilung und der Farbe. Es bestehen jedoch bezüglich der Septenanordnung von Pithomyces cynodontis deutliche Unterschiede. So besaßen bei dem Stamm FERM P-3829 die meisten Konidien 3 Quersepten, und es waren nur wenige Konidien mit 4 oder mehr Quersepten vorhanden, unabhängig von dem angewandten Kulturmedium. Die Konidien von Pithomyces cynodontis andererseits besaßen im allgemeinen 3 bis 6 Quersepten. Die Konidien von FERM P-3829 waren ebenfalls in der Form verschieden, von denjenigen von FERM P-3828. Bei den letzteren sind die Konidien praktisch symetrisch ellipsoid, während bei dem zuerst Genannten die Konidien pleomorph sind und nur wenige symmetrisch ellipsoid.

Es zeigte sich, daß die Wachstums- und Kultureigenschaften von FERM P—3829 ziemlich charakteristisch waren und sich stark von denen von Pithomyces chartarum sowie Pithomycea cynodontis unterschieden, besonders in einer späten Kulturstufe. Die Sektorbildung unterscheidet sich auch von derjenigen von Pithomyces chartarum. Während Pithomyces cynodontis sich in einer ziemlich flockigen Weise entwickelt mit sehr vielen hyalinen Lufthyphen, sind die Kolonien von FERM P-3829 üblicherweise schwärzlich und feucht aufgrund der ge-

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2739U9

ringen Menge an dünnen nicht pigmentierten Lufthyphen. Unter Berücksichtigung der Ähnlichkeit in dem Hydroxylierungsprofil, wie unten angegeben, scheint FERM P-3829 dem Stamm Pithomyces cynodontis von 11 Arten von Pithomyces am ähnlichsten zu sein (Ellis, Dermatiaceous Hyphomycetes). Es wird daher vorgeschlagen, diese neue Species der Art Pithomyces, Pithomyces niger nov. sp. zu nennen. Etymologisch beruht niger (schwarz) auf der Farbe der Kolonien auf verschiedenen Agarnährböden.

Die Morphologie und Taxonomie ist unten auch in Beziehung auf bestimmte Stämme angegeben, die bekannt sind, aber die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wichtig sind, da sie zu einer hohen Ausbeute an 10-Hydroxypatschulol führen. Diese Stämme sind:

Paecilomyces carneus FERM P-3797 NRRL 11054 Penicillium rubrum FERM P-3796 NRRL 11055 Phoma sp. FERM P-3798

Paecilomyces carneus FERM P-3797 NRRL 11054

Die Kolonien auf Malzextraktagar, Czapekagar und Kartoffeldextroseagar erreichten nach 10 Tagen bei 26,5°C einen Durchmesser von 8 bis 25 mm. Bei 37°C fand kein Wachstum statt. Ein gutes Wachstum fand bei 26,5⁰C auf Sakaguchi-Wang-Agar statt. Die Kolonien (growth) waren blaß- zimtf arben bis rosa und samtartig bis pulverig im Aussehen. Die Rückseite der Kolonien war rötlich-braun oder ocker-orange. Das Pigment auf Agar ist braun. Die Konidiophoren sind 1,7 bis 2,5 (^,2) /um dick und erheben sich von dem Lufthyphen verhältnismäßig kurz oder von dem Rasen und sind ungleichmäßig verzweigt, glattwandig und tragen auseinanderstrebende Gruppen von 2 bis 5 Phialidon an der Spitze der Verzweigungen. Die Phialidcn sind

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../27

5,0 bis 16,8 /um lang, schlank, lanzenförmig und laufen in einen schlanken Hals aus. Die Konidien mit einer Größe von 2,7 bis 3,7 x 2,4 bis 3,0 /um sind Phialosporen in langen auseinandergehenden Ketten, kugelförmig bis ellipsoid und stachelig. Aufgrund der Eigenschaften der sporogenösen Zellen und der Phialiden, die am Ansatzpunkt dick sind und nach und nach gegen das äußereEnde hin zulaufen, gehört der Stamm FERM P-3797 zu der Art Paecilomyces. Von seinen Kolonieeigenschaften, der Wachstumstemperatur und der Form und Größe der Konidien wird der angegebene Stamm identifiziert als Paecilomyces carneus. (R.A. Samson, Paecilomyces and some allied hyphomycetes. Studies in Mycology Nr. 6, 1974).

Penicilllum rubrum FERM P-3796 (NRRL 11055)

Isoliert aus schlammigem Boden in Kamakura, Japan

Die Kolonien auf Czapekagar erreichen einen Durchmesser von 8 mm nach 4 Tagen und 20 bis 23 mm nach 10 Tagen bei 26,5°C. Sie zeigen ein ziemlich begrenztes Wachstum, das typisch samtartig aussieht. Der Konidienbereich ist dunkelolivgrün bis olivgrau gefärbt. Der Rand ist 1 bis 2 mm breit und weiß. Es sind ziemlich reichlich indisch-rote Exsudate vorhanden. Das Mycel ist lachsfarben bis orange- lederfarben oder apricot. Die Rückseite der Kolonie ist ockerfarben, lohfarben oder kastanienbraun und geht später in rötlichbraun bis maron über. Das Pigment in Agar besitzt die Farbe von gebrannter Umbra-oder gebrannter Siena -Erde.

Die Kolonien auf eingeweichtem Agar erreichen 11 mm Durchmesser in 4 Tagen und 35 bis 36 mm nach 10 Tagen bei 26,5°C. Der Rand ist 3 mm breit und weiß bis rötlich-gold (sunset). Es war reichlich rotes Exsudat vorhanden. Die Rückseite der Kolonie ist schokoladenbraun bis rötlich-braun oder maron. Das Pigment in Agar ist scharlachrot bis braunrot. Das Wachstum bei 37°C auf Czapek ist ziemlich gut und erreicht

../28 809812/0662

3fc

15 mm Durchmesser nach 10 Tagen. Das Wachstum auf Sakaguchi und Wang-Agar bei 26,5°C wird als gering oder mäßig gut bewertet.

Die Penicilli sind charakteristisch biverticilliert und symmetrisch. Die Konidiophoren sind 2,5 /um dick und glattwandig. Metulae , 2,4 bis 3,0 χ 9,4 bis 11,7 /Um, sind locker zusammenhängend und etwas auseinandergehend angeordnet. Ihre Anzahl beträgt üblicherweise bis zu 10, und sie sind glattwandig. Sterigmaten (phialiden), 2,4 bis 2,7 χ 10,0 bis 13,4 /U sind locker zusammenhängend angeordnet. Die übliche Zahl beträgt bis zu 2 bis 5 per Metula, und sie sind typischerweise lanzenförmig und glattwandig.

Die Konidien, 1,7 bis 2,4 χ 2,4 bis 3,4 /um, sind Phialosporen, in langen lockeren parallelen oder etwas auseinanderlaufenden Ketten von einer Länge von 83 bis 116 /Un> oder darüber, subglobulös (rundlich) bis ellipsoid und glattwandig. Es werden keine Perithetien oder Sclerotien gebildet.

Die morphologischen Eigenschaften der Penicilli des unter der Nr. FERM P-3796 hinterlegten Stammes sind Charakteristika für die Biverticillate -Symmetrica Abteilung der Art Penicillium. Im Hinblick auf die Eigenschaften der Pigmentierung, der Kolonietextur und der Anordnung der Metulae und Konidien wurde der Stamm FERM P-3796 identifiziert als Penicillium rubrum (S. Abe; Studies on the Classification of the Penicillia; J. Gen. Appl. Microbiol. Band 2, S. 1 bis 344, 1956).

Phoma sp. FERM P-5798

Isoliert aus Bodenproben aus Kamakura, Japan

../29 809812/0662

- as -

Die Kolonien sind 40 bis 50 mm im Durchmesser nach Tagen und 90 mm nach 12 Tagen bei 26,5⁰C Sie sind charakterisiert durch ein dichtes Mycelwachstum, das blaß bis dunkelgrau oder olivfarben ist. Die Rückseite der Kolonien ist dunkeloliv bis nahezu schwarz. Pycnidien besitzen einen Durchmesser von 80 bis 200 /um, werden submers reichlich gebildet, sind üblicherweise kugelförmig, braun bis schwarz, mit einer oder mehreren Ostiolen, mit einem Durchmesser von 20 /um und die Wände sind pseudoparenchymatös.

Die Konidien sind 1,7 bis 2,0 χ 4,0 bis 5,0 /um und stammen aus nicht abgegrenzten konidiogenen Zellen, sind hyalin, monozellular, oval oder zylindrisch. Es werden keine Chlamydosporen gebildet.

Auf der Grundlage der Bildung von dunkelgefärbten Pycnidien mit 1 bis 5 Ostiolen und eiförmigen oder kurzen zylindrischen Konidien, die aus nicht abgegrenzten konidiogenen Zellen stammen,.wurde der unter der Nr. FERM P-3798 hinterlegte Stamm identifiziert als zu der Art Phoma der Ordnung Spaeropsidalen gehörend (J.A. von Arx, The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture, 2. Ausg., J. Cramer, Gantner Verlag, S. 145-163, 1974).

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Die in Tei>elle I erwähnten Organismen wruden auf entsprechenden Schrägagar 8 bis 10 Tage bei 28°C gezüchtet. Das Inokulum wurde hergestellt durch Suspendieren der Sporen in 9 ml physiologischer Kochsalzlösung. 1 ml dieser Suspension wurde verwendet, um eine Vorkultur in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen, 100 ml eines entsprechenden Mediums enthaltend, zu beimpfen. Dieser Kolben wurde aud einem Rotationsschüttler (250 UpM χ 5 cm)

/ bzw. ProJlplatten

809812/0662 "^/3°

48 Stunden bei 28°C inkubiert. 2 ml der entstehenden Mycelsuspension wurden verwendet, um die Hauptkultur in 500 ml Schüttelkolben, enthaltend 100 ml Medium, zu beimpfen. Nach 24 oder 48 Stunden langem Inkubieren unter den oben erwähnten Bedingungen wurde eine Lösung von 10 mg Patschulol in 0,2 ml Dimethylsulfoxid zugegeben. Die Brühe wurde nach einer Inkubationszeit mit Patschulol von 24 bis 72 Stunden aufgearbeitet.

Die verschiedenen entstandenen Metaboliten wurden extrahiert und analysiert durch Ansäuern der Brühe mit Zn Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 und 2-maliges Extrahieren mit 100 ml Chloroform. Die vereinigten Auszüge wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Eine Lösung des Rückstands in 1 ml Chloroform wurde für die gaschromatographische Analyse der Metaboliten unter den folgenden Bedingungen verwendet (Perkin Eimer 3920 Gaschromatographen):

Säule: 5 % SE 30, Länge 2 m

Temperaturprogramm: Anfangstemperatür 200⁰C, 8 Minuten

Erwärmungsgeschwindigkeit 32 /min Endtemperatur 300⁰C, 4 Minuten

Trägergas: Stickstoff, Fließgeschwindigkeit 30 ml/min Temperatur des Injektionsblocks: 250°C Grenzschichttemperatur: 33O°C

Detektorsystem: Flammenionisation

Schreiber: W + W 1100, Papiergeschwindigkeit 1 cm/min

Die Metaboliten waren auch teilweise trennbar durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (Teilchengröße 0,25 mm) unter Verwendung von Äther oder Äther/Chloroform-Gemischen.

../31 809812/0662

Der Nachweis wurde durchgeführt durch Besprühen der entwickelten Platten mit einer 70-%igen Lösung von Schwefelsäure in Äthanol, 1 Minuten langes Erhitzen auf 14O°C und Besprühen mit einer 2-%igen Lösung von Vanillin in Äthanol. Die Metaboliten erschienen als blaue und violette Flecke.

../Tabelle

809812/0662

!-iikroorrianismus

Tabelle I

Hinterlegungsstelle, ilLunmer

% 10-Hydroxjpatschulol

in dem biologisch umgewandelten Produkt

7739U9

angewandte Bioumwandlungslnedien *; (3. Tabelle II)

Absidia glauca Aspergillus fumigatus Aspergillus niger

CBS 1O2.O8 CBS 113.23 ATCC 11394

* 2

Aspergillus niger _<,janim 3

Aspergillus ochraceus

SJcwm 1

Il Il *· f . O

Λ»«·«in *■

Aspergillus terreus Choanephora circinans Curvularia falcata

(=lunata)

Cunninghamella blakesleeana Diplodia natalensis Gliocladium ro se um 0.09

Oj36 O.,85 O.68 O,72

Mucor corymbifer

(Cf Abidia corymbifera) Mucor griseocyanus Nocardia lurida
Nocardia opaca

Rhizopus nigricans

(Cf Rhizopus stolonifer)

Rhizopus circinans Rhizopus arrhizus Streptomyces aureofaciens Streptomyces rimosus Streptomyces spectabilis Gl iod ad ium roseum >^mm Glomerella rubicola Calonectria decora

NRRL 416

NRRL 398 ATCC 10020 CBS 2546 NRRL 2380

CBS 133.27

CBS 447.62

ETH

ETH

ETH

CBS 100.17

ATCC 1207a

ETH 24315

CBS 266-39

ATCC 62276 CBS 147.22

ATCC 11145

ATCC 10762

ETH

NRRL 2494

NRRL 8194 CBS 200.35 ATCC 14767

JO bis

·

0,15

O .,63 Oj46 0,04 3,24 0,16 0,64

1,25

O_;27

Il I·

I·'

t t

H If

0,78 ]_;08 O_}62

1,18

3,6

²J^{4 2}I⁴

3,2

0,21 ¹I²

1.76

4,4 °i²

1,15 0^85 0,45 Ij68

²I⁶

5,34 16,6 17,S

13,5,4,6,8

12,5,1O

6,5,12,11

6,12,11,5,2

6,5,11,10,2

6,16,12,10,2,5

12,7,6,10,2,5

5,10,7,11,12,2

1O,7,5,3

7,10,15,3,5,7

5,6

11,12

12,3,11,15,10

10,23,24

11,5,6,12,10

11,3,15

5,10,6

10,12,11

6,5

11,6

11,13

13,1O

11,15

10,11

12,6,10,5,11

24,23

22,14,23,20

14,19,22,20

6,12,5,11,10

16,17

5,10,25

*) Die Mr. der I-iedien ist angegeben^ um die erzielte Ausbeute

zu steigern.

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2739U9

Tabelle II . Zusammensetzung der in Tabelle I.verwendeten Medien

Staumnlösuiig der Spurenelemente: 1,0 g FeSO₄ . 7 H₂O

0,15 g CuSO₄ . 5 H₂O

I₇O g ZnSO₄ . 7 H₃O

O,l g MnSO₄ . 4 H₂O

0,1 g K₂MoO₄

destilliertes Wasser auf 1000 ml

4_f0 g Hefeextrakt 10.0 g Malzextrakt.

4^0 g Saccharose ad 1000 ml Leitungswasser vor dem Sterilisieren 7,3 nach dem Sterilisieren 7,1 30,0 g Saccharose
2,0 g NaNO₃ ;

1,0 g KH₂PO₄
Ο,5 g MgSO₃ . 7 H₂O 0_;01 g FeSO₄ . 7 H₂O O₁5 g Hefeextrakt .?

1,5 g Maisquellwasser (cornsteep) ad 1000 ml Leitungswasser, pH 3,0

10,Og rohe Glucose 10,0 g distillers solubles 5,Og NaCl

1,0 g NaNO₃ 10 g CaCO₃ 50,0 g Glucose
20,0 g Papton-

5,0 g Maisquellwasser (cornsteep) ad 1000 ml Leitungswasser, pH 6,2 vor den Sterilisieren

ad 1000 ml Leitungswasser,dP. 8,0 iiach dem »Sterilisieren

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50,0 g Glucose 2,6 g d-Weinsäure 2_;6 g Ammoniumtartrat 0,17 g (NH₄J₂SO₄ 0,4 g (NH₄J₂HPO₄ 0_;5 g K₂CO₃ 0,27 g MgCO₃ 1.0 g Hefeextrakt ' IjO ml Spurenelemente (stammlösung der Spurenelemente) 1000 ml Leitungswasser

pH 5,0 vor dem Sterilisieren

50,0 g Glucose

2jO g NaNO₃

1,0 g KH₂PO₄

0,5 g MgSO₄ . 7 H₃O

0,5 g KCl

0-1 ml Spurenelemente (stammlösung der Spurenelemente) ad 1000 ml Leitungswasser, pH 5,0 vor dem Sterilisieren

5OjO g rohe Glucose 2OjO g Edamin 1^5 giiaisquellwasser (cornsteep) ad 1000 ml. Leitungswasser. pH eingestellt auf 6,5 vor dem

Sterilisieren

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10,0 g I'laiscjuellwasser (cornsteep) 1O,O g Glucose

2jO g Hefeextrakt

2,0 g Ammonium-tartrat 10j0 g CaCO₃
ad 1000 ml Leitungswasser, pH 6,0 vor dem Sterilisieren

10,0 g Trypton

ΙΟ, O	g	ad 1000	Glucose	7 H2O
10,O	g	PH 7,E	NaCl	/ rl *■» \j
5,O	g	i	NaNO3	"7 H f^
1,0	g	K2HPO4
1,0	g	MgSO4 .	Wasser,
0,002	g	ZnSO4 .
0,01	g	FeSO. . 4
O.I	g	CaCl2
ml dest.

10

2OjO g Saccharose 3₃O g Hefeextrakt I₅O g NaNO₃ 1,0 g Glycin I₁O g KH₂PO₄ 0,5 g MgSO₄ . 7 H₃O 0,5 g KCl 0,01 g FeSO₄ . 7 H₃O dest. . H₂O, pH eingestellt auf 5,0 Vor dem Sterilisieren ad 1000 ml

11

IOOO ml Malzextrakt spec. Gew. 1,03-1,035 20 g Saccharose

15,0 g Pepton

3jO g Kaisquellv/asser (cornsteep]

0,05 g Gi'lucose ad 1000 ml Leitungswasser P" vor dem Sterilisieren 6,5

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. 36

2^5 g NaCl 1,0 g Haisquellwasser (cornsteep)

4,0 g Pepton- 3_}0 g (NH₄)H₂PO₄

10.0 g Glucose 2,5- g CaCO^

4,0 g Fleischextrakt 2,2 g Sojaöl

1*0 g Hefeextrakt 2_n5 gHefeextrakt

ad 1000 ml dest. wasser; 10.0 g Glucose pH vor dem Sterilisieren 6,3, ad 1000 ml de st. wasser nach dem Sterilisieren 6,3 pH 'vor dem Sterilisieren 7,6 nach dem Sterilisieren 6,9

15_ JL6

10,0 g Glucose 50,0 g Saccharose

1O₇O g Maisquellwasser 7,6 g NaNO₃

(cornsteep)

ad 1000 ml Wasser. pH.einge-^· 10 g K-HPO. stellt ' ^{2 4}

auf 7_?2 Sterilisation 0,5 g MgSO₄ . 7 H₃O

0^5 g KCl

0,04 g FeSO₄ . 7 H₂O ad 1000 ml dest. Wasser pH

17

5O₅O g Saccharose
5,0 g NH₄NO₃
6,5 g K₂HPO₄ .
5,0 g MgSO₄ . 7 HO
0j08 g FeCl₃ . 6 H₂O
0,05 g ZnSO₄ . 7 H₂O

ad 1000 ml dest. Wasser, pH 6,5 nach deia Sterilisieren

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30.0 g Saccharose 3,0 g NaNO₃ IjO g KH₂PO₄ 0,5 g MgSO₄ . 7 H₂O 0,5 g KCl

0,01 g FeSO₄ . 7 H₃O ad 1000 ml dest. Wasser, pH

us

10,0 g Glucose

5,0 g P>epton

3,0 g Fleischextrakt

5_}0 g NaCl
1O₇O g CaCO₃
ad 1000 ml Leitungsv/asser

pH vor dem Sterilisieren 7,6 nach dem Sterilisieren 8,05

20

50^0 g Maltose 2O₅O g Sojamehl 20^0 g Casaminosauren 5,0 g NaCl 5jO g NaNO₃ ad 1000 ml Leitungswasser pH 6j5 Vor dem Sterilisieren

7,5 g (NH₄)₂SO₄

2_;2 g MgSO₄ . 7 H₂O

1,66 g NH₄Cl

71_T0 g Maisstärke

18.0 g Baumwollsamen-Hehl

6,66 gMaiswasser-Rückstand

(Pulver)

10,0

g CaCO

Oj0055 g CoSO₄ . 7 H₃O 0,044 g FeSO₄ . 7 H₃O 0,066 g MnSO₄ . 7 H₃O 0,103 g ZnSO₄ . 7 H₃O 9,0 ml Sojaöl
ad 1000 ml Leitungswasser

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11 22

ΙΟ,Ο g Maisstärke 7,0 g Maisquellwasser (cornsteep

10^0 g Fepton (Difco) 20.0 g Glucose

4jO g NZ-Amin A (Sheffield) 10,0 g

0j5 g MgSO₄ . 7 H₃O

2,0 g CaCO₃ 2O₇O g Glucose

5₇O g belasse ad 1000 ml dest. Wasser, pH 6₇9

0,6 g Na₃HPO₄ 0,5 g CaCO₃ ad 1000 ml dest. Wasser, pH

11

20,0 g Eiomalζ

15_T0 g Sojamehl 1,0 g Casamino säuren 1,0 g Jiefeextrakt 5,0 g NaCl ad 1000 ml dest. Wasser, pH 6,3

50,0 g Glucose (getrennt

sterilisiert)

1,25 g Maisquellwasser (cornsteep) 0,5 g FeSO₄ . 7 H₃O 0^5 g MgSO₄ . 7 H₃O 0,5 g KCl I₁O g K₂HPO₄ 2,0 g NaNO₃ ad 1000 ml Leitungswasser. pH -7,.C

809812/0662

In Tabelle III ist eine zweite Reihe von Mikroorganismen angegeben, die ebenfalls 10-Hydroxypatschulol bildeten. Für die biologischen Umwandlungen gem. Tabelle III wurden die Mikroorganismen auf Malzschrägagar gezüchtet und aufbewahrt. 10 ml eines Vorkulturmediums in einem Reagensglas mit einem Durchmesser von 21 mm wurden mit einer Impföse voll Sporen von der SchrägagarkuLtur beimpft. Das Reagensglas

G X*

wurde 24 Stunden bei 26,5 C auf ein/Reagensglas-Schüttelvorrichtung inkubiert und die Kultur dann in einen 500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen gegeben, der 100 ml des Mediums und 10 mg Patschulol als Substrat in 0,2 ml Dimethylsulfoxid enthielt. Der Kolben wurde, soweit nicht anders angegeben, 3 Tage bei 26,5°C auf einem Rotationsschüttler inkubiert.

Nach der angegebenen Inkubationszeit wurden 50 ml der Kultur filtriert und der pH-Wert des Filtrats auf 3 eingestellt. Das angesäuerte Filtrat wurde zweimal mit 50 ml Chloroform extrahiert. Der Auszug wurde durch Durchleiten durch mit Silicon behandeltesPhasen - Trennpapier I-PS (Whatman) entwässert und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 1 ml Chloroform gelöst und der Gas-Flüssigkeits- sowie der Dünnschicht-Chromatographie unterworfen.

Für die in Tabelle III angegebenen Umwandlungen wurden die als A und B bezeichneten Medien angewandt, außer, wenn die Buchstaben (A) oder (B) angegeben sind, um anzuzeigen, daß nur das eine Medium für diesen Mikroorganismus angewandt wurde. Die beiden Medien besaßen die folgende Zusammensetzung:

809812/0662

2739U9

^Tabelle III

Nr. des Stammes' '_

Ausbeute: > 10% 1O- Iydroxypatschulol

Cephalosporium coremioides Ausbeute: 5-10% 10-Eydroxypat schulol Aspergillus oryzae Cladosporium gp(auch bezeichai-

bar als Art von Aureobasidium)

Ausbeute: 1-5% 10-Hydroxypatschulol

Absidia corymbifera

Aspergillus clavatus Aspergillus flavus Aspergillus niger

Cochliobolus sativus

Cochliobolus sativus

Cochliobolus sativus Curvularia lunata Eurotium repens

Eurotium repens

Gliocladium roseum

Metasphaeria sp. P-83 Pellicularia filamentosa Pellicularia filamentosa

Penicillium brevi-compactum

Penicillium citrinum

Penicillium verruculosum Penicillium verruculosura Rhizopus arrhizus

Rhizopus arrhizus

Rhizopus circinans

Trichoderma hematum

Trichoderma koningii

Ausbeute: ^1'. 10-Ilydroxypatschulol

Aspergillus niger IFO-8579 NRRL 11003

IAM-3011 NRRL IIOO4 IFO-6403 (B) NRRL y-11005

IFO-5999 IFO-7259 IFO-7377

IFO-7463 IFO-6005 NRRL 8194 FERIi P-3957

IFO-6258 IFO-6675

(A)

IFO-5724 IFO-6020

ATCC-18646 (B) ATCC-18649 (A)

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- Mt-

2739A49

Medium A	g/1-	Medium B	•	Glucose	g/i
	20	Corn Steep liquor	50
Saccharose	3	FeSO4.7 H2O	5
Hefeextrakt	1	MgSO4.7 H2O	0,01
NaNO3	1	KCl	0,5
Glycin	1	KH2PO4	0,5
KH2PO4	0,5	NaNO3	1
MgSO4.7 H2O	0,5		1
KCl	0,01
FeSO4.7 H2O

pH eingestellt auf 6,3-vor der Behandlung im Autoklaven

P^H ^eingestellt auf 6;3 der Behandlung im Autoklave.

809812/0662

so

Tabelle III (Forts.)

Aspergillus terreus Cephalosporium spinosum Cephalosporium sp. WN-831 Curvularia lunata

Daldinia concentrica Emericellopsis glabra Eurotium repens Eurotium repens Eurotium repens Eurotium repens Gliocladium roseum Gliocladium roseum Gliocladium roseum Gliocladium roseum

Gymnopilus aeruginosus Rhizopus arrhizus Rhizopus circinans Sporotrichum gougeroti Thamnostylum priforme

Trichoderma aureoviride Trichoderma hamatum K-63 Trichoderma longibranchia IPO-7770 IFO-9031 IFO-4041 IFO-4087 IFO-4885 IFO-8914

(B)

IFO-8377

IFO-5982 (A) IFO-6117 (B) ATCC-18651

ATCC-18648 (B)

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2739U9

Jeder von 45 500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen, enthaltend 100 ml des Mediums (wie oben angegeben), wurde mit 10 ml einer Vorkultur von Cephalosporium coremioides (NRRL 11003) (IFO 8579) beimpft. Das Substrat Patschulol (900 mg in 45 ml Dimethylsulfoxid) wurde gleichmäßig auf die 45 Kolben verteilt, die dann unter Schütteln auf einem Rotationsschüttler (180 UpM) bei 26,5°C 160 Stunden inkubiert wurden. Bei Beendigung der Fermentation wurde die Kultur filtriert, um das Mycel zu entfernen, das dann mit Wasser gewaschen wurde. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt, der pH-V/ert auf 3_f0 eingestellt und die Lösung mit einem gleichen Volumen Chloroform zweimal extrahiert. Die Auszüge wurde über Natriumsulfat entwässert und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wurde über Silicagel chromatographiert und nacheinander mit einem Lösungsmittelgemisch aus Petroläther und Äther eluiert (Petroläther/Äther 9:1, 4:1, 2:1 bzw. 4:3). Das fraktionierte Eluat wurde durch Dünnschichtchromatographie und Gaschromatographie analysiert.

Die gaschromatographische Analyse der Umwandlungsprodukte wurde ausgeführt mit Hilfe eines Gaschromatographen Hitachi GC Typ 063; Säulenlänge 1 m, gepackt mit 2 % Silicon OV-17, Säulentemperatur 210⁰C, Einspritztemperatur 290°C, Trägergas N₂ (Fließgeschwindigkeit 33,3 ml/min).

Die Dünnschichtchromatographie wurde durchgeführt mit Hilfe von Silicagelplatten (Kieselgel 60, F 254, 0,25mm; Merck) unter Anwendung des folgenden Lösungsmittelsystems:

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A; Äther/Chloroform (1:1), B; Cyclohexane/Äthylacetat . (1:1), C; benzol/Aceton (5:2).

Die Rotation wurde in Chloroformlösung bei 25°C bestimmt. Das Kopfeluat enthielt das Substrat. Die umgewandelten Produkte wurden nacheinander in der folgenden Reihenfolge eluiert:

Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl-l,6-methanonaphthalin-1,5-diol kristallisiert aus n-Hexan (40 mg), f.p. 109.5⁰C [a]_D -87,5 (c, 0,2); Rf 0.57 (Lösungsmittel Ά) ,^;·Ό, 6i-(Lösungsm. L 0,72 (Lösungsmittel C), Gas-chromatographische Petentionszeit (i. I¹28 MS, M⁺ (m/e 238) Grund-peak m/e 122.

Decahydro-4,83,9,9-tetramethyI-1,6-methanonaphthalin-1,6-diol, kristallisiert aus η-Hexan (40mg), -·.

F.p. 116.5-117°C, [σ]_β -105.0 (C, 0.2); Rf 0.38 Lösungsmittel ( Ai 0.49 Lösungsmittel (B), o,o2 Lösungsmittel (C),.RT.1'21"; IR, 35^! 1475,1465, 1380, 1372, 1335, 1290, 1075, 1053, 1002 cm"¹; MS, M⁺

(m/e 238)Grund-peak m/e 195.

Nichtideiitifizierte Verbindung, kristallisiert aus "n-Hexan (40

ο "¹^

F.p. 116,0 C, [a]_D -88,0 (c, 0,2); Rf 0,30 Lösungsmittel (A),

0.38 Lösungsmittel (E), 0,51 Lösungsmittel (C),.RT I¹JO"; IR, 34'. 1490, 1470, 1390, 1380, 1368, 1045, 1020, 1000, 990 cm"¹; MS, M⁺ (m/e 2 38)Grund-peak m/e 138.

Decahydro-4,8,9,9-tetramethyl-l,6-methanonaphthalin -1,lodiol kristallisiert aus η-Hexan (βθ mg), F.;:. 10Ö.0 C

809812/0662

Si

d -113,5 (c, 0,2); Rf 0,30 Lösungsmittel Lösungsmittel (B), 0,49 Lösungsmittel (C); RT, 2Ό3"; MS, M⁺ (m/e 2.J)Q) Grund-peak m/e 83.

Beispiel 4

424 mg eines teilweise gereinigten Metabolitengemisches, enthaltend 326 mg 1O-Hydroxypatschulol, wurden in 3 ml Oioxan gelöst und dann in 50 ml Wasser suspendiert. Es wurde Platinschwarz, das hergestellt worden war aus 465 mg PtOp, zugegeben und unter heftigem Rühren Sauerstoff in das Reaktionsgemisch geleitet. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von gesättigter Natriumbicarbonatlösung über 8 gehalten. Nach vollständiger Oxidation wurde der Katalysator abfiltriert, mit Wasser gewaschen und das Filtrat mit 20 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung versetzt. Nach Extraktion mit Chloroform (2x150 ml) wurde die wäßrige Phase mit 1n Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und mit Chloroform

(2x150 ml) ausgezogen.. Dieser Chloroformextrakt wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum destilliert. Beim Umkristallisieren aus Isopropyläther erhielt man 205 mg der Säure 4-Carboxy-patschulol (Formel VI). Ausbeute 59,4 %, Fp. 148-149°C; C⁰Jj? = -95,8° (c = 0,288 in Chloroform).

Beispiel 5

200 ml einer Vorkultur von Gliocladium roseum (NRRL 8194), die 48 Stunden in dem in Tabelle II angegebenen Medium 11 unter den in Beispiel Λ beschriebenen Bedingungen gewachsen war, wurden verwendet, um einen 14 1 Glasfermenter Blattrührsystem, 4 Schikanen,

enthaltend 6 1 des gleichen Mediums zusammen mit 0,02 % Polypropylenglykol-monobutyläther (als Antischaummittel) zu beimpfen. Die Fermentationsbedingungen waren die folgenden: Temperatur 28°C, Rührgeschwindigkeit 400 UpM und Belüftung 5 l/min. Eine Lösung von 3 g Patschulol in 40 ml Dirnethyl-

/46 809812/0662

sulfoxid wurde 24 Stunden nach dem Beimpfen zugegeben. Das Substrat war nach 52 Stunden vollständig metabolisiert. Der pH-Wert wurde dann mit konz. Salzsäure auf 2 eingestellt, die gesamte Brühe über Kieselgur filtriert und das Mycel mit 2 1 V/asser gewaschen. Das FiItrat wurde 3-mal mit 2 1 Chloroform extrahiert. Die vereinigten Auszüge wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft.Der Rückstand wurde über Silicagel chromatographiert, mit Chloroform/Äther 1:1 eluiert. Man erhielt 1,3 g rohes Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl-1,6-methanonaphthalin-1,4a-diöl, R_f 0,4 (Chloroform/Äther 1:1), umkristallisiert aus η-Hexan, Fp. 118-120⁰C; ßÜ^ -69,3° (c = 0,501 in CHCl₃).

C₁₅H₂₆O₂ berechnet C 75,58 H 10,99 238,37 gefunden C 75,71 H 11,02

Beispiel 6

200 ml einer Vorkultur von Fusarium lycopersici (ΕΤΗ), die 48 Stunden im Medium Nr. 10 der Tabelle II unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen gewachsen war, wurden verwendet, um eirf^Glasfermenter, enthaltend 8 1 des gleichen Mediums zusammen mit 0,02 % Polypropylen-glykol-monobutyläther, zu beimpfen. Es wurde bei folgenden Fermentationsbedingungen gearbeitet: Temperatur 28⁰C, Rührgeschwindigkeit 400 UpM und Belüftung 5 l/min. Eine Lösung von 1,6 g Patschulol in 64 ml Dimethylsulfoxid wurde nach 24 Stunden zugegeben. Das Substrat war nach 28 Stunden vollständig metabolisiert. Der pH-Wert der gesamten Brühe wurde mit konz. Salzsäure auf 3 eingestellt. Das Mycel wurde über Sand abfiltriert und mit 2 1 V/asser gewaschen. Das Filtrat wurde 2-mal mit 2 1 Chloroform extrahiert. Die vereinigten Auszüge wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde über Silicagel chromatographiert und mit Chloroform : Äther 1:1 eluiert. Man erhielt 520 mg Decahydro^ea^^-tetramethyl-1,6-methanonaphthalin-1,7-diol, R_f 0,5 (Chloroform/Äther 1:1);

809812/0662 --/⁴⁷

2739U9

umkristallisiert aus η-Hexan; Fp. 1O9,5»C; £pj^? ""⁸7»2°

(c = 1,00 in CHCl₃).

C₁₅H₂₆O₂ berechnet C 75,58 H 10,99 238,37 gefunden C 75,43 H 11,08

Beispiel 7

200 ml einer Vorkultur von Nocardia lurida (ETH 24315), die 24 Stunden im Medium Nr. 13 der Tabelle II unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen gewachsen war, wurden verwendet, um einen Glasfermenter, enthaltend 8 1 des gleichen Mediums, zusammen mit 0,02 % Polypropylen-glykol-monobutyläther zu beimpfen. Es wurde bei folgenden Fermentationsbedingungen gearbeitet: Temperatur 28⁰C, Ruhrgeschwindigkeit 400 UpM und Belüftung 5 l/min. Eine Lösung von 240 mg Patschulol in 40 ml Dimethylsulfoxid wurde nach 24 Stunden zugegeben. Das Substrat war nach 29 Stunden vollständig metabolisiert und der pH-Wert wurde mit konz. Salzsäure auf 2,5 eingestellt. Die Brühen von 2 Ansätzen wurden zusammengegeben und über Kieselgur filtriert. Das Filtrat wurde 2-mal mit 2 1 Chloroform extrahiert und die vereinigten Auszüge mit 2 1 2n Kaliumbicarbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde über Silicagel Chromatographiert und mit Chloroform/Äther 1:1 eluiert. Neben anderen Verbindungen erhielt man 100 mg Isomerendo von Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl-1,6-methanonaphthalin-1,8-diol, R^ 0,2 (Chloroform/Äther 1:1), umkristallisiert aus Äther/Petroläther, Fp. 195-196⁰C.

Beispiel 8

200 ml einer Vorkultur von Curvularia lunata (NRRL 2380), die 72 Stunden im Medium Nr. 6 der Tabelle Hunter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen gewachsen war, wurde verwendet, um einen Glasfermenter, enthaltend 8 1 des gleichen

../48 809812/0662

ο Π O Q / / Q

Mediums, zusammen mit 0,02 % Polypropylen-glykol-monobutyläther zu beimpfen. Es wurde bei folgenden Fermentationsbedingungen gearbeitet: Temperatur 28⁰C, Rührgeschwindigkeit 300 UpM und Belüftung 4 l/min. Nach 24 Stunden wurde eine Lösung von 800 mg Patschulol in 30 ml Dimethylsulfoxid zugegeben. Das Substrat war nach 30 Stunden vollständig metabolisiert und der pH-Wert wurde mit konz. Salzsäure auf 3 eingestellt. Die Fermentationsbrühen von 2 Ansätzen wurden über Sand filtriert und das Filtrat 2-mal mit 2 1 Chloroform extrahiert. Die vereinigten Auszüge wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde über Silicagel chromatographiert und mit Chloroform/Äther 1:1 eluiert. Man erhielt neben anderen Verbindungen 700 mg exo Isomer von Decahydro-4,8a,9»9-tetramethyl-1,6-methanonaphthalin-1,8-diol, R_f 0,5 (Chloroform/Äther 1:1) Fp. 158,1-158,4°C (aus η-Hexan).

Beispiel 9

100 ml einer Vorkultur von Aspergillus niger (ATCC 11394), die 24 Stunden in Medium Nr. 11 der Tabelle II unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen gewachsen war, wurden verwendet, um einen Glasfermenter, enthaltend 8 1 des gleichen Mediums, zusammen nLt 0,02 % Polypropylen-glykol-monobutyläther zu beimpfen. Es wurde bei den folgenden Fermentatinnsbedingungen gearbeitet: Temperatur 28°C, Rührgeschwindigkeit 400 UpM und Belüftung 5 l/min. Eine Lösung von 800 mg Patschulol in 32 ml Dimethylsulfoxid wurde nach 24 Stunden zugegeben. Das Substrat war nach 29 Stunden vollständig metabolisiert. Die Fermentationsbrühe wurde über Kieselgur filtriert, das Mycel mit 1 1 Wasser gewaschen und das Filtrat 2-mal mit 2 1 Chloroform extrahiert.

Die vereinigten Auszüge wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde über Silicagel chromatographiert und mit

809812/0662 "^/49

Chloroform/Äther 1:1 eluiert. Man erhielt neben anderen Verbindungen 383 mg Decahydro-4,8a,9»9-tetramethyl-1,6-methanonaphthalin-1,6,8-triöl; Fp. 156-158°C (aus Isopropyläther); ßxj^ -61,5° (c = 0,333 in CHCl₃).

C₁₅H₂₅O 254,37

berechnet C 70,83 H 10,30
gefunden C 70,77 H 10,21

Beispiel 10

Die folgenden Mikroorganismen wurden 6 Tage auf Schrägagar bei 26,5°C gezüchtet.

Mikroorganismus Arthrinium sp. Beauveria bassiana Botryodioplodia theobrotnae Cladosporium cladosporioides Coniothyrium sp. Gliomastix murorum var. felina Gongronella butleri Kabatiella caulivara Kabatiella caulivara Mortierella ramanniana Paecilomyces carneus Penicillium rubrum Phoma sp.
Sesquicillium candelabrum Hinterlegungs-IIr.

FERM P-3821 FERM P-3820 IFO - 6469 FERM P-3822 FERM P-3816 FERM P-3819 FERM P-3817 IFO - 7314 IFO - 9171 FERM P-3818 FERM P-3797 FERM P-3796 FERM P-3798 FERM P-3823

809812/0662 ../50

S3

Eine Impf öse . voll Sporen wurde verwendet, um 10 ml des folgenden Mediums in einem Reagensglas mit einem Durchmesser von 21 mm zu beimpfen. Das Medium enthielt (in g/l) Glucose 50, Maisquellwasser 10, KCl 0,5, KH₃PO₄ 1, NaNO₃I. Der pH-Wert wurde vor der Behandlung im Autoklaven auf 6,3 eingestellt. Das Reagensglas wurde auf einem Reagensglasschüttler 48 Stunden bei 26,5°C inkubiert. 1 mg Patschulol in 20 yul Dirnethylsulfoxid wurde in jedes Reagensglas gegeben und weitere 3 Tage inkubiert. Nach Beendigung der biologischen Umwandlung wurde die Kultur filtriert, der pH-Wert des Filtrats auf 3»0 eingestellt und das Filtrat dann mit 10 ml Chloroform extrahiert. Der Auszug wurde entwässert durch Durchleiten durch mit Silicon behandeltes Phasentrennpapier (1-PS Whatman) und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 0,5 ml Äthylacetat gelöst und der Gas-Flüssigkeitsund Dünnschicht-Chromatographie unterworfen.

Man erhielt die folgenden Ausbeuten an 10-Hydroxypatschulol:

Mikroorganismus

Arthrinium sp. Beauveria bassiana Botryodiplodia theobromae Cladosporium cladosporioides Coniothyrium sp. Gliomastix murorum var. felina Gongronella butleri Kabatiella caulivara Kabatiella caulivara Mortierella ramanniana

Ausbeute an 10-Hydroxypatschulol (?ό)

3 3

10 3 5 3 3 5 5 3

../51

809812/0662

- 54 -

Paecilomyces carneus Penicillium rubrum Phoma sp. Sesquicillium candelabrum

80 20

Beispiel 11

Jeder von 17 500 ml Kolben, enthaltend 100 ml des
Mediums mit der in Beispiel 10 angegebenen Zusammensetzung, wurde mit 10 ml einer Vorkultur von Penicillium rubrum
(FERM P-3796, NRRL 11055) beimpft und 48 Stunden unter Schütteln inkubiert. In Dimethylsulfoxid gelöstes Patschulol
wurde in einer Konzentration von 0,1 g/l zugegeben und weitere 85 Stunden auf einem Rotationsschüttler mit 150 UpM
bei 26,5°C inkubiert. Nach Beendigung der Fermentation wurden die Kulturen zusammengegeben (pH 3»45) und 2-mal mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die Auszüge wurden über Natriumsulfat entwässert und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wurde über Silicagel Chromatographie rt und mit Chloroform eluiert. Die das Diol enthaltenden Fraktionen (nachgewiesen durch Dünnschichtchromatographie und Gaschromatographie) wurden zusammengegeben und im Vakuum eingedampft. Man erhielt 125 mg 10-Hydroxypatschulol als blaß-gelbes Pulver. Beim Umkristallisieren aus η-Hexan erhielt man 90 mg des Diols in Form weißer Nadeln; Fp 107°C. Die Retentionszeit bei der GasChromatographie betrug 2 min 24 sec; MS, M⁺ m/e 238, Grund-peak m/e 83; das IR-Spektrum war identisch mit demjenigen von authentischem 10-Hydroxypatschulol; Nt-IR S 3,55(d) 2H.

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../52

2739U9

Beispiel 12

10 konische 500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen, enthaltend 100 ml des unten angegebenen Mediums, wurden mit der Sporensuspension des Stammes Paecilomyces carneus (FERM P-3797) beimpft und die Kultur 3 Tage bei 26,5°C geschüttelt. Es wurde folgendes Medium verwendet (g/l): Dextrin 50, Pharma media (Traders Oil Mill Co., Texas, U.S.A.) 10, KCl 0,5, KH₂PO^ 1, NaNO, 1. 1 g Patschulol wurde in 10 ml Dimethylsulfoxid gelöst und die Lösung gleichmäßig auf die 10 Kolben verteilt. Die biologische Umwandlung wurde 7 Tage bei 26,5°C auf einem Rotationsschüttler mit 180 UpM durchgeführt.

Nach Beendigung der biologischen Umwandlung wurde die Kulturbrühe filtriert und das Mycel mit 80-%igem wäßrigen Aceton extrahiert. Nach Entfernung des Acetons wurde der Auszug mit dem Filtrat der Kultur zusammengegeben, das dann 2-mal mit gleichen Volumina Chloroform bei einem pH-Wert von 3,0 extrahiert wurde. Die berechnete Ausbeute des Produktes in den Auszügen des Lösungsmittels betrug 50 %, Die Chloroformauszüge wurden über Natriumsulfat entwässert, im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und auf eine mit Silicagel gepackte Säule gegeben. Das 1O-Hydroxypatschulol wurde mit dem Lösungsmittelgemisch Chloroform:n-Hexan (50:50) eluiert. Die Fraktionen, die nur 1O-Hydroxypatschulol enthielten, wurden zusammengegeben und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhielt 454 mg des Produktes als blaßgefärbten Feststoff. Beim Umkristallisieren aus η-Hexan erhielt man 352 mg leicht gefärbte Kristalle von 1O-Hydroxypatschulol, die umkristallisiert wurden unter Bildung von 260 mg des Diols in Form von weißen Nadeln. Fp. 107,5 bis 108°C; Retentionszeit bei der Gaschromatographie 2 min 24 sec; MS, M⁺ m/e 238, Grund-peak m/e 83» das IR-Spektrum war identisch mit demjenigen einer authentischen Probe von 1O-Hydroxypatschulol; NMR</3,55(d) 2H.

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../53

Beispiel 13

Die folgenden Mikroorganismen:

Pithomyces chartarum var. Japonicum FERM P-3828

Pithomyces niger nov. sp. FERM P-3829

Pithomyces cynodontis ATCC 26150

Pithomyces atro-olivaceus ifo 6651

wurden auf Czapek-Dox-Schrägagar gezüchtet und aufbewahrt, wobei das folgende Medium verwendet wurde:

Glucose	30 g	g	g
K2HPO4	ι g		/ 1000 ml (pH 5;6)
MgSO4.7H2O	0,5	g
NaNO-	2 g
KCl	0,5
FeSO4	OjOl
Agar	20.0

10 ml des folgenden Mediums:

Glucose 20 g

Kaisquellwasser 10 g Pepton 10 g

V/asser auf -fOOO ml _ (pH 5,6)

die in einem Reagensglas mit einem Durchmesser von 21 mm enthalten waren, wurden mit einer Impföse voll Sporen aus der Schrägagarkultur beimpft. Die Reagensgläser wurden auf einer Schüttelvorrichtung für Reagensgläser mit 160 UpM 72 Stunden bei 27°C inkubiert. Dann

wurde 1 ml Patschulolsuspension (20 mg/ml in physiol.Kochsalzlösung, ent haltend 20 % Tween-80, mit Ausnahme von Pithomyces chartarum

809812/066 2

../54

var. Japonicum FERM P-3828, wo 56 mg/ml Patschulol verwendet wurden) zugegeben. Es wurde weitere 168 Stunden inkubiert. 1,5 ml der Fermentationsbrühe wurden dann entnommen und mit 4,0 ml Wasser verdünnt. Die verdünnte Brühe wurde mit 4,0 ml Äthylacetat, enthaltend 0,40 mg/ml Methylstearat als internen Standard für die quantitative Gas-Flüssigkeits-Chromatographie, extrahiert. Das Gemisch wurde mit 3000 UpM 15 Minuten zentrifugiert und ein Anteil der oberen Schicht ( 4 /ul) der Gaschromatographie in einem Shimadzu/Gaschromatogramm 4 CM(PE) unter den folgenden Bedingungen unterworfen: Säulenlänge 2 m, gepackt mit 5 % SE 30 auf Chromosorb W (DMCS), Säulentemperatur 230°C, Injektortemperatur 260°C, Trägergas He (Fließgeschwindigkeit 30 ml/ min), Flammenionisationsdetektor. Die Retentionszeiten für Patschulol, 10-Hydroxypatschulol und den internen Standard betrugen 2,3, 4,4 bzw. 6,0 min.

Man erhielt die folgenden Ausbeuten an 10-Hydroxypatschulol:

Mikroorganismus

Pithomyces chartarum var. Japonicum Ferm P-3828

Pithomyces niger nov. sp. FERM P-3829

Pithomyces atroolivaceus IFO 6651

Pithomyces cynodontis ATCC 26150

Substrat- 1041 ydroxy-pat-

Konzantration cschulol WICh 168 h·

5.6 mg/ml

2 mg /ml
2 mg/ml
2 mg/ml

17%

41%

6%

16%

../55

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Beispiel 14

Jeder von 6 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen, enthaltend 100 ml des folgenden Mediums:

Glucose 10 g

Kais quellwasser 10 g

Pepton 1 g

Wasser auf . 100 ml (pH 5_,6)

wurde mit 5 ml einer Impfkultur von Pitho-

myces niger nov. sp. FERM P-3829 beimpft, die erhalten worden war durch 48 Stunden langes Züchten unter den in Beispiel 13 angegebenen Bedingungen. Die Fermentation wurde bei 27°C mit 180 UpM 24, 48 bzw.72 Stunden

lang mit jeweils 2 Kolben durchgeführt und dann 200 mg Patschulol in 10 ml phys. Kochsalzlösung, enthaltend 20 Vol.-% Tween-80 zu jedem Kolben gegeben. Die Fermentation wurde weitere 168 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt.

ein Nach der angegebenen Zeit wurde V Anteil entnommen

und durch das in Beispiel 13 beschriebene gaschromatographische Verfahren untersucht. Ungeachtet des Zeitpunkts, zu dem das Substrat zugegeben wurde, wurden am 5· Tag nach der Substratzugabe mehr als 40 % 1O-Hydroxypatschulol gebildet.

Beispiel 15

Jeder von 4 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen, enthaltend 100 ml des folgenden Mediums:

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	2739449	50 g
Glucose	0,5 g
NaNO3	0,5 g
MgSO4.7H2O	1,0 g
K2HPO4	0,5 g
KCl	0,5 g
FeSO4.7H2O	10 g
Peptoni	4OOO ml (pH 556)
Wasser auf

wurde mit einer Impföse voll Sporen von Pithomyces chartarum var. Japonicum FERM P-3828 von dem in Beispiel 13 erwähnten Schrägagar beimpft und unter den in Beispiel 14 angegebenen Bedingungen gezüchtet bzw. inkubiert. 10 ml einer Patschulolsuspension (600 mg Patschulol, 2 ml Tween-80 und 8 ml phys. Kochsalzlösung) wurden zu 2 Kolben nach 72 Stunden langer Züchtung gegeben und zu 2 anderen nach 96 Stunden langer Züchtung. Die biologische Umwandlung wurde weitere 192 Stunden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Ein Anteil der Fermentationsbrühe wurde in regelmäßigen Intervallen entnommen und durch das in Beispiel 13 beschriebene gaschromatographische Verfahren untersucht. Nach 5 bis 7 Tagen wurden mehr als 15 % 1O-Hydroxypatschulol erhalten.

Beispiel 16

400 ml des in Beispiel 14 verwendeten Mediums wurden in einem 1 1 Fermenter

sterilisiert und mit 20 ml einer Impfkultür von Pithomyces chartarum var. Japonicum FERM P-3828, die wie in Beispiel 14 hergestellt worden war, beimpft. Die Fermentation

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wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

Temperatur: 26,5 + 0,5°C Belüftung: 400 ml/min Rührgeschwindigkeit: 300 UpM pH: 7,0

Zugabe weniger Tropfen Nissan Desfoom (Antischauimittel)

Nach 48 Stunden langer Fermentation wurden 40 ml

Patschulolsuspension (800 mg Patschulol, 8 ml Tween-80, 32 mlphysiol. Kochsalzlösung) in das Gefäß gegeben und die biologische Umwandlung 168 Stunden lang unter den für die Fermentation angegebenen Bedingungen durchgeführt. Man erhielt 30 % 10-Hydroxypatschulol.

Beispiel 17

500 ml Kolben mit Schikanen, enthaltend 100 ml des in Beispiel 14 angegebenen Mediums, wurden mit 5 ml einer Impfkultur von Pithomyces chartarum var. Japonicum FERM

die
P-3828, wie in Beispiel 14 angegeben erhalten worden war, beimpft und unter den in Beispiel 14 angegebenen Bedingungen geschüttelt. Nach 48 Stunden wurden 200 ml Patschulol in 10 ml phys. Kochsalzlösung, enthaltend 20 Vol.-% Tween-80 zu jedem von 100 Kolben zugegeben und 114 Stunden weiter inkubiert. Die vereinigten Fermentationsbrühen wurden 2-mal mit 10 1 Dichlormethan extrahiert und die Auszüge unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde der Säulenchromatographie über Silicagel (Wako gel C-200, 5,3 x 87 cm) unterworfen, wobei mit einem Benzol-Äthylxnethylketon-Gemisch (10:1) eluiert wurde und durch Dünnschichtchromatographie überwachte 15 g Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 421 bis 830 wurden zusammengegeben und unter vermindertem Druck zu einem kristallinen Rückstand eingedampft. Beim Umkristallisieren aus Benzol-Hexan erhielt man 5,112 g 10-Hydroxypatschulol als farblose Nadeln. Die Mutterlauge wurde mit einem Öl vermischt, das aus den

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Fraktionen 357 bis 420 und 831 bis 1040, die jeweils 10-Hydroxypatschulol und kleine Mengen anderer hydroxylierter Produkte enthielten durch Verdampfen des Lösungsmittels erhalten worden war. Das Gemisch
wurde der Säulenchromatographie über Silicagel (Wako gel C-300, 3,3 x 61 cm) unterworfen und die Säule mit Benzol-Aceton (15:1) eluiert. Die Fraktionen 71 bis 120 wurden zusammengegeben und unter vermindertem Druck eingedampft. Beim Umkristallisieren des Rückstands aus Benzol-Hexan
erhielt man weitere 1,337 g 10-Hydroxypatschulol als
farblose Nadeln. Die Gesamtausbeute betrug 6,449 g
(30,1 %).

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Hydroxylierung von Patschulol, dadurch gekennzeichnet , daß man Patschulol unter wäßrigen aeroben Bedingungen in Gegenwart eines oxidierenden Mikroorganismus hydroxyliert.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus ein Fungus ist.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß der oxidierende Mikroorganis mus ein Fungus der Art Absidia, Arthrinium, Aspergillus,

   Aureobasidium, Beauveria, Botryodiplodia, Calonectria, Cephalosporin, Choanephora, Cladosporium, Cochliobus, ConiothyriuiP, Cunninghamella, Curvularia, Daldinia, Diplodia, Emericellopsis, Eurotium, Fusarium, Gliocladium, Glicmastix, Glanerella, Gongronella, Gymnophilus, Kabatiella, Metasphaeria, Mortierella, Mucor, Norcardia, Paecilomyces, Pellicularia, Penicillium, Pithomyces, Phoma, Rhizopus, Sesquicillium, Sporotrichum, Streptomyces, Thamnostylum oder Trichodermaist.

   4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die Hydroxylierung in Gegenwart einer Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff durchgeführt wird.

   5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch g e k e η η zeichnet , daß die Hydroxylierung in Gegenwart einer Quelle für assimilierbaren Stickstoff durchgeführt wird.

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   ../2 ORIGINAL INSPECTEO

   6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxylierung bei einer Temperatur von 15 bis 35⁰C durchgeführt wird.

   7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Hydroxylierung bei einem pH-Wert von 2 bis 10 durchgeführt wird.

   8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Patschulol in dem Substrat 0,005 bis 2,0 Gew.-% beträgt.

   9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Konzentration an Patschulol in dem Substrat 0,01 bis 1 Gew.-% beträgt.

   10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus zu der Art Pithomyces gehört.

   11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch g e k e η η zeichnet , daß der oxidierende Mikroorganismus Calonectria decora (ATCC 14767) ist.

   12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus Glomerella rubicola (CBS 200.35) ist.

   13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus Gliocladium roseum (NRRL 8194) ist.

   14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet , daß der oxidierende Mikroorganismus Cephalosporium coremioides (NRRL 11003) (IFO 8579) ist.

   15· Verfahren nach Anspruch 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus Aspergillus oryzae (IAM 3011) (NRRL 11004) ist.

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   16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus Cladosporium sp. (NRRL Y-11005) auch als Aureobasidium pullulans (IFO 6403) bezeichnet, ist.

   17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch g e k e η η zeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus Pithomyces chartarum var. Japonicum (FERM P-3828) ist.

   18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch g e k e η η zeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus Pithomyces niger nov. sp. (FERM P-3829) ist.

   19. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch g e k e η η zeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus Pithomyces cynodontis (ATCC 26150) ist.

   20. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch g e k e η η zeichnet , daß der oxidierende Mikroorganismus Pithomyces atroolivaceus (IFO 6651) ist.

   21. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch g e k β η η zeichnet , daß der oxidierende Mikroorganismus Penicillium rubrum (FERM P-3796) (NRRL 11055) ist.

   22. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus Botryodiplodia theobromae (IFO-6469) ist.

   23. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus JPaecilomyces carneus (FERM P-3797) (NRRL 11054) ist.

   24. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der oxidierende Mikroorganismus Phoma sp, (FERM P-3798) ist.

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   25. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch g e k e η η

   ζ e i c h ne t , daß die Hydroxylierung an dem C 10 Atom des Patschulols stattfindet unter Bildung von Deca-

   hydro-4,8a,9,9-tetramethyl-1,6-methanonaphthalin-1,10-diol.

   26. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet , daß die Hydroxylierung an dem C-6-Atom stattfindet unter Bildung von Decahydro-4,öa,9»9-tetramethyl-1,6-methanonaphthalin-1,6-diol.

   27. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet , daß die Hydroxylierung an dem C-5-Atom stattfindet unter Bildung von Decyhydro-^ea^^-tetramethyl-1,6-methanonaphthalin-i,5-diol.

   28. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxylierung an dem C-8-Atom stattfindet unter Bildung von Decahydro-^Sa^^-tetramethyl-1,6-methanonaphthalin-i,8-diol.

   29. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gek e η η zeichnet, daß die Hydroxylierung an den C-6-und C8-Atomen stattfindet unter Bildung von Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl-1,6-methano-naphthalin-1,6,8-triol.

   30. Verwendung des nach Anspruch 25 erhaltenen 10-Hydroxypatschulols zur Herstellung der Hydroxysäure der Formel

   durch Oxidation.

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   31. Verwendung des nach Anspruch 25 erhaltenen 10-Hydroxypatschulols zur Herstellung von Norpatschulol der Formel

   durch Oxidation von 10-Hydroxypatschulol der Formel

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   und anschließende oxidative Carboxylierung der Säure der Formel

   '"COOH

   Hydroxylierte Patschulole der allgemeinen Formel

   in der 1 oder 2 der Reste R eine Hydroxygruppe bedeuten und die anderen ein Wasserstoffatom (mit Ausnahme von 10-Hydroxypatschulol).

   33. Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl-1,6-methanonaphtha-

   lin-1 /la-diol der Formel

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   3k. Decahydro-4,8a-9,9-tetramethyl-1,6-methanonaphtha-

   lin-1,7-diol der Formel

   VIII

   35. Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl-1,6-methanonaphthalen-1,8-diol der Formel

   IX

   36. Decahydro-4,8a,9,9-tetramethyl-1,6-methanonaphthalin-1,6,8-triol der Formel

   37. Decahydro-4, 8a, 9,9-te tramethyl-1,6-methanonaphthaÜn-

   1,6-diol der Formel

   VII

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