DE2406447A1 - Verfahren zur umwandlung von (-)reticulin in (+)salutaridin - Google Patents

Description

Es besteht bereits seit vielen Jahren Interesse an einem Verfahren zur Phenoloxydation von (-)Reticulin zu (+)Salutaridin, da die letztere Verbindung in das Alkaloid Kiebain übergeführt werden kann. Es wurde berichtet, daß Reticulin mit Mangandioxyd zu SaIutaridin bei einer Ausbeute von 0,024 i» oxydiert werden kann. Diese Salutaridinausbeute ist so niedrig, daß ein Herstellungsverfahren auf dieser Basis praktisch nicht in Frage kommt. Es wurde daher nach anderen Verfahren zur Durchführung der vorgenannten Umwandlung gesucht .

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein neues biochemisches Verfahren zur Umwandlung von (-)Reticulin in (+)Salutaridin zur Verfügung zu stellen. Ferner besteht die erfindungsgemäße Aufgabe darin, ein enzymatisches Verfahren für diese Umwand- , lung zu schaffen, welche das gewünschte Produkt in guter Ausbeute liefert. Außerdem sollen Mikroorganismen zur Verfügung gestellt

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werden, welche dazu in der Lage sind, oxydative Kopplungsenzyme zu erzeugen.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß (-)Reticulin in (+)Salutaridin durch Umsetzung mit einem oxydativen Phenolkopplungsenzym umgewandelt werden kann, welches durch verschiedene Stämme von Mikroorganismen, die zu den Klassen der Schizomycetes oder Eumycetes gehören, erzeugt wird. Diese Phenoloxydation erfolgt gemäß dem nachstehenden Reaktionssehema:

^CH3°

(-)Reticulin

(+)Salutaridin

Gemäß einer bevorzugten erfindungs gemäß en Ausführungsform wird (-)Reticulin dadurch in (+)Salutaridin übergeführt, daß man die Ausgangsverbindung mit einem oxydativen Phenolkopplungsenzym in Berührung bringt, welches durch Züchtung von Stämmen von Schizomycetes oder Eumycetes in wäßrigen Nährmedien erzeugt wurde. Es ist am günstigsten, die Umwandlung dadurch vorzunehmen, daß man geeignete Stämme von Schizomycetes oder Eumycetes, welche die gewünschten Enzyme erzeugen, in Gegenwart von Retieulin züchtet. Andererseits kann die Umwandlung - wie es für den Fachmann leicht erkennbar ist - mit Hilfe der durch die Mikroorganismen erzeugten Enzyme durchgeführt werden, beispielsweise durch gründlichen Kontakt des (-)Reticulins mit ruhenden Zellen der die gewünschten Enzyme erzeugenden Mikroorganismen.

Bei der Durchführung der bevorzugten Methode zur Umwandlung von (-)Reticulin in (+)Salutaridin züchtet man die Stämme der Schizomycetes oder Eumycetes in wäßrigen Nährmedien und in-Gegenwart

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von (-)Reticulin ausreichend lange, daß die gewünschte Umwandlung erfolgt. Dauer und Bedingungen für die Durchführung dieser Fermentation hängen vom jeweils eingesetzten speziellen Mikroorganismus ab. Es wurde allgemein festgestellt, daß der Organismus am besten unter aeroben Bedingungen in Nährmedien mit sehr guter Eignung für die Züchtung von Mikroorganismen gezüchtet werden kann. Die für die Durchführung der Fermentation angewendete Temperatur hängt vom speziellen Mikroorganismus ab. Im allgemeinen v/erden jedoch bei Temperaturen von etwa 24 bis 37°C befriedigende Ergebnisse erzielt;, es ist zweckmäßig, die Fermentation bei etwa 28 C durchzuführen. Die Konzentration des (-)Reticulins in der Fermentationsbrühe ist nicht ausschlaggebend; im allgemeinen beträgt der bevorzugt angewendete Anteil etwa 10 bis 50 mg/100 ml Brühe (abhängig vom jeweils eingesetzten speziellen Mikroorganismus). Bei der Durchführung des Verfahrens kajin das (-)Reticulin aseptisch in Form einer wäßrigen Lösung bei einem p^-Wert von etwa 4,5 bis 6,7 in das sterilisierte Medium eingegeben werden. Man läßt das Wachstum im bebrüteten Medium dann so lange (gewöhnlich etwa 3 bis 10 Tage) erfolgen, Ms sieh möglichst hohe Mengen des (+)Salutaridins gebildet haben. Andererseits kann man das Reticulin, wie der Fachmann leicht erkennen wird, dann in die Fermentationsbrühe einbringen wenn die Gärung bereits einige Zeit in Gang ist, und die Fermentation dann fortsetzen, bis die Bildung des Salutaridins beendet ist. Ferner kann das Reticulin, wie es dem Fachmann ersichtlich ist, gründlich mit den durch die Fermentation der ausgewählten Mikroorganismen erzeugten oxydativen Phenolkopplungsenzymen in Berührung gebracht werden, beispielsweise durch innigen Kontakt des (-)Reticulins mit ruhenden Zellen des die gewünschten Enzyme enthaltenden Stammes.

Die wäßrigen Fermentationsmedien, welche bei der Herstellung des gewünschten biochemischen Enzymsystems eingesetzt werden, werden nach herkömmlichen Methoden zur Züchtung derartiger Mikroorganismen, beispielsweise nach den bei der Herstellung von Antibiotika angewendeten Verfahren, erzeugt. Solche Medien enthalten assimilierbaren Kohlen- und Stickstoff liefernde Substanzen sowie anorganische Salze einschließlich der für den reibungslosen Stoffwechsel

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der Mikroorganismen erforderlichen Spurenmetalle.

Als Substanzen, welche den assimilierbaren Kohlenstoff in den Nährmedien liefern, eignen sich im allgemeinen Kohlenhydrate, wie Zuckerarten, z.B. Glucose, Rohrzucker, Maltose, Milchzucker oder Dextrin, und Stärkearten. Die im Medium eingesetzte genaue Menge der Kohlenstoff liefernden Substanz hängt teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums ab. Im allgemeinen ist jedoch ein Kohlenhydratanteil von etwa 0,1 bis 6 Gewichtsprozent des Mediums ausreichend. Man kann eine einzige Kohlenstoff liefernde Substanz einsetzen oder mehrere solche Substanzen im Medium vereinigen.

Verschiedene Stickstoff liefernde Substanzen, wie Caseinhydrolysate, enzymatdschePapainspaltproaukte aus So jabohnenmehl, Erdnußmehl, Erdnußölmehl, lösliche Brauerei- und Brennereirückstände (Distiller "'s solubles), Maisquellwässer, Natriumnitrat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat, werden leicht durch die Mikroorganismen assimiliert.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird (-)Reticulin in (+)Salutaridin übergeführt. Im allgemeinen wird (-)Reticulin bevorzugt als Ausgangsverbindung eingesetzt, obwohl man im Verfahren der Erfindung ebenso gut Mischungen der (-)- und (+)-Form von Reticulin, insbesondere das racemische Gemisch, einsetzen kann. Die Verwendung von (-)Reticulin wird erfindungsgemäß bevorzugt, da man auf diese Weise maximale Anteile des gewünschten (+)Salutaridins erhält und die Gewinnung des gewünschten Produkts auf weniger große Schwierigkeiten stößt.

Das erfindungsgemäß erzeugte (+)Salutaridin wird leicht gewonnen, indem man die alakalische filtrierte Brühe mit einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Äthylacetat oder Benzol, extrahiert. Die Lösung des gewünschten Produkts im betreffenden Lösungsmittel kann dann durch chemische Methoden, beispielsweise nochmalige Extraktion, Aufteilung zwischen alkalischen wäßrigen Lösungen der Fermentationsprodukte und mit Wasser nicht mi-schbaren Lösungsmitteln, und/oder durch Flüssigkeits-Chromatographie oder Dünnschichtchromatographie über beispielsweise Siliciumdioxid

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weiter gereinigt werden.

Das nach dem erfindungs gemäß en Verfahren hergestellte (+)Salutaridin wird zweckmäßig durch Flüssigkeits-Chromatographie und/oder Dünnschicht Chromatographie unter Anwendung der nachstehend beschriebenen Methoden untersucht. Diese Prüfmethoden bilden ein praktisches liittel zur Bestimmung der Mikroorganismen, welche die gewünschten, die umwandlung des (-)Reticulins in (+)Salutaridin bewirkenden Enzymsysteme erzeugen. Man kann diese Methoden daher zur Selektion der in den erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Mikroorganismen anwenden.

Die zur Umwandlung von (-)Reticulin in (+)Salutaridin brauchbaren oxydativen Phenolkopplungsenzyme werden durch zu den Schizomycetes und Eumycetes gehörende Mikroorganismenarten erzeugt. Diese Klassen von Mikroorganismen sind in"Bergey*s Manual of Determinative Bacteriology", 7.Ausgabe, Williams und Wilkins, sowie in "A Dictionary of the Fungi" von Ainsworth und Bisby, 1954, Commonwealth Mycological Institute, beschrieben. Es wurde gefunden, daß Arten der Ordnungen Pseudomonadeles und Actinomycetales aus der Klasse Schi-* zomycetes, insbesondere bestimmte Spezies der Genera Pseudomonas und Streptomyces, Enzyme mit Eignung für die Umwandlung von (-)Reticulin in (+)Salutaridin erzeugen. So wurden bestimmte aus Bodenpopulationen isolierte Stämme von Pseudomonas sp. MB 3119, Streptomyces sp. MA 4382, 4383, 4384 und 4390 sowie Streptomyces griseus MA-8 als brauchbar befunden (die MB- und MA-Nummern sind jene, welche diesen Kulturen in der Kulturkollektion von Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, V.St.A., zugeordnet wurden). Kulturen dieser Organismen wurden unwiderruflich in der Kulturkollektion der Northern Regional Research Laboratories des Department of Agriculture in Peoria, Illinois, V.St.A., hinterlegt, wo sie jedermann unter den nachstehenden NRRL-Nummern frei verfügbar sind:

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Pseudoinonas sp. MB 3119 - NRRLB 5686 Streptomyces sp. MA. 4382 - NRRL 5688 Streptomyces sp. MA 4383 - NRRL 5689 Streptomyces sp. MA 4384 - NRRL 5690 Streptomyces sp. IiA 4390 - NRRL 5691 Streptomyces griseus MA-8 - NRRL 5687

Die morphologischen und Züchtungsmerkmale dieser Organismen sind aus den nachstehenden Aufstellungen ersichtlich.:

Pseudomonas sp. MB 3119

Morphologie: Stäbchen, 0,4 x 1,2-1,7 Mikron, einzeln und paarweise auftretend; gramnegativ; beweglich.

Nähragarkolonien:(48 Std.-28°C) kreisförmig, Rand zusammenhängend,

glänzend, leicht erhöht, viskos, gelbbraune Färbung, 2-3 mm

Schrägagar-Nälir- (48 Std.-28°C) gutes Waschtum, fadenförmig, glänmedium: zend Nähr brühe: (48 Std.-28 C) trübes, kleines, knopf artiges Sede-

ment, welches bei Störung viskos ist, kein Ring oder Häutchen

EMB-Agar: gutes Wachstum, rosa—gelbbraune Färbung,

halbtransparent

Magermilch-Platte: gutes Wachstum, mäßige Hydrolyse von Casein

Lackmusmilch: Wachstum, jedoch keine Färb- oder Konsistenzänderung

Nitratreduktion: negativ Oxidase: positiv Katalase: positiv Indol: negativ HgS-Erzeugung: negativ Methylrot: negativ Voges-r-Proshauer: negativ Gelatine: mäßige Verflüssigung Stärke: keine Hydrolyse

gutes Wachstum bei 28⁰C und 37°C

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schwache Säure erzeugung aus Glucose unter oxidierenden Bedingungen nach. 5 Tagen bei 28°C.

Streptomyces sp. MA 4382

Morphologie: Sporophoren verzweigt, gekrümmt, bilden Büschel;

Sporen oval, 0,9 x 1,2 Mikron (97OX), in Ketten von mehr als 10 Sporen; Kultur zeigt an den meisten Medien gute Sporenbildung.

Tomatenpaste — Hafermehl—Agar

V : Rückseite: dunkelrot

A : pulverig, flach, graustichiges Schmutzigrosa (6 ec) SP: helles Rötlichbraun Czapek-Dox—Agar (Rohrzuckernitrat-Agar)

V : Rückseite: rosa

A : pulverig, flach, helles graustichiges Rosa (5 cb) SP: hellrosa
Eieralbuminagar

V : Rückseite: rosa

A : pulverig, flach, Zentrum helles graustichiges Rosa

(5 cb), Rand hellbeige (3 ec) SP: hellrosa-beige Glycerin-Asparagih-Agar

V : Rückseite: dunkelrot

A : pulverig, helles graustichiges Rosa (5 cb), Rand

hellbeige (3 ec) SP: rosa-beige
Mineralsalz-Stärke-Agar

V : Rückseite: graustichiges Rosa

A : pulverig, hellbeige (3 ec) mit rosa Tönung im Zentrum der Kolonie und grünlicher Tönung am Rand SP: hellrosa-beige salzhaltiger Hefeextrakt-Glucose-Agar

V : Rückseite: Zentrum rötlichbraun, Rand dunkles

Gelbbraun

A : pulverig, hellbraun SP: helles Rötlichbraun

— 7 — 4098 33/1061

ί 2406A47

Hefeextrakt -Malzextrakt-Agar

V : Rückseite: rot

A : pulverig, helles graustieiliges Rosa (5 cb), Rand

hellbeige (3 ec) SP: rötliciibraun Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar

V : cremefarben bis gelbbraun A : cremefarben

SP: keines Melanin: negativ H₂S-Erzeugung: negativ Nähragar

V : Rückseite: dunkle Cremefarbe A : pulverig, cremefarben

SP: keines S tärk e agar-Nährm ed ium

V : Rückseite: dunkle Cremefarbe

A : pulverig, cremefarben bis hellbeige SP: keines

Hydrolyse von Stärke: gut G elatine agar-Nährmedium

V : Rückseite: rosastichige Cremefarbe

A : pulverig, flach, helles graustichiges Rosa SP: keines

Verflüssigung von Gelatine: gut Gelatine-Stichkultur

V : leicht, gelbbraun, flockig A : keines

SP: keines

Verflüssigung von Gelatine: vollständig Kartoffelkeil

V : gelbbraun

A : gut, helle Cremefarbe bis hellbeige SP: leichte Bräunung des Keils Lo effler-Blut serum

V : cremefarben A : keines

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SPi keines

Verflüssigung: keine
Magermilcli-Agar

V : Rückseite: dunkle rotstichige Cremefarbe
A : pulverig, helle Cremefarbe

SP: helles Rötlichbraun
Hydrolyse von Casein: positiv
Lackmusmileh

V : gutes Ringwachsturn, gelbbraun mit Purpurstich
A : mäßig, weiß bis beige

Färbet tiefpurpur oberhalb der Hälfte und gelbbraun am Boden, zeigt Reduktion von Lackmus an

Eoagulierung und/oder Peptonisierungi fast vollständige Peptonisierung, Milch wird alkalisch
(p_s 8,0)
Magermilch

V : gutes Ringwachstum, gelbbraun bis braun
A i mäßig, beige

SP: hellbraun

Koagulierung und/oder Peptonisierung: fast vollständige Peptonisierung, Milch wird alkalisch
(% 7,8)
(Eyrosin-Agar

V : Ruckseitei dunkelrot

A : pulverig, flach, helles graustichiges Rosa (5 cb

Rand hellbeige (3 ec)
SPi rosa
Zersetzung von Tyrosin: positiv

!£rypton-He"f 6 ext rakt—Brühe

purpurnes Pigment, welches mit NaöH einen tiefen rot stichigen Purpurton annimmt (reversibel bei Säurezugabe) und sich mit HCl gelbbraun färbt (reversibel bei RaÖH-Zugabe)

Kohlenstoffverwertung

Pridham-Gottlieb-Basismedium + 1 # Kohlenstoff liefernde Substanz} + = Wachstum^ + = Wachstum schlecht oder fraglich; - = kein Wachstum im Vergleich zu

— 9 -

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362 JIO

Blindprobe (keine Kohlenstoff liefernde Substanz)

Glucose +

Arabinose +

C ellulo se —

Fructose +

Ino sit -

Milchzucker +

Maltose +

Mannit +

Mannose +

Raffinose -

Rhamnose - '

Rohrzucker +

Xylose +

Temperaturbereich (salzhaltiger Hefeextrakt-Glucose—Agar)

28°C: gutes Wachstum

37⁰C: mäßiges Wachstum

5O⁰C: kein Wachstum

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in salzhaltigem Hefeextrakt-Glucose- -Agar)
aerob
Nitratreduktion: positiv

Streptomyces sp. MA 43,83

Morphologie: Sporophoren verzweigt, gekrümmt, Büschel bildend; Sporen oval bis zylindrisch, 0,9 x 1,2 Mikron (97OX), in Ketten von mehr als 10 Sporenj Kultur zeigt an den meisten Medien gute Sporenbildung
Tomatenpaste-Häfermehl-Agar

V : Rückseite: bfaun

A s körnig, helles Gelbbraun mit grünstichig-gelb-

braunem Rand (2 ec) SF: keines Czapek-Dox-Agar (Rohrzuckernitrat-Agar)

V : farblos bis helle Cremefarbe

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A : dünn, flach, cremefarben SPs keines E i e ralbumin—Agar

V : Rückseite: gelbbraun

A : dünn, pulverig, hellbeige SPt keines GIy cerin-Asparagin-Agar

V : Bückseite: rötliches Gelbbraun

A : körnig, hellbeige mit. gelbgrünen Tönungen (2 db), umrandet mit graustichig-gelbgrünen Tönungen (2 db) SP: keines Mineralsalz-Stärke-Agar

V : Rückseite: gelbbraun mit grünstichig-gelbbraunera

Rand

A : pulverig bis körnig, helles Gelbbraun mit gelblich-grünen Tönungen (2 ec) SP: gelbbraun salzhaltiger Hefeextrakt-Glucose-Agar

V : Rückseite: braun, stark gekräuselt

A : körnig, helles Gelbbraun mit gelblich-grünen Tönungen (2 ec bis 2 db) SP: gelbbraun Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

V : Rückseite: braun

A : körnig, helles Gelbbraun mit gelblich-grünen Tönungen (2 db), Rand helles Gelbbraun SP: gelbbraun Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar

V : Rückseite: rötliches Gelbbraun

A : pulverig, cremefarben bis hellbeige SP: keines Melanin: negativ HpS-Erzeugung: negativ Nähragar

V : Rückseite: gelbbraun A : hellbeige

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SP: keines Stärke-Agar-Nährmedium

V : Rückseite: tiefe Cremefarbe A : cremefarben bis hellbeige SP: keines

Hydrolyse von Stärke: gut Gelatine-Agar-Nährmedium

V : Rückseite: gelbbraun A : cremefarben

SP: keines

Verflüssigung von Gelatine: gut Gelatine-Stichkultur

V : mäßig, hellbrauner Ring A : keines

SP: hellbraun

Verflüssigung von Gelatine: vollständig Kartoffelkeil

V : gelbbraun

A : helle Cremefarbe bis hellbeige SP: leichte Bräunung des Keils Loeffler-Blutserum

V : gelbbraun A : keines SP: keines Verflüssigung: leicht

Magermilch-Agar

V : gelbbraun

A : cremefarben bis hellbeige SP: keines

Hydrolyse von Casein: positiv Lackmusinilch

V : guter Y/achstumsring, gelbbraun mit Purpurstich A : mäßig, weiß bis beige

Farbe: tiefpurpur oberhalb der Hälfte und gelbbräun am Boden, zeigt Reduktion von Lackmus an

Koagulierung und/oder Peptonisierung: fast vollständige Peptonisierung, Milch wird-alkalisch

(p_H 8,05)

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Magermilch.

V : guter Wachstumsring, gelbbraun bis braun A : mäßig, beige

SP: hellbraun Koagulierung und/oder Peptonisierung: fast vollständige Peptonisierung, Milch, wird alkalisch. (P_n 7,85) Tyrosin-Agar

V : Rückseite: braun

A : körnig, graustichiges gelbbraun (3 ge) SP: keines

• Zersetzung von Tyrosin: positiv Kohlenstoffverwertung

Pridham-Gottlieb-Basismedium + 1 fo Kohlenstoff liefernde Substanz; + = Wachstum; + = Wachstum schlecht oder fraglich; - = kein Wachstum im Vergleich zu Blindprobe (keine Kohlenstoff liefernde Substanz)

Glucose +

Arabinose -

,Cellulose -

Fructose +

Inosit -

Milchzucker +

Maltose +

Mannit +

Mannose +

Raffinose -

Rhamnose -

Rohrzucker +

Xylose +

Temperaturbereich (salzhaltiger Hefeextrakt-Glucose-Agar)

28⁰C: gutes Wachstum

37⁰C: mäßiges Wachstum

5O°C: kein Wachstum

Sauerstoffbedarf. (Stichkultur in salzhaltigem Hefeextrakt-Glucose-

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-Agar) /V

Nitratreduktion: negativ

Streptomvces sp. MA. 4384

Morphologie: Sporophoren verzweigt, gekrümmt, Büschel bildend; Sporen oval bis zylindrisch, 0,9 x 1,2 Mikron (97OX) in Ketten von mehr als 10 Sporen; Kultur zeigt an den meisten. Medien gute Sporenbildung«
Tomat enpast e-Haf ermehl-Agar

V" : Rückseite: braun

A : körnig, mittelrötlichbraun (4 ge)

SP: hellbraun
C zap ek-Dox-Agar (Rohrzuckernitrat -Agar )

V : Rückseite: cremefarben

A : dünn, körnig, cremefarben mit rosa Tönung SP: keines
Ei eralbumin-Agar

V : Rückseite: cremefarben

A : dünn, pulverig, cremefarben mit rosa Tönung SP: keines
Glyc erin-A sparagin-Agar

V : Rückseite: dunkelbraun

A : körnig, mittelrötlichbraun (4 ge) SP: braun
Mineralsalz-Stärke-Agar

V : Rückseite: rosa-beige

A : körnig, mittelrötlichbraun (4 ge), Rand hellbeige (3 ec) SP: rötlichbraun salzhaltiger Hefeextrakt-Glucose-Agar

V : Rückseite: rötlichbraun

A : körnig, hellbeige mit rötlichen Tönungen SP: rötlichbraun Hefeextrakt-Malz extrakt-Agar

V : Rückseite: rötlichbraun

A : körnig, mittelrötlichbraun (4 ge) <.

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SP: rötliehbraun Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar

V : Rückseite: braun A : beige

SP: dunkelbraun Melanin: positiv HgS-Erzeugung: positiv Nähragar

V : Rückseite: gelbbraun A : körnig, hellbeige SP: hellbraun

Stärkeagar-Nährmedium

V : Rückseite: gelbbraun A : beige

SP: hellbraun Hydrolyse von Stärke: gut G elat ine agar - Nährmedium

V : Rückseite: gelbbraun A : cremefarben bis beige SP: hellbraun Verflüssigung von Gelatine: gut

Gelatine-Stichkultur

V : Wachstum gut, gelbbraun A : keines

SP: braun

Verflüssigung von Gelatine: vollständig Kartoffelkeil

V : gelbbraun

A : tiefe Cremefarbe SP: braun Lo effler-Blutserum

V : cremefarben A : keines

SP: keines

Verflüssigung: keine Magermilch-Agar

V : Rückseite: rötliehbraun

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A : cremefarben bis beige SP: rötlichbraun Hydrolyse von Casein: positiv Lackmusmilch

V : ausgeprägtes Ring- und Oberflächenwachstum,

dunkelbraun bis grau mit Purpurstich A : weiß bis beige Farbe: bräunlichpurpur oberhalb der Hälfte und braun

am Boden, zeigt Reduktion von Lackmus an Koagulierung und/oder Peptonisierung: Peptonisierung nahezu vollständig, Milch wird alkalisch (p_H 8,2) Magermilch

V : ausgeprägtes Ringwachstum, dunkelbraun A : mäßig, beige

SP: dunkelbraun

Koagulierung und/oder Peptonisierung: Peptonisisrung fast vollständig, Milch wird alkalisch

(p_H 8,35) Tyrosin-Agar

V : dunkelbraun

A : körnig, mittelrötlichbraun, Rand hellbeige SP: dunkelbraun

Zersetzung von Tyrosin: positiv Kohlenstoffverwertung

Pridhara-Gottlieb-Basismedium + 1 fo Kohlenstoff liefernde Substanz; + = Wachstum; + = Wachstum schwach oder fraglich; - = kein Wachstum im Vergleich zu Blindprobe (keine Kohlenstoff liefernde Substanz)

Glucose + Arabinose _+ Cellulose Fructose + Inosit + Milchzucker +

Maltose + *

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Mannit +

Mannose +

Raffinose _+

Rhamnose +

Rohrzucker. +

Xylose +

Temperaturbereich, (salzhaltiger Hefeextrakt-Glucose-Agar)

28⁰G : gutes Wachstum

37⁰C : mäßiges Wachstum

5O⁰C : kein Wachstum

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in salzhaltigem Hefeextrakt-Glucose- -Agar)

Nitratreduzierung: positiv

Streptomyces sp. MA 4390

Morphologie: Sporophoren verzweigt mit Ketten von mehr als 10 Sporen, enge Spiralen bildend; Sporen oval bis zylindrisch, 0,9 χ 1,2 Mikron (97OX); Sporenbildung an den meisten Medien gut. Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

V : Rückseite: gelbbraun

A : pulverig, flach, mittelbraun mit rosa Tönungen

(4 ge) SP: keines Czapek-Dox-Agar (Rohrzuckernitrat-Agar)

V : Rückseite: helles Rötlichbraun

A : dünn, pulverig, mittelrötlichbraun (4 ge)

SP: keines Ei eralbumin-Agar

V" : Rückseite: hellbraun

A : dünn, pulverig, hellbraun bis mittelrötlichbraun

SP: keines Glyc erin-Aspar agin-Agar

V : Rückseite: helles Rötlichbraun bis 'gelbbraun

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A : pulverig, mittleres Rötlichbraun (4 ge) SP: keines Mineralsalz-Stärke-Agar

V : Bückseite: helles Rötlichbraun

A : dünn, pulverig, mittleres Rötlichbraun (4 ge) SP: keines salzhaltiger Hef eextrakt-Gluco se-Agar

V : Rückseite: rötlichbraun bis gelbbraun

A : pulverig, mittleres Rötlichbraun (4 ge) SP: keines Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

V : Rückseite: rötlichbraun bis gelbbraun

A : pulverig, mittleres Rötlichbraun (4 ge), umrändert mit Flächen von dunkelrötlichbraunem vegetativem Wachstum

SP: keines Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar

V : gelbbraun

A : zerstreut, beige SP: keines Melanin: negativ HpS-Erzeugung: negativ Nähragar

V : Rückseite: tiefrosa-cremefarben A : hellrosa-beige

SP: keines Stärkeagar-Nährmedium

V : Rückseite: rosa-beige

A : graustichiges Lavendelblau SP: helles, rotstichiges Gelbbraun Hjrdrolyse von Stärke: gut Gelatineagar-Nährmedium

V : Rückseite: cremefarben mit rosa Tönung A : rosa-cremefarben

SP: keines

Verflüssigung von Gelatine: gut

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Gelatine-Stichkultur

V : gelbbraunes Ringwaehstum A : keines

SP: hellbraun

Verflüssigung von Gelatine: vollständig Kartoffelkeil ~

V : gelbbraun A : braun SP: hellbraun

Loeffler-Blutserum

V : cremefarben A : keines

SP: keines

Verflüssigung: keine Magermilch-Agar

V : Rückseite: dunkelrosa

A : pulverig, mittleres Rötlichbraun, umrändert mit

einigen gräulich-braunen Flächen SP: dunkelrosa

Hydrolyse von Casein?¹ positiv Lackmusmilch

V : gutes Ringwachstum, gräulich-gelbbraun mit Pur

purstich A : keines Farbe: purpur oberhalb der Hälfte und rosa-braun am

Boden, zeigt Reduktion von Lackmus an Koagulierung und/oder Peptonisierung: Peptonisierung

vollständig, Milch wird alkalisch (p^ 7,6) Magermilch

V : gutes Ringwachstum, gelbbraun bis braun A : keines

SP: rosa-beige

Koagulierung und/oder Peptonisierung: Peptonisierung

vollständig, Milch wird alkalisch (p^ 7,4) Tyrosin-Agar

V : Rückseite: rotstichiges Gelbbraun

A : pulverig, flach, mittleres Rötlichbraun (4 ge)

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SP: keines
Zersetzung von Tyrosin: positiv Kohl ens t ο f f verwertung

Pridham-Gottlieb-Basismedium + 1 $ Kohlenstoff liefernde Substanz; + = Wachstum; + = Wachstum schwach oder fraglich; - = kein Wachstum im Vergleich zu Blindprobe (keine Kohlenstoff liefernde Substanz)

Glucose +

Arabinose +

Cellulose -

Fructose +

Ino sit -

Milchzucker +

Maltose +

Mannit +

Mannose +

Raffinose +

Rhamnose -

Rohrzucker +

Xylose +

Temperaturbereich (salzhaltiger Hefeextrakt-Glucose-Agar)

28⁰C : gutes Wachstum

37°C : mäßiges Wachstum

50⁰C : kein Wachstum

Sauerstoffbedarf (Stiehkultur in salzhaltigem Hefeextrakt-Glueose- -Agar)
aerob
Nitratreduktion: negativ

Bei der vorstehenden Beschreibung der Streptomyces bedeuten: V: vegetatives Wachstum
A: Luftmyzel·
SP: lösliches Pigment

Alle die Streptomyces betreffenden Werte wurden nach 3 Wochen bei 28⁰C bestimmt, sofern nichts anderes angegeben ist; der p_H-Wert

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aller Medien wurde auf etwa 6,8 bis 7,2 eingestellt. Die Farbzahl-"bezeiclmungen wurden dem "Color Harmony Manual", 4.Ausgabe (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois, entnommen.

Andere Mikroorganismen, welche als für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbar befunden wurden, gehören der Klasse Eumycetes an. Insbesondere die Unterklassen Phycomycetes und Fungi imperfecti innerhalb der Klasse Eumycetes umfassen Arten, welche im Rahmen der Erfindung bevorzugt einsetzbar sind. So bilden Arten der Gattungen Mucor, Syncephalastrum, Cunninghamella, S. Neurospora und Parasitella aus den Unterklassen Mucorales und Sphoeriales sowie der Gattungen Penicillium, Aspergillus, Torula und Sterigmatocystis aus der Unterklasse Fungi imperfecti erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen. Spezielle Organismen innerhalb dieser Gattungen (mit ihren Kennzahlen gemäß der Kulturkollektion von Merck & Co., Inc.) mit besonders guter Eignung sind Penicillium chrysogenum MF 3965, Cunninghamella sp. TtTF 4547, Torula cremoris MY-59» Neurospora sp. MF 2347 und Aspergillus sp. MF 4536. Weitere im erfindungsdungsgemäßen Verfahren verwendbare Arten von Eumycetes sind Parasitella simplex ATCC 6476 (auch als Mucor parasiticus bekannt), Syncephalastrum nigricäns QM 835, Cunninghamella echinulata QM 35L und Sterigmatocystis nigra NRRL 367 (¹¹ATCC" bedeutet "American Type Culture Collection", "QM" "Army Quartermaster Corp. Collection, Natick, Massachusetts").

Die nachstehenden Kulturen wurden unwiderruflich in der Kulturkollektion der Northern Regional Research Laboratories des Department of Agriculture, in Peoria, Illinois hinterlegt, wo sie jedermann unter den folgenden NRRL-Kennzahlen frei verfügbar sind:

Cunninghamella sp. MF 4547 - NRRL 5695 Aspergillus sp. MP 4536 - NRRL 5694 Torula cremoris MY-59 - NRRL Y7495 Neurospora sp. MF 2347 - NRRL 5692 Penicillium chrysogenum MF 3965 - NRRL 5693

Die morphologischen und Züchtungsmerkmale der ersten beiden Organismen sind in den nachstehenden Aufstellungen angeführt:

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Cunninghamella sp. MP 4547

Morphologie: Konidiophoren aufrecht, verzweigt, enden in verbreiterten Köpfen, die mit sphärischen bis ovalen Ko nidi en bedeckt sind; Myzel nicht-septiert.

Koloniebeschreibung:

Czapek-Dox-Agar: weich, ausgebreitet, helles Gelbbraun; Rückseite: gelb; Malzextrakt—Agar: flockig, ausgebreitet, hellrosa-beige; Rückseite: gelbbraun; Saboraud-Glucose-Agar: weich, ausgebreitet, hellrosa- -beige; Rückseite: gelbbraun (mehr ins Gelbliche).

Aspergillus sp. MP 4536

Morphologie: Konidiophoren kurz mit Ketten von sphärischen Konidien, welche säulenförmige Köpfe bilden.

Koloniebe- flach, ausgebreitet, dunkelolivgrün bis dunkelsalbeischreibung: grün; Rückseite der Kolonie ist gelb bis gelblichgrün

(Czapek-Dox-Agar, Saboraud-Glucose-Agar und Malzextrakt-Agar).

Beispiel

Ein lyophilisiertes Röhrchen von Parasitella simplex ATCC 6476 wird in 10 ml eines sterilen Basismediums suspendiert. Jeweils 0,3 ml der erhaltenen Suspension werden zur Beimpfung von jeweils 10 ml eines sterilisierten Basismediums mit einem Gehalt von 3000jig dl-Reticulin in 25 χ 150mm-TeströTirchen verwendet. Biß Röhrchen werden 5Tage bei 28⁰C an einem Rotationsschüttelapparat (220 UpM; Verschiebung etwa 5,1 cm) bebrüt et. Nach der Entnahme der Röhrchen vom Schüttelapparat werden etwa 1 ml 0,5 m Dinatriumphosphat, welches mit NaHpPO. auf einen p_H~Wert von etwa 8 eingestellt wurde, und anschließend 2 ml Äthylacetat zugegeben. Die Mischung wird dann so lange kräftig geschüttelt, bis sich eine glatte Emulsion bildet. Diese wird in ein Zentrifugenröhrchen übergeführt und so lange zentrifugiert, bis die Emulsion in eine Lösungsmittel- und eine wäßrige Fraktion aufbricht. Der erhaltene Äthylacetatextrakt wird dann gemäß den nachstehend beschriebenen Methoden durch Flüssigkeit s-Chromatographie und Dünnschichtchromatographie analysiert,

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wobei sich, die Gegenwart von Salutaridin ergibt.

Zur Herstellung des'in diesem Beispiel verwendeten Basismediums löst man 10 g Glucose, 3 g Malzextrakt, 2 g Hefeextrakt und 8 g Nährbrühe (Difco) in so viel Wasser, daß man 1 Liter Medium erhält. Vor der Verwendung stellt man den Pg-Wert des Mediums mit NaOH auf 7,0 ein. Bei Verwendung als festes oder Vorratsmedium werden 20 g/Liter Agar zugesetzt. Die Sterilisieruhg wird durch Behandeln der Medien während 20 Minuten bei 121⁰C im Autoklav vorgenommen.

Das dl-Reticulin wird unter aseptisehen Bedingungen in Form einer sterilen wäßrigen Lösung in solcher Menge zugesetzt, daß man eine Konzentration von 300^UgZmI erreicht. Diese Lösung von dl-Reticulin wird dadurch, hergestellt, daß man 6 mg der Verbindung in 1 ml Wasser löst, den p_H~Wert auf 7 einstellt und durch Filtration sterilisiert.

Der in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellte Äthylacetatextrakt wird durch Flüssigkeits-Cnromatographie über einem Anionenaustauscherharz und/oder Kieselgel gemäß den nachstehenden Methoden auf die Gegenwart von Salutaridin untersucht: 0,5 ml des in der beschriebenen V/eise hergestellten Äthylacetatextrakts werden mit Hilfe eines Stickstoffstroms zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit 0,5 ml wäßriger Natronlauge (p_H 11) versetzt. Man injiziert 10 Mikroliter dieser Lösung in die Anionenaustauschersäule und vergleicht die Verweilzeiten der Peaks im resultierenden Chromatogramm mit jenen von authentischem Salutaridin. Die typischen Verweilzeiten für I so salutaridin, (+) Salutaridin und (-)Reticulin bei Verwendung der Anionenaustauschersäule betragen 4,2 , 6,0 bzw. 13»5 Minuten. Wenn ein Peak im Anionenaustauscherchromatogramm die identische Verweilzeit wie das authentische (+)Salutaridin aufweist, injiziert man, um das Ergebnis zu bestätigen, 10 Mikroliter des Äthylac e tat extrakt s in einen mit einer Kieselgelsäule ausgestatteten Flüssigkeitschromatograph. Die typischen Verweilzei-ten für (+)Salutaridin und (-)Reticulin bei Verwendung der Kieselgelsäule betragen 8,2 bzw. 18,0 Minuten. Aus der

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nachstehenden Tabelle sind die beider Anionenaustausch-und Kieselgel- -Flüssigkeitschromatographie angewendeten chromatographischen Bedingungen ersichtlich:

Art der
Chromatograph!e

Säule
Elutionsmittel

Säulendruck
(Überdruck)

Säulen-Fließgeschwindigkeit

Temperatur

Anzeigegerät (UV-254)
Papiervorschub
injizierte Menge

Anionenaustausch

Du Pont SAX (1/2 Meter)

0,01 m Natriumborat (P_H 9)/0,001 m Natriumnitrat

etwa 14 Atm. 0,4 ml/min

Räumt emp eratur 0,01 OD

etwa 0,51 cm/min 10 Mikroliter

Adsorption Nester/Paust SIL-X (1 Meter) Chloroform/Methanol (Volumverhältnis 9:1)

etwa 49 Atm. 0,6 ml/min

Raumtemperatur 0,01 OD etwa 0,51 cm/min 10 Mikroliter

Die Ferment at ionsbrüh en, welche bei der allgemeinen Prüfung mittels Flüssigkeits-Ghromatographie positive Resultate liefern, werden nochmals mit Hilfe von zwei verschiedenen, nachstehend beschriebenen dünnschichtchromatographischen Systemen überprüft. Zu diesem Zweck wird die restliche Hälfte des Äthylacetatextrakts der Brühe aufgeteilt und auf die Dünnschichtchromatographieplatten (in zwei Flecken auf jede der beiden Platten) aufgebracht. Einer dieser Flecken ist ein Gemisch mit authentischem (+)Salutaridin, welches die Feststellung der Übereinstimmung mit dem erzeugten Fleck als weiteren Nachweis neben dem Rf-Wert ermöglicht. Außerdem wird eine reine authentische Probe von (+)Salutaridin (2jj.g) längsseits dieser beiden Flecken untersucht. Die Sichtbarmachung an den entwickelten Platten wird durch UV-Absorption (Fluoreszenzauslöschung der dem UV-Licht ausgesetzten Platten) und mittels Joddampf bewirkte Farbreaktion vorgenommen. Durch die letztere Methode kann die UV-Absorption verstärkt werden. Die Feststellungsgrenze beträgt bei jeder Methode etwa 1 jug in einem Fleck entsprechend einer Ausbeute von 0,25 i° in der gesamten Brühe.

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pünnschichtchromatographiesystem A
Methanol/Aceton/Chloroform (1 : 1 : 8) an SiOg-Platten (Kieselgel, Quantum Industries). Bei diesem System können die nachstehenden ausgeprägten Flecken in der Reihenfolge abnehmender Beweglichkeit festgestellt werden:

Fleck	Rf	Uv-Absorption	Jodreaktion
unbekannte Substanz I	0,65	schwach	braun
(+)Salutaridin	0,6	stark	gelb
unbekannte Substanz II	0,5	schwach	gelb
Isosalutaridin	0,45	stark	gelb
Isoboldin	0,3	schwach	purpur
(-)Reticulin	0,1	schwach	gelb ·
Dünnschichtchromatographiesystem B

Chloroform an Aluminiumoxid F254 Typ T (E.Merck). Von den vorstehend genannten Verbindungen verläßt lediglich (+)Salutaridin die Ursprungszone (Rf 0,3)» wenn es Joddampf ausgesetzt wird, entwickelt es eine charakteristische graue Farbe, welche bald ins Gelbe übergeht.

Beispiel 2

Die Oberfläche eines das Basismedium enthaltenden Schrägagars wird mit Hilfe einer sterilen Ösennadel mit der gemäß Beispiel 1 hergestellten Suspension von Parasitella simplex ATCC 6476 beimpft. Die Schrägpräparate werden 5 Tage bei 28⁰C bebrütet. Nach dieser Zeit zeigt sich ein üppiges Wachstum. Man beimpft 40 ml steriles Basismedium mit mehreren Ösen des Pilzes aus dem bebrüteten Schrägpräparat. Jeweils 1 ml der erhaltenen Suspension werden dann in jeden von dreißig 250 ml-Erlenmeyer-Kolben, welche 40 ml des in Beispiel 1 beschriebenen sterilen Basismediums sowie 300 jug/ml dl-Reticulin enthalten, eingeimpft. Die erhaltenen beimpften Kolben sowie Vergleichskolben ohne Reticulin werden 5 Tage bei 28°C an einem Rotations Schüttelapparat bebrütet. Danach wird der Inhalt der das dl-Reticulin enthaltenden Kolben vereinigt.

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Sowohl die reticulinhaltige Ferment at ionsbrühe als auch, die Vergleichsbruhe werden auf die Gegenwart von Salutaridin untersucht. Es wird festgestellt, daß die dl-Reticulin enthaltenden Brühen im Gegensatz zu den Vergleichsbrühen Salutaridin enthalten.

Beispiel 3

40 ml in einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindliches Basismedium werden mit der in Beispiel 2 beschriebenen Schrägkultur von Parasitella simplex ATCC 6476 beimpft. Man bebrütet 3 Tage bei 28⁰C an einem Schüttelapparat. Dann beimpft man 60 Kolben, welche jeweils 40 ml des 300jug/ml dl-Reticulin enthaltenden Basismediums beinhalten, mit 1 ml der resultierenden Impfkultur. Nach 5tägiger Bebrütung bei 28⁰C an einem Schüttelapparat werden die erhaltenen Fermentationsbrühen untersucht. Es wird festgestellt, daß sie Salutaridin enthalten.

Beispiel 4

Eine Öse Parasitella simplex ATCC 6476 wird aus einer Schrägkultur in 10 El steriles Basismedium übergeführt. Die Suspension (0,25 ml) überimpft man in 25 x 150 mm-Teströhrchen, welche 10 ml steriles Basismedium und 300 lug/ml dl-Reticulin enthalten. Die beimpften Röhrchen werden bei 28⁰C an einem Rotationsschüttelapparat bebrütet. Man entnimmt einzelne Röhrchen nach 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 Tagen Bebrütung und prüft auf die Gegenwart von Salutaridin. Die nachstehende Tabelle zeigt die in den Fermentationsbrühen enthaltene Salutaridinmenge, wie sie gemäß den hier beschriebenen Methoden bestimmt wurde:

gebildetes Salutaridin Tage der Bebrütung .ju.g/ml

4 0,5

5 0,9

6 3,6 .

7 1,4

8 3,5

9 2,9 10 .5,7

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Beispiel 5

Eine durch Fermentation von 2250 ml Basismedium mit einem Gehalt von 675 mg dl-Reticulin, wie in Beispiel 3 beschrieben ist, erhaltene Gärbrühe wird durch Zugabe von 14,2 g Dinatriumphosphat alkalisch gemacht (p_H 8,1). Die erhaltene Mischung wird mit 500 ml Äthylacetat verrührt und filtriert. Man extrahiert die wäßrige. Schicht des Filtrats zweimal mit jeweils 350 ml Äthylacetat und trocknet die erhaltenen vereinigten Extrakte über Natriumsulfat. Der .nach dem Eindampfen im Vakuum erhaltene Rückstand wird zwischen 100 ml 4prozentiger Natronlauge und 100 ml Benzol unter Stickstoff aufgeteilt. Die abgetrennte wäßrige Schicht wird mit weiterem Benzol gewaschen und anschließend mit 85prozentiger Phosphorsäure auf P₁J 7,0 bis 8,0 eingestellt. Man extrahiert die erhaltene alkalische Lösung in einer Stickstoffatmosphäre dreimal mit jeweils 100 ml Chloroform. Die vereinigten Extrakte werden getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird an drei Siliciumdioxidplatten (E.Merck, 2 mm, 20 χ 20 cm) unter Verwendung von 20 fo Methanol in Chloroform als Entwicklungs-Iiösungsmittel chromatographiert. An den entwickelten Platten werden zwei ausgeprägte Banden durch UV festgestellt und durch Abschaben isoliert. Das abgeschabte SiOp-Material wird mit Methanol extrahiert. Ben. beim Abdämpfen des Methanols anfallenden Pest stoff extrahiert man nochmals mit Dichlormethan, wobei man SiOp-freie Substanzen erhält. Die sich langsamer bewegende Bande (Rf 0,6, 13 mg) wird als Isosalutaridin identifiziert. Das Produkt der sich rascher bewegenden Bande (Rf etwa 0,65) erfordert eine v/eitere Reinigung, welche an zwei Aluminiumoxidplatten (20 χ 20 cm, E.Merck) unter Verwendung von Chloroform als Lösungsmittel (Rf etwa 0,3) vorgenommen wird. Durch Isolierung des Produkts aus dieser Bande nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhält man 13,4 mg Salutaridin, das bezüglich des rechtsdrehenden Isomeren in Form eines gelben, kristallinen Feststoffs angereichert ist. Die Kristallisation aus 0,2 ml Äthylacetat liefert 7,1 mg hellgelbe Kristalle vom Fp. 212 bis 2H⁰O; /όί/_Ώ +Η,7±7,8 (C 0,48, Methanol); >?^^hano1 280 mu-(£=6,050), 241 mu (6 = 18,900); Kernresonanz (CDCl-.) T2,66 (C₅-H), 3,47 (AB-Quartett, C₁-H und C₂-H), 3,83 (C₈-H), 6,21 und 6,34 (OCH₃) und 7,61 ppm (IiCH₃), deckt sich mit authentischerprobe von (+)Salutaridin.

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Massenspektrum: M 327, m/e 312, 299, 284.

Isosalutaridin: Kernresonanz (CDCl₃)T3,37 (C₅-H), 3,46 (C₄-H), 3,80 (C₁-H), 3,83 (Cg-H), 6,19 und 6,28 (OCH₃) und 7,59 ppm (N-CH₃) alles Singuletts.

Beispiel 6

1 Liter sterilisiertes Basismedium, welches Glucose, Malzextrakt, Hefeextrakt und Nährbrühe (Difco) sowie 400 mg (-)Reticulin.HCl. .2HpO (entsprechend 339 mg (-)Reticulin-Base) enthält, wird mit Parasitella simplex ATCC 6476 beimpft und unter Belüftung 6 Tage bei 28⁰C bebrütet. Man versetzt die erhaltene Fermentationsbrühe mit 100 ml 0,5 m Dinatriumphosphat und 250 ml Benzol. Nach gründlichem Rühren wird die Mischung filtriert. Man trennt die organische Schicht ab und extrahiert die wäßrige Phase mit weiteren 25O ml Benzol. Die vereinigten Benzolextrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und zweimal mit jeweils 50 ml 1 η Natriumhydroxid in einer Stickstoff atmosphäre extraiiiert. Die vereinigten alkalischen Extrakte werden mit Benzol rückgewaschen, mit 85prozentiger Phosphorsäure auf einen p^-Wert von 7,5 eingestellt und zweimal mit jeweils 200 ml Benzol extrahiert. Die vereinigten Benzolextrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Als Rückstand erhält man rohes (+)Salutaridin, welches nach den in Beispiel 5 beschriebenen Methoden chromatographiert wird. Dabei erhält man eine (+)Salutaridin-Fraktion, welche aus Äthylacetat Kristalle vom Fp. 191 bis 194°C liefert (Fp. von authentischem (+)Salutaridin I90 bis 194⁰C). Die optische Rotationsdispersion in Äthanol entspricht in jeder Einzelheit jener einer authentischen Probe von (+)Salutaridin.

Beispiel 7

Zahlreiche identische Röhrchen, welche sterilisiertes Basismedium und 300jtig (-)Reticulin/ml enthalten, werden gemäß Beispiel 1 mit Parasitella simplex ATCC 6476 beimpft und bebrütet. Beginnend 3 Tage nach der Beimpfung werden täglich jeweils zwei Röhrchen entnommen. Man bestimmt den p„-Wert und untersucht die Brühe nach den vorstehend beschriebenen Methoden. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in der nachstehenden Tabelle angeführt:

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4 0 9 8 3 3/ 1 061

	Ρττ-Wert der	-Ά	Salutaridin	1 8	2406447
Alter	n Brühe	.Jig/ral
(Tage)	7,2	0,1
3	7,6	1,1
4	8,0	2,8
5	8,0	1,1
6	8,1	3,9
7	8,3	3,4
8	8,5	5,6
9	8,7	5,1
10	8,8	4,4
11	8,8	4,7
12	B e i s ρ i e

500 ml des in Beispiel 1 beschriebenen Standard-Basismediums, welches 300jug/ml dl-Reticulin enthält, werden in eine 20,3 χ 38,1 cm-Kulturschale gegeben. Die Oberfläche dieses Mediums wird durch Besprühen mit einer Sporensuspension von Parasitella simplex ATCC 6476 beimpft und 5 Tage bei 28⁰C bebrütet. Danach entfernt man die an der Oberfläche gewachsene dichte, kompakte Matte aus der Schale und gibt sie in eine andere Schale, welche lediglich 500 ml 0,1 m Acetatpuffer (p_w 5,0) enthält. Man läßt die Matte unter gelindem Rütteln 1 Stunde an der Oberfläche des Puffers schwimmen und überträgt sie dann in eine Schale, die denselben Puffer sowie 0,1 fo Glucose und 300jüig/ml Reticulin enthält. Diese Schale wird sodann v/eitere 6 Tage bei 28 C bebrütet. Prüfungen v/erden am ursprünglichen Züchtungsmedium nach 5 Tagen sowie am letztlich resultierenden Ruhezellenmedium nach 6 Tagen vorgenommen. Das Züchtungsmedium enthält 1,3jug/ml (+)Salutaridin zum Zeitpunkt der Übertragung und das Ruhezellenmedium 2,13jug/ml nach den zusätzlichen 6 Tagen. In der Ruhezellenphase ist kein weiteres Wachstum feststellbar.

Beispiel 9

Verschiedene, in der nachstehenden Tabelle beschriebene sterilisierte Medien mit einem Gehalt von 300jug/ml (-)Reticulin werden

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mit Parasitella simplex ATCC 6476 beimpft, 4 Tage bebrütet und schließlich untersucht. Die nachstehende Tabelle zeigt außer den Medien auch die (+)Salutaridin-Werte.

Medium Medium ' Salutaridin Nr. jag/ml

1 NYM* + 1 g CaCCK/Kolben 3,2

2 NYM + 1 Tropfen Tween 20²VKolben 3,4

3 2 °fo Glucose + 5 i° Sojabohnenmehl 2,4

4 2 i> Glucose + 5 i° Sojabohnenmehl + 0,3 i> YE** 2,2

5 2 £ Glucose + 5 # CSL*** 1,7

6 2 5$ Glucose + 5 1° CSL + 0,3 # YE 1,5

7 2 ?δ Glucose + 5 # CSL + 2 # Sojabohnenmehl 1,8

8 NYM (Vergleichsprobe) 2,2

*NYM = Standard-Nährbrühe-Hefeextrakt-Malzextrakt-Glucose-Medium **YE = Hefeextrakt
***CSL = Maisquellwasser

'AHe Medien(außer das CaCO^ enthaltende) werden auf einen p^-Wert von 7,0 eingestellt; in allen Fällen werden 40 ml in 250 ml-Erlenmeyer-Kolben eingefüllt.

'Tween 20 = Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat.

Beispiel 10

Das Verfahren von Beispiel 1 wird unter Verwendung der nachstehenden Mikroorganismen anstelle von Parasitella simplex ATCC 6476 wiederholt:

Streptomyces sp. MA 4382 Streptomyces sp. MA 4383 Streptomyces sp. MA 4384 Streptomyces sp. MA 4390 Streptomyces griseus MA-8 Penicillium chrysogenum MF 3965 Syncephalastrum nigricans MF 2684 Cunninghamella echinulata MF 2757 Torula cremoris MY-59 - 30 -

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Pseudomonas sp. MB 3119
Cunninghamella sp. MF 4547 Neurospora sp. MF 2347
Aspergillus sp. MP 4536
Sterigmatocystis nigra MF 523

In jedem Falle ergibt die Untersuchung der Ferment at ionsbrühe die Gegenwart von. (+)Salutaridin.

Das nach den vorstehend beschriebenen Verfahren erzeugte (+)SaIutaridin wird nach herkömmlichen Methoden in Thebain, ein wertvolles Alkaloid, umgewandelt.

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Claims (21)

Patentan s ό r ü c h e

1. Verfahren zur Herstellung von (+)Salutaridin, dadurch gekennzeichnet , daß man (-)Retieulin in innige Berührung mit einem oxydativen Phenolkopplungsenzym bringt, welches durch Züchtung eines Stammes der Klasse Schizomycetes oder Eumycetes in einem wäßrigen Nährmedium erzeugt wurde.

2. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm der Klasse Schizoraycetes angehört.

3. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm der Ordnung Pseudomonadales oder Actinomycetales angehört.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm dem Genus Pseudomonas angehört.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Pheiio lko pplungs enzym erzeugende Stamm dem Genus Streptomyces angehört.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm Streptomyces griseus ist.

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm Streptomyces sp. NRBL 5688 ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm der Unterklasse Phycomycetes oder Fungi imperfecti angehört.

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9. Verfahren nach Anspruch. 8, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm der Ordnung Mucorales oder Sphoeriales angehört.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm dem
Genus Mucor, Syncephalastrum, Cunninghamella, S.Neurospora oder Parasitella angehört.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm Parasitella simplex ATCG 6476 ist.

12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm Cunninghamella sp. NRRL 5695 ist.

13· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm Syncephalastrum nigricans QM 835 ist.

14. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Pheno lko pplungs enzym erzeugende Stamm der Ordnung Moniliales angehört.

15. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der das oxydative Phenolkopplungsenzym erzeugende Stamm dem Genus Penicillium, Aspergillus, Torula oder Sterigmatocystis angehört.

16. Verfahren zur Herstellung von (+)Salutaridin, dadurch gekennzeichnet, daß man einen ein oxydatives Phenolkopplungsenzym erzeugenden Stamm der Klasse Schizomycetes oder Eumycetes in einem wäßrigen TTährmedium in Gegenwart von (-)Reticulin züchtet.

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17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Parasitella simplex ATCC 6476 ist.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Cunninghamella sp. NRRL 5695 ist.

19· Verfahren zur Herstellung von ~(+)Salutaridin, dadurch, gekennzeichnet, daß man einen ein oxydatives Phenolkopplungs enzym erzeugenden Stamm der Klasse Schizomycetes oder Eumycetes in einem wäßrigen Nährmedium in Gegenwart von (—)Reticulin züchtet und das (+)Salutaridin durch Extraktion der filtrierten alkalischen Ferment at ions"brühe mit einem mit Wasser nicht
mischbaren Lösungsmittel gewinnt.

20. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Parasitella simplex ATCC 6476 ist.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Cunninghamella sp. NRRL 5695 ist.

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