DD153213A5

DD153213A5 - Verfahren zur herstellung der die faktoren a,b,d und h von a-30912 enthaltenden antibiotikummischung a-42355 sowie der einzelnen faktoren

Info

Publication number: DD153213A5
Application number: DD80221644A
Authority: DD
Inventors: Laverne D Boeck; Ralph E Kastner
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1979-06-08
Filing date: 1980-06-06
Publication date: 1981-12-30
Also published as: PT71349A; JPS5635988A; FI801772A; DK244680A; ES492227A0; RO79494A; FR2458587A1; IT1209228B; GR69261B; IT8022585A0; AR222553A1; AU5901580A; PL224774A1; US4288549A; GB2058078A; ES8105149A1; CA1154695A; EP0021684A1; RO79494B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotikummischung A-42355 der A-30912-Faktoren A, B, D und H sowie der einzelnen Faktoren. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dasz a) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 in einem assimilierbare Ausgangsstoffe fuer Kohlenhydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Naehrmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Ausbildung einer betraechtlichen antibiotischen Aktivitaet gezuechtet und b) die A-42355-Antibiotikummischung gegebenenfalls von dem Naehrmedium abgetrennt wird und c) die Antibiotikum A-30912-Faktoren A, B, D und H gegebenenfalls aus der A-42355-Anibiotikummischung isoliert werden.

Description

Aktenzeichen: X-5164A-2

Anmelder:

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V. St. A.

Vertreter:

Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung der die Faktoren A, B, D und H von A-30912 enthaltenden Antibiotikummischung A-42355 sowie der

einzelnen Faktoren

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotikummischung A-42355 der A-30912-Faktoren A, B, D und H, sowie der einzelnen Faktoren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

A-30912 Faktor A (Antibiotikum A-22082) ist in den US-PS 4 024 245 und 4 024 246 abgehandelt. Zur Zeit des Erscheinens dieser Patentschriften wurde angenommen, daß A-30912-Faktor A von Echinocandin B /vgl. F. Benz et al., HeIv. Chirru Acta 57, 2459-2477 (1974) und CH-PS 568 386 (Derwent Abstract 75884W_)_/,verschieden sein könnte. Erst spätere

Prüfungsergebnisse haben gezeigt, daß A-30912-Faktor A mit Echinocandin B identisch ist. Auch Antibiotikum SL 7810/F ist als Echinocandin B identifiziert worden /C. Keller-Juslen, et al., Tetrahedron Letters 1976 (46), 4147-4150 und BE-PS 834 289 (Derwent Abstract 3O159Xj_/.

Keller-Juslen und Mitarbeiter haben für Echinocandin B (SL 7810/F) die Struktur 1 vorgeschlagen:

HO

OH

1_ R= Linolecyl

Echinocandin B (Antibiotikum 32204) wird wie in CH-PS 568 (Derwent Abstract 75884W) angegeben durch Fermentation eines Stamms von Aspergillus nidulans var. echinulatus A 32 204 (NRRL 386O) erzeugt. Das Antibiotikum SL 7810/F wird wie in BE-PS 834 289 (Derwent Abstract 30159X) angegeben durch einen Stamm von Aspergillus rugulosus, Thorn und Raper (NRRL 8039) erzeugt.

Die A-30912-Faktoren B und D sind in der US-PS 4 O24 245 beschrieben. A-3O912-Faktor B.ist dem Antibiotikum SL 781O/-II ähnlich und kann mit diesem identisch sein. A-30912-Faktor D ist dem Antibiotikum SL 781O/-III ähnlich und kann mit diesem identisch sein. Die Antibiotika SL 781O/-II und SL 781O/-III werden, wie in der BE-PS 834 289 (Derwent Abstract 30159X) angegeben, durch einen Stamm von Aspergillus rugulosus, Thorn und Raper (NRRL 8O3S) erzeugt.

A-30912-Faktor A (Antibiotikum A 22082) und ein Verfahren zu seiner Herstellung unter Verwendung von Aspergillus nidulans NRRL 8112 sind in US-PS 4 024 24 6 und A-30912-Faktoren A, B, C, D, E, F und G und ein Verfahren zu ihrer Herstellung unter Verwendung von Aspergillus rugulosus NRRL 8113 sind in US-PS 4 024 245 beschrieben.

Ziel der Erfindung: . ^v

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung der neuen A-42355-Antibiotikummischung der A-30912-Faktoren A, B, D und H und ihrer.einzelnen Faktoren zur Verfügung zu stellen, das von einem neuen Mikroorganismus Gebrauch macht. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Antibiotikummischung A-42355, die die A-30912 Faktoren A, B, D und H enthält, durch Züchtung des neu isolierten Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 in einem assimilierbare Ausgangsstoffe für Kohlenhydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Ausbildung einer beträchtlichen Menge antibiotischer Wirksamkeit erzeugt und die Antibiotikummischung von dem Nährmedium abgetrennt, wonach die einzelnen Antibiotikumfaktoren A, B, D und H isoliert werden können. A-30912-Faktor H ist ein neues

Antibiotikum mit antifungaler Wirksamkeit, das in der Anmeldung der gleichen Anmelderin vom gleichen Tag mit dem internen Aktenzeichen X-5281A beschrieben ist. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung von A-30912-Faktor A (Echinocandin B; SL 7810/F) durch Züchten von Aspergillus nidulans var. roseus unterscheidet sich von den bekannten Verfahren. Aus Zweckmäßigkeitsgründen wird die Bezeichnung A-30912-Faktor A hierin für dieses Antibiotikum gebraucht.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des die A-30912-Faktoren A, B, D und H enthaltenden A-423 Antibiotikumgemisches und von Antibiotikum A-30912-Faktor A, Antibiotikum A-30912-Faktor B, Antibiotikum A-30912-Faktor D und Antibiotikum A-30912-Faktor H, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440

in einem assimilierbare Ausgangsstoffe für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Ausbildung einer beträchtlichen antibiotischen Aktivität gezüchtet und

(b) die A-42355-Antibiotikummischung gegebenenfalls von dem Nährmedium abgetrennt wird und

(c) die Antibiotikum A-30912-Faktoren A, B, D und H gegebenenfalls aus der A-42355-Antibiotikummischung isoliert werden.

Im Rahmen der Erfindung wird auch eine biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 zur Verfügung gestellt.

Die beigefügten Zeichnungen dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. -

Figur 1 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von A-30912-Faktor H in einer KBr-Scheibe.

Figur 2 zeigt die relativen Wanderungen der A-30912-Faktoren bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von Kieselgel (Merck-Darmstadt) als Adsorbens, eines Lösungsmittel-Systems aus drei Teilen Ethylacetat und zwei Teilen Methanol und einer Bioautographie mit Candida albicans zum Nachweis. Der Pfeil gibt die Richtung des Lösungsmitelflusses an; das Zeichen "+" zeigt den Ausgangspunkt an. Das Gebiet, in dem die geringfügigen Faktoren E, F und G erscheinen, ist durch eine Klammer bezeichnet. Gegenüberstellungen der R^-Werte von A-30912-Faktor A und der geringfügigen Faktoren E, F und G finden sich in US-PS 4 024 245 (siehe Tabelle I in Spalte 4),

Ausführliche Beschreibuna der Erfindunq:

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Erzeugung der A-30912-Antibiotika. Die A-30912-Antibiotika werden als Gemisch erzeugt, das mehrere Einzelfaktoren enthält. Die Bezeichnung "Antibiotikummischung", wie sie auf dem Fermentationsgebiet und in der vorliegenden Beschreibung gebraucht wird, bezieht sich auf eine Mischung aus gleichzeitig erzeugten einzelnen Antibiotikumfaktoren. Wie für den Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres ersichtlich, hängt das Verhältnis der erzeugten Einzelfaktoren in einem Antibiotikumgemisch von den angewandten Fermentationsbedingungen ab und ändert sich mit diesen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Antibiotikummischung wird hierin als die A-42355-Antibiotikummischung bezeichnet. Um jedoch Verwechslungen zu vermeiden, werden die A-30912-Bezeichnungen für diejenigen Einzelfak-

toren der A-42355-Mischung gebraucht, die mit A-30912-Faktoren identisch sind.

Wie im Fall der A-30912-Antibiotikummischung ist A-30912-Faktor A der Hauptfaktor der A-42355-Antibiotikummischung. Die A-30912-Faktoren B, D und H sind auch in der A-4 2355-Mischung geringfügige Faktoren.

A-30912-Faktor H (A-3O912H), der neu gefundene Bestandteil der A-30912-Antibiotikummischung, steht dem A-30912-Faktor A recht nahe. Unter den derzeit bekannten Bedingungen ist A-30912H ein geringfügiger Faktor in der A-30912-Mischung und liegt in Mengen im Bereich von 0,01 bis 1,0 % des Gesamtkomplexes vor. Ein weiterer geringfügiger Faktor der A-30912-Mischung ist zwar erkannt, aber nicht in zu seiner Charakterisierung ausreichender Menge isoliert worden. A-30912-Faktor H wird von diesem Faktor am besten durch Kieselgel-TLC unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus 3 Teilen Ethylacetat und 2 Teilen Methanol oder aus 95 Teilen Acetonitril und 5 Teilen Wasser abgetrennt. In beiden Systemen ist der nichtcharakterisierte geringfügige Faktor stärker polar als die anderen A-30912-Faktoren.

Ä-30912-Faktor H ist ein weißer amorpher Feststoff, dessen Elementaranalyse folgende Werte ergibt: Kohlenstoff 58,27 %, Wasserstoff 7,49 %, Stickstoff 8,87 %, Sauerstoff 24,99 %.

A-30912-Faktor H hat ein Molekulargewicht von etwa 1073. Dieses Molekulargewicht beruht auf der Peak-Anpassung (FD/FD) der quasimolekularen Ionen von A-30912-Faktor A (C₅₂Hg₁N O.g) und A-30912-Faktor H. Das quasimolekulare

Ion von A-30912-Faktor H (+Na) hat, wie festgestellt wurde,

die Masse 1096,5782, 1096,5814. Die mittlere Masse 1096,5798 liegt innerhalb der Fehlergrenze für Cj.,H^N₇0_1f..Na, das eine theoretische Masse von 1096,57940 hat.

Als empirische Formel für A-30912-Faktor H wird deshalb Cj-OHOoN₇O₁-. angenommen. Die . Elementaranalyse von A-30912-Faktor H stimmt besonders gut mit der empirischen Formel C_C..,H N_0 H_O0 (ber. C 58,30; H 7,79; N 8,98; 0 24,93)

D-J OJ / IO Δ

überein.

Das in Figur 1 dargestellte Infrarotabsorptionsspektrum von A-30912-Faktor H in einer KBr-Scheibe zeigt die folgeden charakteristischen Absorptionsmaxima: 2,9 (sehr stark), 3,4 (stark), 3,5 (mittel), 5,9-6,1 (sehr stark), 6,6 (stark), 6,9 (stark), 7,9-8,1 (mittel) und 9,1 (stark) Mikron.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von A-30912-Faktor H in neutralem sowie in saurem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 223 nm (epsilon 13 100) und 275 nm, breites Peak (epsilon 2 100). Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von A-30912-Faktor H in basischem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 245 nm (epsilon 14 700) und 290 nm, breites Peak (epsilon 3 500) und auch Endabsorption.

Das C magnetische KernresonanzSpektrum von A-30912 Faktor H in Perdeuteromethanol zeigt folgende Werte:

delta 176,07, 174,15, 173,49, 172,56, 172,47, 169,88, 158,45, 133,01, 130,90, 129,52, 129,04, 116,21, 82,15, 77,00, 75,98, 75,71, 71,27, 69,55, 69,42, 68,22, 62,44, 58,69, 57,25, 56,81,· 56,08, 52,88, 51,32, 39,08, 38,60, 36,89, 32,65, 30,77, 3O,45, 30,26, 28,18, 27,14, 26,55, 20,11, 19,60, 11,33.

A-30912-Faktor H hat die folgenden spezifischen Drehungswerte:

/^⁵ -40° (c 0,5, CH₃OH)

/alpha/3^ -151° (c 0,5, CH₃OH)

Electrometrische Titration von A-30912-Faktor H in 66-prozentigem wäßrigen Dimethylformamid ergibt das Vorliegen einer titrierbaren Gruppe mit einem pK -Wert von etwa 12,90

ei

(Anfangs-pH 7,12).

Die Aminosäureänalyse von A-30912-Faktor H ergibt nach Hydrolyse das Vorliegen von Threonin und vier weiteren noch nicht identifizierten Aminosäuren.

A-30912-Faktor H ist in vielen verschiedenen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Ethylacetat löslich, aber in unpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diethylether und Petrolether unlöslich. A-30912-Faktor H ist auch in wäßrigen Lösungen, insbesondere solchen mit einem pH-Wert von über 7,0, löslich.

A-30912-Faktor H (Mol. Gew. 1073) unterscheidet sich von A-30912-Faktor A (Mol. Gew. 1059) nur durch 14 Masseneinheiten. Beide Verbindungen sind hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften sehr ähnlich und bilden bei der Hydrolyse Linoleinsäure. A-3O912H weist eine weitere -CH₂~Gruppe auf, die als -O-CH,. anstelle einer der -OH-Gruppen in dem cyclischen Peptidteil des Moleküls vorliegt.

A-3O912H hat die durch Formel 2 dargestellte Struktur:

πα

Ηβ/

HO. Η—β / Ο=·. "H ^ΧΟΗ ·

2_ R =.Linoleoyl

Der Mikroorganismus:

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzeugung von A-30912-Antibiotika wird, wie beschrieben, eine neue Kultur, die eine Varietät von Aspergillus nidulans darstellt, gezüchtet. Die neue Kultur hat die Bezeichnung Aspergillus nidulans var. roseus erhalten.

Der erfindungsgemäß verwendete neue Mikroorganismus ist eine biologisch reine Kultur, die aus einer Bodenprobe aus Greenfield, Indiana, V. St.. A. isoliert worden ist. Ein Stammcharakteristikum dieses Mikroorganismus ist die Erzeugung der A-30912-Antibiotika. Eine Unterkultur dieses Mikroorganismus ist in der ständigen Kulturensammlung des

Northern Regional Research Laboratory, U. S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service,· Peoria, Illinois 61604, V. St. A. hinterlegt und zu einem Teil dieser Sammlung gemacht worden, von der sie unter der Nr. NRRL 11440 für die Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt wird.

Wie bei anderen Mikroorganismen unterliegen die Merkmale von Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 Schwankungen. Beispielsweise können künstliche Varianten und Mutanten des Stamms NRRL 11440 durch Behandlung mit den verschiedensten bekannten mutagenen Mitteln, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, Wellen hoher Frequenz, radioaktive Strahlen und Chemikalien erhalten werden. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten von Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440, die noch das Charakteristikum der Erzeugung der A-30912-Antibiotika aufweisen, können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.

Taxonomie von Aspergillus nidulans var. roseus

Die erfindungsgemäß verwendete neue Kultur ist von Thomas H. Sands der Lilly Research Laboratories eingehend untersucht und charakterisiert worden.

Zur Vereinfachung wird die ifeue Kultur Aspergillus nidulans var. roseus im folgenden als Kultur A-42355 bezeichnet. Die taxonomische Grundlage, worauf diese Kultur als neue Varietät von Aspergillus nidulans klassifiziert und als A. nidulans var. roseus bezeichnet worden ist, wird im folgenden abgehandelt. Bei dieser Abhandlung beziehen sich die Bezeichnungen "ISCC-NBS" auf Farbnamen auf der Grundlage der ISCC-NBS-Methode (K. L. Kelly und D. B. Judd,

"The ISCC-NBS-Methods of Designating Colors and A Dictionary of Color Names", U. S. Department of Commerce, Circ. 553, Washington, D. C.1955). Die Bezeichung "Maerz und Paul" bezieht sich auf Farbblöcke nach A. Maerz und M. R. Paul in "Dictionary of Color", McGraw-Hill Book Company, New York, N. Y., 1950.

Vergleiche beruhen auf der Arbeit von K. B. Raper und D. I. Fennel, "The Genus Aspergillus", Williams and Wilkins, 1965.

Die Kultur A-42355 erreicht einen Durchmesser von 14 mm in 7 Tagen und von 35 mm in 21 Tagen, wenn sie bei 25 ⁰C auf Czapek-Lösung-Agar gezüchtet wird. Die Oberfläche der Kolonie ist radial bucklig, konvex und zunächst samtartig bis schwach flockig. Das Aussehen der Oberfläche ändert sich mit dem Altern infolge der Bildung eines rosafarbenen Exudats, das nach erfolgtem Trocknen eine Pockenoberfläche ergibt. Der Randbereich ist stark gekerbt bis gelappt und scharf begrenzt, wobei nur spärliches peripheres Wachstum unter der Oberfläche erkennbar ist. Mit dem Altern der Kolonie verursachen Pigmentänderungen eine Gürtelwirkung. Die Rückseite der Oberfläche erscheint konkav und nur an der Peripherie in Berührung mit dem Agar. Es wird ein rosafarbenes lösliches Pigment gebildet. Die Mycelschicht ist sehr zäh und bildet keinen deutlichen Geruch. In jungen Kolonien wird die Pigmentierung durchs unreife Conidien beeinflußt, die hellgrünlich gelb sind (ISCC-NBS 101 und Maerz und Paul 11-K-l). Diese Farbe ist schließlich auf die Peripherie der Kolonie beschränkt. Nach 10 Tagen sind fast runde Massen von Hüllzellen, die schwärzlich purpurfarbene Cleistothecien umkrusten, über die gesamte Kolonie verteilt, sind aber am auffälligsten in der Mitte angehäuft. Nach 21 Tagen ist der schmale, etwas abgeflachte

Randbereich grau-grünlich gelb (ISCC-NBS 105 und Maerz und Paul 12-1-2). Innerhalb dieses Randbereichs ist die Kolonie mäßig gelblich-rosafarben (ISCC-NBS 29 und Maerz und Paul 11-A-6), und die Färbung wird durch das Exudat beeinflußt. Nach 21 Tagen wird die Mitte durch gräulich-grüne Conidien und von Hüllzellen umkrustete schwärzlich-purpurfarbene Cleistothecien verdunkelt. Die Rückseite reicht von hellbraun (ISCC-NBS 57 und Maerz und Paul 13-A-7) bis mäßig rötlichbraun (ISCC-NBS 43 und Maerz und Paul 6-F-9). Nach 3 Wochen oder langer weist die Rückseite Schattierungen von sehr dunkel purpurfarben, nahezu schwarz auf. .

Der Conidienkopf ist zuerst radiär und glänzend gelb und wird darm dunkelgrün und engsäulig. Im Zustand der Reife haben die Köpfe eine Länge von 93,4 bis 116,7 μΐη und eine durchschnittliche Größe von 106 χ 47 μπι. Die Blase ist in etwa spateiförmig bis birnenförmig und wie die Conidiophoren hellbraun. Die Blasen sind über die oberen zwei Drittel fortpflanzungsfähig und haben Größen von 10 bis 12x8 bis 10 μΐη (Durchschnittsgröße 9,2 χ 11,3 μπι). Die Conidiophoren sind gewunden, glatt und verhältnismäßig dickwandig. Ihre Länge reicht von 88 μΐη bis 112 μΐη (Durchschnitt 101 μπι) . Diese Dicke kann zwar 4 bis 6 μπι betragen, doch sind die meisten 6 μπι dick.

Die Sterigmata sind beidseitig gezahnt, glasartig bis hellbraun und glattwandig. Primärsterigmata sind nahezu keilförmig. Ihre Länge reicht von 6,3 bis 10,3 μΐη und ihre Dicke von 2 bis 3 μπι an der dicksten Stelle (Durchschnittsgröße: 9,3 χ 2,7 μπι) . Sekundär sterigmata sind ei- bis birnenförmig und haben Größen von 5,5 bis 11,0 χ 2,4 bis 3,2 μπι (Durchschnittsgröße 9,9 χ 2,9 μπι) . Die Conidien sind kugelförmig, schwach gerauht bis stachelig und dunkelgrün. Ihr Durchmesser reicht von 2', 4''bis 4,0 μπι und der mittlere Durchmesser liegt bei 3,2 μΐη.

Auf Malzextraktagar von 35 ⁰C bildet sich in 7 Tagen eine Kolonie von 14 mm Durchmesser. In 21 Tagen erreicht der Durchmesser der Kolonie 30 mm. Anfangs besteht die Kolonie aus weißen Lufthyphen. Conidienbildung erfolgt in der ersten Woche, und die verhältnismäßig flache samtartige gekerbte Kolonie wird dunkelgelblich-grün (ISCC-NBS 137 und Maerz und Paul 24-J-6). Infolge konzentrischer Ringe gelber kugelförmiger Massen von Hüllzellen, die dunkle purpurfarbene Cleistothecien umgeben oder einkrusten, sieht die Kolonie gegürtelt aus. Der conidiogene Zustand auf Malzextraktagar ist diesem Zustand auf Czapek-Lösung-Agar mit Ausnahme der Abmessungen vergleichbar.

Conidienköpfe haben Längen von 100 bis 170 μπι und Durchschnittsgrößen von 138 χ 50 μπι. Die Länge der 6 μπι dicken Conidiophoren reicht von 100 bis 210 μπι (Durchschnitt 182 μπι) . Die Blasengrößen liegen zwischen 8 bis 12 χ 6 bis 12 μπι (Durchschnittsgröße: 12 χ 9,2 μπι) . Die Größe der Primärsterigmaten liegt zwischen 5,5 bis 8,7 χ 2,4 bis 4,0 μπι (Durchschnittsgröße 7,2 χ 6,6 μπι). Die Größe der Sekundärsterigmaten liegt zwischen 5,5 bis 10,3 χ 2,0 bis 3,6 μπι (Durchschnittsgröße 7,4 χ 3,5 μπι) . Der Conidiendurchmesser liegt zwischen 2,3 und 3,2 μπι, im Mittel aber bei 3,2 μπι.

Die ascogene Form ist auf beiden Agarsorten praktisch gleich. Zahlreiche dunkelpurpurfarbene Cleistothecien sind mit kugelförmigen bis fast kugelförmigen dickwandigen glasigen bis blassgelben Hüllzellen mit einem Durchmesser von 12,6 bis 18,2 μπι (Durchschnittsgröße 15,3 μπι) verkrustet. Die Cleistothecien sind kugelförmig bis nahezu kugelförmig und haben Wandungen bis zu drei Schichten dick, wobei die äußere Schicht aus pseudoparenchymatischen Zellen besteht. Der Durchmesser der Cleistothecien liegt zwischen 140 und 800 μπι, in den meisten Fällen 165 bis 250 μπι bei einem

Durchschnitfcsdurchmesser von 229 μΐη. Die achtsporigen glasigen Asci sind kugelförmig bis fast kugelförmig oder unregelmäßig ellipsoid. Sind sie kugelförmig, dann haben sie einen Durchmesser von 9,2 μΐη bei wenig Abweichung von dieser Größe. Ellipsoide Asci sind 9,3 χ 8,3 μτη groß. Die Ascosporen sind orangerot pigmentiert, kugelförmig in der Aufsicht: und linsenförmig von der Seite gesehen. Zwei feingefaltete vollständige parallel äquatoriale Grate sind in der Längsachse der Seitenansicht zu erkennen. In der Aufsicht ist ein einziger Grat peripher zu dem Sporenhauptkörper zu erkennen, der glatt und von zweiklappiger Konstruktion ist. Der Grat ist 0,5 μπι breit. Der Sporenkörper hat einen Durchmesser von 4,4 μΐη. Die Durchschnittsgröße der Seitenansicht beträgt 4,7 χ 3,7 μΐΐι.

Gelblichgrime leicht gerunzelte Conidien, säulenförmige Conidienköpfe, glattwandige hellbraune Conidiophoren und Blasen, beidseitig gezahnte Sterigmata und die Bildung von kugeligen dickwandigen Hüllzellen ordnen A42355 in die Aspergillus nidulans-Gruppe ein. Aufgrund dieser Eigenschaften in Verbindung mit der Tatsache, daß die Kultur · einen.. ascogenen Zustand aufweist, worin dunkelpurpurfarbene kugelförmige Cleistothecien mit Hüllzellen (siehe oben) eng verbunden oder sogar damit verkrustet sind und organgerote linsenförmige Ascosporen aufweist, die mit zwei gefalteten parallel äquatorialen Graten versehen sind, gehört A42355 zum Genus Emericella, der vollkommenen Form der A. nidulans-Gruppe.

A42355 entspricht nicht vollständig der Beschreibung der verschiedenen veröffentlichten Species oder Varietäten in der A. nidulans-Gruppe. Die A42355 am nächsten kommende Species ist A. nidulans(Eidam) Wint. aufgrund der Typkultur WB1S7 (NRRL 187). Diese Kulturen sind hinsichtlich

Farbe und' Ascosporentyp vergleichbar, unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der Gratbreite. Die Cleistothecien sind ähnlich, aber die Wandung von A42355 besteht aus einer Mehrfachschicht von Zellen anstelle einer einzigen Schicht. Beide Kulturen zeigen eine gelbgrüne, überwiegend conidiale Stufe auf Malzextraktargar, aber die ascogene Form von A42355 ist stärker ausgeprägt als die der Typkultur, bei der sie teilweise überwachsen und trüb pigmentiert ist. Bei beiden Kulturen sind die Hyphen, Gonidiophoren und Blasen glattwandig ohne Verkrustung. Die Blasen von A42355 sind jedoch spatel- bis birnenförmig, wohingegen die Blasen von A. nidulans halbkugelförmig sind. Bei der Züchtung auf Czapeklösung-Agar unterscheiden sich Kolonien von A42355 und A. nidulans hinsichtlich Wachstumsgeschwindigkeit, Exudatbildung, Anzahl und Größe der Conidienköpfe und der meisten anderen Abmessungen.

Wenn auch zwischen A42355 und A. nidulans (Eidam) Wint. Ähnlichkeiten bestehen, so bestehen doch andererseits genügend signifikante Unterschiede, weshalb A42355 als neue Varietät anzusehen ist, die die Bezeichnung A. nidulans var. roseus erhalten hat.

Züchtung von A. nidulans var. roseus

Das zur Züchtung von A. nidulans var. roseus verwendete Nährmedium kann jedes aus einer Reihe von Medien sein, wobei jedoch bestimmte Nährmedien wegen der Einfachheit ihrer Herstellung, optimaler Ausbeute und der leichten Isolierung des Produkts bevorzugt sind. So ist beispielsweise eine bevorzugte Kohlenstoffquelle für Fermentationen in großtechnischem Maßstab Baumwollsaatöl oder Glucose, doch •können auch Melasse,. Stärke, Dextrin, Lactose, Saccharose, Maltose, Glycerin, Fettsäuren und dergleichen verwendet werden. Bevorzugte Ausgangsmaterialien für Stickstoff sind enzymhydrolysiertes Casein, Sojabohnenmehl und lösliches

Fleischpepton, doch können auch Rückstände der Korndestillation, Nitrate, Mononatriumglutamat und dergleichen, verwendet werden. Anorganische Nährsalze können in das Nährmedium aufgenommen werden. Hierzu gehören die üblichen löslichen Salze, die Ionen von Natrium, Magnesium, Zink, Eisen, Calcium, Ammonium, Chlor, Carbonat, Sulfat, Nitrat, Phosphat und dergleichen liefern.

Wesentliche Spurenelemente, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus nötig sind, sollen gleichfalls in das Nährmedium aufgenommen werden. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die den Wachstumserfordernissen des Organismus genügen.

Es kann erforderlich sein, geringe Mengen (d. h. 0,2 ml/1) eines Schaumverhütungsmittels, wie Polypropylenglykol, Fermentationsmedien zuzusetzen, wenn die Schaumbildung Schwierigkeiten bereitet.

Zur Erzeugung beträchtlicher Mengen der A-42 355-Antibiotikummischung ist submerse, aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt.. Kleine Mengen der A-4 2355-Antibiotikummischung können durch Schüttelflaschenkultüren erhalten werden. Wegen der zeitlichen Verzögerung der Antibiotikumbildung, die gewöhnlich als Folge der Inokulierung großer Tanks mit der Sporenform des Organismus auftritt, ist es vorzuziehen, ein vegetatives Inokulum zu verwenden. Das vegetative Inokulum wird durch Beimpfen eines kleinen Volumens Nährmedium mit der Sporenform oder Mycelfragmenten des Organismus hergestellt, wodurch eine frische kräftig wachsende Kultur des Organismus erhalten wird. Das vegetative Inokulum wird dann in einen größeren Tank überführt. Das zur Züchtung des vegetativen InokulmriS verwendete Medium kann das gleiche sein wie das für die Fermentationen

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in größerem Maßstab verwendete, aber es können auch andere Medien verwendet werden.

A. nidulans var. roseus NRRL 11440 kann bei Temperaturen zwischen 20 und 43 ⁰C gezüchtet werden; der Organismus wächst am besten bei Temperaturen von 30 bis 37 ⁰C. Optimale Erzeugung der A-30912-Antibiotikummischung erfolgt bei Temperaturen von etwa 30 ⁰C.

Wie bei submersen aeroben Züchtungsverfahren üblich, wird durch das Nährmedium sterile Luft geblasen. Zur Erzielung einer guten Antibiotikumbildung soll die Belüftung und Bewegung zur Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von wenigstens 40 % Luftsättigung bei Atmosphärendruck ausreichen. Rühren oder Schütteln dient auch zum Aufbrechen des dicken und kräftigen Kulturwachstums während der Fermentation.

Die Erzeugung der A-42355-Antibiotikummischung kann während der Fermentation durch Untersuchung von Proben des fermentierten Nährmediums oder alkoholischer Extrakte der Biomasse oder der gesamten Maische auf antibiotische Aktivität gegenüber einem Organismus verfolgt werden, von dem bekannt ist, daß er gegenüber den A-30912-Antibiotika empfindlich ist. Ein für die Prüfung auf das Vorhandensein von A-30912-Antibiotika geeigneter PrüfOrganismus ist Candida albicans. Die Bioprobe erfolgt zweckmäßigerweise mit Hilfe der Papierscheiben- oder Agarquellprobe auf besamten Agarplatten.

Antibiotische Wirksamkeit kann im allgemeinen am zweiten Fermentationstag nachgewiesen werden. Maximale Bildung an antibiotischer Aktivität erfolgt gewöhnlich zwischen dem sechsten und achten Tag.

Die einzelnen A-30912-Faktoren können von der A-42355-Mischung abgetrennt und mit Hilfe der TLC identifiziert werden (vergleiche Figur 2). Kieselgel ist ein bevorzugtes Adsorbens.

Die R_f-Werte der A-30912-Faktoren A bis G, unter Verwendung von Kieselgel (Merck, Darmstadt) TLC, eines Lösungsmittelsystems aus 7 Teilen Benzol und 3 Teilen Methanol und Candida albicans zur Bioautographie sind in Tabelle I zusammengestellt.

T ab e 1 1 e I

A-30912-Faktor	R_f-Wert
A	0,35
B	0,45
C	0,54
D	0,59
E	0,27
F	0,18
G	0,13

Die R^-Werte der A-30912-Faktoren A, B, C, D und H in verschiedenen Lösungsmittelsystemen unter Verwendung von Kieselgel-TLC (Merck-Darmstadt, silica gel # 60 plates, 20 χ 20 cm) und Candida albicans zur Bioautographie sind in Tabelle II angegeben.

Tabelle II

A-30912-Faktor

Faktor A Faktor B Faktor C Faktor D ' Faktor H

Lösungsmittelsysterne

a: Ethylacetat:Methanol (3:2)

b: Ethylacetat-.Methanol (7:3)

c: Acetonitril:Wasser (95:5) . .

d: Ethylacetat:Ethanol:Essigsäure (40:60:0,25)

R_f-Werte	- Lösungsmittelsysteme	C	d
a	b	0,28	0,43
0,28	0,14	0,42	0,47
0,39	0,21	0,51	0,58
0,46	0,31	0,57	0,61
0,50	0,38	0,36	0,53
0,42	0,27

Gewinnung der A-30912-Antibiotika

Die A-30912-Antibiotika können nach auf dem Fermentationsgebiet bekannten Methoden aus dem Fermentationsmedium gewonnen werden. Sie sind im allgemeinen in dem Mycelteil des Fermentationsmedium enthalten. Die beste Gewinnung wird durch Extraktion der gesamten Maische erzielt. Vorzugsweise wird ein gleiches Volumen eines Lösungsmittels, wie Methanol, zu der Gesamtmaische gegeben und der pH-Wert der abfiltrierten Maische auf etwa 4 bis 6 erniedrigt, ehe die Extraktion durchgeführt wird. Ein anderes Verfahren zur Isolierung besteht darin, daß das Mycel abgetrennt und mit Methanol extrahiert wird und die Antibotika aus dem Methanolextrakt extrahiert werden. Chloroform ist ein besonders vorteilhaftes Lösungsmittel für die Extraktion der A-3O912-Antibiotika als A-42355-Mischung, doch können auch andere Lösungsmittel verwendet werden.

Aus der abgetrennten A-42355-Mischung können die einzelnen A-30912-Antibiotika durch Chromatographieren unter Verwendung verschiedener Adsorbentien isoliert werden. Zu geeigneten Adsorbentien gehören Kieselgel und Umkehrphasenharze, wie Kieselgel/Cgf Kieselgel/C.g, Quantum LP-1 oder LiChroprep RP-8 und RP-18; Florisil; Sephadex G-25, LH-20 und G-15; Aluminiumoxid; Diaion HP-20; Amberlite XAD-4 und X-384. Diaion ist von Mitsubishi Chemical Industries, Tokyo; die Amberlite-Harze sind von Rohm und Haas Co., Philadelphia, Pa.; die Sephadex-Harze von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden; Florisil von Floridin Co., Tallahassee, Fla., und Kieselgel/Co und Kieselgel/C.,, von E. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland, erhältlich. Die Herstellung von Kieselgel/C.o mit hoher Belastungsfähigkeit aus LP-1-Kieselgel (Whatman) ist in Beispiel 8 beschrieben.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Endreinigung der A-30912-Antibiotika ist die Umkehrphase-Hochleistungs-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLPLC) unter Verwendung von Kieselgel/C₁₈ als Adsorbens. Bei diesem Verfahren wird eine A-42355-Mischung (beispielsweise durch Extraktion der filtrierten Maische mit Chloroform erhalten) in einem Lösungsmittel gelöst und auf eine mit dem gleichen Lösungemittel äquilibrierte Säule aufgebracht. Die Säule wird dann mit dem Lösungsmittel eluiert. Methanol:Wasser!Acetonitril (7:2:1) ist ein bevorzugtes Lösungsmittelsystem. Die aufgefangenen Fraktionen werden durch Bioautographie mit Candida albicans und/oder mit Hilfe von UV-Licht (auf der Grundlage relativer Rückhaltzeiten) geprüft. Die den gewünschten A-30912-Faktor enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. In manchen Fällen ist es nötig, eine weitere chromatographische Trennung durchzuführen, um den A-30912-Faktor in gereinigter Form zu erhalten.

A-30912-Faktoren A, B, D und H können durch Hochleistungs-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie unter den folgenden Bedingungen getrennt werden:

Säule: Glas, 0,8 χ 15,0 cm

(R) Füllung: Nucleosil^v ' 10-C.g (Machery-Nagel

and Company); nach der Aufschlämmungsfüllmethode von Beispiel 8 gefüllt

Lösungsmittel: Methanol:Wasser:Acetonitril (7:2:1) Proben: 8 μΐ

Probengewicht: 8 pg

Säulentemperatur: Zimmertemperatur

Fließgeschwindigkeit: 1,8 ml/Min. Druck: 14 bar (200 psi)

Nachweismittel: UV von 222 nm (ISCO Model 1800

Variable Wavelength UV-Visible Absorbance Monitor)

Pumpe: LDC Duplex Minipump

Injektion: Schleifeninjektion

Die angenäherten Rückhaltzeiten für A-30912-Faktoren A, B, D und H unter diesen Bedingungen sind in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

A-30912-Faktor	Rückhaltzeit (Sekunden)
A.	792
B	870
H	990
D	1 140

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.

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Beispiel 1

Herstellung ver Ä-4 2355-Antibiotikummischung A. Schüttelkolbenfermentation

Eine Kultur von Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 wird auf einer 18 χ 150 ram Agarschräge aus einem Medium der folgenden Zusammensetzung hergestellt.

Bestandteil Menge

Glucose	5 g
Hefeextrakt	2 g
CaCO₃	3 g
Pflanzensaft*	200 ml
Agar**	2Og
entionisiertes Wasser	auf 1 Liter

(Anfangs-pH 6,1)

*V-8 Saft, Campell Soup Co., Camden, N. J. **Meer Corp.

Die mit Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 beimpfte Schräge wird etwa 7 Tage bei 25 ⁰C inkubiert. Die reife Kultur wird mit Wasser bedeckt und mit einer sterilen Schlaufe zum Ablösen der Sporen gekratzt. Die so erhaltene Suspension wird mit 10 ml sterilem entionisierten Wasser aufgenommen.

1 ml der so erhaltenen Suspension wird zum Inokulieren von 55 ml vegetativen Mediums in einem 250 ml Kolben verwendet. Das vegetative Medium hat folgende Zusammensetzung:

25	g
36	g
6	g
10	g
2	g
10	g
1100	ml

Bestandteil ' Menge

Saccharose Portwein-Melasse Maisquellwasser Malzextrakt K₂HPO₄

Enzymatisches Hydrolysat von Casein*

Leitungswasser

(Anfangs-pH 6,5-6,7)

*N-Z-Case, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N. J,

Das inokulierte vegetative Medium wird bei 25 ⁰C 48 Stunden auf einer Rundschüttelvorrichtung bei 250 U/Min, inkubiert. Nach 24 Stunden wird das Medium 1 Minute bei geringer Geschwindigkeit in einer Mischvorrichtung (Waring) homogenisiert und dann die übrigen 24 Stunden inkubiert. Stattdessen kann das inokulierte vegetative Medium aber auch 48 Stunden inkubiert und dann 15 Sekunden bei geringer Geschwindigkeit homogenisiert werden.

Dieses inkubierte vegetative Medium kann zum Beimpfen von Schüttelkolbenfermentationskulturmedium oder zum Inokulieren eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden. Stattdessen kann es für eine spätere Verwendung gelagert werden, wobei es in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff gehalten wird. Für eine derartige Lagerung wird die Kultur in einer Mehrzahl von kleinen Phiolen folgendermaßen hergestellt.

Die vegetativen Kulturen werden mit gleichen Volumina einer Suspendierlösung der folgenden Zusammensetzung vermischt:

Bestandteil Menge

Glycerin 20 ml

Lactose 10 g

entionisiertes Wasser ' auf 100 ml

Die Suspensionen werden auf kleine sterile 4 ml Schraubverschlußrohre verteilt. Diese Rohre werden in der Gasphase von flüssigem Stickstoff aufgehoben.

Eine so hergestellte gelagerte Suspension kann zum Inokulieren von Agarschrägen oder flüssigen Medien verwendet werden. Die Schrägen werden bei 25 ⁰C im Licht 7 Tage inkubiert.

B. Tankfermentation

Zur Herstellung eines größeren Volumens an Inokulum werden 10 ml der inkubierten vegetativen Kultur der ersten Stufe zu 400 ml eines vegetativen Nährmediums der zweiten Stufe mit der gleichen Zusammensetzung verwendet. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 1 Erlenmeyer-Weithalskolben 24 Stunden bei 25 ⁰C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert, die mit 250 U/Min, durch einen Bogen von 5 cm rotiert.

800 ml des wie oben beschrieben hergestellten inkubierten Mediums der zweiten Stufe werden zum Inokulieren von 100 sterilen Produktionsmediums mit einer der folgenden Zusammensetzungen verwendet:

Medium I

Bestandteil Menge

ZnSO₄.7H₂O 0,00455 g/l

lösliches Fleischpepton* 30,5 g/l

Sojabohnenmehl 15,5- g/l

Tapioca-Dextrin** 2,0 g/l

Portwein-Melasse 10,5 g/l

enzymatisches Hydrolysat

von Casein*** 8,5 g/l

Na₂HPO₄ 4,5 g/l

MgSO₄.7H₂O 5,5 g/l

FeSO₄.7H₂O 0,1 g/l

Baumwollsaatöl 40,0 ml

(Antifoam)**** 1,0 ml

Leitungswasser 1000,0 ml

(Anfangs-pH 6,8-7,0)

*0.M. Peptone, Amber Laboratories, Juneau, Wise. **Stadex 1.1, A.E. Staley Co., Decatur, 111.

***N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J. .

****P2000, Dow Corning, Midland, Mich.

Medium II

Bestandteil Menge

Glucose 2,5 %

Stärke 1,0%

lösliches Fleischpepton* 1,0 %

Portwein-Melass 1,0 %

CaCO₃ 0,2 %

MgSO₄.7H₂O 0,05 %

enzymatisches Hydrolysat von

Casein** 0,4 %

(Antifoam)*** 0,02 % Leitungswasser zum Auffüllen

*0.M. Peptone **N-Z-Amine A ***Antifoam "A", Dow Corning

Das inokulierte Produktionsmedium überläßt man in einem Fermentationstank von 165 1 Fassungsvermögen bei einer Temperatur von 25 ⁰C 7 Tage der Fermentation. Dabei wird mit steriler Luft unter Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von etwa 50 % der Luftsättigung belüftet.

C. Vegetatives Medium der dritten Stufe

Immer dann, wenn die Fermentation in größeren Tanks als für 1 Fermentationen durchgeführt wird, ist zu empfehlen, daß zum Beimpfen der größeren Tanks eine vegetative Kultur der dritten Stufe verwendet wird. Ein bevorzugtes vegetatives Medium der dritten Stufe hat folgende Zusammensetzung':

Bestandteil Menge

Saccharose Portwein-Melasse Maisquellwasser

enzymatisches Hydrolysat -von Casein*

Malzextrakt K₂HPO₄

Leitungswässer

25	g
25	g
6	g
10	g
10	g
2	g
1000	ml

(Anfangs-pH 6,1) *N-Z-Case

Beispiel 2

Abtrennung der A-42 355-Anibiötikummischung

Die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Produktionsmedium II erhaltene Gesamtfermentationsmaische (4127 1) wird 1 Stunde lang gründlich .mit 4280 1 Methanol verrührt und dann unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Super-cel, eine Diatomeenerde, Johns Manville Products Corp.) filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wird unter Verwendung von 5n HCl auf 4,0 eingestellt. Das angesäuerte Filtrat wird zweimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von 20 1 eingeengt. Dieses Konzentrat wird zu 200 1 Diethylether gegeben, wodurch die A-42355-Mischung ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, und man erhält 2775 g der A-4 2 355-Mischung als grau-weißes Pulver.

Beispiel 3 Isolierung von A-30912-Faktor A

1 g der wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellten A-42355-Antibiotikummischung wird in 7 ml Methanol:Wasser-.Acetonitril (7:2:1) gelöst. Diese Lösung wird nach Filtrieren auf eine 35 cm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 3,7 cm /Michel-Miller High Performance Low Pressure (HPLPLC) Chromatography Column, Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ 08360/, die mit LP-1/C..g Kieselgel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 μπι) gefüllt ist, aufgegeben, das wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt worden ist, wobei eine Schlinge mit einem Ventilsystem verwendet wird. Die Säule war in Methanol: ~ Wasser Acetonitril (7:2:1) durch die in Beispiel 8 beschriebene Aufschlämmfüllmethode gefüllt worden. Zur Förderung des Lösungsmittels durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. bei 7 bar wird eine FMI-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenanordnung verwendet (Fließgrenze 19,5 ml/Min.),und jede Minute wird eine Fraktion aufgefangen. Die Elution des Antibiotkums wird unter Verwendung eines UV-Geräts (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Type 6) bei 280 nm verfolgt.

Die Fraktionen 112 bis 140 werden vereinigt und zu 20 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit η HCl auf 4,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird zweimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte werden im Vakuum bis zu einem öl eingeengt. Dieses öl wird in tert.-Butanol gelöst, und die Lösung wird gefriergetrocknet. Dadurch werden 524 mg A-4 2355-Faktor A (A-30912 Faktor A; A-22082) erhalten.

Beispiel 4 Isolierung von Ä-30912-Faktor B

A-42355-Mischung wird wie in Beispiel 2 beschrieben abgetrennt mit der Ausnahme, daß die konzentrierten Chloroformextrakte (28 5 1) an einer Kieselgelsäule (150 1 Kieselgel, Grace Sorte 62) bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 l/Min, chromatographiert werden. Die Säule wird mit 200 1 Chloroform gewaschen, mit 500 ml Acetonitril eluiert und dann kontinuierlich mit einer Acetonitril-Wasser-Mischung (98:2) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l/Minute eluiert. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von 200 1 aufgefangen und jeweils für sich allein auf ihre biologische Wirksamkeit analysiert. Die Bioanalyse wird durch Papierscheibenprobe auf Agarplatten durchgeführt, die mit Candida albicans besamt sind. Die Fraktionen 77 bis 103 (1365 1) werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. 4,5 1 eingeengte Lösung enthalten einen Niederschlag, der abfiltriert wird, wodurch 119 g an Faktor B angereicherte A-42355-Mischung erhalten wird. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird erneut in Methanol gelöst. Die Methanollösung wird zu 10 Volumina Diethylether gegeben, wodurch der Faktor B enthaltende Antibiotikumkomplex ausfällt. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wodurch weitere 24 g an Faktor B angereicherte A-4 2355-Mischung als graues Pulver erhalten werden.

1,0 g der so erhaltenen an Faktor B angereicherten A-42355-Mischung wird in 8 ml MethanolrWas.ser!Acetonitril (7:2:1) gelöst. Diese Lösung wird nach Filtrieren auf eine Kieselgelsäule (3,7 cm I.-D. χ 33 cm Michel-Miller Column) mit Hilfe eines Ventilsystems durch eine Schlaufe aufgegeben. Die Säule war wie in Beispiel 3 beschrieben mit LP-1/C,_O

Io

_ 3 "J _

Kieselgel-Umkehrphasenharζ (10 bis 20 Mikron) in Methanol: Wasser!Acetonitril (7:2:1) gefüllt worden. Das Lösungsmittel wird in einer Geschwindigkeit von 10 ml/Min, bei etwa 7 bar, wie in Beispiel 3 beschrieben, durch die Säule bewegt. Jede Minute wird eine Fraktion aufgefangen. Die Elution des Antibiotikums wird bei 280 nm, wie in Beispiel 3 beschrieben, verfolgt. Fraktionen 102 bis 110 werden vereinigt und im Vakuum eingeengt, wodurch ein öl erhalten wird. Das öl wird in einem kleinen Volumen tert-Butanol gelöst und gefriergetrocknet, wodurch 22 mg A-30912-Faktor B erhalten werden.

Beispiel 5 Isolierung von A-30912-Faktor D

Die nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise erhaltenen konzentrierten Chloroformextrakte von zwei Fermentationsansätzen (3800 1 und 4007 1) werden vereinigt und wie in Beispiel 4 beschrieben an einer Kieselgelsäule chromatographiert. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 200 1 aufgefangen und, wie in Beispiel 4 beschrieben, auf ihre biologische Wirksamkeit geprüft. Die Fraktionen 47 bis 63 (850 1) werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Die 0,7 1 ausmachende eingeengte Lösung wird zu 10 Volumina Diethylether gegeben, wodurch die an Faktor D angereicherte A-42355-Mischung ausfällt. Der so erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wodurch 32 g an Faktor D angereicherte A-42355-Mischung als graues Pulver erhalten werden.

1,0 g der so erhaltenen an Faktor D angereicherten A-42355-Mischung wird in 5 ml Methanol:Wasser!Acetonitril (7:2:1) gelöst. Diese Lösung wird filtriert und auf eine Kieselgelsäule (3,7 cm I. D. χ 30 cm Michel Miller Column) mit Hilfe eines Ventilsystems durch eine Schlaufe aufgegeben. Die Säule war mit LP-l/C-g Kieselgel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Mikron) gefüllt. Die Füllung war wie in Beispiel 3 beschrieben in Methanol:Wasser:Acetonitril (7:2:1) erfolgt. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/Min. bei etwa 3 bar, wie in Beispiel 3 beschrieben, durch die Säule bewegt. Alle 2 Minuten wird eine Fraktion aufgefangen. Die Elution des Antibiotikums wird wie in Beispiel 3 beschrieben bei 280 nm verfolgt. Die Fraktionen 96 bis 108 werden vereinigt und im Vakuum zu einem öl eingeengt. Dieses öl wird in einem kleinen Volumen tert.-Butanol gelöst und gefriergetrocknet, wodurch 89 mg A-30912-Faktor D erhalten werden.

Beispiel6 Isolierung von A-30912-Faktor H

5,0 g der wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellten A-42355-Antibiotikummischung werden in 35 ml Methanol:Wasser Acetonitril (7:2:1) gelöst, und die erhaltene Lösung wird nach Filtrieren auf eine 42 cm messende Glassäule mit einem Innendurchmesser von 3,7 cm (Michel-Miller Column) mit Hilfe eines Ventilsystems durch eine Schlaufe aufgegeben. Die Säule war mit LP-1/C..^ Kieselgel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Mikron) in Methanol:Wasser Acetonitril (7:2:1), wie in Beispiel 3 beschrieben, gefüllt worden. Das Lösungsmittel wird durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 13 ml/Min, bei 8,4 bar, wie in Beispiel 3 beschrieben, ge-

führt, wobei alle 2 Minuten eine Fraktion aufgefangen wird. Die Elution des Antibiotikums wird wie in Beispiel 3 beschrieben bei 280 nm verfolgt. Die Fraktionen 112 bis 132 v/erden mit den Fraktionen 106 bis 117 einer zweiten gleichartigen Reinigung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden im Vakuum bis zu einem öl eingeengt. Das öl wird in einem kleinen Volumen tert-Butanol gelöst und gefriergetrocknet, wodurch 173 mg roher A-30912-Faktor H erhalten werden.

150 mg des rohen A-30912-Faktor H werden in 8 ml Methanol: Wasser!Acetonitril (7:2:1) gelöst, die gebildete Lösung wird filtriert und auf eine 32 cm lange Glassäule mit einem Innendurchmesser von 2,0 cm, wie oben beschrieben, aufgegeben. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/Min, bei 5,6 bar, wie in Beispiel 3 beschrieben, durch die Säule geführt, wobei alle 3 Minuten eine Fraktion aufgefangen wird. Die Elution des Antibiotikums wird wie in Beispiel 3 beschrieben, bei 280.nm verfolgt. Die Fraktionen 17 und 18 werden vereinigt und im Vakuum bis zu einem öl eingeengt. Das öl wird in einem kleinen Volumen tert.-Butanol gelöst und gefriergetrocknet, wodurch 29 mg A-30912-Faktor H erhalten werden.

Beispiel 7

Herstellung von Kieselgel/C. „ Umkehrphasenharz

Stufe 1: Hydrolyse

1000 g LP-1 Kieselgel (Quantum Corp., nun Whatman) werden· zu einer Mischung von 1650 ml konzentrierter Schwefelsäure mit 1650 ml konzentrierter Salpetersäure in einem 5 1 Rundkolben gegeben und bis zur Ausbildung einer guten

Suspension geschüttelt. Die Mischung wird über Nacht (16 Stunden) auf einem Dampfbad erwärmt, wobei der Kolben

mit einem Wasserkühler versehen ist.

Die Mischung wird in einem Eisbad gekühlt und sorgfältig unter Verwendung eines Siriterglastrichters filtriert. Das Kieselgel wird mit entionisiertem Wasser bis zu einem neutralen pH-Wert gewaschen. Dann wird es mit 4 1 Aceton gewaschen und 2 Tage im Vakuum bei 100 ⁰C getrocknet.

Stufe 2; Erste Silylierung

Das in Stufe 1 erhaltene trockene Kieselgel wird in einem Rundkolben in 3,5 1 Toluol suspendiert. Der Kolben wird 2 Stunden auf einem Dampfbad erwärmt, wodurch etwas zurückgebliebenes Wasser azeotrop entfernt wird. 321 ml Octadecyltrichlorsilan (Äldrich Chemical Company) werden zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird über Nacht (16 Stunden) unter mäßigem mechanischen Rühren bei 60 ⁰C zum Sieden unter Rückfluß erwärmt. Dabei wird dafür gesorgt, daß der Rührer der Kolbenwandung nicht nahe kommt, um ein Vermählen der Kieselgelteilchen zu vermeiden.

Nach Abkühlenlassen der Mischung wird das silanisierte Kieselgel abfiltriert, mit 3 1 Toluol und 3 1 Aceton gewaschen und über Nacht (16 bis 20 Stunden) an der Luft getrocknet. Das getrocknete Kieselgel wird in 3,5 1 Acetonitril: Wasser (1:1) in einem 5 1 Kolben suspendiert, bei Zimmertemperatur 2 Stunden sorgfältig gerührt, mit 3 1 Aceton gewaschen und über Nacht an der Luft getrocknet.

Stufe 3: Zweite Silylierung ·

Die in der ersten Silylierung angewandte Arbeitsweise wird unter Verwendung von 200 ml Octadecyltrichlorsilan wiederholt. Die Suspension wird 2 Stunden bei 60 ⁰C zum Sieden unter Rückfluß erwärmt, wobei sorgfältig gerührt wird. Das schließlich gebildete Produkt wird abfiltriert, mit 3 1 Toluol und 6 1 Methanol gewaschen und im Vakuum bei 50 ⁰C über Nacht (16 bis 20 Stunden) getrocknet.

Beispiel 8

Aufschlämmfüllverfahren für Michel-Miller-Säulen Allgemeine Angaben:

A. Nach dieser Arbeitsweise können Säulen für analytische oder präparative Zwecke gefüllt werden.

B. Kieselgel- und Kieselgel-Umkehrphasenfüllungen (z. B. Quantum LP-1, Teilchengröße 10 bis 20 Mikron; LiChroprep RP-8 und RP-18, Teilchengröße 25 bis 40 Mikron) sind zu empfehlen. Andere Kieselgele (z. B. Shandons ODS Hypersil, Teilchengröße 5 Mikron) sowie andere Arten von Harzen sind jedoch gleichfalls mit Erfolg verwendet worden.

C. Im allgmeinen sind Drucke von weniger als 14 bar und Fließgeschwindigkeiten zwischen 5 und 40 ml/Min. für diese Aufschämmfülltechnik erforderlich. Im einzelnen richten sich die Werte nach Säulenvolumen und Umfang. Zu beachten ist folgendes: Der Druck beim Füllen soll um 2 bis 3,5 bar höher sein als der bei der Trennung angewandte Druck. Dadurch wird sichergestellt, daß während der Trennungen keine

weitere Kompression des Adsorbens erfolgt. Auf diese Weise können mit Umkehrphasenkieselgel gefüllte Säulen ohne Wirksamkeitseinbuße mehrere Jahre betrieben werden.

D. Plötzliche Erniedrigung des Drucks kann die Bildung von Sprüngen oder Kanälen in dem Füllungsmaterial verursachen, die das wirksame Arbeiten der Säule stark beeinträchtigen. Deshalb ist es von Bedeutung für ein langsames Abfallen des Drucks auf 0 zu sorgen, wenn die Pumpe abgestellt worden ist.

E. Ungefähres Volumen der Säulen (Ace Glass Cat. No., ungepackt): 5795-04, 12ml; 5795-10, 110ml; 5795-16, 300 ml; 5795-24, 635 ml und 5796-34, 34 ml.

F. Die zum Füllen einer Glassäule erforderliche Zeit liegt je nach Säulenumfang und Geschicklichkeit zwischen Minuten und mehreren Stunden.

Beispiel:

1. Die Glassäule wird über eine Kupplung mit einer Vorratssäule verbunden (das Volumen der Vorratssäule soll doppelt so groß sein wie das der Säule). Beide Säulen werden mit der Vorratssäule oben in senkrechte Stellung gebracht.

2. Das Füllmaterial wird abgewogen (100 g für eine Säule von 200 ml).

3. Das Füllmaterial wird mit 5 Volumina Lösungsmittel, und zwar einer Mischung aus 70 bis 80 % Methanol und 20 bis 30 % Wasser, Versetzt.

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4. Dann wird gut geschüttelt bis alle Teilchen befeuchtet sind, und über Nacht oder langer stehengelassen, damit eine vollständige Tränkung der Teilchen durch Lösungsmittel gewährleistet wird. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen.

5. Das Harz wird mit zur Füllung der Vorratssäule ausreichendem Lösungsmittel aufgeschlämmt und dann schnell in diese eingegossen. Dabei ist zu beachten: Die Säule muß mit dem gleichen Lösungsmittel vorgefüllt und die Vorratssäule soll vor dem Eingießen der Aufschlämmung mit Lösungsmittel teilweise gefüllt sein. Die Verwendung grösserer Aufschlämmungsvolumina kann gleichfalls zu guten Ergebnissen führen, doch erfordert dies (a) einen größeren Vorratsraum oder (b) mehrere Vorratsraumfüllungen während des Einfüllvorgangs.

6. Die Vorratssäule wird mit dem Teflonstopfen unterhalb der Säule geschlossen (vergleiche Figur 1 von US-PS 4 131 547, Stopfen Nr. 3), dann wird mit der Pumpe verbunden und sofort mit dem Pumpen von Lösungsmittel durch das System bei einer Höchstfließgeschwindigkeit von 20 ml/Min, wenn Ace Cat. No. 13265-25 Pumpe oder ein vergleichbares Lösungsmittelabgabesystem verwendet wird, begonnen.

7. Diese Arbeitsweise wird fortgesetzt, bis die Säule vollständig mit Adsorbens gefüllt ist. Der Druck soll die Höchsttoleranz der Säule während dieses Vorgangs nicht übersteigen (14 bar für große Säulen und 21 bar für Analysensäulen) . In den meisten Fällen genügen Drucke von weniger als 14 bar.

8. Wenn:der Druck Höchstwerte übersteigt, wird die Fließgeschwindigkeit vermindert, wodurch der Druck fällt.

9. Nach Füllung der Säule mit Adsorbens wird die Pumpe abgestellt, der Druck auf null abfallen gelassen und die Verbindung zur Vorratssäule gelöst. Die Vorratssäule wird durch eine Vorsäule ersetzt, die mit Lösungsmittel und einer kleinen Menge Adsorbens gefüllt wird, wonach bis zur vollständigen Füllung der Säule mit Höchstdruck gepumpt wird. Bezüglich weiterer Hinweise siehe Beispiel 8.

Zu beachten:

Nach dem Abstellen der Pumpe muß dafür gesorgt werden, daß der Druck immer langsam abfällt, dadurch wird die Bildung von Sprüngen oder Kanälen in dem Füllmaterial vermieden.

10. Nach Aufheben des Drucks wird die Verbindung zur Vorsäule sorgfältig gelöst. Einige mm (2 bis 4 mm) der Füllung werden mit einem kleinen Spatel vom oberen Ende der Säule entfernt. Auf das obere Ende der Säule werden 1 oder 2 Filter gelegt, die gelinde auf das Füllmaterial aufgedrückt werden, worauf der Teflonstopfen bis zu festem Verschluß auf die Säule aufgebracht wird. Die Säule wird mit der Pumpe verbunden, worauf Druck angelegt wird (gewöhnlich weniger als 14 bar) und durch die Glaswandung am oberen Ende der Säule beobachtet wird, ob sich das Harz noch weiter zusammenpackt. Sollte sich das Füllmaterial noch weiter absetzen (was bei größeren Säulen der Fall sein kann), erscheint ein kleiner Leerraum oder Kanalbildung, und die Stufe 9 sollte wiederholt werden.

Claims

Erfindungsansprüche

1. . Verfahren zur Herstellung der A-42355-Antibiotikummischung, die A-30912 Faktoren A, B, D und H enthält, sowie von Antibiotikum A-30912 Faktor A₇ Antibiotikum A-30912 Faktor B, Antibiotikum A-30912 Faktor D und Antibiotikum A-30912 Faktor H, dadurch gekennzeichnet , daß

(a) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440

in einem assimilierbare Ausgangsstoffe für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Ausbildung einer beträchtlichen antibiotischen Aktivität gezüchtet und

(b) die A-42355-Antibiotikummischung gegebenenfalls von dem Nährmedium abgetrennt wird und

(c) die Antibiotikum A-30912-Faktoren A, B, D und H gegebenenfalls aus der A-42355-Antibiotikummischung isoliert werden.
2. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung der A-42355-Antibiotikummischung, die die A-30912-Faktoren A, B, D und H enthält, dadurch gekennzeichnet , daß

(a) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440

in einem assimilierbare Ausgangsstoffe für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Ausbildung einer beträchtlichen antibiotischen Aktivität gezüchtet und

(b) die A-42355-Antibiotikummischung von dem Nährmedium abgetrennt wird.
3. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von A-30912-

Faktor A₇ dadurch gekennzeichnet, daß

(a) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440

" in einem assimilierbare Ausgangsstoffe für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Ausbildung einer beträchtlichen antibiotischen Aktivität gezüchtet und

(b) die A-42355-Antibiotikummischung von dem Nährmedium abgetrennt und

(c) A-30912-Faktor A aus der abgetrennten A-42355-Antibiotikummischung isoliert wird.
4. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von A-30912-

Faktor B, dadurch gekennzeichnet, daß

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OO 1 A A A

(a) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440

in einem assimilierbare Ausgangsstoffe für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Ausbildung einer beträchtlichen antibiotischen Aktivität gezüchtet und

(b) die A-42355-Antibiotikummischung gegebenenfalls von dem Nährmedium abgetrennt wird und

(c) A-30912-Faktor B aus der abgetrennten A-42355-Antibiotikummischung isoliert wird.
5. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von A-30912-

Faktor D, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440

in einem assimilierbare Ausgangsstoffe für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Ausbildung einer beträchtlichen antibiotischen Aktivität gezüchtet und

(b) die A-42355-Antibiotikummischung gegebenenfalls von dem Nährmedium abgetrennt wird und

(c) A-30912-Faktor D aus der abgetrennten A-42355-Antibiotikummischung isoliert wird.
6. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von A-30912-

Faktor H, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440

in einem assimilierbare Ausgangsstoffe für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Ausbildung einer beträchtlichen antibiotischen Aktivität gezüchtet und

(b) die A-42355-Antibiotikummischung gegebenenfalls von dem Nährmedium abgetrennt wird und

(c) A-30912-Faktor H aus der abgetrennten A-42355-Antibiotikummischung isoliert wird.

Zeichnungen