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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung der neuen Metaboliten SL 7810/F-II und SL 7810/F-III, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm der Gattung Aspergillus rugulosus Thom & Raper auf oder in einem Nährmedium züchtet und hierauf die Metaboliten aus der Fermentationsbrühe isoliert und reinigt.
2. Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass man als neuen Stamm der Gattung Aspergillus rugulosus Thom & Raper den Stamm NRRL 8039 verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft die neuen Metaboliten, die nachstehend als SL 7810/F-II und SL 7810/F-III bezeichnet werden, sowie Verfahren zu deren Herstellung.
Es ist bekannt, dass die Behandlung von Pilzerkrankungen grosse Probleme bietet, stehen doch nur sehr wenige brauchbare antifungische Substanzen zur Verfügung, die aber alle nicht voll befriedigen. Beispielsweise erfasst das aus einem Mikroorganismus gewonnene Amphotericin B ein breites Erregerspektrum von Mykosen, es ist jedoch mit toxischen Nebenwirkungen belastet. Im Laufe der Suche nach neuen antifungischen Substanzen aus Mikroorganismen konnten nun aus Kulturen eines Aspergillus-Stammes ein Gemisch von Metaboliten isoliert werden. Zwei davon, die Antibiotika SL 7810/F-II und SL 7810/F-III zeichnen sich durch eine hohe Aktivität gegen Hefen und Pilze aus.
Erfindungsgemäss gelangt man zu den neuen Metaboliten SL 7810/F-II und SL 7810/F-III, indem man einen Stamm der Gattung Aspergillus rugulosus Thom & Raper auf oder in einem Nährmedium züchtet und die Metaboliten aus der Fermentationsbrühe auf an sich bekannte Weise durch Extraktion und/oder Adsorption isoliert und hierauf reinigt.
Die neuen Antibiotika haben folgende Charakteristika:
SL 7810/F-II
Farbloses amorphes Pulver vom Smp. 158-1600 (Zers.);
20 [a] 20 = ¯47,9 (c = 0,81 in Methanol).
Analyse: Gef. C 58,5, N 8,0, N 9,3, 0 23,8 /0.
Mol.-Gew. (osmometrisch in Methanol bestimmt): 1018.
UV-Spektrum in Methanol: ma: 193 nm, log e' = 1,95 (vgl. Fig. 1) 278 nm, log e' = 0,18
IR-Spektrum in Nujol (vgl. Fig. 2) tH-NMR-Spektrum in DMSO (100 MHz, Tetramethyl silan als interner Standard) (vgl. Fig. 3).
Farbreaktionen: Ninhydrin negativ
Cl2-Benzidin blau (Löslichkeit, Stabilität, Dünnschichtchromatogramm und
MIC-Werte siehe unten).
SL 7810/F-III
Farbloses amorphes Pulver vom Smp. 164-1680 (Zers.); val D20 = 53,00 (c = 1,00 in Methanol).
Analyse: Gef. C 61,1, H 8,0, N 9,0, 0 22,0 /0
UV-Spektrum in Methanol:;l,, 193 nm, log e' = 1,98 (vgl. Fig. 4) 278 nm, log e' = 0,24
IR-Spektrum in Nujol (vgl. Fig. 5) tH-NMR-Spektrum in DMSO (100 MHz, Tetramethyl silan als interner Standard) (vgl. Fig. 6).
Farbreaktionen: Ninhydrin negativ Clp-Benzidin blau (Löslichkeit, Stabilität, Dünnschichtchromatogramm und
MIC-Werte siehe unten).
Löslichkeit
Die Antibiotika SL 7810/F-II und SL 7810/F-III sind bei Raumtemperatur leicht löslich in Methanol und Äthanol, schwer löslich in Chloroform, Äther, Petroläther, Hexan und praktisch unlöslich in Wasser.
Stabilität Die neuen Antibiotika SL 7810/F-II und SL 7810/F-III sind in Gegenwart von Licht und besonders an der Luft wenig stabil und zersetzen sich. Die Zersetzung wird auch beim Erwärmen auf über 500 bemerkbar.
Charakteristisch für beide Antibiotika ist die Instabilität unter basischen Bedingungen. Bei einem pH über 8 tritt Umwandlung zu Zersetzungsprodukten auf, die biologisch nur noch schwach bzw. nicht mehr aktiv sind.
Dünnschichtprogramm
Die Analyse erfolgt auf Kieselgel Merck 60-Platten (0,25 mm Schichtdicke). Mit den nachstehenden Fliessmitteln können folgende R-Werte festgestellt werden: Fliessmittel R-Werte
SL 7810/F-II SL 7810/F-III Chloroform-Methanol-Wasser 0,47 0,59 (70:25:5) Chloroform-Methanol 0,27 0,44 (10:3) (Essigester-n-Butanol) 0,33 0,34 wassergesättigt (3:1)
Beim Entwickeln mit einer 0,20/obigen Ce(SO4)2-Lösung in 500/oiger Schwefelsäure als Sprühreagens können folgende Flecken (nach Erwärmen auf 1300) nachgewiesen werden:
SL 7810/F-II braune Flecken
SL 7810/F-III braune Flecken
Zur Detektion der Antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II und SL 7810/F-III kann auch Joddampf verwendet werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren läss sich nach für die fermentative Gewinnung von Antibiotika bekannten Methoden ausführen. Eine Kultur von dazu geeigneten Mikroorganismen wurde am 17. Juni 1974 beim United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, I11., USA deponiert und steht der Öffentlichkeit unter der Bezeichnung NRRL 8039 zur Verfügung. Vorzugsweise wird der Stamm NRRL 8039 verwendet.
Doch können auch Stämme verwendet werden, die aus dem Ausgangsstamm Aspergillus rugulosus Thom & Raper durch Behandlung mit mutagenen Substanzen oder Strahlen oder durch Selektion gewonnen werden können.
Charakteristikum des Stammes NRRL 8039
Der neue Stamm NRRL 8039 von Aspergillus regulosus Thom & Raper wurde aus einer auf dem Jaunpass in der Schweiz gesammelten Bodenprobe isoliert und lässt sich aufgrund seiner morphologischen Merkmale mit Hilfe der Aspergillus-Monographie von K. B. Raper & D. I. Fennell (The Genus Aspergillus: The Williams & Wilkins Company Baltimore, 1965, 686 S.) bei Aspergillus rugulosus Thom & Raper einordnen.
Der Stamm NRRL 8039 wächst auf Agarnährböden zwischen 15 und 500 C, das Wachstumsoptimum liegt zwischen 35 und 420 C. Auf Czapek-Dox-Agar wächst der Stamm NRRL 8039 eher langsam, die Kulturen entsprechen habituell annähernd der Artbeschreibung (Raper & Fennell, 1965): 20 Tage alte Kolonien sind stark gefältelt und das kurze, samtartige Luftmycel ist grau, hellbraun bis braun-violett pigmentiert. Der Kolonierand bleibt bei tieferen Inkubationstemperaturen (z. B. 18 bis 270 C) weiss, bei höheren Temperaturen (z. B. 33 bis 450 C) erscheint dieser gelb-braun. Die Rückseite der Kolonie bleibt bei tieferen Inkubationstemperaturen gelblich, bei höheren Temperaturen wird ein violettes Pigment gebildet und in den Agar ausgeschieden.
Auch nach 20tägiger Inkubation auf Czapek-Dox-Agar werden keine Cleistothecien und nur bei höheren Inkubationstemperaturen vereinzelte, aber verkümmerte Konidienträger gebildet.
Bedutend schneller und besser entwickelt sich der Stamm NRRL 8039 auf 2 o/o Malz-Dextrose-Agar, wo bereits nach 20tägiger Inkubation bei 270 die Haupt- und Nebenfruchtformen in beachtlichen Mengen gebildet und ausgereift sind.
Die Kolonien sind höchstens ganz schwach, meist aber überhaupt nicht gefältelt und das samtartige Luftmycel ist einheitlich gelblich gefärbt. Die Rückseite der Kolonie ist bei tieferen Inkubationstemperaturen gelb, bei höheren Temperaturen hellbraun.
Der auf 2 o/o Malz-Dextrose-Agar wachsende Stamm NRRL 8039 zeigt dunkelgrüne Konidienköpfchen, die meist in kleineren Grüppchen in und am Rand der Kolonie auftreten.
Die Morphologie und Dimension aller Strukturen der Nebenfruchtform stimmen gut überein mit der erwähnten Artbeschreibung von Aspergillus rugulosus.
Bezüglich der Hauptfruchtform bestehen hingegen einige Differenzen zur Artbeschreibung: So bleiben die in mehreren Lagen des samtartigen Luftmycels sich in grosser Zahl entwickelnden, kugeligen Cleistothecien bedeutend kleiner als für die Art angegeben wird (50-80 c im Durchmesser gegen.
über 225-350 y). Auch sind die Hüllenzellen hyalin, während sie bei dieser Art dunkelbraun sein sollten. Eine gute Übereinstimmung mit der Artbeschreibung besteht hingegen im artcharakteristischen Merkmal der violett-orange-roten, linsenförmigen, 4,1-5,0 X 3,4-3,8 cm grossen Ascosporen, deren Oberfläche mehr oder weniger deutlich runzlig und gefurcht und deren beiden parallel angeordneten Siquatorsäume 0,4-0,7 p breit sind.
Der neue Stamm NRRL 8039 lässt sich auf verschiedenen Nährböden mit den üblichen Nährstoffen züchten, z. B.
wie im nachstehenden Beispiel beschrieben.
Die neuen Antibiotika SL 7810/F-II und SL 7810/F-III kann man in der Weise herstellen, dass man ein flüssiges Medium mit einer Sporen- oder Mycelsuspension des Stammes NRRL 8039 beimpft und die Kultur 2-4 Tage, vorzugsweise 3 Tage, bei 270 inkubiert. Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen, entweder in Oberflächen- oder Submerskultur.
Sobald eine maximale Menge an Antibiotika produziert ist (feststellbar durch Nachweis der Aktivität gegen Candida albicans) werden diese aus der Kulturbrühe nach an sich bekannten Methoden isoliert, z. B. wie im nachstehenden Beispiel beschrieben, wobei als Lösungsmittel statt Essigester auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B. Butylacetat oder Butanol, verwendet werden.
Zur Abtrennung von fettartigen Begleitstoffen aus dem rohen Extrakt kann als erste Operation eine Filtration über eine Kieselgelsäule durchgeführt werden, wobei etwa die 4bis Sfache GewichtsmengeKieselgel, bezogen auf dieExtraktmenge, angewandt wird. Die Elution erfolgt mit Chloroform
Methanol-Gemischen (siehe nachfolgendes Beispiel).
Ein anderes Verfahren ist beispielsweise wie folgt durch führbar:
Man trennt fettartige Begleitstoffe und weitere Neben produkte durch geeignete Fällungsreaktionen ab. Dazu wird z. B. der Essigester-Extrakt mit Petroläther verrieben, wobei die gegen Candida albicans aktiven Antibiotika im unlösli chen Anteil verbleiben. Dieser Rückstand wird in Methanol aufgeschlämmt und nach Abfiltrieren von unlöslichen, inaktiven Anteilen das Filtrat im Vakuum eingedampft. Dieses Material löst man in Methanol und tropft die klare Lösung zur 10fachen Menge Essigester. Die Fällung enthält SL 7810/ F-II und SL 7810/F-III neben inaktiven Begleitstoffen.
Die weitere Reinigung und Auftrennung der Komponenten aus dem Gemisch erfolgt nun durch an und für sich bekannte chromatographische Methoden, wobei sich die Gelchromatographie an Sephadex LH 20 und die Chromatographie an Kieselgel sehr gut eignen. Diese Methoden werden in Kombination und zur Reinigung der einzelnen Komponenten wiederholt angewendet. So wird z. B. eines der oben beschriebenen Rohprodukte zuerst an Sephadex LH 20 mit Methanol chromatographiert, wobei die drei Antibiotika bei der Elution in den gleichen Fraktionen auftreten. Die vereinigten aktiven Fraktionen werden anschliessend an Kieselgel, Korngrösse 0,06-0,2 mm, chromatographiert. Zur Elution kann entweder Chloroform, dem steigende Mengen Methanol zugesetzt werden, oder aber durchgehend ein Chloroform-Methanol Wasser-Gemisch (80:17,5:2) verwendet werden.
Entsprechend den Rf-Werten im Dünnschichtchromatogramm wird bei der Elution von Kieselgelsäuren zuerst SL 7810/F-III, dann SL 7810/F-II erhalten. Zur Auftrennung von Mischfraktionen, insbesondere SL 7810/F-II und SL 7810/F-III, wird an der 250- bis 400fachen Menge Kieselgel eventuell mehrmals chromatographiert. Die gegen Candida albicans aktiven und im Dünnschichtchromatogramm reinen Fraktionen entsprechen nach den Rt-Werten den beanspruchten Antibiotika.
Die neuen Antibiotika zeigen interessante pharmakologische Eigenschaften.
Zur biologischen Charakterisierung der Antibiotika SL 7810/F-II und SL 7810/F-III dient ihr Wirkungsspektrum.
Während sämtliche Verbindungen bei den gebräuchlichen Testbedingungen unwirksam sind gegen grampositive und gramnegative Bakterien, wie z. B. Staphylococcus aureus und Escherichia coli, zeigen sie ausgeprägte Wirkungen gegen Hefen und Pilze.
In der nachstehenden Tabelle sind die Mindesthemmkonzentrationen gegen verschiedene Hefen und Pilze aufgeführt.
Der hierfür verwendete Reihenverdünnungstest wurde auf bekannte Weise durchgeführt mit den angegebenen Teststämmen. Die Inkubation beim Reihenverdünnungstest erfolgte in einem Malzextrakt-Medium (20/zig) vom pH 4,44,7 bei 27 bis 370 C je nach Temperaturoptimum des betreffenden Teststammes.
Die Auswertung erfolgt nach 72 Stunden Inkubationsdauer. Die Teststämme sind in der Mycothek der Firma Sandoz deponiert und stehen dort zur Verfügung.
Stamm MIC-Werte in ug/ml
SL 7810/F-II SL 7810/F-III
Candida albicans 0,3 1
Candida albicans H 12 0,1 0,3
Candida albicans 5897 0,3 1
Candida albicans 439 0,03 0,3
Candida albicans resistent 30 10 gegen Blasticidin S Candida tropicalis 0,03 0,3
Candida tropicalis CK 4 0,03 0,1
Candida krusei 0,3 1
Saccharomyces cerevisiae 10 10
Hansuela anomala 0,01 0,1
Rhodotorula rubra 31,6 31,6
Kloeckera apiculata 3,16 10
Wie aus den vorstehenden Untersuchungsresultaten (MIC Werte) hervorgeht, zeigen die genannten Verbindungen eine Wirksamkeit gegen bestimmte Pilze, insbesondere gegen Candida albicans. Die Wirksamkeit gegen Candida albicans kann auch in vivo gezeigt werden.
Die neuen Antibiotika eignen sich daher für die Behandlung der durch Candida albicans hervorgerufenen Erkrankungen.
Im allgemeinen werden befriedigende Resultate mit einer Tagesdosis von etwa 100 bis 1500 mg erzielt. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen von 30 bis 750 mg verabreicht werden.
Als Heilmittel können die neuen Antibiotika allein oder in geeigneten Arzneiformen gemeinsam mit anorganischen oder organischen, pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden. Beispielsweise werden sie als Bestandteil einer Salbe eingesetzt, wobei die Konzentration in der Salbe ca. 5 bis 130 mg Wirkstoff pro g Salbe betragen kann. Andere Formen sind Tabletten, Kapseln und Lösungen.
In dem nachfolgenden Beispiel, welches die Ausführung des Verfahrens erläutert, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Alle angegebenen Verhältnisse sind Volumen/Volumen. Merck, Sephadex und Dispax sind Handelsmarken.
Beispiel
Eine Sporensuspension, die zur Beimpfung der Nährlösung dient, wird aus einer Kultur des Stammes NRRL 8039 hergestellt. Hierzu beimpft man 200 ml Nähragar folgender Zusammensetzung:
20 g Cerelose (Glucose)
2 g Pepton
2 g Malzextrakt
2 g Hefeextrakt
2 g primäres Kaliumphosphat
2 g MgSO4 - 7H20
15 g Agar
1 Liter entionisiertes Wasser
Nach 10 Tagen Inkubation bei 270 werden die gebildeten Sporen in 200 ml sterilem Wasser suspendiert und damit ein Stahlfermenter beimpft, der 50 Liter folgender Nährlösung enthält:
20 g Cerelose (Glucose)
10 g Stärke
10 g Sojapepton
3 g Calciumcarbonat
2 g Natriumnitrat
1 g primäres Kaliumphosphat
0,5 g Kaliumchlorid
0,5 g MgSO4 - 7H20
1 ml Gemisch aus 90 0/0 Rhodorsil Siliconernulsion Antimousse B sowie 10 o/o Polypropylenglykol
2020 (Chem. Werke Hüls, Marl BRD)
1 Liter entionisiertes Wasser
Dieser Fermenter wird unter Rühren während 42 Stunden bei 270 inkubiert, wobei die Belüftung 1 Liter Luft/Min./
Liter Medium beträgt, bei einer Rührgeschwindigkeit von
250 U/Min.
Diese Kultur dient als Vorkultur für 500 Liter Fermen ter der gleichen Nährlösung, die damit 66 Stunden bei 270 inkubiert wird. Die Belüftungsrate beträgt wiederum 1 Liter
Luft/Min./Liter Medium, die Rührgeschwindigkeit aber nur
150 U/Min. Nach 66 Stunden Inkubationsdauer wird die Kul turbrühe geerntet und wie folgt aufgearbeitet:
450 Liter Kulturbrühe werden mit 2 N Salzsäure auf pH 7,0 gestellt, mit 500 Litern Essigester versetzt und mit dem Dispax-Reaktor homogenisiert. Anschliessend wird die organische Phase mit dem Separator von der Brühe getrennt und mit 50 Liter Wasser gewaschen. Dieser Extraktionsschritt wird zweimal wiederholt. Die erhaltenen 3 Extrakte werden vereinigt und unter Vakuum (Wasserringpumpe) bei 20 bis
400 zur Trockne eingeengt.
Dieses Material wird an der 4fachen Menge Kieselgel
Merck 60 (Korngrösse 0,063-0,20 mm) fraktioniert. Die
Eluate mit Chloroform + 10 o/o Methanol und Chloroform + 20 0/o Methanol enthalten inaktive Begleitstoffe. Die Chro matographiesäule wird anschliessend mit Chloroform-Metha nol (1:1) eluiert und die Fraktionen mit Aktivität gegen Can dida albicans vereinigt und zur Trockene eingeengt.
Durch Chromatographie von 16,4 g aktivem Material an
1 kg Kieselgel Merck 60 (Korngrösse 0,063-0,20 mm) und
Elution mit Chloroform + 20 o/o Methanol werden zuerst
Mischfraktionen von SL 7810/F-II und SL 7810/F-III erhal ten.
Durch weitere Chromatographie der aktiven Mischfrak tionen von SL 7810/F-II und SL 7810/F-Ill aus obiger Kiesel chromatographie können die beiden Antibiotika isoliert werden.
Dazu wird das Material (2,5 g) in Chloroform +20 O/o Metha- nol gelöst und die Lösung an einer Säule von 1 kg Kieselgel, die mit demselben Lösungsmittelgemisch bereitet ist, absor biert. Die Elution erfolgt durchgehend mit Chloroform + 20
Prozent Methanol, wobei zuerst vorwiegend SL 7810/F-III, dann vorwiegend SL 7810/F-II eluiert wird. Zur Gewinnung von reinem SL 7810/F-III werden die eingedampften Misch fraktionen (0,75 g), die dieses Antibiotikum enthalten, in
Chloroform + 10 o/o Methanol gelöst und die Lösung analog wie früher beschrieben an 1 kg Kieselgel Merck absorbiert.
Die Elution mit Chloroform + 10 0/o Methanol bis 15 o/o
Methanol liefert das stark angereicherte Material von SL
7810/F-III. Nach Gelfiltration (0,55 g) an 500 g Sephadex
LH 20 mit Methanol wird reines SL 7810/F-III erhalten: farbloses amorphes Pulver mit dem Smp. 164-1680 (Zers.).
Zur Isolierung von SL 7810/F-II werden die Mischfrak tionen (1,7 g), die SL 7810/F-II enthalten, in Chloroform + 20 O/o Methanol gelöst und diese Lösung an einer mit dem selben Lösungsmittelgemisch bereiteten Säule von 1 kg Kie selgel adsorbiert. Die Elution mit Chloroform + 20 /0 Me thanol ergibt stark angereicherte Fraktionen des SL 7810/
F-II. Die nachfolgende Gelfiltration (1,2 g) an 1,2 kg Se phadex LH 20 mit Methanol liefert reines SL 7810/F-II, ein amorphes Pulver mit dem Smp. 158-1600 (Zers.).
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PATENT CLAIMS
1. Process for the preparation of the new metabolites SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III, characterized in that a strain of the genus Aspergillus rugulosus Thom & Raper is grown on or in a nutrient medium and the metabolites are then isolated from the fermentation broth and cleans.
2. The method, characterized in that the strain NRRL 8039 is used as the new strain of the genus Aspergillus rugulosus Thom & Raper.
The present invention relates to the new metabolites, hereinafter referred to as SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III, and methods for their production.
It is known that the treatment of fungal diseases presents great problems, as there are very few useful antifungal substances available, but they are not all satisfactory. For example, amphotericin B, which is obtained from a microorganism, covers a wide range of pathogens from mycoses, but it is contaminated with toxic side effects. In the course of the search for new antifungal substances from microorganisms, a mixture of metabolites could now be isolated from cultures of an Aspergillus strain. Two of them, the antibiotics SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III are characterized by their high activity against yeasts and fungi.
According to the invention, the new metabolites SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III are obtained by growing a strain of the genus Aspergillus rugulosus Thom & Raper on or in a nutrient medium and by carrying out the metabolites from the fermentation broth in a manner known per se Extraction and / or adsorption isolated and then cleaned.
The new antibiotics have the following characteristics:
SL 7810 / F-II
Colorless amorphous powder of mp 158-1600 (dec.);
20 [a] 20 = ¯47.9 (c = 0.81 in methanol).
Analysis: Found C 58.5, N 8.0, N 9.3, 0 23.8 / 0.
Mol. (determined osmometrically in methanol): 1018.
UV spectrum in methanol: ma: 193 nm, log e '= 1.95 (see FIG. 1) 278 nm, log e' = 0.18
IR spectrum in Nujol (see FIG. 2) tH-NMR spectrum in DMSO (100 MHz, tetramethyl silane as internal standard) (see FIG. 3).
Color reactions: ninhydrin negative
Cl2-benzidine blue (solubility, stability, thin layer chromatogram and
MIC values see below).
SL 7810 / F-III
Colorless amorphous powder of mp 164-1680 (dec.); val D20 = 53.00 (c = 1.00 in methanol).
Analysis: Found C 61.1, H 8.0, N 9.0, 0 22.0 / 0
UV spectrum in methanol:; l ,, 193 nm, log e '= 1.98 (see FIG. 4) 278 nm, log e' = 0.24
IR spectrum in Nujol (see FIG. 5) tH-NMR spectrum in DMSO (100 MHz, tetramethyl silane as internal standard) (see FIG. 6).
Color reactions: ninhydrin negative Clp-benzidine blue (solubility, stability, thin layer chromatogram and
MIC values see below).
solubility
The antibiotics SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III are easily soluble in methanol and ethanol at room temperature, poorly soluble in chloroform, ether, petroleum ether, hexane and practically insoluble in water.
Stability The new antibiotics SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III are not very stable in the presence of light and especially in the air and decompose. The decomposition is also noticeable when heated to over 500.
Both antibiotics are characterized by instability under basic conditions. At a pH above 8, conversion to decomposition products occurs which are biologically only weak or no longer active.
Thin film program
The analysis is carried out on silica gel Merck 60 plates (0.25 mm layer thickness). The following R values can be determined with the following eluents: Eluent R values
SL 7810 / F-II SL 7810 / F-III chloroform-methanol-water 0.47 0.59 (70: 25: 5) chloroform-methanol 0.27 0.44 (10: 3) (ethyl acetate-n-butanol ) 0.33 0.34 water-saturated (3: 1)
When developing with a 0.20 / above Ce (SO4) 2 solution in 500% sulfuric acid as a spray reagent, the following stains (after heating to 1300) can be detected:
SL 7810 / F-II brown spots
SL 7810 / F-III brown spots
Iodine vapor can also be used to detect the antibiotics SL 7810 / F, SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III.
The method according to the invention can be carried out according to methods known for the fermentative production of antibiotics. A culture of suitable microorganisms was deposited on June 17, 1974 at the United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, I11., USA and is available to the public under the designation NRRL 8039. Strain NRRL 8039 is preferably used.
However, strains can also be used which can be obtained from the starting strain Aspergillus rugulosus Thom & Raper by treatment with mutagenic substances or rays or by selection.
Characteristic of strain NRRL 8039
The new strain NRRL 8039 from Aspergillus regulosus Thom & Raper was isolated from a soil sample collected on the Jaunpass in Switzerland and, due to its morphological features, can be analyzed using the Aspergillus monograph from KB Raper & DI Fennell (The Genus Aspergillus: The Williams & Wilkins Company Baltimore, 1965, 686 p.) With Aspergillus rugulosus Thom & Raper.
The strain NRRL 8039 grows on agar nutrient media between 15 and 500 C, the optimum growth lies between 35 and 420 C. On Czapek-Dox-Agar the strain NRRL 8039 grows rather slowly, the cultures habitually approximate the species description (Raper & Fennell, 1965) : 20-day-old colonies are strongly crinkled and the short, velvety aerial mycelium is pigmented gray, light brown to brown-violet. The colony rim remains white at lower incubation temperatures (e.g. 18 to 270 C), and appears yellow-brown at higher temperatures (e.g. 33 to 450 C). The back of the colony remains yellowish at lower incubation temperatures, at higher temperatures a purple pigment is formed and excreted in the agar.
Even after 20 days of incubation on Czapek-Dox agar, no cleistothecia are formed and only occasional but stunted conidial carriers are formed at higher incubation temperatures.
The strain NRRL 8039 developed significantly faster and better on 2 o / o malt dextrose agar, where the main and secondary fruit forms were formed and matured in considerable quantities after 20 days of incubation at 270.
The colonies are at most very weak, but mostly not crinkled at all, and the velvety aerial mycelium is uniformly colored yellow. The back of the colony is yellow at lower incubation temperatures and light brown at higher temperatures.
Strain NRRL 8039, growing on 2 o / o malt dextrose agar, shows dark green conidia heads, which usually appear in smaller groups in and on the edge of the colony.
The morphology and dimension of all structures of the secondary crop form agree well with the species description of Aspergillus rugulosus mentioned.
With regard to the main fruit form, however, there are some differences to the description of the species: the spherical cleistothecia, which develop in large numbers in several layers of the velvety aerial mycelium, remain significantly smaller than specified for the species (50-80 c in diameter against.
over 225-350 y). The envelope cells are also hyaline, while in this species they should be dark brown. In contrast, there is a good agreement with the description of the species in the characteristic characteristic of the violet-orange-red, lenticular, 4.1-5.0 X 3.4-3.8 cm large ascospores, the surface of which is more or less clearly wrinkled and grooved and their two parallel seams are 0.4-0.7 p wide.
The new strain NRRL 8039 can be grown on various nutrient media with the usual nutrients, e.g. B.
as described in the example below.
The new antibiotics SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III can be prepared by inoculating a liquid medium with a spore or mycelium suspension of strain NRRL 8039 and the culture for 2-4 days, preferably 3 days , incubated at 270. The cultivation takes place under aerobic conditions, either in surface or submerged culture.
As soon as a maximum amount of antibiotics is produced (ascertainable by detecting the activity against Candida albicans), these are isolated from the culture broth by methods known per se, e.g. Example, as described in the example below, other organic solvents, such as. As butyl acetate or butanol can be used.
As a first operation, filtration over a silica gel column can be carried out in order to remove fat-like accompanying substances from the crude extract, using about 4 to 5 times the amount by weight of silica gel, based on the amount of extract. Elution takes place with chloroform
Methanol mixtures (see example below).
Another method can be carried out, for example, as follows:
Fat-like accompanying substances and other by-products are separated off by suitable precipitation reactions. For this, z. B. the ethyl acetate extract triturated with petroleum ether, the antibiotics active against Candida albicans remaining in the insoluble portion. This residue is slurried in methanol and, after filtering off insoluble, inactive fractions, the filtrate is evaporated in vacuo. This material is dissolved in methanol and the clear solution is added dropwise to 10 times the amount of ethyl acetate. The precipitation contains SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III in addition to inactive accompanying substances.
The further purification and separation of the components from the mixture is now carried out by chromatographic methods which are known per se, gel chromatography on Sephadex LH 20 and chromatography on silica gel being very suitable. These methods are used repeatedly in combination and for cleaning the individual components. So z. B. one of the crude products described above is first chromatographed on Sephadex LH 20 with methanol, the three antibiotics occurring in the same fractions during elution. The combined active fractions are then chromatographed on silica gel, particle size 0.06-0.2 mm. Either chloroform, to which increasing amounts of methanol are added, or a continuous chloroform-methanol-water mixture (80: 17.5: 2) can be used for the elution.
According to the Rf values in the thin-layer chromatogram, SL 7810 / F-III is obtained first, then SL 7810 / F-II when eluting silica. For the separation of mixed fractions, in particular SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III, it may be chromatographed several times on 250 to 400 times the amount of silica gel. The fractions active against Candida albicans and pure in the thin layer chromatogram correspond to the claimed antibiotics according to the Rt values.
The new antibiotics show interesting pharmacological properties.
Their spectrum of activity serves for the biological characterization of the antibiotics SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III.
While all compounds are ineffective against gram-positive and gram-negative bacteria, such as e.g. B. Staphylococcus aureus and Escherichia coli, they show pronounced effects against yeasts and fungi.
The table below shows the minimum inhibitory concentrations against various yeasts and fungi.
The serial dilution test used for this was carried out in a known manner with the test strains indicated. The incubation in the serial dilution test was carried out in a malt extract medium (20%) with a pH of 4.44.7 at 27 to 370 ° C, depending on the optimum temperature of the test strain in question.
The evaluation is carried out after 72 hours of incubation. The test strains are deposited in the Sandoz Mycothek and are available there.
Strain MIC values in µg / ml
SL 7810 / F-II SL 7810 / F-III
Candida albicans 0.3 1
Candida albicans H 12 0.1 0.3
Candida albicans 5897 0.3 1
Candida albicans 439 0.03 0.3
Candida albicans resistant 30 10 to Blasticidin S Candida tropicalis 0.03 0.3
Candida tropicalis CK 4 0.03 0.1
Candida krusei 0.3 1
Saccharomyces cerevisiae 10 10
Hansuela anomala 0.01 0.1
Rhodotorula rubra 31.6 31.6
Kloeckera apiculata 3.16 10
As can be seen from the above test results (MIC values), the compounds mentioned show activity against certain fungi, in particular against Candida albicans. The effectiveness against Candida albicans can also be shown in vivo.
The new antibiotics are therefore suitable for the treatment of the diseases caused by Candida albicans.
Satisfactory results are generally obtained with a daily dose of about 100 to 1500 mg. This dose can be administered in 2 to 3 portions of 30 to 750 mg if necessary.
As a remedy, the new antibiotics can be administered alone or in suitable pharmaceutical forms together with inorganic or organic, pharmacologically indifferent auxiliaries. For example, they are used as part of an ointment, the concentration in the ointment being about 5 to 130 mg of active ingredient per g of ointment. Other forms are tablets, capsules and solutions.
In the following example, which explains the implementation of the method, but is not intended to restrict the scope of the invention in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius. All stated ratios are volume / volume. Merck, Sephadex and Dispax are trademarks.
example
A spore suspension, which is used to inoculate the nutrient solution, is prepared from a culture of the strain NRRL 8039. Inoculate 200 ml nutrient agar with the following composition:
20 g cerelose (glucose)
2 g peptone
2 g malt extract
2 g yeast extract
2 g primary potassium phosphate
2 g MgSO4 - 7H20
15 g agar
1 liter of deionized water
After 10 days of incubation at 270, the spores formed are suspended in 200 ml of sterile water and inoculated with a steel fermenter containing 50 liters of the following nutrient solution:
20 g cerelose (glucose)
10 g starch
10 g soy peptone
3 g calcium carbonate
2 g sodium nitrate
1 g primary potassium phosphate
0.5 g potassium chloride
0.5 g MgSO4 - 7H20
1 ml mixture of 90 0/0 Rhodorsil silicone emulsion Antimousse B and 10 o / o polypropylene glycol
2020 (Chem. Werke Hüls, Marl FRG)
1 liter of deionized water
This fermenter is incubated with stirring at 270 for 42 hours, the aeration being 1 liter of air / min. /
Liter of medium at a stirring speed of
250 rpm
This culture serves as a preculture for 500 liters of fermen ter of the same nutrient solution, which is thus incubated at 270 for 66 hours. The ventilation rate is again 1 liter
Air / min. / Liter of medium, but the stirring speed only
150 rpm After 66 hours of incubation, the culture broth is harvested and processed as follows:
450 liters of culture broth are adjusted to pH 7.0 with 2 N hydrochloric acid, 500 liters of ethyl acetate are added and the homogenization is carried out using the Dispax reactor. The organic phase is then separated from the broth with the separator and washed with 50 liters of water. This extraction step is repeated twice. The 3 extracts obtained are combined and under vacuum (water ring pump) at 20 to
400 evaporated to dryness.
This material is made up of 4 times the amount of silica gel
Merck 60 (grain size 0.063-0.20 mm) fractionated. The
Eluates with chloroform + 10% methanol and chloroform + 20% methanol contain inactive accompanying substances. The chromatography column is then eluted with chloroform-methanol (1: 1) and the fractions with activity against Can dida albicans are combined and evaporated to dryness.
By chromatography of 16.4 g of active material
1 kg silica gel Merck 60 (grain size 0.063-0.20 mm) and
Elution with chloroform + 20 o / o methanol are first
Get mixed fractions of SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-III.
The two antibiotics can be isolated by further chromatography of the active mixed fractions of SL 7810 / F-II and SL 7810 / F-Ill from the above silica gel chromatography.
For this purpose, the material (2.5 g) is dissolved in chloroform +20 O / o methanol and the solution is absorbed on a column of 1 kg of silica gel, which is prepared with the same solvent mixture. The elution is carried out continuously with chloroform + 20
Percent methanol, whereby primarily SL 7810 / F-III is eluted, then mainly SL 7810 / F-II. To obtain pure SL 7810 / F-III, the evaporated mixed fractions (0.75 g) containing this antibiotic are in
Chloroform + 10 o / o methanol dissolved and the solution absorbed on 1 kg of silica gel Merck analogously as described earlier.
Elution with chloroform + 10 0 / o methanol to 15 o / o
Methanol provides the highly enriched material from SL
7810 / F-III. After gel filtration (0.55 g) on 500 g Sephadex
LH 20 with methanol gives pure SL 7810 / F-III: colorless amorphous powder with the mp. 164-1680 (dec.).
To isolate SL 7810 / F-II, the mixed fractions (1.7 g) containing SL 7810 / F-II are dissolved in chloroform + 20 O / o methanol and this solution on a column prepared with the same solvent mixture 1 kg of silica gel adsorbed. Elution with chloroform + 20/0 methanol gives highly enriched fractions of the SL 7810 /
F-II. The subsequent gel filtration (1.2 g) on 1.2 kg Sephadex LH 20 with methanol gives pure SL 7810 / F-II, an amorphous powder with mp 158-1600 (dec.).