DE2643487A1 - Antibioticum a-22082 und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Antibioticum a-22082 und verfahren zu seiner herstellung

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DE2643487A1
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DE
Germany
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antibiotic
methanol
medium
weak
epsilon
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Withdrawn
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DE19762643487
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English (en)
Inventor
Calvin Eugene Higgens
Karl Heinz Michel
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Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

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Description

PFENNING-MAAS
X-4684
Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V.St.A.
Antibioticum A-22082 und Verfahren zu seiner Herstellung
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Polypeptid-Antibioticum, das als A-22082 bezeichnet wird, und andere mengenmäßig geringere Faktoren, die durch Züchtung des bisher noch nicht beschriebenen Stamms des Organismus Aspergillus nidulans NRRL 8112 erzeugt werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Erzeugung einer antibiotisch wirksamen Mischung aus dem Antibioticum A-22082 und anderen mengenmäßig geringeren Faktoren, zur Trennung dieser Mischung und zur Isolierung des Antibioticums A-22082. Das antibiotisch wirksame Gemisch wird durch Züchten eines neuen Stamms von Aspergillus nidulans NRRL 8112 unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zum Auftreten von antibiotischer Aktivität in wesentlicher Stärke erzeugt. Das Äntibioticagemisch wird durch Extraktion mit einem polaren organischen Lösungsmittel von dem Fermentationsmedium abgetrennt. Es wird weiter gereinigt, und das Antibioticum A-22082 kann durch eine Reihe verschiedener Maßnahmen, zum Beispiel durch Chromatographie, isoliert werden.
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Das Antibioticum A-22082 ist eine weiße amorphe feste Substanz, die in Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat und in wässrigen Lösungen mit einem pH-Wert von über 7,0 löslich, aber in Diäthylather und Petroläther unlöslich ist und folgende Merkmale hat:
a) ein durch Massenspektrometrie und Titration bestimmtes Molekulargewicht von etwa 1100,
b) eine Elementarzusammensetzung von 56,52 % Kohlenstoff, 7,29 % Wasserstoff, 8,68 % Stickstoff und 27,09 % Sauerstoff,
c) die empirische Formel ^5·ι_53Η79_83Ν7Οΐ7_-ΐ9'
d) folgende Werte der spezifischen Drehung:
/alpha/ ^5 -44° (c 0,5, CH3OH) /alpha/3g5-156O (c 0,5, CH3OH),
e) in einer KBr-Scheibe ein Infrarotabsorptionsspektrum mit folgenden charakteristischen Absorptionsmaxima: 2,97 (stark), 3,30 (schwach), 3,36 (Schulter),
3,39 (mittelstark), 3,47 (schwach), 5,97 (stark),
6.06 (stark), 6,45 (mittelstark), 6,53 (mittelstark), 6,83 (mittelstark), 7,78 (schwach), 8,00 (schwach),
9.07 (schwach) und 11,66 (schwach) Mikron,
f) Ultraviolettabsorptionsspektren in neutralem und saurem Methanol mit Absorptionsmaxima bei 225 nm (epsilon 18 000),
. 275 nm (epsilon 3000) und 284 nm (Schulter epsilon 2500) und Absorptionsmaxima in basischem Methanol bei 245 nm (epsilon 16 000) und 290 nm (epsilon 3000),
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g) ein magnetisches C-Kernresonanzspektrum in Perdeuteromethanol mit folgenden Charakteristik^: delta 176,1, 174,3, 173,4, 172,7, 172,4, 169,8, 158,4, 132,8, 130,9, 129,6, 129,0, 116,2, 77,0, 75,7, 74,4, 71,3, 70,9, 69,6, 68,3, 62,4, 58,7, 56,9, 56,1, 52,9, 39,0, 38,5, 36,8, 35,2, 33,9, 32,9, 32,6, 30,7, 30,4, 30,2, 28,2, 27,0, 26,5, 23,6, 20,1, 19,6, 14,4 und 11,3 ppm,
h) eine titrierbare Gruppe mit einem pKa-Wert von 12,7 in 66-prozentigem wässrigem Dimethylformamid,
i) nach Hydrolyse eine Aminosäurenanalyse, die das Vorliegen von Threonin, Hydroxyprolin und drei anderen noch nicht identifizierten Aminosäuren erkennen läßt,
j) einen Rf-Wert von 0,35 auf einem Kieselsäuregel-Dünnschicht chromatogramm unter Vewendung von Benzol und Methanol im Verhältnis von 7 : 3 als Lösungsmittelsystem und einer Bioautographie mit Candida albicans zum Auffinden,
k) die folgenden R^-Werte bei den angegebenen papierchromatographischen Systemen unter Anwendung der Bioautographie mit Candida albicans zum Auffinden:
Rf 1^ "* Lösungsmitte lsy s tem
0,76 mit Wasser gesättigtes Butanol
0,69 mit Wasser gesättigtes Butanol plus
2 % p-Toluolsulfonsäure
0,75 Methanol/0,1 n HCl (3:1)
0,17 Butanol/Äthanol/Wasser (13,5:15:15ο)
0,78 Methanol/O,O5 m Natriumeitrat, pH 5,7
(7:3); mit 0,05 m Natriumcitrat, pH 5,7, gepuffertes Papier
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Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt folgende Stufen:
a) Züchten von Aspergillus nidulans NRRL 8112 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlehydraten, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis antibiotische Aktivität in wesentlichem Umfang in diesem Kulturmedium durch diesen Organismus gebildet worden ist, und
b) gegebenenfalls die Abtrennung des antibiotisch wirksamen Gemisches von dem Kulturmedium und
c) gegebenenfalls die Isolierung des Antibioticums A-22082.
Die bei der Elementaranalyse des Antibioticums A-22O82 erhaltenen Werte stimmen besonders gut mit einer empirischen Formel von C52H81N7O18.H2O (ber. C 56,24, H 7,54, N 8,84, 0 27,39) überein.
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibioticums A-22082 in KBr-Scheibe ist in der beigefügten Zeichnung wiedergegeben.
Das Antibioticum A-22082 ist dem von F. Benz et al. in HeIv. Chim. Acta Bd. 57, S. 2459 - 2477 (1974) beschriebenen PoIypeptidantibioticum Echinocandin B ähnlich, hat aber ein Wirkungsspektrum, das sich von dem von Echinocandin B unterscheidet.
Ein für die Herstellung von Antibioticum A-22082 brauchbarer Organismus wird als ein Stamm von Aspergillus nidulans (Eidam) Wint. in der Aspergillus nidulans-Gruppe klassifiziert. Diese Klassifizierung beruht auf den Beschreibungen von K.B. Raper und D. I. Fennel in "The Genus Aspergillus", The Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md, USA, 1965.
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Die Zuordnung der Farbnamen erfolgt entsprechend der ISCC-NBS-Methode (K. L. Kelly und D. B. Judd, "The ISCC-NBS Method of Designating Color and a Dictionary of Color Names," U.S. Dept. of Commerce, Circ. 553, Washington,. D. C, 1955). Die Maerz- und Paul-Farbblöcke sind von A. Maerz und M. R. Paul in "Dictionary of Color," McGraw-Hill Book Company, New York, N.Y., 1950, beschrieben.
Wenn nichts anderes angegeben ist, werden die Kulturen bei 25 0C gezüchtet.
KulturCharakteristiken von A. niduTans NRRL 8112 S ζ apeklö sung-Agar
Nach zweiwöchiger Züchtung bei 25 C erreicht die Kultur einen Durchmesser von 4,0 cm. Die Kolonie ist leicht gerunzelt und hat einen stark gekerbten Rand, der aus tief eingetauchten bräunlichgelben Hyphen besteht. Manchmal tritt ein farbloses Exudat auf, das mit dem Altern rosafarben wird. Lose verwobene nahezu kugelförmige Mycelbüschel treten ungleichmäßig auf der Oberfläche verteilt und in einer fast am Rande verlaufenden Linie auf. Mit der Reifung werden die Büschel fester verwoben oder verflochten und sind mit Hüllzellen vermengt und schließlich in diesen eingeschlossen. Das frühe Wachstum ist weiß bis lederfarben und geht in blaßgelbgrün über (ISCC-NBS 12 und Maerz und Paul 10-A-1). In zwei Wochen wird das Wachstum blaßorangegelb (ISCC-NBS 73 und Maerz und Paul 10-B-3). Nach drei Wochen sind die weit verstreuten Conidienköpfe, die manchmal Flecken bilden, zunächst weiß bis hellgelb und werden dann dunkelgräulichgelb (ISCC-NBS 91 und Maerz und Paul 13-11-1). Lösliches Pigment wird nicht entwickelt. Die schwach gewölbe Kolonierückseite ist weiß bis hellbraun (ISCC-NBS 57 und Maerz und Paul 5-A-10) und geht mit dem Altern in dunkelpurpurfarbene Schattierungen über.
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Die Conidienköpfe sind zuerst radial, werden aber mit dem Alter kurz und säulenförmig. Junge kugelförmige Köpfe können einen Durchmesser von bis zu 70 ,n, im Durchschnitt einen Durchmesser von 60 ,u haben. Säulenförmige Köpfe sind 75 bis 125 ,u lang und 30 bis 65 ,u stark und sind im Durchschnitt 95 χ 47 ,u.
Conidxophoren, Bläschen und Phialiden sind glattwandig und blaßbraun. Die Conidiophoren haben eine Länge von 38 bis 56 Ai, können jedoch 85 ,u erreichen. Sie sind bis zu 5 ,u stark.
Die Bläschen sind nicht ganz kugelförmig bis halbkugelförmig und können am Ende abgeflacht sein. Sie haben im allgemeinen Durchmesser von 8 bis 11 ,u, im Mittel 9,6 ,u.
Sterigmata sind in Doppelreihen angeordnet, und sekundäre Sterigmata kommen häufig in Paaren vor. Primäre Sterigmata sind nahezu keilförmig. Ihre Länge reicht von 3,2 ,u bis 6,3 ,u und beträgt im Mittel 4,4 ,u. Ihre größte Dicke beträgt 2,8 ,u. Sekundäre Sterigmata sind flaschenförmig und länglich. Ihre dickste Stelle beträgt 3,4 ,u und die dünnste 1 ,u. Ihre Länge reicht von 4,7 bis 7,9 ,u, im Mittel 6,2 .u.
Die Conidien sind leicht gerunzelt, kugelförmig, gelb bis grün in der Masse und haben einen Durchmesser von 1,6 bis 4,6 Ai, im Mittel 2,5 ,u.
Der ascogene Zustand ist in Hüllzellen auf der Oberfläche der Kolonie inkrustiert, kann aber auch unterhalb der Oberfläche auftreten. Die Hüllzellen oder Hüllschichten sind glasig und durchsichtig und werden mit der Entwicklung von Kleistothecia rosafarben bis bräunlich. Die Hüllzellen sind kugelförmig bis nicht ganz kugelförmig oder oval bis länglich und haben im allgemeinen einen Durchmesser von 14 bis 18 ,u.
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Die Kleistothecia sind kugelförmig, dickwandig und in jungem Zustand durchsichtig und im Zustand voller Reife dunkelpurpurfarben. Ihr Durchmesser reicht von 185 .u bis 320 ,u und beträgt im Mittel 200 ,u.
Asci sind durchsichtig, kugelförmig bis oval und können vor der Kleistotheciarexfe zerfallen. Kugelförmige Asci haben einen Durchmesser 'von 12,6 .u; ovale Asci haben im Mittel eine Abmessung von 14,1 χ 11,1 ,u bei einer Länge von 12,6 bis 17,4 .u und einer Dicke von 9,5 bis 12,6 ,u.
Ascosporen sind glattwandig, orangefarben und zeigen zwei feingefaltete parallele äquatoriale Erhebungen, die ungebrochen und 0,8 ,u dick sind. Ist die Erhebung äquatorial, dann verläuft sie durch die lange Achse eines linsenförmigen Ascosporen, die 4,3 bis 5,1 ,u lang und 2,7 bis 3,5 ,u breit ist und im Durchschnitt 4,5 ,u : 3,2 ,u beträgt. Ist die Erhebung pheripher, erscheint die Ascospore kugelförmig, und der Körper hat einen Durchmesser, der der Länge der konvexen Ansicht gleich ist.
Ma1ζextraktagar
Bei 25 0C wächst die Kultur rasch und erreicht in zehn Tagen einen Durchmesser von 5 cm und in drei bis vier Wochen einen Durchmesser von bis zu 7 cm. Die Kolonien sind samtartig gelbgrün. Am 17.-ten Tag treten kleine weiße Büschel von Hüllzellen willkürlich auf der Oberfläche verteilt und in einer Bande nahe am Rand auf. Die Hüllzellenbüschel werden mit dem Alter dumpfgelb. Der gekerbte äußere Rand der Kolonie besteht aus tiefeingetauchten gelblich-braunen Hyphen. Im allgemeinen ist die Oberfläche olivgrün (ISCC-NBS 125 und Maerz und Paul 24-L-1), und die Rückseite der Kolonie ist oliv (ISCC-NBS 1Ο7 und Maerz und Paul 15-L-4).
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in
Die conidialen und ascogenen Zustandsformen sind denen auf Szapek-Lösungsagar von einigen Ausnahmen abgesehen vergleichbar. Die Bläschen sind kleiner und haben Durchmesser von 6,3 bis 11,0 /U, im Mittel 8,7 ,u. Kugelartige Asci haben einen Durchmesser von 11,0 ,u, und Asci haben eine Länge von 11,1 bis 12,6 ,u und eine Dicke von 9,5 bis 10,3 .u und messen im Durchschnitt 11,3 χ 10,1 ,u. Ascosporen haben im Mittel Abmessungen von 4,0 χ 3,2 ,u.
Der das Antibioticum A-22082 erzeugende Stamm von Aspergillus nidulans NRRL 8112 unterscheidet sich in bestimmten Merkmalen von dem von Raper und Fennel (vergleiche oben) beschriebenen Organismus. Der A-22082 erzeugende Stamm bildet kleinere Conidiophoren, Conidien und Hülzellen, aber etwas größere Conidialköpfe und sekundäre Sterigmata. Der A-22082 erzeugende Stamm bringt ein Exudat hervor, was der von Raper und Fennell beschriebene Organismus nicht tut. Alle übrigen Merkmale stimmen mit denjenigen der veröffentlichten Beschreibung überein und bestätigen die Identifizierung des A-22082 erzeugenden Organosmus als einen neuen Stamm von Aspergillus nidulans (Eidam) Wint.
Die Aspergillus nidulans-Kultur, die sich für die Erzeugung des neuen Antibioticagemisches eignet, das das Antibioticum A-22082 und andere in geringerer Menge auftretende Faktoren enthält, wurde beim Northern Regional Research Laboratory, U.S. Dept. of Agriculture, Agriuhltural Research Service, Peoria, Illinois,V.St.A., hinterlegt und in die Kulturensammlung dieses Instituts aufgenommen. Sie ist unter der Nummer NRRL 8112 für die Allgemeinheit zugänglich.
Die bekannte Verbindung Sterigmatocystin wird von Aspergillus nidulans NRRL 8112 erzeugt. Während des Gewinnungsverfahrens durch Extraktion des Fermentationsmediums mit polarem organischem Lösungsmittel wird Sterigmatocystin zusammen mit den antibiotischen Gemischen extrahiert. Die antibiotischen Gemische werden von Sterigmatocystin durch Fällung getrennt.
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Zur Abtrennung des antibiotischen Gemischs, das das Antibioticum A-22082 und andere in geringerer Menge auftretende Faktoren enthält, von den anderen Komponenten des Fermentationsmediums wird von einer Adsorption an einer Kieselsäuregelsäule und Elution mit Acetonitril/Wasser (97 : 3) Gebrauch gemacht. Das Antibioticum A-22082 wird von den anderen in geringerer Menge auftretenden Faktoren durch Chromatographieren an einer Kieselsäuregelsäule mit Acetonitril/Wasser (97 : 3) als Elutionsmittel abgetrennt und isoliert.
Das Nährmedium für die Züchtung von A. nidulans NRRL 8112 kann aus einer Reihe verschiedener Medien gewählt werden. Im Hinblick auf eine möglichst wirtschaftliche Erzeugung, optimale Ausbeuten und Einfachheit bei der Isolierung des Produkts werden jedoch bestimmte Nährmedien bevorzugt. So ist beispielsweise für Fermentationen in großem Maßstab Saccharose eine bevorzugte Kohlehydratquelle, doch können auch Glucose, Maltose, Glycerin und ähnliche Stoffe hierfür verwendet werden. Bevorzugte Stickstoffquellen sind enzymhydrolysiertes Casein und Maisquellwasser.
Anorganische Salze, die als Nährstoffe dienen, können in das Nährmedium eingeführt werden. Hierzu gehören die üblichen löslichen Salze, die Natrium-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlor-, Carbonat-, Sulfat-, Nitrat- und dergleichen Ionen liefern können. Wesentliche Spurenelemente, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus erforderlich sind, sollen gleichfalls in dem Nährmedium vorhanden sein. Solche Spurenelemente treten gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen auf, die für die Wachsturnserfordernisse des Organismus ausreichen.
Es kann erforderlich sein, Medien für Fermentationen in großem Maßstab geringe Mengen (d. h. 0,2 ml/1) eines Schaumverhinderungsmittels, zum Beispiel Polypropylenglycol, zuzusetzen, wenn durch Schaumbildung Schwierigkeiten auftreten.
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Zur Erzeugung beträchtlicher Mengen des Antibioticums A-22082 wird eine aerobe Submersfermentation in Tanks bevorzugt. Geringe Mengen des Antibioticums A-22082 können in Schüttelkolbenkulturen erhalten werden. Wegen der zeitlichen Verzögerung der Antibioticumerzeugung, die gewöhnlich mit der Beimpfung von großen Tanks mit der Sporenform des Organismus verbunden ist, wird vorzugsweise ein vegetatives Inokulum verwendet. Dieses vegetative Inokulum wird durch Inokulieren eines kleinen Volumens des Nährmediums mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Organismus hergestellt, wodurch eine frische kräftig wachsende Kultur des Organismus erhalten wird. Das vegetative Inokulum wird dann in einen größeren Tank überführt. Das für die Züchtung des vegetativen Inokulums verwendete Medium kann dasselbe sein wie das für die Fermentation in größerem Maßtab verwendete, doch können auch andere Medien verwendet werden.
A. nidulans kann bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 40 0C gezüchtet werden. Die optimale A-22082-Erζeugung findet offenbar bei Temperaturen von etwa 25 bis 30 0C statt.
Wie bei aeroben Submerszüchtungsverfahren üblich, wird das Nährmedium durch Einleiten von steriler Luft durch eine Verteilungsvorrichtung, zum Beispiel eine Brause, belüftet, während es durch übliche Turbinenrührer in einem vollständig mit Pralleinrichtungen ausgestatteten Gefäß mechanisch bewegt wird. Eine sehr gute Antibioticumerzeugung wird erzielt, wenn der im Medium gelöste Sauerstoffgehalt bei oder über 35 % der Luftsättigung gehalten wird.
Die Erzeugung des Antibioticums A-22082 kann während der Fermentation durch Prüfung von Proben alkoholischer Extrakte der Gesamtgärmaische auf ihre antibiotische Wirkung gegen einen Organismus verfolgt werden, dessen Empfindlichkeit gegenüber dem Antibioticum bekannt ist. Ein für die Prüfung auf das Antibioticum A-22082 geeigneter PrüfOrganismus ist
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Candida albicans. Dieser Biotest wird zweckmäßigerweise mit der PapierScheibenprüfung auf Agarplatten durchgeführt.
Im allgemeinen läßt sich eine antibiotische Aktivität am dritten Tag der Fermentation nachweisen. Die höchste Erzeugung antibiotischer Aktivität durch A. nidulans erfolgt gewöhnlich zwischen dem vierten und dem sechsten Tag der Fermentation.
Das Antibioticum A-22082 ist ein wertvolles antifungales Mittel. Die antifungale Wirkung des Antibioticums A-22082 kann durch in-vitro-Tests nachgewiesen werden. Sie wird durch die übliche Scheibendiffusionsmethode bestimmt (ein 6 mm Bausch wird in eine das Antibioticum A-22082 enthaltende Lösung eingetaucht und auf eine Agarplatte aufgebracht, die mit dem Testorganismus besamt ist). In der Tabelle ist das Minimum der inhibierenden Konzentration (MIC) je Scheibe aufgeführt, bei welcher das Antibioticum A-22082 das Wachstum repräsentativer Organismen inhibiert.
T a b eile
Testörganismus MIC (mcg/Scheibe) Candida albicans 0,625
Trichophyton mentagrophytes O,O78
Candida tropicalis 3,12
In-vitro—Scheibendiffusionsteste zeigen gleichfalls, daß das Antibioticum A-22082 Geotrichum candidum und vier Species von Microsporum inhibiert.
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-MT-
Die antifungale Wirksamkeit des Antibioticums A-22O82 kann auch durch in-vivo-Tests nachgewiesen werden. Durch Verabreichung von zwei Dosen des Antibioticums A-22082 an mit Candida albicans infizierte Mäuse wird ein Schutz gegen C. albicans erzielt. Ein Maß für den erreichten Schutz ist der ED1. -Wert (die wirksame Dosis in mg/kg, die zu einem Schutz von 50 % der Mäuse führt; vergleiche W. Wick et al., J. Bacteriol. Bd. 81, S. 233 - 235, 1961). Die ED50-Werte für das Antibioticum A-22082 gegen Candida albicans bei Mäusen sind 3O mg/kg (intraperitoneal) und 50 mg/kg (subkutan).
Bei der intraperitonealen (ip) oder subkutanen (se) Verabreichung des Antibioticums A-22082 an Mäuse in einer Menge von 1OO mg/kg zweimal täglich während drei Tagen (insgesamt 600 mg/kg) sind keinerlei Anzeichen einer akuten Toxizität zu erkennen. Auch bei ip-Verabreichung des Antibioticums A-22082 an Mäuse in einer Menge von 200 mg/kg dreimal in 24 Stunden (insgesamt 600 mg/kg) treten keine Anzeichen von akuter Toxizität auf.
Bei seiner Verwendung als antifungales Mittel wird das Antibioticum A-22O82 parenteral und gewöhnlich zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht. Die Dosierung des Antibioticums A-22O82 hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von der Art und Schwere der jeweiligen Infektion.
Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.
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Beispiel 1
A. Schüttelkolbenfermentation unter Verwendung von A. nidulans NRRL 8112 zur Erzeugung eines antibiotischen Gemischs, das Antibioticum A-22082 und andere in geringer Menge auftretende Faktoren enthält
Eine Kultur von Aspergillus nidulans NRRL 8112 wird auf einem
Schrägagar folgender Zusammensetzung bereitet und erhalten:
Bestandteil Menge (%)
Tomatenpaste 2
Baby-Hafermehl 2
Agar 2
entionisiertes Wasser 94
Der Schrägagar wird mit Aspergillus nidulans NRRL 8112 inokuliert und danach etwa 7 Tage bei 25 0C gehalten. Die reife Schrägkultur wird mit Rinderserum bedeckt und mit einer sterilen Schlaufe zum Ablösen der Sporen geschabt. Die erhaltene Suspension wird zu sechs Körnern lyophylisiert.
Ein so hergestelltes lyophylisiertes Korn wird zum Beimpfen von 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung verwendet:
Bestandteil Menge (%)
Glucose 1 ,0
Glycerin 1,0
Baumwollsamenmehl 2,5
CaCO3 0,1
Wasser 95,4
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Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben 48 Stunden bei 25 0C auf einem Schüttler inkubiert, der bei 250 Umdrehungen pro Minute durch einen Bogen von 5 cm Durchmesser rotiert.
B. Tankfermentation unter Verwendung von A. nidulans NRRL 8112 zur Erzeugung der antibiotischen Mischung des Antibioticums A-22082 mit anderen in geringen Mengen auftretenden Faktoren
Zur Gewinnung eines großen Volumens Inokulum werden 10 ml des oben beschriebenen inkubierten vegetativen Mediums zum Beimpfen von 200 ml eines Mediums für die vegetative Züchtung mit der gleichen Zusammensetzung wie das vegetative Medium verwendet. Dieses Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 1 Weithals-Erlenmeyer-Kolben 48 Stunden bei 25 0C auf einem Schüttler inkubiert,, der mit 250 Umdrehungen/Minute durch einen Bogen von 5 cm Durchmesser rotiert.
800 ml des wie oben beschrieben hergestellten inkubierten vegetativen Mediums der zweiten Stufe werden zum Inokulieren von 100 1 sterilem Produktionsmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:
Bestandteil Menge (%)
Saccharose 2,0
Maltose 1,0
Malzextrakt 1,0
Melasse 0,5
Maisquellwasser 0,5
Enzymhydrolysat von Casein 0,5
Wasser 94,5
N-Z-Case, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y., V.St.A.
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Nach dem Sterilisieren des Mediums durch 30-minütiges Erwärmen in einem Autoklaven auf 120 0C bei 1 bis 1,4 atü liegt sein pH-Wert bei 7,1. Das beimpfte Produktionsmedium wird in einem 165 1 Fermentationstank 5 Tage bei einer Temperatur von 25 0C der Fermentation überlassen. Während dieser Zeit wird es mit steriler Luft in einem Verhältnis von 0,4 Vol./Vol./Min. belüftet und mit herkömmlichen Geräten bei 250 Umdrehungen/Minute gerührt.
Beispiel2
Abtrennung des antibiotischen Gemischs, das das Antibioticum A-22082 und andere in geringer Menge auftreten Faktoren enthält
200 1 der wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnenen Fermentationsmaische werden unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Super-CeI, eine Diatomeenerde, Johns-Manville Products Corp.) filtriert. Das abgetrennte Mycel wird mit 1OO 1 Methanol extrahiert. Der Methanolextrakt wird im Vakuum auf ein Volumen von etwa 50 Liter eingeengt und dann durch Zugabe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,5 bis 4,0 angesäuert. Die so erhaltene Lösung wird zweimal mit jeweils der Hälfte ihres Volumens entsprechender Chloroformmenge extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und auf ein Volumen von etwa einem Liter eingeengt.
250 ml dieses Chloroformkonzentrats werden zu 100 ml Acetonitril gegeben. Die erhaltene Lösung wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum auf ein Volumen von etwa 150 ml eingeengt. Dieses konzentrierte Filtrat wird auf eine Kieselsäuregelsäule (5,5 χ 54 cm; Kieselsäuregel von Woelm) aufgebracht. Die Säule wird mit AcetonitriliWasser (97 : 3) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml/Minute eluiert, wobei Fraktionen mit einem Volumen von jeweils etwa 10 ml aufgefangen
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werden. Die Elution wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselsäuregel und von Benzol:Methanol (7 : 3) als Lösungsmittelsystem verfolgt. Das Vorhandensein des antibiotisehen Gemischs, das das Antibioticum A-22082 und andere in geringerer Menge auftretende Faktoren enthält, wird durch Bioautographie unter Verwendung von Candida albicans festgestellt. Das antibiotische Gemisch ist in den Fraktionen 136 bis 190 enthalten, die vereinigt und im Vakuum eingedampft werden. Man erhält so 453 mg des antibiotischen Gemischs .
Beispiel 3 Isolierung des Antibioticums A-22082
200 mg des wie in Beispiel 2 beschrieben erhaltenen antibiotischen Gemischs,. das das Antibioticum A-22082 und andere in geringerer Menge auftretende Faktoren enthält, werden in einer Kieselsäuregelsäule (1,5 χ 6,0 cm; Kieselsäuregel von Woelm) chromatographiert. Die Säule wird mit Acetonitril: Wasser (95 : 5) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von
1 ml/Min, eluiert, wobei 5 ml Fraktionen aufgefangen werden. Die Fraktionen werden wie in Beispiel 2 beschrieben geprüft. Die das Antibioticum A-22082 enthaltenden Fraktionen 1 bis 3 werden vereinigt und im Vakuum bis zu einem Öl eingeengt. Dieses Öl wird wiederum in einer Kieselsäuregelsäule (1,5 χ 12 cm; Kieselsäuregel von Woelm) chromatographiert, wobei mit Acetonitril:Wasser (97 : 3) eluiert wird. Die das Antibioticum A-22082 enthaltenden Fraktionen 15 bis 20 werden vereinigt und im Vakuum bis zu einem Öl eingeengt. Dieses öl wird in
2 ml Methanol gelöst, und die Methanollösung wird zu 20 ml Diäthylather gegeben. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wonach 35 mg des Antibioticums A-22082 erhalten werden.
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Jo
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Claims (1)

  1. Patentansprüche
    1. Antibiotisch wirksames Gemisch, enthaltend das Antibioticum A-22082 und andere in geringerer Menge auftretende Faktoren .
    ( 2/ Antibioticum A-22082, gekennzeichnet durch folgende Parameter: weißer amorpher Feststoff, der in Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat und wässrigen Lösungen mit einem pH-Wert von über 7,0 löslich', aber in Diäthyläther und Petroläther unlöslich ist, mit
    a) einem ungefähren Molekulargewicht von 1100, bestimmt durch Massenspektrometrie und Titration,
    b) einer Elementarzusammensetzung von 56,52 % Kohlenstoff, 7,29 % Wasserstoff, 8,68 % Stickstoff und 27,09 % Sauerstoff,
    c) einer empirischen Formel Cj-.,,-.,!!.- 0.JSi7O.. __.. ,
    d) den folgenden Werten der spezifischen Drehung:
    /alpha/ ^5 -44° (c 0,5, CH3OH) /_alpha/3|5-156O (c 0,5, CH3OH),
    e) einem Infrarotabsorptionsspektrum in einer KBr-Scheibe, das folgende charakteristische Absorptionsmaxima zeigt: 2,97 (stark), 3,30 (schwach), 3,36 (Schulter),
    3,39 (mittelstark), 3,47 (schwach), 5,97 (stark),
    6.06 (stark), 6,45 (mittelstark), 6,53 (mittelstark), 6,83 (mittelstark), 7,78 (schwach), 8,00 (schwach),
    9.07 (schwach) und 11,66 (schwach) Mikron,
    709816/1139
    : -QRlGJMAL INSPECTED
    f) Ultraviolettabsorptionsspektren in neutralem und in saurem Methanol mit Absorptionsmaxima bei 225 nm (epsilon 18 000), 275 nm (epsilon 3000) und 284 nm (Schulter, epsilon 2500) und Absorptionsmaxima in basischem Methanol bei 245 nm (epsilon 16 000) und 290 nm (epsilon 3000),
    1 3
    g) einem C magnetischen KernresonanzSpektrum in Perdeutero-
    methanol mit folgenden Charakteristika: delta 176,1, 174,3, 173,4, 172,7, 172,4, 169,8, 158,4, 132,8, 130,9, 129,6, 129,0, 116,2, 77,O, 75,7, 74,4, 71,3, 70,9, 69,6, 68,3, 62,4, 58,7, 56,9, 56,1, 52,9, 39,0, 38,5, 36,8, 35,2, 33,9, 32,9, 32,6, 30,7, 30,4, 30,2, 28,2, 27,0, 26,5, 23,6, 20,1, 19,6, 14,4 und 11,3 ppm,
    h) einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 12,7 in 66-proζentigern wässrigem Dimethylformamid,
    i) einer Aminosäureanalyse nach Hydrolyse, die das Vorhandensein von Threonin, Hydroxyprolin und drei anderen noch nicht identifizierten Aminosäuren anzeigt,
    j) einem R--Wert von 0,35 bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselsäuregel und von Benzol:Methanol (7 : 3) als Lösungsmittelsystem sowie von Candida albicans zur bioautographischen Feststellung,
    k) den folgenden Rf-Werten bei der Papierchromatographie unter Verwndung der im folgenden angegebenen Systeme und von Candida albicans zur bioautographischen Feststellung:
    0 9 8 16/1139
    264348? BRD f
    R —Wert
    f Lösungsmittelsystem
    0,76 mit Wasser gesättigtes Butanol
    0,69 mit Wasser plus 2 % p-Toluolsulfon-
    säure gesättigtes Butanol,
    0,75 Methanol/0,1 η HCl (3:1)
    0,17 Butanol/Äthanol/Wasser (13,5:15:150)
    0,78 Methanol/0,05 m Natriumeitrat vom pH 5,7
    (7:3); Papier gepuffert mit 0,05 m Natriumeitrat vom pH 5,7.
    3. Verfahren zur Herstellung des antibiotisch wirksamen Gemischs nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man
    a) Aspergillus nidulans NRRL 8112 in einem Nährmedium, das assimilierbare, Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen züchtet, bis eine erhebliche antibiotische Aktivität von diesem Organismus in dem Nährmedium erzeugt ist, und
    b) gegebenenfalls das antibiotisch wirksame Gemisch von dem Nährmedium abtrennt und
    c) gegebenenfalls das Antibioticum A-22082 isoliert.
    70 9 816/1139
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