DE2509820A1 - Aculeacin-antibiotika - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Aculeacin-Antibiotika und insbesondere Antibiotika aus der Gruppe der Aculeacine, die gegen pathogene liefe und Pilze aktiv sind.

Us hat sich gezeigt, daß ein zu dem Genus Aspergillus, Stamm Nr. M 4214, gehörender Pilz unbekannte Antibiotika produziert, die gegen Hefen, wie Candida albicans, und gegen Pilze, wie pathogene Pilze, aktiv sind und die als Aculeacine bezeichnet werden.

Der Stamm Aspergillus M 4214 besitzt die folgenden taxonomen Eigenschaften:

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A. Makroskopische Eigenschaften:

1. chapek-Agarmedium:

Wachstum: schnell, Durchmesser 45 - 60 mm bei 26°C in 10 Tagen.

Oberfläche der Kolonie: flach; in einem frühen Stadium der Kultur v/eiß; hellbraun (3 gc) bis graubraun (4 Ii) entsprechend der Bildung von Konidiosporen.

Kolonie: teilweise staubig gelbliche (1 1/2 gc) Konidienköpfe.

Keine Bildung von Screrotium.

Umgebung der Kolonie: geringfügig spinnwebenartig. Rückseite der Kolonie: farblos bis perlrosa (3 ca). Keine Bildung von löslichem Pigment und durchsickerndem Material.
Wachstum bei 37°C: langsam; 10 - 13 mm in 10 Tagen.

2. Malzextrakt-Ägarmedium:

Wachstum: schnell, Durchmesser 70 - 72 mm bei 26 C in

10 Tagen.

Oberfläche der Kolonie: flach; in einem frühen Stadium der Kultur weiß; entsprechend der Bildung von Konidiosporen

dunkelrötlich grau (5 ig).

Konidien: starke Bildung.

Umgebung der Kolonie: mehr oder weniger spinnwebenartig.

Rückseite der Kolonie: hell weizenfarben (2 ea).

Keine Bildung von löslichem Pigment" und durchsickerndem

Material.

Wachstum bei 37°C: langsam, 12 - 14 mm in 10 Tagen.

3. Kartoffel-Glukose-Agarmedium:

Wachstumsgeschwindigkeit und Bedingungen: ähnlich wie

auf dem Malzextrakt-Agar-Medium.

Wachstum bei 37°C: langsam, 12 - 14 mm in 10 Tagen.

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Die Farbangaben beruhen auf der Bezeichnungsweise, die in dem "Color Harmony Manual", Ausgabe 1958, veröffentlicht von der Container Corporation of America, angegeben ist.

B. Mikroskopisches Aussehen:

Der Konidienkopf ist in einem frühen Wachstumszustand sphärisch und wird dann geteilt und nimmt die Form mehrerer Zylinder an. Die Konidophoren besitzen eine Länge von 250 - 1000 ,um, insbesondere eine Länge von 600 - 1000,um. Die Breite beträgt 10 13 ,um. Sie sind hellgelblich braun und besitzen eine glatte und geringfügig dicke Wand. Die Dicke beträgt etwa 1,5 - 2 ,u. Das Visikel ist braun und sphärisch und besitzt einen Durchmesser von 40 - 80 ,um, insbesondere von 5O - 70 ,um. Das Segmatum ist einlinig und besitzt eine Größe von 6 - 8 χ 3 - 4 ,um und ist dicht in Linie angeordnet. Die Konidiosporen sind im allgemeinen subsphärisch oder sphäroid, zeigen unterschiedliche Formen und eine Größe von 3,5 - 5 χ 3 - 3,5 ,um, sind braun gefärbt und zeigen eine rauhe Wandung. Auf dem Chapek-Agarmedium werden zusammen mit den oben beschriebenen Konidiosporen teilweise hell gefärbte, stabförmige Konidiosporen mit den Abmessungen 5 - 7 χ 2 - 3 ,um und starker Wandung gebildet.

C. Wachs tumsbedingungen:

Wachstuns temperatur: 13 - 40⁰C, Wachstums-pll-Wert: 2-9. Optimale Wachstumstemperatur und optimaler pH-Wert: 29 - 31°C, pH-Wert 3-5.

Entsprechend den obigen taxonomen Untersuchungen ist dieser Stamm in die Gruppe der Aspergillus niger einzureihen (vgl. Jap. J. Agricul. Chem., 27 (1953), S. 806-809, und"The genus Aspergillus" (1965), S. 328-331), die schwarz-braune Konidiosporen besitzen. Weiterhin wird diese Gruppe entsprechend dem einlinigen oder doppellinigen Segmatum in zwei Gruppen aufgeteilt. Dieser Stamm gehört zu der einlinigen Gruppe. Bislang

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sind Pilze mit einlinigcm Segmatum als Aspergillus japonicus und Aspergillus aculeatus bekannt geworden, und da die Konidiosporen des Aspergillus japonicus sphärisch oder subsphärisch mit einem Durchmesser von 3 - 5 ,um sind und das Visikel eine Größe von 15 - 45 ,ura, insbesondere 20 - 35 ,um aufweist, und die lionidiosporc des Aspergillus aculeatus subsphärisch oder sphärisch mit den Abmessungen 4,5 - 5 χ 3 - 3,5 ,um sind und das Visikel eine Größe von 30 - 100,um, insbesondere von 60 80,um besitzt, ähnelt dieser Stamm hinsichtlich seiner taxonomen Eigenschaften dem Aspergillus aculeatus. Weiterhin ähneln sich bei einem Vergleich dieser Stamm und der von der American Type Culture Collection erhältliche Stamm Aspergillus aculeatus ATCC 1034, so daß dieser Stamm als Aspergillus aculeatus M4214 bezeichnet wird. Dieser Stamm ist mit der permanenten llinterlegungsnummer FERM-P 2324 bei dem Institute for Industrial Fermentation and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt worden. Weiterhin ist dieser Stamm unter Hin zunähme der Hinterlegungsnummer NRPJj bei dem United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and Development Division, hinterlegt worden.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Aculeacin-Antibiotika, die gegen pathogene Pilze und Hefen aktiv sind, sowie die Schaffung eines industriell vorteilhaften Verfahrens zur Herstellung der Aculeacine.

Weitere Ausführungsformen, Gegenstände und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, den Beispielen und den Zeichnungen. Die Zeichnungen geben dabei folgendes wieder:

Fig. 1 und 2: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-A in Methanol.

Fig. 3 und 4: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-A in methanolischer Kaliumlösung.

Fig. 5: Infrarot-Absorptionsspektrum von Aculeacin-A.

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Fig. 6: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-B in Methanol.

Fig. 7: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-B in 0,01 n-KOH-Lösung in 90%igem Methanol.

Fig. 8: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-C in Methanol.

Fig. 9: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-C in 0,01 n-KOH-Lösung in 90%igem Methanol.

Fig. 10: Ultraviolctt-Absorptionsspektrum von Aculeacin-D in Methanol.

Fig. 11: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-D in 0,01 n-KOII-Lösung in 90%igem Methanol.

Fig. 12: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-E in Methanol.

Fig. 13: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-E in 0,01 n-KOH-Lösung in 90%igem Methanol.

Fig. 14: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-F in Methanol.

Fig. 15: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-F in 0,01 n-KOH-Lösung in 90%igem Methanol.

Fig. 16: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-G in Methanol.

Fig. 17: Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-G in 0,01 n-KOH-Lösung in 90%igem Methanol.

Fig. 18: Infrarot-Absorptionsspektrum von Aculeacin-B.

Fig. 19: Infrarot-Absorptionsspektrum von Aculeacin-C.

Fig. 20: Infrarot-Absorptionsspektrum von Aculeacin-D.

Fig. 21: Infrarot-Absorptionsspektrum von Aculeacin-E.

Fig. 22: Infrarot-Absorptionsspektrum von Aculea.cin-F.

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Fig. 23: Infrarot-Absorptionsspektrum von Aculeacin-G.

Fig. 24: NMR-Spektrum von Aculeacin-B.

Fig. 25:. NMR-Spektrum von Aculeacin-C.

Fig. 26: NMR-Spektrum von'Aculeacin-D.

Fig. 27: NMR-Spektrum von Aculeacin-E.

Fig. 28: NMR-Spektrum von Aculeacin-F.

Fig. 29: NMR-Spektrum von Aculeacin-G.

Fig. 30: Schematische Wiedergabe der Aminosäureanalyse von Aculeacin-B, -C, -D, -E, -F und -G.

Fig. 31: NMR-Spektrum von Aculeacin-S.

Fig. 32: Wiedergabe der Aminosäureanalyse des Chlorwasserstoffsäurehydrolysats von Aculeacin-A.

Fig. 33: Zweidimensionales Dünnschicht-Chromatogramm des Chlorwasserstof fsäurehydrolysats von Aculeacin-A.

Fig. 34: Hochspannungspapierelektrophoresemuster des Chlorwasserstof f säurehydrolysats von Aculeacin-A.

Die Antibiotika der Aculeacingruppe umfassen Aculeacin-A, -B, -C, -D, -E, -F und -G, die durch Züchten von Aspergillus aculeatus M 4214 FERM-P 2324 erhalten werden und die eine starke antifungistische Wirkung besitzen, ein Maximum der Ultraviolett-Lichtabsorption bei 2 77 m,u besitzen und Threonin als Aminosäurebestandteil enthalten. Da die Antibiotika der Aculeacingruppe Peptidantibiotika sind, werden die zu dieser Gruppe gehörenden Antibiotika im folgenden als Aculeacine bezeichnet.

Erfindungsgemäß erhält man die Aculeacine durch Züchten des Stammes Aspergillus aculeatus M 4214 FERi-I-P 2324 in einem geeigneten iJährmedium, wie es für die Antibiotikherstellung üblich ist. Das Züchten der Mikroorganismen kann in unterschiedlicher Weise erfolgen, beispielsweise mit Hilfe einer flüssigen Kultur oder einer festen Kultur. Für die technische Herstellung

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ist eine submerse belüftete Kultur bevorzugt, die mit in 1 bis 2 Tage gezüchteten Sporensuspension von Aspergillus aculeatus M 4214 FERM-P 2324 inokuliert wird.

Die zur Herstellung der Aculeacine geeigneten Nährmedien können eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie Glukose, eine assimilierbare Quelle für organischen und anorganischen Stickstoff, wie Maiswasser, Pepton und Amirioniumsulfat, sowie weiterhin Salze, wie Phosphatsalze, Magnesiumsalze oder Kaliumsalze, enthalten. Die für die Bildung der Aculeacine angewandte Züchtungstemperatur kann innerhalb des Temperaturbereiches verändert v/erden, in dem die Mikroorganismen zu wachsen in der Lage sind und Aculeacine gebildet werden, wobei die Temperatur vorzugsweise zwischen 25 und 23°C liegt.

Die Kulturdauer beträgt im allgemeinen 70 - 90 Stunden, wobei die Züchtung natürlich dann beendet werden sollte, wenn die Kulturbrühe das größte Ausmaß in der Bildung des Antibiotikums zeigt.

In der in dieser Weise erhaltenen Kulturbrühe sind die Aculeacine dem Mycel und teilweise außerhalb des Mycels angereichert.

Die Aculeacine können mit Hilfe der Bechermethode oder der Papiers cheibeniaethode bestimmt v/erden, wobei man als Testorganismen Candida albicans oder Trichophyton asteroides verwendet.

Die Aculeacine können vorzugsweise und in wirksamer Weise von dem Mycel isoliert werden.

Gemäß einer bevorzugten Verfahrensweise wird die gesamte Brühe unter Verwendung eines Trommelfilters, einer Filterpresse oder einer Zentrifuge filtriert, um das die Aculeacine enthaltende Mycel zu gewinnen. Das in dieser Weise erhaltene feuchte Mycel wird mit einem mit T7asser mischbaren organischen Lösungsmittel,

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wie Alkohol oder Aceton, extrahiert; dann wird das Lösungsmittel aus dem Extrakt abdestilliert, der Rückstand mit Wasser verdünnt, das Verdünnungsmittel mit n-Butanol oder Äthylacetat extrahiert und der Extrakt mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man ein öliges Material erhält. Das ölige Material kann durch Absorptions-Chromatographie oder durch Verteilungs-Chromatographie unter Verwendung von aktivem Aluminiumoxid, Siliciumdioxidgel oder dergleichen gereinigt werden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Aculeacine sind die folgenden:

1. Elementaranalyse;

N %

Aculeacin-A	56.38	8.01	9.29
Aculeacin-3	60.52	3.54	9.46
Aculeacin-C	59.04	8.27	9.66
Aculeacin-D	57.95	8.02	8.83
Aculeacin-E	57.46	8.01	9.11
Aculeacin-F	54.81	7.59	9.04
Aculeacin-G	56.08	7.73	8.68

2. Molekulargewicht:

Aculeacin-A Aculeacin-B Aculeacin-C Aculeacin-D Aculeacin—E Aculeacin-F Aculeacin-G

Rastmethode:

1,021

1145 ---' 1206 1133 — 1199 1209 — 1284 1195 ~ 1270 1227 -^ 1287 1255 -^ 1330

Aminosäureanalyse: ⁺

(869)n (54O)n (54O)n (555)n (650)η (565)n (710)n

Berechnet aus der ermittelten Threonin-Menge.

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3. Summenformel:

Aculeacin-B: Aculeacin-C: Aculeacin-D: Aculeacin-E: Aculeacin-F: Aculeacin-G:

4. S chme1ζρunkt:

Aculeacin-A: Aculeacin-B: Aculeacin-C: Aculeacin-D: Aculeacin-E: Aculeacin-F: Aculeacin-G:

164 - 167 C 143 - 151°C 164 - 168°C 159 - 162°C 1S6 - 191°C 163 - 167°C (schmilzt)

166 - 170^uC ( " ) Keine der Substanzen zeigt einen scharfen Scliinelzpunkt.

5. Spezifischer Drehwert:

- -24 (C=LO Methanol)

Aculeacin-A Aculeacin-B Aculeacin-C Aculeacin-D Aculeacin-E Aculeacin-F Aculeacin-G :

-53^U

-45°

-47, 5^C

-46°

-

-55°

-52°

Ergebnis der Bestimmung von [ oc_/^³ (C=O. 53, Methanol)

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2S09820

6. Ültraviolett-Absorptionsspektrum:

Fig. 1: Aculeacin-Λ in Meth-anol (32 4 T/ml) Fig. 2: Aculeacin-Ä in Methanol (32.4 ?Vral) Fig. 3: Acvileacin-Λ in 0,01 n-K0H-90%igem Methanol

(162 r/ml)
Fig. 4: Aculeacin-A in 0,01 n-KOII-90 2 Methanol

(16,2 T/ml)

Fig. 6: Aculeacin-B in Methanol (40 und 400 T/ml) Fig. 7: Aculeacin-B in 0,01 n-KOH-90% Methanol

(36 und 360 //ml)

Fig. 8: Aculeacin-C in Methanol (40 und 400 T/ml) Fig. 10: Aculeacin-D " ( )

Fig. 12: Aculeacin-E " " ( " ) Fig. 14: Aculeacin F " " ( )

Fig. 16: Aculeacin-G " ( )

Fig. 9: Aculeacin-C in 0,01 n-KOH-90 I Methanol

(40 und 400 T/ml)
Fig. 11: Aculeacin D in 0,01 n-KOH-90 % Methanol

(40 und 400 37ml)
Fig. 13: Aculeacin-E in 0,01 n-KOH-90 % Methanol

(40 und 400 T/ml)
Fig. 15: Aculeacin-F in 0,01 n-K0II-90 % Methanol

(40 und 400 T/ml)
Fig. 17: Aculeacin-G in 0,01 n-KOII-90 % Methanol

(40 und 400 f/ml)

Wie aus den Figuren zu ersehen ist, besitzt jede Substanz eine maximale Absorptionsbande bei 277 m,u und Schultern bei 226 und 283 m,u.

1%

Die E, -Werte jeder Substanz sind in der folgenden Tabelle 1 cm

zusammengestellt:

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2b0982O

- Ii -

Tabelle I

in Methanol	277 ni/U (Peak7)	283 m,u (Schulter)	in 0,01 n-KOH-90 ♦% Methanol	295,5 m,u
225 ia/u (Schulter)	15r6	13	247 in,u	21,9
A 145	18,5 (279 m.u)	15,6 (285 m,u)	148	21,6 (297 m.u)
B 144	18,3 (279 m.u)	15,1 . (285 itiyU)	104	2O,O
C 137	17,2 (278 m,u)	14,3 (284 m,u)	100	19,5
D 137	16,0	13,5	100	21,2
E 132	14,5	11,8	120	19,6
F 134	17,4	' 14,7	125	23,0
G 143	115

7. Infrarot-Absorptionsspektrum (XBr- Preßling):

Fig. 5: Aculeacin-Λ

Fig. 18: Aculeacin-B

Fig. 19: Aculeacin-C

Fig. 2O: Aculeacin-D

Fig. 21: Aculeacin-E

Fig. 22: Aculeacin-F

Fig. 23: Aculeacin-F

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8. Kernmagnetisehes Resohanzspektrum:

Die NMR-Spektren der Aculeacine in Deutero-diraethylsulfoxid (DMSO-d6) bei 100 MHz sind in den Fig. 24, 25, 26, 27, 28, 29 und 31 angegeben (innerer Standard: Tetramethylsilan (TMS)).

9. Farbreaktion:

Die Farbreaktionen der Produkte sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt;

Tabelle II

Farbreaktion	Aculoacine	Λ	B	C ID	I	+	E	F	G
+: positiv -; negativ					+	+	+
Pauli-Reaktion	+	+ "	±	-	+		+
Folin-Reaktion	+ ""	+	4-	-	+	+	+
HJO.-Benzidin-Reaktion	+	+	+	-	+	+	+
KMnO.-Entfärbungs-Reaktion	-	-	-	-	-	-	-
Ninhydrin-Reaktion	"-	-	-	-	-	-
Sakaguchi-Reaktion	-	-	-	-	- -	-
Ehrlich-Reaktion	-	-	-	-	-	-
Isatin

10. Löslichkeit;

Löslich in niedrig-molekularem Alkohol, geringfügig löslich in Äthylacetat und Wasser und unlöslich in Aceton, Chloroform, η-Hexan und Petroläther.

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2509320

11. Die Aculeacine werden bei einem alkalischen pll-lvert zersetzt, und sind aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit bei der Elektrophorese nicht beweglich. Die Aculeacine können nicht

in
aus einer Butanollösung"» V/asser mit einem ρϊί-Wert von 2-9 überführt werden, was einen Hinweis auf das neutrale Verhalten der Aculeacine gibt.

12. Farbe: Weisses kristallines Pulver.

13. Rf-Wert:

Trägermaterial: Siliciumdioxidgel-Schicht (Produkt der

Eastman Kodak Co., Eastman chromagram

sheet No. 6060).
Lösungsmittel: A: Äthylacetat/Isopropanol/Wasser (10/2/1).

B: Chloroform/Methanol (10/3).

C: Äthylacetat/Methanol/Wasser (20/4/1).

D: Äthylacetat/n-Butanol (3/1). Entwickler: Jod.

Biologische Wertung unter Verwendung von Candida albicans (lediglich für Aculeacin-A).

Tabelle III

Lösungsmittelsystem: ABCD

Aculeacin-A: 0,47 0,28 0,37

Aculeacin-B: 0,52 0,91

Aculeacin-C: 0,46 0,87

Aculeacin-D: O_#35 0,67

Aculeacin-E: 0,18 O,58

Aculeacin-F: 0,15 0,38

Aculeacin-G: 0,13 0,32

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14. Aminosäure-Zusammensetzung:

Die Aculeacine werden während 20 Std. bei 110°C mit 6 n-HCl hydrolysiert, wonach die eine positive riinhydrinreaktion zeigenden bestandteile mit einem automatischen Aminosäurenanalysator analysiert v/erden. Die Ergebnisse sind in der Fig. 30 (ausgezogene Linie: Absorptionen bei 57O m,u; gestrichelte Linie: Absorptionen bei 440 m ,u), in der folgenden Tabelle und in der Fig. 32 (ausgezogene Linie: Absorptionen bei 440 m/U; gestrichelte Linie: Absorptionen bei 57O m,u) angegeben.

Die zweidimensionale Dünnschichtchromatographie erfolgt mit Hilfe einer Celluloseplatte einer n-Butanol/Essigsäure/ '.-Jasser-Mischung (3/1/1) als Primärentwickler und einer Phenol/Wasser-Iiischung (75/25) als Sekundärentwiqkler. Das Ergebnis der Anfärbung mit Ninhydrin ist in der Fig. 33 wiedergegeben, die L-Threonin und fünf unbekannte Ninhydrinpositive Bestandteile zeigt.

Die Fig. 34 zeigt das Ergebnis der bei 2000 V während 3O Min. (pH-Wert bei 1,8 in einem Aineisensäure/Essigsäure-Puffer) auf Filterpapier (Toyo-Filterpapicr Wr. 51, Produkt der Toyo Roshi Co., Tokio) durchgeführten Papierelektrophorese. Als Kontrollsubstanzen sind L-Threonin und L-Histidin verwendet worden. Ils lassen sich L-Threonin und fünf unbekannte Ninhydrin-positive Bestandteile herstellen.

In den Fig. 33 und 34 werden die folgenden Abkürzungen verwendet :

Vio: violett; Y-G: gelblich grün; Y-O: orangegelb; D-Vio: dunkelviolett; Y: gelb; Or: orange; Thr: L-Threonin und His: L-Histidin.

In den Fig. 32, 33 und 34 sind die Ergebnisse der Hydrolyse von Äculeacin-A wiedergegeben:

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¹ Tabelle IV

CD CO CO

Zeit (Min.)

A .

16

22

37

118

128

132

138

142

146

158

.. 132

256

.29 3

Farbe

B

V

V

V

Y

Y

Y

Y

Y

V

V

Y '

'."..V1;

V

Aminosäure

C

UK

UK

HH „

UK

UK

UK

UK

UK

UK

Thr

Pro

3JK'.

UK

Aculeacine.

D

-

+

+

-

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+

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-

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E

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Tr

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-

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+

-

■ +

Tr

+

I + +

-

+

+

Tr

- .

Abkürzungen:

Farbe: Y - gelD (starke Absorption bei V *= violett (starke Absorption' bei

+ = positiver Peak

- kein Peak

Tr s* Spuronpeak"

UK's unbekannte

m,u), 570 n.xx)

Lis :	17,	5 Minuten
His :	24,	Minuten
Asp :	148	Minuten:
He :	288	Minuten
Leu :	297	Minuten

Bei den Aculcacinen handelt es sich um Peptid-Antibiqtika, die in Wasser wenig löslich sind, wie es die oben angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften zeigen.

Von den bislang bekannten Antibiotika, die in Methanol bei 277 m,u ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum zeigen, ähneln die Antibiotika Myroridin (JA-OS 45-1227G), Athleastatin (JA-OS 41-12668), Monilin (Takeda Institute Annual Report, 14, 8-10 · (1955)), Oryzamycin (JA-OS 33-2800), Saramycetin (Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1961), S. 436-444), Unamycin (J. Antibiotics, Ser. A, 13 (196O), 3. 114-120) und Vengicide (GB-PS 764 19 8) in gewisser Weise den Aculeacinen. Die Aculeacine unterscheiden sich jedoch von diesen Antibiotika wie folgt:

Myroridin ist ein basisches, wasserlösliches Antibiotikum, das sich von den Aculeacinen unterscheidet. Athlestatin ähnelt den Aculeacinen in seinen physikalisch-chemischen Eigenschaften und seinen biologischen Eigenschaften, unterscheidet sich jedoch hinsichtlich seiner Summen formel (C₀₀Uc₀Hc-O₁₀) und seiner Ultra-

OZ bo ο \ Z

violett-Zibsorptionssaaxiina (die bei 278 und 225m,u liegen) von den Zvculeacinen. Monilin ist eine basische iiukleos ids ubs tanz und zeigt bei der Elementaranalyse einen höheren Stickstoffgehalt/als ihn die Aculeacine auf v/eisen. Oryzamycin ist eine saure ölige Substanz. Saramycetin ergibt bei der Hydrolyse Asparaginsäure, Cystin, Glycin und Threonin, während es sich bei Unamycin um eine saure Polyensubstanz handelt. Vengicid ist eine dem ilonilin ähnliche Nukleosidsubstanz.

Wie aus den obigen Ausführungen hervorgeht, handelt es sich bei den Aculeacinen um neue Antibiotika, die sich von den bislang bekannten Antibiotika unterscheiden.

Die biologischen Eigenschaften der Aculeacine sind die folgenden :

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1. Aktivität gegen Bakterien:

Die Untersuchung erfolgt auf Glucose-Bouillon-Agar bei 37 C während 18 Stunden. Es zeigt sich fast keine Aktivität gegen Bakterien wie Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Sarcina lutea oder dergleichen.

2. x^ktivität gegen lief en:

Die Untersuchuna erfolgt auf Sabroud-Agar bei 30°C während 48 Stunden. Die Ergebnisse dieser Untersuchung in Form der minimalen inhibierenden Konzentration sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

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Tabelle V

	Candida krusei	Λ	Aculeacine	B	C	D	E	noo	>1OO	F	G	-
Testorganismen	Candida parakrusei	0.2	0.8	0.2	0.05	6.3			0.4	0.4
Candida albicans 1	Candida tropicalis	<0.1	0.4	0.1	0.025	3.2		0.2	0.2
CNJ	Candida pseudotropi- calis	<0.1	0.4	0.1	0.025	3.2	0.2	0.2
Il Il O	Saccharonvces cere- visiae	0.2	0.4	0.1	0.05	3.2	0.4	0.2
4	Saccharomyces sake	1.6	0.4	0.1	0.05	3.2	0.2	0.1
Ii Ii r	Mycotorula japonica	<-0.1	0.4	0.1	0.05	3.2	0.2	0.1
6	Torula utilis	0.8	1.6	0.4	0.1	3.2	0.8	0.4
Cryptococcus neo- formans	3.2	6.3	1.6	0.4	50	3.2	3.2
Candida albicans 7 Il Il O Candida guilliermon- dii Candida pulcherrima	>100	>100	>100	>100	>100	>100	>100
	0.8	6.3	3.2	0.4	50	6.3	6.3
1.6	3.2	1.6	0.2	25	3.2	3.2
1.6	6.3	3.2	0.4	>100	6.3	6.3
<0.1	0.2	0.05	0.02 5	0.8	0.1	0.1
<0.1	0.05		0.0125 0.0063 0.2	0.05	0.05
>100	>100	>100	>100	>100
3.2 0.1 0.8 0.2

ο to co

2509320

3. Wirkung gegen Pilze:

Da die Aculeacine keine fungizide Wirkung besitzen, werden Fungi in Sabroud-Agar-Medium inokuliert, das die Aculeacine in unterschiedlicher Konzentration enthält, und während 7 bis 14 Tagen bei 26°C inkubiert. Die 80 %-Wachstumsinhibierungskonzentration der Aculeacine v/ird durch das Verhältnis der Fläche der Riesenkolonie und Fläche der Kontrollkolonie, die ohne Zusatz von Aculeacinen gezüchtet wurde, bestimmt.

I. 80 ^-Wachstumsinhibierungskonzentration (7VmI) von Aculeacin-A.

i) Derinatopathogene Pilze:

Trichophyton asteroides 0.004

Trichophyton rubrum 0.006

Microsporum gypseum 0.008 ii) Phytopathogene Pilze:

Fusarium oxysporum f. lini 2.O

Cercospora kikuchii 4.0 :

Corynespora cassicola 2.0

Diaporthe phaseolorum 0.01

Sclerotium bataticola 0.08

Ascochyta soyaecola 0.08

Collectotrichum linicolum 0.4

Glomerella cingulata 0.06

Helrainthosporium oryzae 0.008

II. 80 %-Wachstumsinhibierungskonzentration von Aculeacinen.

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Aspergillus fumigatus er Μ)	Tri chophyton asteroides (T/ml)
7.0. .	0.04 - ·
0.7	0.01
0.4	0.005
2.0	0.003
0.6	0.003
0.7	0,005
0.5	0.004

Aculeacin-B Aculeacin-C Aculeacin-D Aculeacin-E Aculeacin-F Aculeacin-G Aculeacin-A

4. Akute Toxizität bei der Maus:

Die Aculeacine sind in Wasser praktisch unlöslich, jedoch in l%iger Natriumcarboxymethylcelluloselösung (CMC) und riatriumdeoxycholat (DOC) löslich. Die LD₁^_n des unter Verwendung dieser Additive bereiteten Aculeacin-A-Präparats ist die folgende:

Verabreichungsweg . ^LD5q (^m9/^k9)

i.p. 600 (CMC)

i.m. 600 (DOC), >346O (CMC)

i.V. 350 (DOC)

p.o. >3000 (CMC)

Die in Klammern angegebenen Abkürzungen stehen für die verwendeten Additive.

Die intraperitoneale Verabreichung der in einer 0,5%igen Carboxymethylcelluloselösung suspendierten Aculeacine in einer Dosis von 300 mg/kg an Mäuse führt zu folgenden Ergebnissen. Es werden männliche Mäuse des Stamms ddy mit einem Gewicht von 20 g verwendet, die jeweils in Gruppen zu vier Tieren eingesetzt werden.

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	Tabelle VI	der toten Tiere nach 4 8 Std.	* nach 72 Std.
	Anzahl nach 24 5ta.	O	O
Aculeacin-B	O	O	O
Aculeacin-C	O	O	O
Aculeacin-D	O	O	O
Aculeacin-E	O	O	O
Aculeacin-F	O	O	O
Aculeacin-G	1

5. Experimenteller chemotherapeutische Effekt an der Maus:

Mit stark pathogener Candida albicans infizierte Mäuse v/erden mit Aculeacin-A behandelt. Die die Wirkung der Behandlung wiedergebenden Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Tabelle VII

Infektionsweg Verabreichungsweg

ED₅₀ (mg/kg)

i.p.
i.p.
i.v.
i.V.

x.p. i.m. p.o. i.p. i.m.

2.0
18.0

1460 χ 2
16.0 χ 2 24.0 χ 2

Die folgenden Beispiele dienen der v/eiteren Erläuterung der Erfindung.

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Beispiel 1

Man teilt 1 Liter eines wäßrigen Mediums, das 2 % Glucose, 1 % Polypepton, 1 % Maiswasser, 0,2 % KH₂PO₄ und 0,1 % MgSO₄ enthält, in gleiche Mengen auf und führt es in zehn 500 ml-Erlenmeyerkolben ein (pH-Wert bei 6,5) und sterilisiert während 15 Minuten bei 120 G. Dann impft man mit Aspergillus aculeatus M 4214 FERM-P 2324 an und züchtet unter Schütteln während 48 Stunden bei 26°C.Mit der Kulturbrühe werden ISO 1 eines sterilisierten Mediums der gleichen Zusammensetzung wie der oben angegebenen, das in einem 250 1-Tank vorliegt, angeimpft, dann wird die Kultur während 15 Stunden bei 26⁰C unter Rühren (25O UpM) submers unter Belüften mit 180 l/Min, gezüchtet. Dann werden mit 60 1 der Kulturbrühe 2200 1 des Mediums (pH-Wert = 6,5), das 1,5 % Saccharose, 1,4 % Dextrin, 2 % Polypepton, 0,45 % Maiswasser, 0,2 I KII₂PO₄, 0,1 % TIgSO₄ und 0,1 % Antischaummittel enthält und in einem Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen von 2500 1 vorliegt, aseptisch angeimpft und während 9O Std. bei 26⁰C unter Belüften mit 1100 l/Min, und Rühren mit 200 UpM fermentiert, wobei man 2000 1 einer Fermentationsbrühe erhält. Die ßrühe enthält die Aculeacine in dem Filtrat in einer Menge von 22 T/ml und in dem Mycel in einer Menge von 180 T/ml.

Beispiel 2

Man zentrifugiert die gemäß Beispiel 1 erhaltenen 2000 1 Kulturbrühe und erhält 130 kg feuchtes Mycel. Das feuchte Mycel wird zu 400 1 Methanol zugesetzt und unter Rühren während 13 Std. extrahiert, wobei man nach dem Abzentrifugieren 435 1 einer Methanollösung erhält. Das restliche Mycel wird erneut mit 200 1 Methanol extrahiert, wobei man 185 1 des Methanolextrakts erhält. Die beiden Extrakte (die 265 g Aculeacine enthalten) werden vereinigt, wonach das Methanol unter vermindertem Druck abdestilliert wird und 50 1 eines Konzentrats zurückbleiben.

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Man versetzt das Konzentrat mit 50 1 Wasser und extrahiert zweimal mit jeweils 50 1 n~Butanol. Die n-Butanolschicht (die 201 g Aculeacin enthält) wird abgetrennt. Dann wird die n-Butanolschicht mit Wasser gewaschen und unter Zugabe einer geringen* Menge auf 22 1 eingeengt. Man setzt 550 g Aktivkohle zu, filtert, engt im Vakuum ein und erhält 5 1 eines dunkelbraun gefärbten viskosen Konzentrats. Das Konzentrat wird auf eine mit aktivem Aluminiumoxid (10 1) gefüllte Säule aufgebracht. Die Säule wird mit 20 1 Äthylacetat gewaschen und dann mit Äthanol eluiert, wobei jeweils 5 1-Fraktionen aufgefangen werden. Die als aktiv bewerteten Fraktionen Ur. 3 - 13 werden vereinigt und mit 100 g Aktivkohle behandelt. Iiach der.Abtrennung der Aktivkohle wird das Filtrat auf 500 ml eingeengt (wobei man eine ölige Substanz erhält). Diese ölige Substanz wird auf eine mit (15 1) Kieselsäure (Silicagel) gefüllte und mit einer Äthylacetat/Methanol-Mischung (10/1) gepackte Säule aufgebracht und mit dem gleichen Lösungsmittel (40 1) entwickelt, um die Fettverunreinigunqen zu entfernen. Anschließend werden mit einer Äthylacetat/Methanol-Mischung (5/1) jeweils 2 1-Fraktionen eluiert, die von den Fraktionen Nr. 3-15 aufgefangen werden. Die aufgefangenen Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum zu einem gelblichen Pulver eingeengt (51 g). Das Pulver wird in 200 ml Methanol gelöst und nach und nach mit einem Liter einer Äthylacetat/n-Hexan-Mischung (1/1) versetzt, um die Aculeacine auszufällen, die abfiltriert und im Vakuum getrocknet v/erden, wobei man 41 g eines weißen Pulvers (Reinheit = 68 %) erhält.

Beispiel 3

Man löst 1,7 g der gemäß Beispiel 2 erhaltenen rohen Aculeacine in 5 ml n-Butanol und trägt die Lösung auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule, die mit einer mit Wasser gesättigten Äthylacetat/n-Butanol-Lösungsmittelmischung (4/1) gepackt ist. Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert, wobei jeweils 10 g Fraktionen aufgefangen werden. Die Fraktionen v/erden biologisch und dünnschichtchromatographisch bewertet, wo-

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bei sich die Aktivität in den Fraktionen iir. 33 - 55 zeigt. Durch Eindampfen im Vakuum zur Trockene erhält man 629 mg eines weißen Pulvers. Das Pulver wird v/eiter dadurch gereinigt, daß man es in 50 ml n-Butanol löst, dreimal nit jeweils 10 ml destilliertem Wasser wäscht und im Vakuum trocken eindampft, Man erhält 577 mg gereinigtes Aculeacin-Λ.

Beispiel 4

Man wiederholt die in Beispiel 1 beschriebenen Fermentationsmaßnahmen dreimal, so daß man 5600 1 Kulturbrühe erhält. Diese Brühe wird zentrifugiert, wobei man 4 50 kg feuchtes Mycel erhält. Man versetzt das Mycel mit 1200 1 Methanol, extrahiert während 20 Std. unter Rühren und zentrifugiert, wobei man 1300 1 des Methanolextrakts erhält. Das Mycel wird erneut mit 1000 1 Methanol extrahiert, wonach man 850 1 dieses Extrakts mit dem ersten Extrakt vereinigt und im Vakuum auf 150 1 einengt. Den Rückstand versetzt man mit 150 1 -fässer und extrahiert dann mit 150 1 n-Butanol. Man versetzt die abgetrennte n-Butanol-Schicht mit 2 kg Aktivkohle und engt die entfärbte Lösung durch azeotrope Destillation ein, v/obei man 6 1 eines dunkelbräunlichen viskosen Konzentrats erhält. Man versetzt es mit 40 1 η-Hexan, zentrifugiert den Niederschlag ab, wäscht ihn mit n-IIexan und erhält die rohen Aculeacine in Form eines dunkelbräunlichen Pulvers (847 g). Nach dem Waschen mit 3 1 Äthylacetat löst man dieses rohe Pulver in 1 Liter Methanol, gibt unter Rühren 10 1 Äthylacetat zu, fällt das Material aus und zentrifugiert es ab. Wach dem Waschen mit Äthylacetat wird das Pulver im Vakuum getrocknet und ergibt die rohen Aculeacine in Form eines hellbraunen Pulver (369 g).

Beispiel 5

Man löst 123 g der in Beispiel 4 erhaltenen pulverförmiger rohen Aculeacinc in 200 ml n-Butanol und trägt die Lösung auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule auf, die mit einer Äthylacetat/ n-Butanol/Wasser-Lösungsmittelmischung (10/2/1) gepackt ist und entwickelt mit der gleichen Lösungsmittelmischung. Jede 1 1-

B 0 9886/1019

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Fraktion wird biologisch und dünnschichtchromatographisch analysiert. Die Fraktionen Nr. 4 - ITr. 25, die Aculeacin-B, -C und -D enthalten (Fraktion I), die vor dem Aculeacin-A eluiert werden, und die nach dem Aculeacin-A eluierten Fraktio-* iien IJr. 44 - 60, die Aculeacin-E, -F und -G enthalten (Fraktio-II),werden aufgefangen und im Vakuum eingeengt, ilan erhält die Fraktion I (23,4 g) und die Fraktion II (5,7 g) in Form von Pulvern. Das in Beispiel 4 erhaltene restliche, rohe, pulverförmige Material wird in gleicher Weise behandelt und ergibt die Pulver der Fraktion I (70 g) und der Fraktion II (17 g).

Beispiel 6

Man löst das gemäß Beispiel 5 erhaltene Pulver der Fraktion I (70 g) in 100 ml Isopropanol und trägt die Lösung auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule, die mit einer Λthylacetat/Isopropanol/ Uasser-Lösunasmittelmischung (10/1/0,5) gepackt ist, auf und entwickelt mit dem gleichen Lösungsmittel. Jede der 500 ml-Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch untersucht, und es v/erden die Fraktionen Nr. 22 - 39 aufgefangen. Die vereinigten Fraktionen werden im Vakuum eingeengt und ergeben die gereinigte Fraktion I (14,5 g).

Das Pulver wird in 15 ml Methanol gelöst und auf eine Säule aufgetragen, die mit Kieselgel gefüllt und mit einer Chloroform/ Methanol-Mischung (10/1) gepackt ist, worauf mit dem gleichen Lösungsmittel entwiekelt wird, ilan fängt jeweils 20 g-Fraktionen auf.

Die Aculeacin-B enthaltenden Fraktionen Mr. 275 - 31O werden aufgefangen und im Vakuum mit einem weißen Pulver eingeengt. (495 mg) . Man erhält das gereinigte pulverförrriige Aculeacin-B (447 mg) durch /auflösen des Materials in 40 ml n-Butanol, zweimaliges Waschen mit 10 ml Wasser und Einengen.

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Durch Sammeln und L'inengen der Fraktionen Ur. 311 - 340 erhält man eine Mischung aus Aculeacin-B und -C (1050 ng).

Die Fraktionen IJr. 341 - 365 v/erden eingeengt und ergeben pulverförmiges Aculeacin-C (995 mg). Das Pulver wird in 4 ml Isopropanol gelöst und auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule, die mit einer Xthylacetat/Isopropanol/Vvasser-riischung (10/1/0,5) gepackt ist, aufgetragen und dann mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt. Die jeweils 20 g umfassenden Fraktionen 24r. 46 enthalten Aculeacin-C. Die Fraktionen werden aufgefangen und im Vakuum eingeengt, wobei man ein weiteres Pulver (61O mg) erhält. Man erhält das pulverförmige gereinigte Aculoacin-C (522 Kig) durch Auflösen des Materials in 40 ml n-Butanol und zweimaliges Waschen der Lösung mit Uasser.

Die Fraktionen Ur. 531 - 625 werden aufgefangen und im Vakuum eingeengt, wobei man pulverförmiges Aculeacin-D (1200 mg)erhält. Das Pulver wird in 5 ml Isonropanol gelöst und auf eine Säule aufgetragen, die mit Kieselgel gefüllt und mit einer Äthylacetat/Isopropanol/VJasser-?lischung (10/1/0, 5) gepackt ist. Die Entwicklung erfolgt mit dem gleichen Lösungsmittel, wobei Fraktionen von jeweils 20 g aufgefangen v/erden. Die Aculeacin-D enthaltenden Fraktionen Nr. 70 - 120 v/erden gesammelt und im Vakuum eingeengt und ergeben 355 mg eines weißen Pulvers. Das Pulver wird durch Auflösen in 40 ml n-Butanol und VJaschen mit Wasser gereinigt. Man erholt 313 mg gereinigtes, pulverförmiges Aculeacin-D.

Beispiel 7

Man löst 17 g des in Beispiel 5 erhaltenen Pulvers der Fraktion II in 40 ml n-Butanol und trägt die Lösung auf eine mit Kieselgel gefüllte und mit einer Äthylacetat/n-Butanol/Wasser-Mischung (10/2/1) gepackte Säule auf. Das Entwickeln erfolgt

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mit dein gleichen Lösungsmittel. Es werden jeweils 500 ml-Fraktionen aufgefangen und analysiert.

Die Fraktionell IJr. 17 - 23 enthalten Aculeacin-E und -F, während die Fraktionen Nr. 24 - 31 Aculeaein-0 enthalten. Die Fraktionen v/erden aufgefangen und behandelt, wobei nan eine Aculeacin-E und -F (31 mg) enthaltende Pulvennischung und ein rohes Aculeacin-G enthaltendes Pulver (SOO mg) erhält.

Die obige Mischung aus Aculeacin-E und -F wird in G ml Methanol gelöst, auf eine mit Kieselgel beschickte und mit einer Chloroform/Methanol-Mischung (10/2) gepackte Säule aufgetragen und mit dem gleichen Lösungsmittel entv7icke.lt, wobei Fraktionen von jeweils 20 g aufgefangen werden. Die Fraktionen Nr. 135 - 175 enthalten Aculeacin-E und ergeben 175 mg des weißen Pulvers. Dieses Pulver wird in 20 ml n-Butanol gelöst, zweimal mit jeweils 5 ml Wasser gewaschen und im Vakuuri eingeengt und ergibt gereinigtes, pulverförmiges Aculeacin-E (155 mg).

Die Fraktionen Nr. 241 - 320 enthalten Aculeacin-F, Durch Einengen erhält man 903 mg eines weißen Pulvers. Man erhält das gereinigte Aculeacin-F in Form eines weißen Pulvers (872 mg). Das rohe, pulverförmige Aculeacin-G wird durch Auflösen in 3 ml Methanol und Chromatographieren über einer mit Kieselgel gefüllten Säule mit Hilfe einer Chloroform/Methanol-Mischung (10/2) gereinigt. Die 20 g-Fraktionen Nr. 181 - 240 enthalten Aculeacin-G. Durch Einengen erhält man 403 mg eines weißen Pulvers. Dieses Pulver wird in der oben angegebenen Weise gereinigt und ergibt gereinigtes, pulverförmicjes Aculeacin-G (334 mg).

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Claims (8)

1. - 26 - ■.

   PATENTANSPRÜCHE

   ; 1, Antifungistisches Antibioticum Aculeacin, ausgewählt aus ^' der Aculeacin-χΛ., Aculeacin-B, Aculeacin-C, Aculeacin-D,

   Aculeacin-E, Aculeacin-F und Aculeacin-G umfassenden Gruppe.
2. 2. Aculeacin-Ä.
3. 3. Aculeacin-E.
4. 4. Aculeacin-C-
5. 5. Aculeacin-D.
6. 6. Aculeacin-E-
7. 7. Aculeacin—F,
8. 8. Aculeacin-G.

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