CN103130533B - 可防除辣椒疫病和辣椒炭疽病的蛋鸡粪有机肥的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及辣椒疫病和辣椒炭疽病的生物防治菌株及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了对辣椒疫病和辣椒炭疽病有显著生物防治作用的棘孢曲霉和皮落青霉，利用该生物防治组合菌株与蛋鸡粪堆肥制成微生物有机肥料，肥料中含有1×106cfu/g个以上菌株，所得蛋鸡粪有机肥的有机质含量>45%，氮含量>0.7%，五氧化二磷含量>1.8%，氧化钾含量>4.5%，总养分含量>7.4%，含水量＜30%，种子发芽指数80%以上。试验表明，在辣椒盆栽试验中，施本产品的试验组比未施肥的对照组其株高可高12-25%，防治辣椒疫病的效率达到30%以上。
Description
技术领域
本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及可防除辣椒疫病和辣椒炭疽病的微生物有机肥料的生产方法。
背景技术
土传病害是以土壤为媒介进行传播的植物病害的统称。我国土传病害种类很多，在节能温室中栽培的瓜类、茄果类、豆类等蔬菜已经发现的病害有100多种，经常发生、危害比较严重的有50余种。在温室中发生最为普遍、危害最为严重的有灰霉病、疫病、白粉病、根腐病、枯萎病、菌核病、蔓枯病、苗期猝倒病、立枯病和多种细菌性病害等。植物土传病原通常侵染植物根部，引起作物根部乃至全株发病，可造成重大的经济损失。辣椒疫病和辣椒炭疽病均为土传病害，在辣椒的种植业中危害严重。土传病害以其危害的广泛性和严重度已引起国内外同行的关注。几十年来国内外广大科研人员在化学防治、抗病品种和生物防治方面做了大量的研究工作，由于化学防治和抗病品种目前只对少数土传病害有效，对大多数病害防效甚微，且使用化学农药还会造成农药残留，环境污染，产生抗药性等不利因素，而生物防治由于克服了化学防治的上述弊病，且研究和实践已证明其对部分土传病害经济有效，越来越受到人们的重视。
随着畜禽养殖业规模化、集约化发展，我国畜禽废弃总量正呈逐年增长的态势，当前我国蛋鸡存栏量已达15亿只，年产鸡粪4320万吨左右，如此巨大的排污量必须得采取有效的处理措施方能减轻其对环境的压力。蛋鸡粪中C含量26.59-30.40％，H含量3.53-3.62％，O含量20.79-23％，N含量1.81-1.85％，S含量0.42-0.45％，其大量的有机物及丰富的氮、磷、钾等营养物质可被再循环利用。将蛋鸡粪制成有机肥是比较常用的处理方式，将农作物秸秆和蛋鸡粪堆制成有机肥，不仅可以变废为宝，同时可有效减少蛋鸡养殖业对环境造成的污染，减少蛋鸡场疾病的发生。同时若在蛋鸡粪有机肥生产过程中添加具有生物防治效果的微生物，使得有机肥除了含有较高的有机质外，还含有可防治土传病害的生防菌，既能够提高土壤肥力，改良土壤，保护生态环境，提高作物产量和品质，又能拮抗作物的土传病害，对于促进农业良性循环和可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于研制一种可防除辣椒疫病和辣椒炭疽病的微生物有机肥料，盆栽防治辣椒疫病的效率达到30％以上，可有效减少农田病害产生，确保集约化农业的顺利发展。
本发明的具体技术解决方案如下：
本发明所用棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号分别为CGMCC No.6799，保藏日期2012年11月09日；所用皮落青霉(Penicillium crustosum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC No.6800，保藏日期2012年11月09日。
所述蛋鸡粪有机肥的具体生产操作步骤如下：
(1)将棘孢曲霉菌种接种到PDA固体平板培养基中，25℃培养5天，产生孢子，用无菌水将孢子洗脱，用血球计数板进行孢子计数，稀释至1×104cfu/ml，以1.5％的接种量接入产孢子固体培养基中，连续黑暗培养5天孢子数可达5.6×108cfu/g，得到棘孢曲霉的产孢子固体培养物；所述棘孢曲霉的产孢子固体培养基由大米和营养液组成，两者按10：7混合均匀；所述营养液由15g磷酸氢二钾和5g的硫酸镁溶于1L水制成；
(2)将皮落青霉菌种接种到PDA固体平板培养基中，25℃培养5天，产生孢子，用无菌水将孢子洗脱，用血球计数板进行孢子计数，稀释至1×104cfu/ml，以0.5％的接种量接入产孢子固体培养基中，采用自然光照培养5天孢子数可达7.5×109cfu/g，得到皮落青霉的产孢子固体培养物；所述皮落青霉的产孢子固体培养基由麸皮85g、稻壳15g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.45g、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.225g和水90ml混合均匀混匀制成，121℃灭菌20分钟；
(3)将棘孢曲霉的产孢子固体培养物和皮落青霉的产孢子固体培养物以1：1混合均匀，得到有机肥菌种；
(4)按2.3～3.5：1的比例将主料和辅料进行堆肥，首先将主料和辅料混合均匀，堆成三角的堆体，堆体的水份为55％～65％，堆体的碳氮比为13:1～30:1；所述主料为水分含量为65％～78％的蛋鸡粪，所述辅料为水分含量为15％～30％的锯末或者水分含量为8％～12％的稻壳或其它农作物秸秆；每周翻动堆体一次，每日测量堆体的温度，一次堆肥18～28天，当堆体经过高温期温度降至40℃时，按0.5％的接种量接入有机肥菌种；二次发酵7～15天，使得棘孢曲霉和皮落青霉在堆肥中的菌落形成单位含量达到1×106cfu/g个以上，即获得蛋鸡粪有机肥；所得蛋鸡粪有机肥的发芽指数80％以上，有机质含量>45％，氮含量>0.7％，五氧化二磷含量>1.8％，氧化钾含量>4.5％，总养分含量>7.4％，含水量＜30％。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1.本发明生产得到蛋鸡粪有机肥中含有抑制于辣椒炭疽病和辣椒疫病土传病害生长的菌株，其抑制效果非常显著。试验结果表明，在平板对峙试验中，棘孢曲霉对辣椒炭疽病的抑制率为81.5％、对辣椒疫病的抑制率为64％；皮落青霉对辣椒炭疽病的抑制率为88.6％、对辣椒疫病的抑制率为71.2％；
2.本发明生产得到生物有机肥，含有丰富的有机质46-50％，总养分含量可达7.4-8.5％，使用本产品后能有效促进植株生长，在盆栽实验中，施本产品的试验组株高比未施肥的对照组高12-25％，且生物有机肥料中含有的丰富营养也为其中的生物防治菌株提供了生长繁殖的条件，在二次发酵过程中，使得生防菌株成为肥料中的优势菌株，在施入土壤后，生防菌更具有适应性，能较快地在土壤中定殖且发挥防病的作用，施入了该生防有机肥的处理组比仅施有机肥的对照组其发病率至少可降低30％；
3.由于本发明生产得到的产品具有生物防治的作用，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于农作物的无公害生产，农民可以不用或者减少化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于农产品的质量。同时，该微生物肥料还有增产功能，可为农民增加收入。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步地说明。
实施例1
(一)棘孢曲霉菌株和皮落青霉菌株的分离和鉴定
从①蛋鸡粪(新鲜)，②蛋鸡粪(堆放)③兔粪，④稻草堆及周边泥土，⑤杂草堆及周边泥土，⑥油菜根际泥土等环境中用PDA培养基共分离出170株真菌，首先将各分离菌与辣椒炭疽病的病原辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)进行平板对峙试验，通过初筛、复筛最终选出7株较高抑制率的真菌，再以辣椒疫霉(Phytophthora capsici)为指示菌观察复筛菌的抑菌谱，其中TCC53对辣椒炭疽病的抑制率为81.5％、对辣椒疫病的抑制率为64％，TCC157对辣椒炭疽病和辣椒疫病的抑菌率分别可达88.6％和71.2％。然后将复筛菌分别置于30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃培养，进行耐温试验，试验表明该两株菌均可在40℃以上生长。
通过形态学观察，TCC53菌落呈绒毛状，白色营养菌丝体发达，有褐色孢子产生，分生孢子梗大都无横隔，梗的顶端膨大形成半球形，从每个小梗的顶端相继生出一串分生孢子；TCC157菌落中心绿色，边缘白色，毛绒状，背面黄色；营养菌丝似根状，有隔；分生孢子梗较短。据菌落形态及镜检结果，参照真菌鉴定手册初步确定TCC53为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，TCC157为皮落青霉(Penicillium crustosum)。
将TCC53及TCC157用引物从菌株扩增出的目的片段，并对其PCR扩增产物进行了序列测定，分别将该菌株的ITS序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比较(BLAST)，发现TCC53与棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，TCC157与皮落青霉(Penicillium crustosum)高度相似，其同源性均达到100％。结合形态学结果，将TCC53鉴定为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，TCC157鉴定为皮落青霉(Penicilliumcrustosum)。
棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号分别为CGMCC No.6799，保藏日期2012年11月09日；皮落青霉(Penicillium crustosum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC No.6800，保藏日期2012年11月09日。
(二)有机肥菌种的具体生产操作步骤如下：
1)将棘孢曲霉菌种接种到PDA固体平板培养基中，25℃培养5天，产生孢子，用无菌水将孢子洗脱，用血球计数板进行孢子计数，稀释至1×104cfu/ml，以1.5％的接种量接入产孢子固体培养基中，连续黑暗培养5天孢子数可达5.64X108cfu/g，得到棘孢曲霉的产孢子固体培养物；所述棘孢曲霉的产孢子固体培养基由大米和营养液组成，两者按10：7混合均匀；所述营养液由15g磷酸氢二钾(K2HPO4)和5g的七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶于1L水制成；
2)将皮落青霉菌种接种到PDA固体平板培养基中，25℃培养5天，产生孢子，用无菌水将孢子洗脱，用血球计数板进行孢子计数，稀释至1×104cfu/ml，以0.5％的接种量接入产孢子固体培养基中，采用自然光照培养5天孢子数可达7.5X109cfu/g，得到皮落青霉的产孢子固体培养物；所述皮落青霉的产孢子固体培养基由麸皮85g、稻壳15g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.45g、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.225g和水90ml混合均匀制成，121℃灭菌20分钟；
3)将棘孢曲霉的产孢子固体培养物和皮落青霉的产孢子固体培养物以1：1混合均匀，得到有机肥菌种。
三)蛋鸡粪有机肥的生产
以水分含量在71.07％的蛋鸡粪210kg为主料，以水分含量在15.6％的锯末90kg混合(配比为2.33：1)，将混合物堆成三角堆体，每周翻动堆体一次，每日测量堆体的温度，一次发酵25天，当堆体经过高温期后温度降至40℃时按0.5％的接种量接入有机肥菌种，二次发酵7天，使得棘孢曲霉和皮落青霉在堆肥中的菌落形成单位含量达到1×106cfu/g个以上，即获得蛋鸡粪有机肥；所得的蛋鸡粪有机肥发芽指数达81.5％，有机质含量49.85％，氮含量0.74％，五氧化二磷含量为1.91％，氧化钾含量为4.78％，总养分含量为7.43％，含水量29.67％。
实施例2
以水分含量在71.07％的蛋鸡粪220kg为主料，以水分含量在15.6％的锯末80kg为辅料混合(配比为2.74：1)，将混合物堆成三角堆体，每周翻动堆体一次，每日测量堆体的温度，一次发酵20天，当堆体经过高温期后温度降至40℃时按0.5％的接种量接入有机肥菌种，二次发酵10天，使得棘孢曲霉和皮落青霉在堆肥中的菌落形成单位含量达到1×106cfu/g个以上，即获得蛋鸡粪有机肥；所得的蛋鸡粪有机肥发芽指数达84.5％，有机质含量50.05％，氮含量0.94％，五氧化二磷含量为1.86％，氧化钾含量为5.11％，总养分含量为7.91％，含水量27.71％。
有机肥菌种的具体生产操作步骤同实施例1。
实施例3
以水分含量在71.07％的蛋鸡粪230kg为主料，以水分含量在11.2％的稻壳70kg为辅料混合(配比为3.28：1)，将混合物堆成三角堆体，每周翻堆一次，每日测量堆体的温度，一次发酵19天，当堆体经过高温期后温度降至40℃时按0.5％的接种量接入有机肥菌种，二次发酵10天，使得棘孢曲霉和皮落青霉在堆肥中的菌落形成单位含量达到1×106cfu/g以上，即获得蛋鸡粪有机肥；所得的蛋鸡粪生防有机肥发芽指数达84.5％，有机质含量46.94％，氮含量1.25％，五氧化二磷含量为2.67％，氧化钾含量为4.58％，总养分含量为8.5％，含水量22.41％。
有机肥菌种的具体生产操作步骤同实施例1。
实施例4
以水分含量在71.07％的蛋鸡粪220kg为主料，以水分含量在11.2％的稻壳80kg为辅料混合(配比为2.75：1)，将混合物堆成三角堆体，每周翻堆一次，每日测量堆体的温度，一次发酵23天，当堆体经过高温期后温度降至40℃时按0.5％的接种量接入有机肥菌种，二次发酵15天，使得棘孢曲霉和皮落青霉在堆肥中的菌落形成单位含量达到1×106cfu/g以上，即获得蛋鸡粪有机肥；所得的蛋鸡粪有机肥发芽指数达88.5％，有机质含量47.55％，氮含量1.17％，五氧化二磷含量为2.38％，氧化钾含量为4.73％，总养分含量为8.28％，含水量23.71％。
有机肥菌种的具体生产操作步骤同实施例1。
Claims (1)
1.可防除辣椒疫病和辣椒炭疽病的蛋鸡粪有机肥的生产方法，其特征在于：所用棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号分别为CGMCC No.6799，保藏日期2012年11月09日；所用皮落青霉（Penicilliumcrustosum），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCCNo.6800，保藏日期2012年11月09日；
所述蛋鸡粪有机肥的具体生产操作步骤如下：
（1）将棘孢曲霉菌种接种到PDA固体平板培养基中，25℃培养5天，产生孢子，用无菌水将孢子洗脱，用血球计数板进行孢子计数，稀释至1×104cfu/ml，以1.5%的接种量接入产孢子固体培养基中，连续黑暗培养5天孢子数可达5.6×108cfu/g，得到棘孢曲霉的产孢子固体培养物；所述棘孢曲霉的产孢子固体培养基由大米和营养液组成，两者按10：7混合均匀；所述营养液由15g磷酸氢二钾和5g的硫酸镁溶于1L水制成；
（2）将皮落青霉菌种接种到PDA固体平板培养基中，25℃培养5天，产生孢子，用无菌水将孢子洗脱，用血球计数板进行孢子计数，稀释至1×104cfu/ml，以0.5%的接种量接入产孢子固体培养基中，采用自然光照培养5天孢子数可达7.5×109cfu/g，得到皮落青霉的产孢子固体培养物；所述皮落青霉的产孢子固体培养基由麸皮85g、稻壳15g、磷酸二氢钾0.45g、七水硫酸镁0.225g和水90ml混合均匀混匀制成，121℃灭菌20分钟；
（3）将棘孢曲霉的产孢子固体培养物和皮落青霉的产孢子固体培养物以1：1混合均匀，得到有机肥菌种；
（4）按2.3～3.5：1的比例将主料和辅料进行堆肥，首先将主料和辅料混合均匀，堆成三角的堆体，堆体的水份为55%～65%，堆体的碳氮比为13:1～30:1；所述主料为水分含量为65%～78%的蛋鸡粪，所述辅料为水分含量为15%～30%的锯末或者水分含量为8%～12%的稻壳或其它农作物秸秆；每周翻动堆体一次，每日测量堆体的温度，一次堆肥18～28天，当堆体经过高温期温度降至40℃时，按0.5%的接种量接入有机肥菌种；二次发酵7～15天，使得棘孢曲霉和皮落青霉在堆肥中的菌落形成单位含量达到1×106cfu/g个以上，即获得蛋鸡粪有机肥；所得蛋鸡粪有机肥的发芽指数80%以上，有机质含量>45%，氮含量>0.7%，五氧化二磷含量>1.8%，氧化钾含量>4.5%，总养分含量>7.4%，含水量＜30%。
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