CN101942395A - 棘孢曲霉 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有广谱的高抗菌活性的微生物菌株。本发明所述的棘孢曲霉命名为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)YM311498，现保藏在国家知识产权局认可的保藏单位，保藏编号为CCTCC NO：M2010062。本发明首次从印楝植物(Azadirachta indica)中分离获得棘孢曲霉类型的内生真菌，在明确具有广谱抗菌活性的棘孢曲霉YM311498的微生物学地位的同时，发现该菌对5种植物病原真菌、3种人体致病真菌、2种革兰氏阴性细菌和1种革兰氏阳性细菌，共11种病原微生物具有比较明显的抑制生长作用。本发明利用植物内生真菌资源，通过发酵获得农用或医用新型天然抗菌药物活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有广谱的高抗菌活性的微生物菌株。
背景技术
印楝(Azadirachta indica A.Juss)为一种热带树种，原产于印度和缅甸，不仅具有昆虫拒食和杀虫活性，还有抑制致病真菌和细菌生长、消炎、抗肿瘤、免疫调节等生理活性，具有较高的生物农药和医药价值。大多数活性物质为四降三萜类化合物，此外还包括一些二萜、三萜、五降三萜及少量的非萜类化合物。印度研究人员曾经从生长在印度的印楝植物中分离和鉴定了内生真菌(Rajagopal K et al，Current Science，2000，78，1375；Mahesh B et al，Current Science，2005，88，218；Verma VC et al，Microbial Ecology，2007，54，119)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离自中国云南省元江县印楝(Azadirachtaindica A.Juss)植物活体中具有广谱的高抗菌活性的微生物菌株-棘孢曲霉。
本发明所述的棘孢曲霉系从中国云南省元江县印楝植物活体中分离获得。现在国家知识产权局认可的保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，保藏单位地址：中国，武汉大学，邮政编码：430072。保藏日期为2010年3月25日，保藏编号为CCTCC NO：M2010062。
本发明所述的棘孢曲霉命名为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)YM311498，现保藏在国家知识产权局认可的保藏单位，保藏编号为CCTCC NO：M2010062。
该微生物属于内生真菌，经形态观察、培养特征以及分子生物学ITS rDNA基因序列分析，确定其分类学地位属于半知菌类(Deuteromycotina)曲霉属(Aspergillus)的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，菌株编号为YM311498。
棘孢曲霉Aspergillus aculeatus YM 311498在察氏培养基上，28℃培养7d后，菌落直径达4.4cm，质地致密，菌落平坦，中央部分土黄色，周围颜色白黄色背面颜色黄色，形状呈不规则圆形，有沟深陷培养基中。分生孢子结构较多，初为微黄色，老后变深呈土黄褐色。在PDA培养基上，28℃培养7d后，菌落直径达4.7cm，10d达4.8cm，质地较薄，中央为土黄色，四周近白黄色，老后菌落呈土褐色，气生菌丝较多，背面淡黄色至黄褐色。在麦芽汁培养基上28℃培养7d，菌落长满整个培养皿，质地致密略呈絮状，中央部分黄色略带红色，有沟和放射纹出现。
以ITS rDNA基因序列同源性为基础构建形成包括菌株YM 311498在内的19株相关真菌的系统发育树，可知棘孢曲霉YM311498碱基序列相似性为100％，与本属菌种Aspergillus aculeatus无差异。
菌株YM 311498的培养基培养特征：
①察氏培养基28℃培养7d，菌落直径达4.4cm，质地致密，菌落平坦，中央部分土黄色，周围颜色白黄色背面颜色黄色，形状呈不规则圆形，有沟深陷培养基中。分生孢子结构较多，初为微黄色，老后变深呈土黄褐色。
②PDA培养基28℃培养7d，菌落直径达4.7cm，10d达4.8cm，质地较薄，中央为土黄色，四周近白黄色，老后菌落呈土褐色，气生菌丝较多，背面淡黄色至黄褐色。
③麦芽汁培养基28℃培养7d，菌落长满整个培养皿，质地致密略呈絮状，中央部分黄色略带红色，有沟和放射纹出现。
菌株YM 311498的形态特征(见图1、图2、图3、图4)：
①无性世代 分生孢子梗长，具有足细胞；分生孢子梗顶端膨大成近球形，顶囊稍大，半球形，约2/3表面可育，直径10～14μm；孢囊上生小梗，梗基1～2μm×2～3μm，分生孢子头致密直柱状，颜色显橙褐色，直径90～110μm×25～50μm；分生孢子球形，大小约2.5μm，壁周围长满刺，刺长0.4～0.5μm。分生孢子梗壁在光学显微镜及电镜下近平滑。
②有性世代未发现。
菌株YM 311498的分子生物学特征：
采用分子生物学PCR技术，DNA序列测定分析，YM 311498菌株ITS rDNA基因组由543个碱基(bp)组成。以ITS rDNA序列为基础构建的系统发育树，该菌与Aspergillus aculeatus的进化距离最近(图4)。
菌株YM 311498的发酵培养特征：
①培养基：PDB培养基。
②培养温度：28±2℃。
③发酵时间：5-7天。
④发酵培养特征：培养第1天，有零星的淡黄色菌丝点出现；培养第3天，发酵液中出现黄色的小菌丝球；培养第5天，黄色菌丝球增多且体积增大，有少量菌丝帖壁，发酵液颜色变为黄色；培养第7天，出现大量的菌丝球，体积也继续增大，发酵液颜色为黄色。
菌株YM 311498的发酵工艺如下：
菌种→活化→一级种子(PDA培养基)→培养(28±2℃，4-5天)→接种→二级种子(PDB培养基，摇床200r/min，28±2℃，3-4天)→接种(按5％接种量)→发酵(PDB培养基，摇床200r/min，28±2℃，6-7天)→发酵物。
上述发酵工艺中的发酵条件如下：
①发酵方式：液体发酵。
②种子培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)。
马铃薯葡萄糖液体培养基的制备：取新鲜马铃薯200克，去皮切成小块，加水1升煮沸30分钟，过滤，滤液加水补足至1升，加入葡萄糖20克，pH自然。
上述培养基中加入15克琼脂，即为PDA培养基。
③发酵培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)。
④培养时间：菌种活化培养4-5天，种子摇床培养3-4天，发酵摇床培养6-7天。
⑤培养温度：种子和发酵培养温度均为28±2℃。
⑥发酵完毕，加入等体积95％乙醇浸提48小时，过滤，将滤液浓缩至干，加入无菌水制得抗菌发酵液制品。
本发明所述的菌株YM311498的抗菌活性试验：
1.病原指示菌：见表1。
表1抗菌试验指示菌
2.病原指示菌培养基：细菌类指示菌采用牛肉膏蛋白胨培养基；皮肤致病真菌类指示菌采用沙氏培养基；植物病原真菌类指示菌采用PDA培养基。
3.内生真菌的培养：
将印楝内生真菌菌株YM311498接入含7mL PDA液体培养基的三角瓶，置于28±2℃摇床(200r/min)培养6d，加入等体积95％乙醇浸提48小时，过滤，将滤液浓缩至干，加入无菌水制成浓度为1mg/ml发酵液样品备用。
4.抗菌活性的测定：
采用滤纸片扩散法(Barry A L et al，J.Clin.Microbiol.，1979，10，885)测定对16种病原微生物的抑制生长活性，滤纸片直径为10mm。在无菌条件下分别取供试指示菌悬液0.2mL，加入相应的固体培养基制成含菌平板，然后取蘸有发酵液样品的无菌滤纸片放入平板内，细菌和皮肤致病真菌置于37±1℃，植物致病真菌置于28±1℃，培养48h后，分别测量抑菌圈直径大小，结果见表2。
表2
本发明首次从印楝植物(Azadirachta indica)中分离获得棘孢曲霉类型的内生真菌，在明确具有广谱抗菌活性的棘孢曲霉YM311498的微生物学地位的同时，发现该菌对5种植物病原真菌、3种人体致病真菌、2种革兰氏阴性细菌和1种革兰氏阳性细菌，共11种病原微生物具有比较明显的抑制生长作用。本发明利用植物内生真菌资源，通过发酵获得农用或医用新型天然抗菌药物活性成分。
附图说明
图1为本发明所述的棘孢曲霉YM311498顶囊及分生孢子显微图(600X)。
图2为本发明所述的棘孢曲霉YM311498足细胞显微图(600X)。
图3为本发明所述的棘孢曲霉YM311498的扫描电镜图(2200X)。
图4为本发明所述的棘孢曲霉YM311498的扫描电镜图(3500X)。
图5为本发明所述的棘孢曲霉YM311498同源性的系统发育树图。
具体实施方式
实施例：
棘孢曲霉YM311498菌株是通过发酵获得农用或医用新型天然抗菌药物活性成分的微生物药源。
取YM311498菌种，在无菌条件下用接种针挑取少量菌丝，接种于装有已灭菌的PDA培养基试管中，置培养箱内于28±1℃活化培养4-5天，备用。在无菌条件下，将活化好的菌种以相同方法接入已灭菌的一级种子PDB培养基中，在28±2℃培养3-4天，即为YM311498菌株的一级种子。
将配制好的PDB培养基100ml装入500ml三角瓶内，121℃灭菌30分钟备用。取YM311498菌株的一级种子，在无菌条件下接种于装有100ml PDB培养基的500ml三角瓶内，接种量按7-10％(v/v)计，置于28±2℃摇床(200r/min)培养6-7天，期间注意检查有无染菌现象。
发酵完毕，于发酵液中加入等体积95％乙醇浸提48小时，过滤，将滤液浓缩至干，加入无菌水即制成抗菌发酵液样品。
Claims (2)
1.一种棘孢曲霉，其特征在于命名为棘孢曲霉Aspergillus aculeatusYM311498，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位，保藏编号为CCTCC M2010062。
2.按照权利要求1所述的棘孢曲霉，其特征是其ITS rDNA基因组由543个碱基组成，序列如下：
1 ctgggtcctt cggggcccaa cctcccaccc gtgcttaccg taccctgttg cttcggcggg
61 cccgccttcg ggcggcccgg ggcctgcccc cgggaccgcg cccgccggag accccaatgg
121 aacactgtct gaaagcgtgc agtctgagtc gattgatacc aatcagtcaa aactttcaac
181 aatggatctc ttggttccgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata actaatgtga
241 attgcagaat tcagtgaatc atcgagtctt tgaacgcaca ttgcgccccc tggtattccg
301 gggggcatgc ctgtccgagc gtcatttctc ccctccagcc ccgctggttg ttgggccgcg
361 cccccccggg ggcgggcctc gagagaaacg gcggcaccgt ccggtcctcg agcgtatggg
421 gctctgtcac ccgctctatg ggcccggccg gggcttgcct cgacccccaa tcttctcaga
481 ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggatt
541 acc。
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