CH666482A5 - Metabolit, dessen herstellung und verwendung. - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbindung der Formel I

CH,

CH, CH, CH, CH, CH, CH, CH, CH,

45

50

in freier Form oder in Form ihrer Alkalisalze (hiernach wird 35 die Verbindung der Formel I als S 39163/F-I genannt) sowie ein Verfahren zur Herstellung von S 39163/F-I in freier Form oder in Form seiner Alkalisalze, indem man einen diesen Metaboliten produzierenden Stamm in Gegenwart eines Nährmediums züchtet, hierauf S 39163/F-I in freier Form aus dem Nährmedium isoliert und gegebenenfalls anschliessend in ein Alkalisalz überführt.

Der Metabolit S 39163/F-I besitzt folgende Charakteristika:

Farbloses amorphes Pulver Smp. 105-115° sintern, ab 125° Zers.

[a]ß° = -15 (c=0,50 in Methanol)

Mol.-Gewicht nach Felddesorption-Massenspektrum:

660

Bruttoformel: C38H60O9 (660,9)

Analyse: Gef. C 68,5 H 9,1 O 22,6%

Ber. C 69,1 H 9,1 O 21,8%

UV-Spektrum in Methanol: max. 205 nm log s' 1,69 (Vgl. Fig. 1 ) 235 nm log e' 1,90

290 nm log e' 1,18 55

IR-Spektrum CH2C12 (Vgl. Fig. 2)

1 H-NMR-Spektrum in DMSO, 360 MHz mit Tetrame-thylsilan als internem Standard (Vgl. Fig. 3).

Löslichkeit: S 39163/F-I ist leicht löslich in Chloroform, Äthanol, Methanol, Pyridin, DMSO und schwer löslich in Äther, Hexan, Wasser.

Stabilität: S 39163/F-I als amorphes Pulver kann bei — 20 ohne nennenswerte Zersetzung über längere Zeit gelagert werden. Eine 1 %ige Lösung in 1-N NaHC03-Äthanol (9:1) ist bei Raumtemperatur 48 Stunden stabil. Eine 2%ige Lösung in 0,5-M K2C03-Lösung in Methanol-Wasser (9:1) erwies sich, 4 Tage bei Raumtemperatur gestanden, nach DC-Analytik als stabil.

In der folgenden Tabelle sind die RrWerte von S 39163/F-I im Dünnschichtchromatogramm angegeben (Kieselgel Merck 60 F 254-Platten, 0,25 mm Schichtdicke, Laufstrecke 12 cm).

40 Fliessmittel

Methylenchlorid-Methanol-W asser (70:25:4)

T oluol-Isopropanol-W asser (50:50:5)

Methanol-Methylenchlorid (30:70)

Rf-Werte S 39163/F-I

0,28

0,21

0,34

Als Nachweisreagenz kann Jod verwendet werden. Beim Ansprühen mit einer 0,1 %igen FeCl3-Lösung in Essigsäure-Konz. Schwefelsäure (1:99) gibt S 39163/F-I einen gelben Fleck; nach Erhitzen auf 120° tritt eine Braunfärbung auf.

HPLC-Analy tik von S 39163/F-I Säulenmaterial: Li-Chrosorb RP 8 (R) Merck (feines Kieselgel)

Mobile Phase:

60

Retentionszeit:

65 Detektion:

Triäthylamin-Phosphatpuffer PH 4,5/Acetonitril (50:50)

7,3 Min. Flussgeschwindigkeit 2 ml/ Min.

UV 290 nm

Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich nach bekannten Methoden ausführen. Eine Subkultur des den Meta-

3

666 482

boliten S 39163/F-I produzierenden Stamm wurde am 3. Oktober 1983 bei der Agricultural Research Culture Collection, 1815, North University Street, Peoria, III, 61604, USA, deponiert und steht der Öffentlichkeit unter der Bezeichnung NRRL 15684 zur Verfügung. Diese Kultur ist auch bei Sandoz AG, Basel, Schweiz, erhältlich.

Charakteristika des Stammes NRRL 15684

Der Pilzstamm NRRL 15684 wurde aus dem Blattgewebe von Buxus sempervirens L. isoliert. Unter gewissen Kulturbedingungen bildet der Pilzstamm dunkelbraune, oberflächlich oder im Agar eingesenkte, kugelige, singuläre, 200-500 (i (meistens 250-350 |i) grosse Pycnidien mit meist einem, manchmal auch 2-3 kurz ausgezogenen Mündungen. Die hellbraunen, ovalen bis zylindrischen dünnwandigen, 4-6 x 2-3 |i (meistens 5 x 2,5 n) grossen Konidien entstehen, soweit dies lichtmikroskopisch beurteilt werden kann, phiali-disch. Die Phialiden sind kugelig bis birnförmig mit kurzer Phialidenmündung und messen 5-7 x 7-7,5 (.i.

Nach den Bestimmungsschlüsseln von B.C. Sutton (in: The Coelomycetes; Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England 1980) lässt sich der Pilzstamm NRRL 15684 aufgrund der Fruktifikationsmerkmalen zur Gattung Microsphaeropsis Höhn stellen.

Die nachfolgenden physiologischen Merkmale sind für den Pilzstamm NRRL 15684 charakteristisch (Folgende Kulturmedien wurden zur Charakterisierung des Pilzstammes verwendet):

MA: 2% Difco malt extract; 0,4% Difco yeast extract,

2% Difco Agar.

CM: Difco corn-meal-Agar.

PA: 0,5% reines Soyaeiweiss (Promine D), 0,1% Difco yeast extract, 2% Difco Agar.

Nachweis des Proteinabbaus durch Aufklaren des Mediums

SA: 0,4 g lösliche Stärke (Difco), 0,1 % Difco yeast extract, 2% Agar

Nachweis des Stärkeabbaus mit KJ-Lösung. CAA: Cellulose-Azur (Calbiochem)-Test nach R.E.

Smith 1977: Applied and Environmental Micro-biology 33, (4), 980-981.

TA: Tween 40-Medium nach G. Sierra 1957: Antonie von Leeuwenhoek 23; 15-22.

Eine Mediumstrübung indiziert Lipase-Aktivität.

Medien mit pH 2,5 bis pH 4,0: MA-Medium gepuffert mit 0,1 M Citronensäure/0,1 M Na2HP04-Puffer nach Mcll-vaine in: Data for Biochemical Research, Oxford, 1969, Seiten 484-485.

Medien mit pH 9,2-10,0: MA-Medium gepuffert mit 0,1 M NaC03/0,l M NaHC03-Puffer nach Delory and King in: Data for Biochemical Research, Oxford, 1969, Seite 496.

Die Puffer- und Medienbestandteile wurden getrennt sterilisiert und erst nach der Sterilisation zusammengegeben.

Physiologische Merkmale des Stammes NRRL 15684 Die optimale Wachstumstemperatur des Stammes NRRL 15684 liegt nahe bei 21 °C (zwischen 18° und 24 °C). Auf MA bei 21 °C erreichen die Kolonién nach 7 Tagen einen Durchmesser von 45-53 mm. Die obere Wachstumsgrenze liegt zwischen 30° und 33 CC, die untere Wachstumsgrenze bei ca. 0 C.

Auf MA entwickelt sich ein zuerst weisses, später sich beige bis grau verfärbendes, wollig-filziges Luftmycel, die Kolonie-Rückseite erscheint hell honigbraun. Auf CM entwickelt sich nur ein völlig farbloses, spärliches Substratmy-cel. Die Pycnidien entstehen sowohl auf MA als auch auf

10

20

25

30

CM, bevorzugt in radialen Sektoren. Licht, z.B. Tageslicht, fördert die Pycnidienbildung.

Der Stamm NRRL 15684 baut Protein (PA), Stärke (SA) und Cellulose (CAA) ab, während eine Lipase-Aktivität (TA) nicht festgestellt werden konnte.

Bei pH 2,6 wächst der Pilzstamm bedeutend langsamer als bei pH 4; pH 9,2 hemmt das Mycelwachstum sehr stark und pH 10 inhibiert das Wachstum praktisch vollständig.

Der neue Stamm NRRL 15684 lässt sich bei geeigneten Temperaturen in verschiedenen Nährmedien mit den üblichen verwertbaren Nähr- und Mineralstoffen in aeroben Oberflächen oder Immersionsverfahren züchten. Die Züchtung des Stammes NRRL 15684 erfolgt durch Anwendung an sich bekannter Methoden und besteht im wesentlichen 15 darin, den genannten Stamm auf oder in einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen zu züchten. Der im Laufe der Züchtung gebildete Metabolit S 39163/F-I wird anschliessend isoliert. Die Fermentationsmedien sollen hauptsächlich eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und gegebenenfalls Mineralsalze und Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Elemente in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Für die Herstellung des neuen Metaboliten S 39163/F-I lassen sich auch Stämme verwenden, wie sie z.B. durch Selektion oder Mutation unter Einwirkung von Ultraviolettoder Röntgenstrahlen, oder Anwendung anderer Massnahmen, z.B. durch Behandlung von Kulturen mit geeigneten Chemikalien, gewonnen werden können. Sobald bei der Züchtung eine maximale Menge des Metaboliten S 39163/F-I produziert worden ist, was z.B. durch die Aktivität gegen Candida tropicalis oder Aspergillus niger oder DC-Kontrolle festgestellt werden kann, wird das Mycel aus der 35 Kulturbrühe abgetrennt und extrahiert. Die im Kulturfiltrat vorhandene Menge des Metaboliten kann durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. Äthylacetat, Butylacetat oder n-Buta-nol gewonnen werden. Eine andere Ausführungsform besteht darin, dass man den Mycelanteil in der Kulturbrühe homogenisiert, z.B. mit einem Ultraturrax, und den Metaboliten durch Extraktion mit den erwähnten Lösungsmitteln gewinnt. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht darin, dass die Kulturbrühe durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren in Mycel und Kulturfiltrat getrennt wird. Das Mycel wird danach mit Methanol oder mit Aceton unter Homogenisieren miteinem Turrax extrahiert, das Zellmaterial abzen-trifugiert und die organische Phase unter Wasserzugabe auf Wasser konzentriert.

Danach wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. Äthylacetat, oder n-Buta-nol extrahiert und die Extrakte, vorzugsweise bei 40-50 °C, im Vakuum eingedampft. Der im Kulturfiltrat verbleibende Anteil an Aktivstoff kann mit den oben erwähnten Lösungs-55 mittein extrahiert werden. Aus den so erhaltenen Rohextrakten kann der Metabolit S 39163/F-I durch an sich bekannte chromatographische Methoden isoliert und rein dargestellt werden.

Vorteilhaft hat sich als erste Operation eine Entfettung der Rohextrakte mit Hexan oder Petroläther erwiesen, wobei lipophile Begleitstoffe entfernt werden können. Aus den entfetteten Rohextrakten kann anschliessend zuerst durch Gelfiltration an Sephadex LH 20 und nachfolgende wiederholte Chromatographie an Kieselgel S 39163/F-I isoliert werden.

Der Metabolit S 39163/F-I lässt sich durch Umsetzung mit geeigneten Alkalimetallbasen in die entsprechenden Salze überführen. Solche sind z.B. das Natrium, Kalium oder Lithiumsalz.

40

45

50

60

65

666 482

4

Der Metabolit S 39163/F-I und seine Salze sind als Heilmittel geeignet.

Der Metabolit S 39163/F-I ist antimikrobiell wirksam; insbesondere wird das Wachstum von Hefen und Hyphomy-ceten gehemmt. Im Agardiffusionstest wurde keine Aktivität gegen Bakterien beobachtet.

Im Reihenverdünnungstest wurden folgende Mindest-hemmkonzentrationen beobachtet (mcg/ml):

Organismus S 39163/F-I

Candida krusei 6,25

Candida tropicalis 6,25

Candida albicans 12,5

Trichophyton quinckeanum 6,25

Aspergillus fumigatus 1,56

Aspergillus niger 1,56

Sabourand Maltose, Inoculumdichte 105 Keime/ml, Inkubationstemperatur 37 °C, Inkubationszeit 24 Stunden.

Der Metabolit S 39163/F-I besitzt bei geringer Toxizität (akute Toxizität: LD50 300 mg/kg Maus i.p.) interessante biologische Eigenschaften und kann daher als Heilmittel verwendet werden.

Ferner zeigt der Metabolit S 39163/F-I eine ausgeprägte Wirkung gegen Herpesviren, wie sich durch Untersuchungen in vitro und in vivo nachweisen lässt. Die Aktivität wurde durch Reduzierung des cytophatogenen Effektes (CPE) unter Verwendung verschiedener Viren, z.B. des Herpes simplex I und II, in vitro ab einer Konzentration von etwa 3 fig/ ml bis etwa 300 )ig/ml nachgewiesen. Der Metabolit S 39163/F-I erscheint daher zur Bekämpfung von Herpeser-krankungen geeignet.

Als Heilmittel kann der Metabolit S 39163/F-I allein oder in geeigneten Arzneiformen gemeinsam mit anorganischen oder organischen, pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden. Beispielsweise wird sie als Bestandteil von Injektions- oder Instillationszubereitungen eingesetzt. Für die Anwendung hängt die zu verabreichende Dosis von der verwendeten Verbindung und der Verabreichungsart sowie der Behandlungsart ab. Man erhält bei Säugetieren zufriedenstellende Ergebnisse bei Verabreichung einer täglichen Dosis von ca. 700 mg. Diese Menge kann gegebenenfalls in entsprechend kleineren Dosen zwei- bis viermal täglich oder in Retardform gegeben werden. Der Metabolit S 39163/F-I kann in ähnlicher Weise wie die für diesen Verwendungszweck bekannten Präparate, z.B. Acyclovir, angewendet werden. Die geeignete Tagesdosis für eine bestimmte Verbindung wird dabei von einigen Faktoren abhängen, z.B. von ihrer relativen Wirksamkeit. Es ist angezeigt, dass sie in ähnlicher Dosierung als die normalerweise für Acyclovir verwendete eingesetzt wird.

Der Metabolit S 39163/F-I kann oral, topical, intravenös oder parenteral verabreicht werden. Bei der Herstellung entsprechender Verabreichungsformen kann der Metabolit S 39163/F-I mit entsprechenden Träger- und Hilfsstoffen, wie Lactose, Maisstärke, Talk, Magnesiumstearat usw., vermischt werden. Die erfindungsgemässe Verbindung kann auch in Form von Salben oder Tinkturen verabreicht werden.

In den nachfolgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

Beispiel 1

Züchtung des Stammes NRRL 15684 im Schüttelkolben a) Impfstoff-Herstellung

200 ml Medium 85 (Zusammensetzung und Herstellung: Malzextrakt 20 g/L; Hefeextrakt 4 g/L; pH 5,6-5,8 vor Sterilisation; Sterilisation 20 Minuten bei 120°) werden in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit Mycel (ab Agar) des Stammes NRRL 15684 beimpft und bei 220 UPM auf einer Schüttelmaschine bei 24 inkubiert.

Nachdem die Kultur gewachsen ist (3-5 Tage) werden 50 ml Corn-Agar (Zusammensetzung und Herstellung: Bac-to Cornmeal Agar 17 g/L; pH 6,5 vor Sterilisation 20 Minuten bei 120°) in einem 200 ml-Erlenmeyerkolben punktförmig beimpft. Die Inkubation erfolgt 17 Tage bei 24°; wobei die Kulturen einem Tag-Nacht-Rhythmus unterworfen werden.

b) Vorkultur

Mit 50 jil Sporensuspension werden 200 ml-Erlenmeyer-kolben mit 100 ml Medium 85 beimpft. Nach 3-5 Tagen Inkubation bei 24° und 180 UPM auf einer Rundschüttelma-schine erhält man eine dickgewachsene Vorkultur.

c) Hauptkultur

Die Hauptstufe wurde mit 10% der Vorstufe beimpft und in 2 L-Erlenmeyerkolben mit 1 Liter SL-Medium (Zusammensetzung und Herstellung: Glukose 100 g/L, Malzextrakt 0,4 g/L, Hefeextrakt 0,4 g/L, NH4N03 0,4 g/L, KH2P04 0,4 g/L, MgS04 • 7H20 0,4 g/L, entmineralisiertes Wasser 1 L, Sterilisation 120°, während 20 Minuten) und 24° und 180 UPM 18 Tage inkubiert.

Beispiel 2

Züchtung des Stammes NRRL 15684 im Fermenter a) Vorkultur

Die erste Vorstufe war in 2 L-Erlenmeyerkolben mit 1 L Medium 85, die je mit 0,5 ml Sporensuspension beimpft werden. Die Inkubation beträgt 5 Tage bei 24° und 180 UPM auf einer Rundschüttelmaschine.

b) Erste Zwischenkultur

Zwei 75 L Fermenter mit 50 L Medium 85 bei 24°, einer Belüftung von 1 L/Minute/Liter Medium, und 150 UPM Rührung mit 2 Scheibenrührern 0 14 cm stellen die erste Zwischenstufe dar. Diese wird 10%ig mit 5 L der gut gewachsenen Vorstufe beimpft und 5 Tage inkubiert.

c) Zwei Zwischenkultur

Ein 750 L Fermenter mit 500 L Medium 85 und ein 200 L Fermenter mit 150 L Medium 85 bilden die zweite Zwischenstufe. Beide werden bei 24°, 3 Tage inkubiert mit einer Luftrate von 1 L/Minute/Liter Medium belüftet und mit 10% der ersten Zwischenstufe beimpft. Die Rührung beim 200 L Fermenter beträgt 100 UPM mit 1 Scheibenrüh-rer von 0 35 cm und bei 750 L Fermenter 100 UPM mit 2 Scheibenrührern von 31 cm Durchmesser.

d) Hauptkultur

Die Hauptstufe in 5 m3 Fermenter mit 3500 SL-Medium wird mit 350 L des 750 L Fermenters beimpft mit einer Luftrate von 1 L/Minute/Liter Medium belüftet, bei 24° 13 Tage inkubiert und mit einer Rührerumfangsgeschwindigkeit von 0,88 m/s gerührt. Die 2 m3 Hauptstufe hat die gleiche Rührerumfangsgeschwindigkeit. Diese wird mit 1800 L SL-Medium beschickt mit 180 L aus dem 200 L Fermenter beimpft und auch bei 24° mit einer Luftrate von 1 L/Minute/Liter Medium 13 Tage inkubiert.

Mit Zugabe von 4N NaOH wird versucht, den pH-Wert

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

666 482

in beiden Hauptstufenfermentationen konstant auf einem Wert von pH 6 zu halten.

Beispiel 3 Isolierung von S 39163/F-I

10 L Kulturbrühe werden über ein Sirupfilter, in Kulturfiltrat und Mycel getrennt. Das erhaltene Kulturfiltrat (ca. 8 Liter) wird anschliessend dreimal mit je 4 Liter Äthylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte bei ca. 40° im Vakuum eingedampft. Erhalten werden 4,7 g Rohextrakt.

Das Mycel wird zweimal mit je 2 Liter Methanol-Ace-ton-Wasser (45:45:10) mit dem Ultra-Turrax je 10 Minuten aufgeschlossen. Danach werden die vereinigten Auszüge im Vakuum von Aceton und Methanol befreit und die verbleibende wässrige Lösung dreimal mit je 400 ml Äthylacetat extrahiert. Die organischen Phasen liefern nach Eindampfen im Vakuum 5,5 g Mycelextrakte. Dieser Rohextrakt wird mit Methanol ausgerührt, wobei schwerlösliche inaktive Begleitstoffe durch Abfiltrieren entfernt werden können. Die in Methanol löslichen Anteile werden eingedampft und der Eindampfrückstand mit dem Rohextrakt aus dem Kulturfiltrat vereinigt. Nach Lösen in 90% wässrigem Methanol und Extraktion dreimal mit je 100 ml Petroläther liefern die wässrigen Methanolextrakte nach Eindampfen im Vakuum 6,67 g Rohprodukt.

Diese 6,67 g entfetteten Rohextrakte aus dem Kulturfiltrat und Mycel werden in Methanol gelöst und die Lösung auf eine Säule von 1,1 kg Sephadex LH20 in Methanol gebracht. Die Elution mit Methanol à 50 ml pro Fraktion liefern nach Eindampfen im Vakuum, 430 mg Material, wo S 39163/F-I enthalten ist. Diese Fraktion wird in Methylenchlorid-Methanol-Wasser (78:20:2) gelöst und die Lösung auf eine mit denselben Lösungsmitteln bereitete Säule von 50 g Kieselgel Merck (Korngrösse 0,05-0,2 mm) gebracht. Die Elution durchgehend mit Methylenchlorid-Methanol-Wasser (78:20:2) ergibt 145 mg stark angereichertes Material des Metaboliten. Nach Aufnahme in Methanol, Filtration der Lösung über Talk und Eindampfen im Vakuum wird analysenreines S 39163/F-I erhalten (Smp. 126-130° nach 15 Stunden Trocknen bei Raumtemperatur im Hochvakuum).

Beispiel 4

Isolierung von S 39163/F-I aus einer 5200 L-Fermentation

5200 L Fermentationsbrühe (nach Beispiel 2 gewonnen) werden bei pH 6,0 mit einem Westfalia-Klarseparator aufgetrennt, wobei ca. 4500 Liter Kulturfiltrat und ca. 600 kg Mycel anfallen. Das Kulturfiltrat wird dann zweimal mit je 2250 Liter Äthylacetat in einem Gegenstrom-Extraktor extrahiert. Die beiden Extrakte werden in einem Kühni-Fallstromver-dampfer bei 75° im Vakuum auf 620 Liter konzentriert. Hierauf wird das Extrakt-Konzentrat im Büchi- und Schmid-Umlaufverdampfer unter Wasserring-Vakuum bei 50 ' auf ca. 5 Liter konzentriert und am Büchi-Rotavapor bei 50 zur Trockene eingedampft. Erhalten werden 1,057 kg Rohextrakt. Das Mycel (~ 600 kg) wird dreimal mit je 700 Liter 90%igem Methanol je 1 Stunde mit einem Dispax-Re-aktor homogenisiert. Die methanolischen Extrakte, nach Abtrennen des Feststoffes im Westfalia-Klärseparator, werden vereinigt und unter Wasserzugabe in Büchi-Umlaufver-dampfer bei max. 50" auf ca. 450 Liter konzentriert. Diese wässrige Phase wird danach dreimal mit je 450 Liter Äthylacetat extrahiert und die Extrakte mit je 100 Liter Wasser gewaschen. Die vereinigten organischen Extrakte werden wie oben zur Trockene eingedampft und liefern 1,380 kg Rohextrakt.

Die beiden Rohextrakte aus dem Kulturfiltrat und dem Mycel (1,057 kg bzw. 1,380 kg) werden anschliessend getrennt in der 10-fachen Menge 90%igem Methanol gelöst und die Lösungen dreimal mit dem gleichen Volumen Hexan extrahiert. Nach dem Eindampfen der wässrigen methanolischen Extrakte werden die folgenden entfetteten Rohextrakte erhalten:

502 g Extrakt aus dem Kulturfiltrat bzw. 630 g Extrakt aus dem Mycel.

Anschliessend wird der entfettete Rohextrakt aus dem Kulturfiltrat (502 g) in 3,2 Liter Methanol gelöst und diese Lösung an 25 kg Sephadex-LH2o in Methanol gebracht (Säulendurchmesser 30 cm). Die Elution mit Methanol liefert 139 g S 39163/F-I als Mischfraktion.

Eine analog durchgeführte Gelfiltration von 630 g entfettetem Rohextrakt aus dem Mycel an Sephadex-LH20 ergab 119,5 g Fraktionen mit S 39163/F-I als Inhaltstoff. Diese beiden vereinigten Mischfraktionen von S 39163/F-I aus der Gelfiltration (258,5 g) werden in 1250 ml Toluol-Isopropa-nol-Wasser (50:50:5) gelöst und die Lösung auf eine mit denselben Lösungsmitteln bereitete Säule (Durchmesser 15 cm) von 25 kg Kieselgel Merck 60 (Korngrösse 0,040-0,063 mm) gebracht. Die Elution durchgehend mit Toluol-Isopropanol-Wasser (50:50:5) liefert 161,6 g Rohprodukt von S 39163/ F-I. Dieses angereicherte Präparat wird anschliessend portionsweise an der 100-fachen Menge Kieselgel chromatogra-phiert.

Dazu werden 25 g des Rohpräparates in 200 ml Methylenchlorid-Methanol-Wasser (78:20:2) gelöst und die Lösung auf eine mit denselben Lösungsmitteln bereitete Mitteldrucksäule von 2,5 kg Kieselgel Merck 60 (Korngrösse 0,04— 0,063 mm) gebracht. Die Elution erfolgt mit Methylenchlorid-Methanol-Wasser (78:20:2) mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von ca. 7 Liter/Std. Nach 10 Liter Durchlauf treten die Eluate mit S 39163/F-I als Inhaltstoff auf. Die Auswertung der chromatographischen Trennung erfolgt nach Eindampfen durch DC-Analyse auf Kieselgel-Merck-Platten mit Methylenchlorid-Methanol-Wasser (78:20:2) als Fliessmittel. Erhalten werden 15,7 g S 39163/F-I als DC-ein-heitliches Präparat. Eine Lösung in Methanol liefert nach Filtrieren über Aktivkohle (Merck) und Eindampfen S 39163/F-I als farbloses amorphes Pulver.

Durch diese letzte portionsweise durchgeführte chromatographische Reinigung an Kieselgel lässt sich aus dem Rohpräparat reines S 39163/F-I gewinnen.

Beispiel 5 Natriumsalz von S 39163/F-I

2000 mg S 39163/F-I werden in Essigsäureäthylester gelöst und langsam mit 1,20 ml einer 10-proz. methanolischen Natriumhydroxyd-Lösung versetzt, wobei das Natriumsalz von S 39163/F-I ausfällt. Nach dem Abfiltrieren oder Dekantieren der Lösung w ird das Na-Salz aus Methanol umkristallisiert. Für die Elementaranalyse wurde im Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet.

Bruttoformel: CagHsgOgNa (MG 682,9)

Analyse: Gef. C 66,7 H 8,6 O 21,4 Na 3,3%

Ber. C 66,8 H 8,7 O 21,1 Na 3,4% Smp. 195-196° unter Zersetzung [a]ß° = -23° (c = 0,5 in MeOH)

Wo0 = - 51° (c = 0,45 in H20).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

c

1 Blatt Zeichnungen

Claims (8)

1. 666 482

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Die Verbindung der Formel I

   OH
2. HO.

   CH,

   CH, CH, CH, CH, CH,

   CH, CH, CH,

   in freier Form oder in Form ihrer Alkalisalze.
3. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I in freier Form oder in Form ihrer Alkalisalze, dadurch gekennzeichnet, dass man einen diese Verbindung produzierenden Stamm in Gegenwart eines Nährmediums züchtet, hierauf die Verbindung der Formel I in freier Form aus dem Nährmedium isoliert und gegebenenfalls anschliessend in ein Alkalisalz überführt.
4. 3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen diese Verbindung produzierenden Stamm der Gattung Microsphaeropsis Höhn züchtet.
5. 4. Verfahren gemäss Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennOH
6. HO.

   zeichnet, dass man den Stamm NRRL 15684 züchtet.
7. 5. Heilmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verls bindung der Formel I in freier Form oder in Form ihrer Alkalisalze enthält.
8. 6. Der Stamm NRRL 15684 als Mittel zur Ausführung des Verfahrens gemäss Anspruch 4.

   20