SU632307A3 - Способ получени полипептидного антибиотического комплекса, обладающего противогрибковой активностью - Google Patents

Description

75 до 125/Ы , а ширина от ЗО до GSfU при среднем размере 95jU х 47/lj . Коиидиоспорь, пузырьки и фиалщдь глаакостен ые и слабо-коричневые. Длина конидноспоризмен етс  от 38 идо но может достигать 85 . Кк ширина составл ет вплоть ао 5 fU , Пузырьки измен ютс  от неполностью сферических до полусферических н на концах могут выравниватьс . Диаметр пузьфьков обьтно составл ет от 8м до 10 , а в среднем 9, 6 rtj . Стеригма типа бисера, а вторична  стеркгма часто парна . Форма первичной стеригмы близка к клинообразной. на измен етс  от 3,2уи до 6,3ш,состав лй  в среднем 4,4Дj . В самом широком месте они имеют .- Вторична  стеркгма имеет форму удлиненной бутылки, В своем самом широком месте они дос тигают 3,4/и, сужа сь к одному концу до 8нирины 1 р . Их длина измен етс  от 4/7 fu до 7,9/11 J. составл   в среднем 6,2 |tj 1 Кокидкн мелкоскладчатые, сферлмеские , с цветом от желтого до зеленого и кзг ген ютс  в диаметре от 1,6 до 4,6, составл   в среднем 2,5/и ,. Клейстоте Щ1Й с| еркческий, тонкостенный и камен . ет цвет от прозрачного в начальиьзй пер1год до T«MHo-nypnypHort) в период окончательного развити . Его диаметр намен етсй от 185|г)до 320 ш , соста&л   в среднем 2ОО jU , Аски прозрачные, от сферических до овальных и могут измельчатьс  развитием клейстотецил. Сферические fflCKH siMefOT диаметр 12,6 ;U . Средний размер овальных асков равен 14. 11, I т вамен етс  от 1.2,6jH цо 17,4т по ЯНШ5в И ОТ Q,5p до 12,6 по ширине. АсЕСЮПОры гладкостегшые, оранжевые н -украшены двум  параллельными эквато риальными гребешками, которые не разрушаютс  и имеют ширину 0,8Я , Если гребешок аква1чзриальный, то он проходи через д и шуюось линзообразной ас кос-- поры, д йна которой составл ет от 4,3i до 3,1/U f а ширина - от 2, до 3,5/ujB среднем размер ее равен 3,2 /U. Ес и гребешки периферийные, то аскоспора кажетс  сферической, а тело имбв1  иамвтр5 равный длине линзообраз ного вида. Агар с со одовым экстршстом. При выраншБашш при 25 С культура растет быстфо, досшга  диаметра 5 см за дес ть диви и вплоть до 7 см за врем  6 4 т трех до четырех недель. Колонии баратистые , желто-аеленого цвета. На седьмой день нал поверхностью и в нижнем по се по вл к 1х:  беспор дочные небольшие белые пучки клеток. Эти пучки клеток с возрастом станов тс  тускл0 жeлlы ffl. Городата  перифери  колонии состоит из желтовато-коричневых нитей. Обычно поверх иость имеет умеренный оливково-аеленый цвет, Конвдиальное и аскогенное состо ни , с небольшими исключени ми аналопмны при росте на агаре Чапека, Пузырьки более мелкие с диаметром, измен ющимCS от 6, до 11, в среднем 8,7у1(. С4)ерические аски имеют диаметр 11,0 ишрику от 9,5/и до 10,Зр. Средний размер аскоспор 4,0д) х 3,2fU . Указанный штамм можно выращивать на питательных средах, содержапшх ис«точнкки углерода, например сахарозу, глюкозу, мальтозу, глкцерол источники азота, например знзимат1-гческий пщро лизат казеина, мука хлопковых сем н, жгадкость от вымачивани  зерна, минеральные соли и микроэлементы. Выполнение предложенного способа иллюстрируетс  следуюпщм примером. Пример. Дл  получени  посевного материала штамгт Aspeid« EU9 niduEons 8112 инкубируют на среде следующего состава (в %); томатна  паста - 2, детска  овс нка - 2, , деионизировапна  вода - 94 при 25 С в течении 7 дней, и смь вагот споровый ма- териад гов жьей сывороткой. Полученной суспензией засевшот50 мл вегетативной среды следующего состава (в %) : глюкоза - 1,0, рол ™ 1,О,-иука хлопкового семени 2,5, углекис. кальций « 0,1, вода - 95,4 н инкубируют в колбе Эрленмейера на 25О мл при 25 С в течение 48 часов на качалке (250 об/мин). Дн   олу€ени  больиюго количества посевного материала 1О мл вышеописанной инкубированной вегетативной среды используют дл  засева 200 мл вегетаTifflHofl растительной среды второй стадии, имеющей I-OT же состав, что и вегетативной среды. Среду второй стадии инкубиру от в 2-литровой хш-фокогорлой колбе Эрленмейера при 25 С в течение 48 часов на встр за1Батвле(250 o6/MHii), Иикубкрован 1ую вегетативную среду ступени (800 кет), приготовленну как описано выше, испа ьзуют дл  56 засева lOO л стерильной ферментационной среды следующего состава (в %): Сахароза2,О Мальтоза1,0 Солодовый экстракт1 ,0 Патока0,5 Жидкость от вымачивани  зернаО,5 Энзиматический гидролизат казеина 0,5 Вода 94,5 После стерилизации в автоклаве при 12О С в течение ЗО минут под давлением рН среды составл ет 7,1, Засе нHyjo ферментационную среду подвергают ферментированию в 165-литровом фермен таре в течение 5 дней при 25 С. Ферментационную среду аэрируют Стерильным воздухом со скоростью 4О об/мин и пере мешивают обычными мешалками со скоростью 2 5О об/мин. -. После ферментации культуральную жид кость (2ОО л) отфильтровывают через фильтр из диатомовой земли, Ог делеиный мицелий экстрагируют метанолом (ЮОл) Метанольный экстракт концентрируют под ,мом до объема примерно 50 л. Кон центрированный Метанольный экстракт под кисл ют до рН 3,5-4,0 добавкой сол но кислоты. Полученный раствор дважды экс трагируют 0,5 объемами хлороформа. Хло роформовые экстракты объедин ют и концентрируют до объема примерно 1 л. Часть этого хлороформного концентрата (25О мл) добавл т-уг к ацетонитрилу (1ОО мл). Полученный раствор прсх жльтровывают , а фильтрат концентрируют под вакуумом до объема примерно 150 мл. Концентри: еванный экстракт помещают в силикагелевую колонку (5,5X54 см). Колонку элюируют смесью ацетонитрил : вода (97:3) со скоростью 5 мл/мин, собира  фракции объемом около 10 мл. Элюирование контролируют силикагелевой тонкослойной хроматографией с использованием системы растворителей бензол: метанол (7:3). Наличие антибиотического комплекса контролируют биоавтографией ; с использованием Candjiа a b eulffe .Фра ции 136-190 содержат антибиотическую смесь. Эти фракции объедин ют и выпа-. ривают под вакуумом с получением 453 мг антибиотического комплекса. Выделение антибиотика А-22О82 про извод т следующим образом. Часть антибиотической смеси, содержащей антибиотик и другие второстепенные факторы (200 мг) и полученной как опи-, сано выше, подвергают хроматографичес-кому разделению на силикагелевой колонке (1,5 X 6,0 см). Колонку элюируют смесью апетонитрил: вода (95:5) со скоростью 1 мл/мин, собира  5 мл фракции . Фракции контролируют как описано выше. Фракш1и 1-3, содержавшие антибиотик А-22О82, объедин ют и конц( рируют под вакуумом до масла. Это масло вновь подвергают хроматографическо- му разделению на си икагелевой. колонке (1,5 X 12 см), элюируют смесью ацетонитрил : вода (97:3). Фракции 15-20, содержавшие антибиотик А, объедин ют и концентрируют под вакуумом до масла. Это масло раствор ют в 2 мл раствора метанола в диэтиловом эфире. Образовавшийс  осадок отдел ют фильтрацией и высушивают с получением 35 мг антибиотика А-22О82. Антибиотик А 22082, обладающий противогрибковой активностью, имеет: Эмпирическую формулуC52Hg,N70,g-H20, Элементарный состав, %: С 56,24 И 7-, 54 N 8,84 О 27,39 молекул рный вес 11ОО CO-ID -44°(С 0,5, ) 5 -15б(С 0,5, ). Максимальные частоты поглощени  в ультрафиолетовом спектре (в кислом и нейтральном метаноле): 225, 275, 284. В основном ме-таноле - 245 и 290 нм. Максимальные частоты поглощени  в инфракрасном спектре ( КВг ): 2,97 (сильный), 3,ЗО(слабый), 3,36 (выступ), 3,39 (средний), 3,47 (слабый), 5,97 (сильный) 6.06(сильный), 6,45 (средний) 6,53 (средний), 6,83 (средний), 7,78 (слабый) 8,ОО (слабый) 9.07(слабый), 11,65 (слабый). Спектр ндерно-магнитного резонанса.. 176,1; 174,3; 173,4; 172,7; 172,4; 169,8; 158,4; 132,8; 13О,9; 129,6; 129,0; 116,2; 77,0; 75,7; 74,4; 71,3; 70,9; 69,6; 68,3; 62,4; 58,7; 56,9; 56,1; 52,9; 39,О; 38,5; 36,9; 35,2; 33,9; 32,е 32,6; ЗО,7; ЗО,4; ЗО,2; 8,2; 27,О; 26,5; 23,6; 2О,1; 19,6; 14,4 н 11,3. Т 0,35 при тонкослойной хроматорафии на силикагеле с использованием истемы растворителей бензол :метанол

(7:3) и биоавто графин Cand i do( «зйЬ cot Its дл  контрол .

Антибиотик А-22082 - белое аморфное вещество, растворимое в метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде , этилацетате и в водных растворах с рН выше 7,0; не растворимо в диэтиловом и тетралейном эфирах.

Антибиотик А 22082 обладает противо грибковой активностью. Эту активность

Исследуемый организм

CandidO aRbicotts 0,625

TricVzophvjloti menlagroph |tes 0,078 Candidoj irop-icoiEis3,12

Противогрибкова  активность антибиотика A-22082 дополнительно показана опытами п vivo . При введении двух доз антибиотика мышам, зараженным Candida atbicaU6|6buia обеспечена зажита против C.OiElsicoirts. Мерой защитного действи   вл етс  величина BD5O {эффективна  доза в мг/кг, защищающа  50% мышей). Величины ED 5о антибиотика против Canciidor аЕЬдсаоа. на мышах составл ли 30 мк/кг (интраперитональное введение) и 5О мг/кг (подкожное введение).

При введеюги антибиотика А-22082 интраперитонально или подкожно мышам в количестве 1ОО мг/кг дважды в день в течение трех дней (общее количество 600 мг/кг) не было обнаружено признаков острой токсичности.

измер ют с помощью обычной диск-диффузионной методики. (б-миллиметровые тампоны погружают в растворы, содержащие антибиотик, помещают на агаровые пластины, засе нные испытуемым организмом ). В таблице приведена минимальна  ингибирующа  концентраци  (МИК) на Тшск, при которой антибиотик А 22082 ингибирует перечисленные орга. низмы.

МИК (мкг/диск)

Также не было признаков острой токсичности при введении антибиотика А-22082 интраперитонально мышам в количестве 200 мг/кг трижды в течение 24 часов (всего бОО мг/кг).

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  полипептидного антибиотического комплекса, обладающего противогрибковой активностью, отличающийс  тем, что штамм АерегgiEEus niduEaviS 8112 выращиваЮТ В аэробных услови х Нс- питательной среде содержащей источники углерода, азота iT MiiHepajibHH© соли с последующим вьщелешгем целевого продукта и,раздечением его на компоненты.