SU287650A1 - Патентно-техн^^нескаябиблиотека - Google Patents

Description

изобретение относитс  к способам нолучени  химических соединений, в особенности к способам получени  соединений с использованием бактериальных культур.

Известен способ получени  изорениератена и его 3-окси- и 3,3-диоксипроизводных с помощью химического синтеза. Однако известный способ довольно сложен и, следовательно, требует больших затрат.

С целью упрощени  технологического нроцесса предлагаетс  получать изорениератен и его 3-окси- и 3,3-диоксиироизводные биологическим путем с использованием культуры гриба Streptomyces mediolani (штамм 2215/74F.i. из Коллекции штаммов Фермитали ). Штамм также депонирован в Институте фитопатологии при Миланском университете иод № LP.V. 1952 н в Международном микологическом институте под № I.M.I. 134886.

Пиже дано описание морфологических и культурных признаков этого гриба. А. Вид под микроскопом

На простой культуральной среде вегетативный мицелий в виде более или менее тонких гифов толщиной 0,4-0,9 мкм с многочисленными длинными разветвлени ми, которые образуют более крупные гифы толщиной 1 - 1,3 мкм, длинные и переплетенные. Из этих гифов моноподиально ответвл ютс  гифы, образующие споры или сиорофоры, которые сильно или слегка вьютс , длинные, образованные малыми цепочками спор, которые вначале св заны , затем свободны. Споры гладкие, чаще кубической формы, иногда также цилиндрической и округлой формы. Под микроскопом они выгл д т в виде характерных кубиков размером (0,9-1,1) X (0,9-1,1) мкм.

Б. Микроскопический вид

В табл. 1 ириведены культуральиые свойства на средах, в которых S. mediolani выращивалс  при 28° С, причем наблюдени  были проведены на 3-й, 8-й, 15-й и 20-й дни после инокул ции .

Гриб про вл ет быстрый обильный рост с образованием компактного твердого вегетативного М1щели  в виде ровной патины, окрашенной в цвета от  ично-желтого до оранл ево-желтого . Воздушный мицелий, также обильный па всей культуральной среде, довольно схож по виду с хлопком, окрашен в цвета от ваиильно-желтого до гвозд.ично-желтого. Значительных различий между грибами, выросшими на синтетической и органической средах, не обнаруживаетс .

В. Био.химические свойства

Рост

Среда

Обильный, в виде ровной натины

Умеренный, в виде ровной патнны

Обильный, в виде

й ровной натины

Обильный, в виде слегка складчатой натины

Обильный, в виде складчатой патины

Обильный, в внде

и ровной патины

Обильный, в виде ровной патины

Обильный, в виде ровной натины

Обнльный, в виде ровной патины

Обильный, в виде ровной патины

Обильный, в виде ровной патины

Обильный, в виде ровной натины Примечание. Растворимый нигмент отсутствует при

Таблица 1

Возушный мицелий

Вегетативный мицелий

Яично-желтый или абрикосово-желтый с обеих сторон

От лимонио-желтого до абрикосово-желтого цвета с обеих сторон

Лимонно-желтого цвета с обеих сторон

Абрикосово-желтого цвета с обеих сторон

Апельсиново-желтого цвета с обеих сторон

Лнельсииово-желтого цвета с обеих сторон

Анельсиново-желтый с обеих сторон

Светлый оранжево-желтый с обеих сторон

Оранжево-желтого цвета с обенх сторон

Глубокого оранжево-желтого цвета с обеих сторон

Оранжево-желтый с обеих сторон

Светлый оранжево-желтый с обеих сторон выращивании на всех средах.

ДНЯ положительна . Крахмал гйдролизует. Молоко не коагулирует, но пептоиизирует. Меланин не образует. Тирозин разлагает. Образует нерастворимые пигменты.

Используют следующие источники углерода: глюкозу, /-арабинозу, сахарозу, d-ксилозу, dманпитол , d-фруктозу, мальтозу, рамнозу и глицерин; мезоинозитол и раффинозу не используют .

Гриб не растет при 50° С и не образует склероций . Погруженна  в воду и взбита  культура образует -изорениератен, 3-оксиизореииератен и 3,3-диоксиизорер1иератен.

Г. Идентификаци  гриба

Свойства, про вл емые грибом и описанные выше, позвол ют отнести его к роду Streptomyces Waksman et Hehrici (Bergeys Mannuel of Determinative Bacteriology, 1957, стр. 774- 775). По Fridman et al. он принадлежит к Rectus Flexibilis группа «желтых (Appl. microbioL, 6, 1958, стр. 52).

вестных подвидов, предложенных Waksman, Baldacci et al.. Cause et al., Flagi et al., Ettingener et al.

Сравнение свойств рассматриваемого гриба и известных показало, что «и один из последних не имеет всех тех свойств, которыми обладает рассматриваемый микроорганизм.

Отсюда следует, что рассматриваемый микроорганизм не может быть идентифицирован с каким-либо видом, описанным в литературе, и поэтому его следует рассматривать как новый вид. Ему было дано название S. mediolani.

Он может быть размножен путем инокул ций на твердой среде или путем лиофилизации суспензии спор в молоке.

Согласно изобретению способ заключаетс  в культивировании S. mediolani в погруженной культуре, в культуральной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных элементов. В частности, микроорганизм культивируют на жидкой культуральной среде в аэробных услови х при температуре 24-37° С, предпочтительно при 27° С в течение 72-

160 час рИ можно варьировать в зависимости от среды от 6 до 8.

В качестве источника углерода могут быть использованы примен вшиес  и ранее глюкоза , декстрин, крахмал, различна  мука-- кукурузна , соева , пшенична , кукурузный настой и т. д..

Источником азота, помимо указанных выше источников углерода, содержащих также азот, могут служить казеин, размолотые семена хлопчатника, соли аммони  и т. д.

Минеральные соли, пригодные дл  приготовлени  каротеноидов, внос т в зависимости от примен емой среды.

Например, могут быть применены обычно употребл емые хлориды, сульфаты или фосфаты натри , кали , магни , цинка, меди н кобальта , карбонат кальци  и др. Ферментацию можно выполн ть лабораторно в колбах нли в промышленных ферментерах различпой мощности . По окончании ферментации мицелий отдел ют от культурального бульона путем фильтровани  или центрифугировани , а нигментные продукты выдел ют нутем экстрагировани  соответствующим органическим растворителем , смешивающимс  или несмешивающимс  с водой, таким как метанол, хлороформ , ацетон или метиленхлэрид. Разделение каждого продукта осуществл ют с помощью хроматографии по известной технологии.

Продукты, полученные предлагаемым способом , были известны и ранее и примен лись в зоотехники с целью нолучени   иц домашней птицы с более  рким желтком. Эти соединени  дают птице в виде добавки к кормам. В данном случае может примен тьс  мицелий, полученный в процессе ферментации, а не только чистые соединени .

Если примен ют мицелий, выделенный из культурального бульона, то его высушивают в гор чем воздухе или в вакууме и затем размалывают .

Полученный таким путем порошок тщательно неремешивают с обычными кормами. Количество пигментного продукта, добавл емое в нищевой продукт, может мен тьс  в завнсимости от нужной пигментации и в соответствии с выбранным количеством натуральных пигментных элементов, предпочтительно оно может составл ть от 0,3 до 6 г на 1 г{ кормов.

Пигментационное действие продуктов, .полученных предлагаемым способом, было определено по интенсивности цвега желтков, измеренной по колориметрической шкале «Roche (Mainguy P. et al).

Опыт был проведен на 30 курах-несущках семимес чного возраста, размещенных по отдельным клеткам и разделенных на три группы по 10 штук в каждой. Группа кур

Состав корма

1Основна  диета, содержаща  небольщое

количество общих пигментов, соответствующее 13,89 мг на 1 кг корма.

2Основна  дпета-|-обезвоженна  люцерна + общие пт1гменты 1500 иг на 1 ц смесн.

3Основна  диета+мицелий с содержанием общих пигментов 1500 мг на 1 ц смеси.

Состав основной, диеты, вес. %:

гибридна  кукуруза39,0

овес17,6

пшеничные отруби12,0

соева  мука 44%-па 15,0

м сна  мука3,0

рыбна  3,0

концентрат дрожжей1,00

dl-метионин0,1

фосфат натри 0,7

карбонат кальц.и 6.30

хлорид натри 0,3

свиной жир1,0 фэркомплекс (фирменный

продукт)1,0

Фэркомнлекс - смесь витамннов и микроэлементов , нмеюща  состав (на 1 кг смеси), г:

защищенный витамин А, м. ед750,000

Дз, м. ед150000

Е, Л1. ед.500

витамин В20,4

В120,0024

Кз0,1

Р2,5

фолинова  кислота0,015

d - кальци  пантотенат1

dl - метионнн40

колннхлорид100

хлортетрациклингидрохлорнд2

иодин0,1

марганец7

цинк5

гидроксибутиотолуол10

неизвестные факторы ростадо 1,000

В уиом нутых груннах 2 н 3 обезвоженную

люцерну н мицелий заменили аналогичными

количествами пшеничных отрубей. Опыт, длившийс  30 дней, был разделен на два иериода;

нредэкснериментальный период (10 дней),

когда кормление нроводили в соответствии с

основной диетой, не содержащей люцерну;

экспернментальный период (19 дней), когда кормление проводили так, как онисаио выше. Во врем  экспериментального иериода и в последующие дпи была определена пигментаци  желтков. Результаты приведены в табл. 2. Следующие нримеры иллюстрируют изобретение .

Пример 1. Спорулированный слой дес тидневной культуры S. mediolani, выросшей в пробирке на агаре-картофельно.м глюкозате при температуре 28° С, сн ли и собрали в 4 мл стерилизованной дистиллированной воды. 0,5 мл этой суспензии испОоаьзовали дл  ннокулироваыи  колбы, емкостью 300 мл, содержащей 60 мл среды следующего состава, %: декстрин4,0 казеин1,0 карбонат кальци 0,5 сульфат аммони 0,1 бикалийфосфат0,01 настой кукурузы1,0 сыра  водадо 100 мл Стерилизацию нроводили нагреванием в ав токлаве ири температуре 190°С в течение 20 мин. После стерилизации рН среды соста вил 6,9. Колбу инкубировали при 28° С в тече ние 26 час на роторном вибраторе с числом оборотов 225 об1мин и ходом 3 см. 2 мл полу ченной таким нутем культуры использовали дл  инокул ции колбы емкостью 300 мл, со держащей 60 мл той же самой среды, стерили зованной так, как описано выше. Инкубацию нроводили в уже оииса нных услови х. После 120 час ферментации иолучили 500 мкг ниг ментных нродуктов на 1 мл культурального бульона. Таблица 2 Пример 2. Процесс такой же, как в при мере 1, с той лишь разницей,что вз лн среду следующего состава, %: нерастворимый крахмал4,5 соева  мука2,25 кукурузный настой2,35 хлорид натри 0,5 карбонат кальци 0,35 сыра  водадо 100 мл. После 120 час ферментации получили 600 мкг пигментных продуктов на 1 мл куль турального бульона. Пример 3. Процесс такой же, как в нри мере 1, но среда имела состав, %: глюкоза мука из сем н хлопчатника растворимый крахмал карбонат кальци  сульфат аммони  кукурузный настой до 100 мл сыра  вода После 120 час ферментаНИИ получил 900 мкг пигментных нродуктов на 1 мл куль турального бульона. Пример 4. Процесс такой же, как в ири 3,0 соева  мука 0,2 меласса карбонат кальци  0,4 0,1 сульфат магни  до 100 мл сыра  вода После 69 час ферментации получили бОО.и/сг иигментных продуктов на 1 мл бульона культуры . Пример 5. Три колбы на 300 мл кажда , содержащие среду, онисанную в примере 1, инокулировали 25-дневной культурой, выраженной на среде и в услови х, оннсанных в нримере 1. Эти колбы инкубировали нрн темнературе 28°С в услови х, оиисанных в нримере 1. 170 мл культурального бульона, полученного таким образом, инокулировали в 3000 мл той же самой жидкой среды, содержащейс  в н тилитровом ферментере, снабженном винтовой мешалкой, переливной трубкой дл  указани  на киненне, барботером, трубкой дл  инокулировани , трубкой дл  отвода воздуха н термометром. Процесс осуществл ли ири температуре 28° С со скоростью аэрации 3 м/мин и нрн перемешивании со скоростью 400 об/мин. Во врем  ферментации вспенивание регулировали путем добавлени  в малых количествах кремниевого иеногасител . Максимальный выход пигментных продуктов получилс  через 77 час ферментации и составил 50 мкг на 1 мл культурального бульона. 10 л культурального бульона фильтровали 2%-иым Хаф)ле Суиерцел (торговое наимеиованне ), фильтрат отделили. Мицелий суспендировали при комнатной температуре в 3 л метанола и взбалтывали. Затем каждый раз экстрагировали 3 л смеси метанола с хлороформом (1:1). Объединенные экстракты повторно иромывали водой и выделенный хлороформенный слой высушивали через сульфат натри  н выиаривали в вакууме ири 35°С. Темио-красиый масл иистый осадок состоит из комнлекса иигментов - изорениератенов. Этот осадок отбирали нетролейным эфиром (300 CMi). Вес красно-коричневой массы, отделенной фильтрованием, составил 1,5 г. Маточные эфирные растворы концентрировали до 100 мл и хроматографировали на колонке с нейтральной окисью алюмини  сначала элюированием иетролейиым эфиром, чтобы удалить жиры, затем петролейиым эфиром, содержащим 1 % ацетона. Элюат из большого верхнего сло  концентрировалн в малом объеме и выдерживали ночь в холодильнике. Выделили 400 мг пурпурно-красного кристаллического нродукта с точкой плавлени  200- 201°С; максимальна  адсорбци  в видимом сиектре при следующих длинах золи (фракци  А): растворитель л.макс , W.W ( 428), 448, 479; петролейный эфир бензол(440), 465, 495.

зол) и Rf 0,38 (петролейный эфир с 1% ацетона ). Эта фракци  А поэтому были индентифицирована как изорениератец путем хроматографического и спектрографического сравиеци  и по точке плавлени  в смеси с образцом, приготовленным путем синтеза. Осуществл   элюирование колонки петролейным эфиром, содержащим 10% ацетона, собрали второй слой; из элюата, сконцентрированного до малого объема, получили 200 мг кирппчно-красного порошка, плав щегос  при температуре 180-185° С, имеющего максимум адсорбции в видимом спектре при следующих длипах волн (фракци  В):

м

HJJ

(425), 446, 475; (438), 463, 493.

Путем хроматографии па топком слое сплпкагел  получили: Rf 0,47 (бензол) и ,7 (метилеихлорид). Указанна  фракци  В мало растворима в обычных органических растворител х , хот  опа растворима в спиртовом растворе карбоната натри , окрашива сь при этом в  рко-красный цвет, и повторно осаждаетс  подкислением.

При обработке указанным ангидридом в ппрпдипе она дает феколацетат (v КВг 12,15, 17,58), нерастворимый в спиртовом растворе карбоната натри .

Указанна  фракци  была идентифицирована с 3-оксиизорениератеном путем хроматографического и спектрометрического сравнени  и по точке плавлени  в смеси. Красно-коричневую массу (1,5 г), первоначально собранную из летролейного эфира, хроматографировали па колонке силикагел  и элюировали бензолом, содержащим 10% ацетона. Из большого нижнего сло  путем выпаривани  растворител  и

последующей обработки петролейным эфиром получили 600 мг кирппчно-красной аморфной массы, плав щейс  при температуре 200°С (с разложением), обладающей макспмальной адсорбцией в видимом спектре ирп следующих длинах воли (фракци  С):

макс ; W.U

(425), 446, 475; (438), 463, 493.

Путем хроматографии на тонком слое силикагел  получили: Rf 0,l (бензол) и Rf 0,26 (метиленхлорид).

Указанна  фракци  С была идентифицирована с 3,3-диоксипзоренператеиом путем хроматографического и спектрографического сравнени  и по точке илавлени  в смеси.

Предмет изобретени 

Claims (3)

1.Способ получени  изоренператена и его 3-оксп- п 3.3-дпоксппронзводных, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  технологиче ского процесса, выращивают грпб Streptomyces mediolani (щтамм 2215/74 F. I. из Коллекции щтаммов Фермитали ) в аэробных услови х в жидкой культуральной среде, содержащей ИСТОЧНИК углерода, азота и минеральных элементов, п отдел ют мицелий гриба, содержащий изорениератеи и его 3-окси- и 3,3-диоксипроизводные , нутем фнльтровани  или центрифугировани .

2.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что выращивание гриба S. mediolani провод т ири температуре 24-37° С при рН от 6 до 8 в течепие 72-160 час.

3.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что изорениератен п его 3-окси-3,3-диоксипроизводные экстрагируют органическим растворителем и очищают путем хроматографии.