SU507204A3 - Способ получени (+) салютаридина - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ( + ) САЛЮТАРИДИНА

неорганические соли, включающие микровключеии  металлов, необходимых дл  соответствующей жизнеде тельности (метаболизма, обмена веществ) микроорганизмов.

В основном углеводы типа Сахаров, например декстроза, сахароза, мальтоза, лактоза, декстрин и т. п., и крахмалы служат подход щими источниками ассимилируемого (усво емого ) углерода в питательных средах. Количество углевода колеблетс  в пределах 0,1- 6% от веса среды. Эти углеродные источники примен ют по отдельности, либо несколько таких углеродных источников соедин ют в среде.

Различные азотные источники, такие, как казеиновые гидролизаты, кащевидные выварки из муки соевых бобов, муки арахиса, муки жмыха земл ного ореха, фильтрат барды, кукурузные соки и т. п., легко усваиваютс  микроорганизмами .

Получаемый в результате процесса () салютаридин легко извлекают путем экстрагировани  щелочной фильтрованной жидкости посредством подход щего водного несмешивающегос  растворител , например этилацетатом или бензолом. Затем раствор очищают очередной экстракцией, разделением диффузией через перегородки между щелочными водными растворами продуктов ферментации и водными несмешивающимис  растворител ми или с помощью средств хроматографии жидкостей или тонкопленочной хроматографии на двуокиси кремни  и т. н.

Окислительные фенолсв зующие ферменты превращают (-) ретикулин в ( + ) салютаридин и продуцируютс  видами микроорганизмов Schizomycetes и Eumycetes.

Культуры этих организмов хран тс  в коллекции культур Позерн Риджэнэн Рисарч Лэбраториа Министерства (Департамента) сельского хоз йства - института, расположенного в Пеории штат Иллинойз, и где значатс  под номерами NRRL Pseudomonas SP MB 3119 -NRRL 5686 Streptomyces sp MA 4382 - NRRL 5688 Streptomyces sp MA 4383 - NRRL 5689 Streptomyces sp MA 4384 - NRRL 5690 Streptomyces sp MA 4390 - NRRL 5691 Streptomyces griseus MA-8 -NRRL 5687

Другие микроорганизмы, которые необходимы дл  процесса, предлагаемого изобретением, подпадают под класс Eumycetes, а именно подклассы Phycomycetes и Fungi imperfect класса Eumycetes, включают разновидности родов Mucor, Cunninghamella, Syncephalastrum, S. Neurospora и Parasitella подклассов Mucorales и Sphoeriales, a также родов Penicillium Aspergillus, Torula и Sterigmatocystis подкласса Fungi imperfecti.

Следующие культуры были навечно помещены в Коллекцию культур Департамента сельского хоз йства США - Позери Риджинал Ресорч Лабораториа, г. Пеори , штат Иллинойз,

они зарегистрированы под следующими номерами NRRL:

Cunninghamella sp. MF 4547 - NRRL 5695 Aspergillus sp. MF 4536 - NRRL 5694 Torula cremoris MY-59 - NRRL 47495 Neurospora sp. MF-2347 -NRRL 5692 Penicillium chrysogenum MF 3965 - NRRL 5693

Пример 1. Одну лиофилизированную пробирку культуры микроорганизмов Parasitella simplex АТСС 6476 суспендируют в 10 мл стерильной основной среды. 0,3 мл полученной суспензии используют дл  засева каждых 10 мл стерилизованной основной среды , содержащей ЗХЮ г ретикулина, в тестпробирках размером 25X150 мм. Эти пробирки с полученным препаратом инкубируют при 28°С в течение 5 дней на аппарате, обеспечивающем вращательно-встр хивающее движение . Затем эти пробирки снимают со встр хивател  и добавл ют 1 мл 0,5 М динатрийфосфата , отрегулированного до значени  8с помощью NaH2P04, после чего добавл ют 2 мл этилацетата. Эту смесь подвергают энергичному встр хиванию до получени  высокодисперсной (ровной) эмульсии. Затем эту эмульсию перенос т в специальную пробирку дл  центрифугировани  и подвергают центрифугированию на прот жении достаточного промежутка времени, чтобы расслоить эмульсию на фракции растворител  и водную . Затем полученный экстракт этилацетата подвергают анализу посредством жидкостной хроматографии и тонкопленочной хроматографии , тем самым показыва  наличие салютаридина .

Основную среду препарировали путем растворени , г: декстрозы - 10; солодовой выт жки - 3; дрожжевого экстракта - 2, питательного бульона (Difco) - 8 в достаточном количестве воды, с тем, чтобы обеспечить 1 л среды. Перед тем, как ее использовать, регулируют рН этой среды до значени  7,0 за счет добавлени  гидроокиси натри . При использовании в качестве твердой (питательной ) или поддерживающей среды в ее состав включают агар в количестве 20 г/л. Стерилизацию производ т путем автоклавировани  сред в течение 20 мин при 121°С.

Ретикулин добавл ют асептически как стерильный водный раствор. Этот раствор препарировали путем растворени  6 мг в 1 мл воды, регулиру  при этом значение рН до 7 и осуществл   стерилизацию посредством фильтрации.

Препарированный этилацетатовый экстракт подвергают (пробирному) количественному анализу на наличие салютаридина с помощью средств жидкостной хроматографии на анионообменной смоле или силикагеле.

Ферментационные бульоны, дающие полол ительные резз льтаты в общей классификации (сортировании, отборе) посредством жидкостной хроматографии, перепровер ютс  с помощью двух различных систем тонкослойной хроматографии. Дл  этой цели оставшуюс  половину этилацетатного экстракта данного бульона раздел ют и нанос т на пластины дл  тонкослойной хроматографии в двух местах (точках) на каждой из двух пластин. Одна из этих точек суть присадка (или смесь, примесь) с подлинным ( + ) салютаридином , котора  позвол ет производить наблюдение совпадени  с точкой полученного вещества и фигурирует как еще одно доказательство помимо значени  Rf. Чистый образец (пробу) (-f-) салютаридина также нанос т вдоль двух выщеуказанных мест на пластине. Проработанные пластины визуально наблюдаютс  посредством ультрафиолетового поглощени  (гашение свечени  пластин, подверженных воздействию ультрафиолетового излучени ) и посредством цветовой реакции, вызванной парами Ь.

( + ) Салютаридин покидает область возникновени  (R/ 0,3) и при воздействии Ь - паров он приобретает характерный серый цвет, который вскоре превращаетс  в желтый.

Пример 2. Суспензию Parasitella simplex АТСС 6476, препарированную аналогично примеру 1, используют дл  посева через стерильную петлю на поверхность скошенного агара, содержащего основную среду. Затем эти скосы инкубируют в течение 5 дней ири 28°С, наблюда  при этом великолепный рост культуры. Несколько полных петель такого гриба из инкубированного скоса используют дл  посева в 40 мл стерильной основной среды . 1 мл полученной суспензии используют дл  посева в каждую из тридцати колб Эрлеимейера емкостью 250 мл, содержащих 40 мл стерильной основной среды, плюс 300 мкг/мл (-) ретикулина. Полученные таким образом инокулированные колбы, а также контрольные колбы (без ретикулина) инкубируют ири 28°С в течение 6 дней на ротационном встр хивателе. В это врем  были сгруппированы (собраны) колбы, содержащие ретикулин , после чего провод т количественный анализ на салютаридин как дл  ферментационного бульона, содержащего ретикулин, так и дл  контрольного бульона. Контрольные бульоны не содержали салютаридина, тогда как бульоны, содержан ие ретикулин, имели в своем составе салютаридин.

Пример 3. Скошенную культуру Parasitella simplex АТСС 6476, описание которой имеетс  в примере 2, примен ют дл  инокулировани  40 мл основной среды в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, после чего систему инкубируют на прот жении 2 дней (2 сут) на встр хивателе ири 28°С. 1 мл полученной посевной (семенной) культуры используют дл  инокулировани  каждой из 60 колб, содержащей 40 мл основной среды с 300 мкг/мл ретикулина. После проведени  инкубации при 28°С в течение 5 сут па встр хивателе полученные ферментационные бульоны подвергают количественному .анализу.

В резлльтате анализа в бульоне содержитс  салютаридин.

Пример 4. Одну нолную петлю Parasitella simplex АТСС 6476 перенос т со скошенной культуры 10 мл стерильной основной среды. 0,25 мл полученной суспензии используют дл  инокул ции тест-пробирок (размер 25Х 150 мм), содержащих 10 мл стерильной основной среды и 300 мкг/мл ретикулииа. Эти

инокулированные пробирки инкубируют при 28°С на ротационном встр хивателе. Отдельные пробирки вывод т из эксперимента через 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 дней инкубации и подвертают количественному анализу на наличие

салютаридина. Ниже приведены количественные данные салютаридина, содержащегос  в ферментационных бульонах:

Врем  инкубации. Образовавшеес  колисутчество салютаридина,

10-S г/мл

0,5 0,9

5 6 7 8 9 10 3,6

1,4 3,5 2,9 5,7

П р и м е р 5. Бульон, полученный путем ферментировани  2250 мл основной среды, содержащей 675 мг ретикулина (как описано в примере 3) делают щелочнылт, довед  значение рН до 8,1 за счет добавлени  14,2 г динатри  фосфата. Полученную смесь перемешивают с 500 мл этилацетата и профильтровывают . Водный слой фильтрата экстрагируют двум  порци ми этилацетата по 350 мл и цолучент ые комбинированные экстракты высушивают на натриевом сульфате и подвергают -концентрации в ваклуме. Полученный в результате остаток (осадок) раздел ют между 100 мл 4%-ного раствора гидроокиси натри  и 100 мл бензола под азотом. Отделенный водный слой промывают дополнительной дозой бензола и затем окисл ют до значени  рН 7,0-8,0 с помошью 85%-ной фосфорной кислоты. Полученный щелочной раствор в азотной атмосфере экстрагируют хлороформом , после чего комбинированные экстракты высушивают и концентрируют. Остаток .цодвергают исследованию посредством методов хроматографии на трех пластинах двуокиси кремни  с использованием 20%-ного метанола в хлороформе в качестве нро вл ющего растворител . Посредством ультрафиолетовых лучей на про вленных пластинах обнаруживают две большие полосы и отдел ют соскабливанием . Соскобленный материал, в котором имеетс  двуокись кремни , перешедша  из основани  - пластинки, экстрагируют метанолом, затем испар   метанол получают твердый осадок из его паров, который вновь экстрагируют дихлорметаном, что приводит

к получению материалов, свободных от содержани  двуокиси кремни . Более медленно движуща с  полоса (R/ 0,6; 13,0 мг) была идентифицирована как изосалютаридин. Продукт быстрее движущейс  полосы (,B5) требовал дальнейшей очистки, котора  выполнена на окисноалюминиевых (двух) пластинах с использованием хлороформа в качестве растворител  (,5). Выделение (извлечение ) продукта из полосы позвол ет получить 13,4 мг салютаридина в виде желтого кристаллического твердого вещества. Кристаллизаци  от 0,2 мл этилацетата дала 7,1 мг бледно-желтых кристаллов. Т. пл. 212-214°С; -fl4,7-f7,8 (С 0,48, NaOH); Я NaOH 280 нм (), 241 нм (2 18900):  дерный магнитный резонанс макс. (С DCls) т 2,66 (Cs-Н), 3,47 (АБ квартет, Ci-Н и Cs-Н) 3,83 (Cs-Н), 6,21 и 6,34 (ОСНз) и 7,61 частей на миллион (NCHs), накладываемые с подлинным (образцом, пробой) ( + ) салютаридина.

Масс-спектрограмма: М 327, м/о 312, 299, 284.

Дл  изосалютаридина (CDCls) т 3,37 (€5- Н), 3,46 (С4-Н), 3,80 (С,-Н), 3,83 (Сз-Н), 6,19 и 6,28 (ОСНз) и 7,59 частей на .миллион (N-СНз) все синглеты.

Пример 6. 1 л стерилизованной основной среды, содержащей декстрозу, солодовую выт жку , дрожжевой экстракт и питательный бульон (Difco), а также 400 мг (-) ретикулина НС1-21 20 эквивалент 339 мг (-) ретикулиновой основы инокулируют культурой Parasitella simplex АТСС 6476 и инкубируют посредством аэрации в течение 6 дней при 28°С. К полученной в результате аэрации ферментационной жидкости (бульон) добавл ют 100 мл 0,5 М двунатриевого фосфата и 250мл бензола. После тщательного перемешивани  смесь профильтровывают, органический слой отдел ют, а водную фазу экстрагируют дополнительным количеством в 250 мл бензола. Комбинированные бензоловые экстракты высушивают над натриевым сульфатом и экстрагируют двум  порци ми по 50 мл 1 Н. раствора гидроокиси натри  в атмосфере азота . Комбинированные щелочные экстракты подвергают обратной промывке бензолом, окисл ют до значени  рН 7,5 с помощью 85%-ной фосфорной кислоты и дважды экстрагируют посредством 200 мл бензола. Комбинированные бензольные экстракты сушат над сульфатом натри  и концентрируют до состо ни  полного высыхани  в вакууме с целью получени  остатка неочищенного (-Ь) салютаридина. Этот остаток исследуют средствами хроматографии с выходом фракции ( + ) салютаридина, позвол ющей кристаллам от этилацетата плавитьс  при 191 - 194°С (т. пл. подлинного ( + ) салютаридина 190- 194°С).

Пример 7. Большое количество идентичных пробирок, содержащих стерилизованную основную среду и 300 мкг (-) ретикулина/мл, инокулируют культурой Parasitella simplex

АТСС 6476 и инкубируют при тех же зслови х , которые указаны в примере 1. Спуст  3 дн  после инокул ции вывод т пробиркидубликаты , определ ют значение рН и провод т количественный анализ бульона. Ниже приведены количественные данные салютаридина , содержащегос  в ферментационном бульоне.

Срок выдержки, Значение рН Количество

сутбульонасалютаридина,

мкг/мл

37,20,1

47,61,1 5 8,0 2,8

68,01,1

78,13,9

88,33,4

98,55,6 108,75,1 П8,84,4 128,84,7

Пример 8. В сушильную чашу поместили 500 мл стандартной основной среды, содержащей 300 мкг/мл ретикулина. Поверхность этой среды инокулируют путем спринцевани  споровой суспензией Parasitella simplex АТСС

6476 и инкубируют при 28°С на прот жении 5 дней. За это врем  плотную насыщенную и массивную пленку, котора  выросла на поверхности , снимают и перенос т из первоначальной чашки в другую, содержащую только 500 мл 0,1 Н, ацетатного буферного раствора (рН 5,0). Эта пленка плавает в течение 1 ч на поверхности буферного раствора, слегка покачива сь и затем ее снова перенос т в чашу, содержащую точно такой же буферный раствор плюс 0,1% декстрозы и 300 мкг/мл ретикулина (ЗХЮ г/Ю- л или 0,3 г на 1 л). Затем эту чашку инкубируют при 28°С в течение еще 6 сут. Получают результаты количественного анализа на среде первоначального роста в течение 5 дней и на заключительной среде поко щихс  клеток за 6 дней. Первоначальна  питательна  среда содержала 1,3 мкг/мл ( + ) салютаридина в момент переноса , а среда поко щихс  клеток -

2,13 мкг/мл по истечении 6 дополнительных дней. В фазе поко щихс  клеток не отмечалось заметного дополнительного роста микроорганизмов . Пример 9. Различные стерилизованные

среды, содержащие 300 мкг/мл (-) ретикулина инокулируют микроорганизмами Parasitella simplex АТСС 6476, и в течение 4 дней наблюдают их рост, после чего производ т количественный анализ на содержание салютаридина .

Ф о р М )Ч1 а изобретени 

Способ получени  ( + ) салютаридина путем окислени  ретикулина, отличающийс   тем, что, с целью повышени  выхода це9 левого продукта, окисление ферментативным путем с осуществл етс  культур микроорганизмов классов Schizomyиспользованием cetes или Eumycetes. 507204 10