PL88619B1

PL88619B1 -

Info

Publication number: PL88619B1
Application number: PL1974168726A
Authority: PL
Original assignee: Merck & Co Incus
Priority date: 1973-02-12
Filing date: 1974-02-11
Publication date: 1976-09-30
Also published as: US3785927A; ES423014A1; SU507204A3; AU6517874A; GB1430698A; FR2217331B1; NL7401076A; JPS49110890A; ZA74872B; FR2217331A1; DD110267A5; DE2406447A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wy- - fcwarzania /+7 salutarydyny z /—/ retikuliny.Od wielu lat poszukiwano sposobu utleniania fe¬ nolowego pierscienia /—/ retikuliny, która z ko¬ lei mozna przeprowadzic w alakaioid tebaine. Wia¬ domo, ze utlenienia pierscienia fenolowego /—/ re¬ tikuliny mozna dokonac za pomoca dwutlenku manganu, lecz wydajnosc tego procesu wynosi za¬ ledwie 0,024%, co oczywiscie wyklucza mozliwosc zastosowan praktycznych.Przedmiotem niniejszego wynalazku jest enzy¬ matyczny sposób przemiany z wysoka wydajnoscia /—/ retikuliny w /+/ salutarydyne.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze /—/ retikuline poddaje sie bezposredniemu zetknieciu z utleniajacym fenole enzymem, stanowiacym pro¬ dukt uzyskany z fermentacji szczepu klasy obej¬ mujacej Schizomycetes i Eumycetes w wodnym srodowisku odzywczym. Zachodzaca przy tym re¬ akcja przedstawiona jest na zalaczonym schema¬ cie.Zetkniecie /—/ retikuliny z wyzej wymienionym enzymem moze nastapic w rózny sposób.Najkorzystniej postepuje sie w ten sposób, ze w wodnym srodowisku odzywczym, zawierajacym /—/ retikuline, prowadzi sie fermentacje szczepu nale¬ zacego do^klasy obejmujacej Schizomycetes i Eumy¬ cetes, po czym wytworzona /+/ salutarydyne wy¬ odrebnia sie ewentualnie z brzeczki pofermenta¬ cyjnej.Oczywiste jest jednak, ze przemiane /—/ retiku¬ liny w /+/ salutarydyne mozna równiez uzyskac stykajac /—/ retikuline z komórkami w stanie spo¬ czynkowym mikroorganizmów, wytwarzajacych po¬ zadane enzymy, alibo tez z wolnym enzymem wy¬ odrebnionym z tych komórek.W korzystnym, opisanym powyzej sposobie reali¬ zacji wynalazku czyli przemiany /—/ retikuliny w /+/ salutarydyne prowadzi sie hodowle szczepów Schizomycetes lub Eumycetes w obecnosci /—/ re¬ tikuliny, w okresie czasu wystarczajacym do doko¬ nania tej przemiany. Czas i warunki fermentacji sa zmienne, w zaleznosci od zastosowanego mikro¬ organizmu. Ogólnie, najlepsze warunki wzrostu mikroorganizmu stwarza aerobowa fermentacja w wodnej pozywce o odpowiednim skladzie. Odpowie¬ dnia temperatura fermentacji jest zwykle 24—37°C, w zaleznosci od zastosowania mikroorganizmu, a korzystnie jest prowadzic proces w 28°C Stezenie /—/ retikuliny w brzeczce fermentacyjnej nie jest wartoscia krytyczna. W zaleznosci od zastosowane¬ go mikroorganizmu, korzystnie jest prowadzic fer¬ mentacje przy stezeniu /—/ retikuliny w granicach —50 ml/100 ml brzeczki. /—/ Retikuline mozna wprowadzac aseptycznie do sterylnej pozywki, w postaci wodnego roztworu o pH 4,5—6,7, a inku- bowana .pozywke fermentowac do osiagniecia ma¬ ksymalnego stezenia /+/ salutarydyny, co zwykle trwa 3—»10 dni. Mozna tez wprowadzac retikuline do brzeczki w trakcie fermentacji i kontynuowac 88 6193 88 619 4 fermentacje do zakonczenia przemiany tego zwiaz¬ ku w salutarydyne.Wodne pozywki fermentacyjne, stosowane do wy¬ twarzania pozadanych enzymów, sporzadza sie spo¬ sobami stosowanymi w hodowli mikroorganizmów, na przyklad w produkcji antybiotyków. Pozywki takie zawieraja zródla przyswajalnego wejgla i azo¬ tu oraz nieorganiczne sole, lacznie z metalami sla¬ dowymi, niezbednymi dla prawidlowego metabo¬ lizmu mikroorganizmów.Odpowiednimi zródlami przyswajiaiLnego wegla sa weglowodany, takie jak cukry, na przyklad dek- stroza, sacharoza, maltoza, laktoza, dekstryna itp. i skrobie. Ilosc zródla wegla w pozywce jest w pewnym stopniu zalezna od innych jej skladników, zwykle odpowiednia iloscia weglowodanów jest 0,1—6°/o wagowych. Pozywka moze zawierac jedno lub k?lka zródel wegla..Mikroorganizmy latwo przyswajaja azot z ta¬ kich zródel jak hydrolizat kazeiny,v hydrolizat papainowy maki sojowej, maka z orzeszków ziem¬ nych, wywar gorzelniany, maniok kukurydziany, azotan sodu, chlorek amonu, siarczan amonu itp.W sposobie wedlug wynalazku dokonuje sie prze¬ miany /—/ retikuliny w /+/ salutarydyne. Korzy¬ stnie jest stosowac jako 'material wyjsciowy /—/ retikuline, lecz mozna równiez stosowac miesza¬ niny /—/ i /+/ retikuliny, a w szczególnosci mie¬ szanine racemiczna. Stosujac /—/ retikuline otrzy¬ muje sie pozadana /+/ salutarydyne z maksymalna wydajnoscia, przy mniej skomplikowanym sposo¬ bie wyodrebniania pozadanego produktu.Wyodrebnienie /+/ salutarydyny mozna dokonac w drodze ekstrakcji przesaczonej i zalkalizowanej brzeczki odpowiednim niemieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem, takim jak octan etylu lub ben¬ zen. Ekstrakt mozna nastepnie oczyszczac przez dalsza ekstrakcje, rozdzial produktów fermentacji miedzy zasadowy roztwór wodny a niemieszagace sie z woda rozpuszczalniki i/lub chromatografie cieczowa lub cienkowarstwowa na zelu krzemion¬ kowym itp. iDoigodnymi sposobami analizy /+/ salutarydyny wytwarzanej wedlug wynalazku sa chromatografia cieczowa i/Lub cienkowarstwowa wedlug dalej po¬ danych przepisów. Sposobami tymi latwo oznacza sie mikroorganizmy wytwarzajace pozadane ukla¬ dy enzymatyczne, przetwarzajace /—/ retikuline w /+/ salutarydyne. Mozna je wiec stosowac do od¬ siewania mikroorganizmów nadajacych sie do sto¬ sowania w sposobie wedlug wynalazku.Utleniajace fenole enzymy, nadajace sie do prze¬ miany /—/ retikuliny w /+/ salutarydyne, stanowia produkty fermentacji szczepów gatunków naleza¬ cych do klas Schizomycetes i Eumycetes. Powyzsze Masy mikroorganizmów sa opisane w „Bergey's Maiiual of Determinative Baoteriology", wydanie 7, oraz w „A Dictionary of the Fungi", 1854, Com- monwoalth Mycological Institut. Zaobserwowano, ze eznyimy przemieniajace /—I retikuline w /+/ salutarydyne sa wytwarzane przez szczepy gatun¬ ków nalezacych do rzedów Pseudomonadeles i Acti- noraycetales klasy Schizomycetas, a zwlaszcza szczepy rodzajów Pseudomonas i Streptomyces. Na¬ daja sie do tego celu równiez wyodrebnione z gle¬ by szczepy Pseudomonas NB 3110, Streptomyces szczep MA 4382, 4303, 4364 i 4390 oraz Streptomy¬ ces griseus MA-8 (liczbami 1MB i MA sa oznaczone kultury zbiorów firmy Merck. & Co., Inc., Rahway, New Jersey). Kultury tych organizmów sa nie¬ odwolalnie zdeponowane w zbiorze kultur Northern Regional Research Laboratories, Department of Agrioulture, Peoria, Illinois, gdzie sa ogólnie do¬ stepne pod nastepujacymi liczbami NURL: Pseudo- io monas szczep MB 34(19— NiRRL B 988% Strepto¬ myces szczep MA 4382—NERL 5688, Streptomy¬ ces szczep MA 4388^NRfRL 5889, Streptomyces szczep MA 4364— NBRL 5690, Streptomyces szczep MA 4390—NRJRL 56&1, Streptomyces griseus MA-8 NRjRL 56ff7.Cechy morfologiczne i hodowlane powyzszych mikroorganizmów sa przedstawione w ponizszych tablicach: Pseudomonas szczep MB 3ill9 Morfologia: paleczki 0,4X1,12 — 1,7 mikrona, wystepuja¬ ce pojedynczo i parami; Gram uljemny; ruch¬ liwy Kolonie na agarze: <48 godzin, E8°C); okragle, brzegi równe, blyszczace, lekko wzniesione, sluzowate, bar¬ wy Ibrazowej, $—3 mm Skos agarowy: <48 godzin, i28°C); wzrost dobry, nitkowaty, blyszczacy Pozywka plynna: (48 godzin, 28^C); roetny, nieznaczny osad, sluzowaty przy dotknieciu, brak pierscieni i aglomeratów Agar EBIM: wzrost dobry, barwy rózowo-brazowej, pól- przejrzysty Agar z odtluszczonym mlekiem: 40 wzrost dobry, umiarkowana hydroliza ka¬ zeiny Mleko lakmusowe: wzrost bez zmiany barwy i konsystencji Redukcja azotanów: 45 ujemna Oksydaza: dodatnia Katalaza: dodatnia 50 Indol: ujemny Wytwarzanie H^S: ujemne Czerwien metylowa: 55 ujemna Próba Voges-Proshauera: ujemna Zelatyna: umiarkowane uplynnianie 60 Skrobia: brak hydrolizy Aerobówy, rosnie dobrze w 28°C i w 37°C. Slabe wytwarzanie kwasu z dekstrozy w warunkach utle¬ niajacych po 5 dniach w 28°C. 65 Streptomyces szczep MA 43825 88 619 6 Morfologia: sporofory rozgalezione, krete, tworza wiazki; zarodniki owalne, 0,9Xil,2 mikrona {97 OX), ~$r lancuchach po wiecej niz 10; kultura do¬ brze zarodnikuje na wiekszosci pozywek Agar z pasta pomidorowa i maka owsiana W: spód kolonii barwy ciemnoczerwonej GP: proszkowata, plaska, barwy szarorózo¬ wej <6 ec) RP: barwy jasnoczerwonawobrazowej Agar Czapek-Doxa (agar sacharozowo-azotanowy) W: spód kolonii barwy rózowej GP: proszkowata, plaska, barwy bladoszara- wo-rózowej (5 cfo) RP: barwy jasnorózowej Agar z albumina jaja W: spód kolonii barwy rózowej GP: proszkowata, plaska, srodek banwy bla- doszaraworózowej RiP: barwy jasnorózowobezowej Agar glicerynowo-asparaginowy W: spód kolonii barwy ciemnoczerwonej GP: proszkowata, barwy bladoszaraworózo- wej (5 clb), ibrzegi jasnobezowe (3 ec) RP: barwy rózowobezowej Agar skrobiowy z solami nieorganicznymi W: spód kolonii barwy szaraworózowej GP: proszkowata, barwy jasnobezowej (3 ec) z rózowym odcieniem w srodku kolonii i zielonawym na brzegach RP: barwy rózowobezowej Agar drozdzowo-dekstrozowy z solami W: spód kolonii w srodku barwy czerwo- nawobrazowej, na brzegach ciemnobra¬ zowej : GP: proszkowata, barwy jasnolbrazowej RP: barwy jasnoczerwonawobrazowej Agar drozdzowe-slodowy W: spód kolonii barwy czerwonej GP: proszkowata, barwy bladoszaraworózo¬ wej RP: 'barwy czerwonawobrazowej Agar peptonowo-drozdzowy z zelazem W: spód kolonii barwy kremowej do brazo¬ wej GP: barwy kremowej RP: brak Melanina: ujemna Wytwarzanie HjS: ujemne Agar odzywczy W: spód kolonii barwy ciemnokremowej GP: proszkowata, barwy kremowej RP: brak Agar skrobiowy W: spód kolonii barwy ciemnokremowej GP: proszkowata, barwy kremowej do jasno¬ bezowej RP: brak Hydroliza skrobi: dobra Agar zelatynowy W: spód kolonii barwy rózowawokremowej GP: proszkowata, plaska, barwy bladoszara- worózowej RP: brak Uplynnianie zelatyny: dobre Slupki zelatynowe W: nieznaczny, barwy brazowej, platkowa¬ ty GP: brak RP: brak Uplynnianie zelatyny: calkowite Slupki ziemniaczane W: barwy brazowej GP: dobra, barwy jasnokremowej do jasno¬ bezowej RP: lekkie sciemnienie ziemniaka Pozywka Loefflera z surowica krwi W: barwy kremowej GP: brak RP: brak Uplynnianie: brak Agar z odtluszczonym mlekiem W: spód kolonii barwy ciemnoczerwonawo- kremowej GP: proszkowata, barwy jasnokremowej RP: barwy jasnoczerwonawobrazowej Hydroliza kazeiny: dodatnia Mleko lakmusowe W: dobry wzrost pierscieniowy, 'barwy bra¬ zowej z purpurowym odcieniem GP: umiarkowana, barwy bialej do bezowej Barwa: ciemnopurpurowa górna polowa, bra¬ zowa na spodzie, co swiadczy o redukcji lakmusu Koagulacja i/lub peptonizacja: prawie calko¬ wita peptonizacja, mleko przyjmuje od¬ czyn zasadowy — pH 8,0 Odtluszczone mleko W: dobry wzrost pierscieniowy, Jbarwy bra¬ zowej GP: umiarkowana, barwy bezowej RP: jasnobrazowy Koagulacja i/lub peptonizacja: prawie calko¬ wita peptonizacja, mleko przyjmuje od¬ czyn zasadowy — pH 7,8 Agar tyrozynowy W: spód kolonii barwy ciemnoczerwonej GP: proszkowata, plaska, barwy bladoszara- worózowiej <5 ob), brzegi barwy jasno¬ bezowej <3 ec) RP: 'barwy rózowe] Rozklad tyrozyny: dodatni Pozywka plynna tryptonowo^drozdzowa Purpurowy pigment, który odwracalnie prze¬ chodzi w glejboki czerwonawo^purpurowy pod wplywem NaOH i brazowy pod wplywem HOl Utylizacja wegla Pozywka podstawowa Pridham-Gottlieba + l°/a zródla wegla; + = wzrost, ±-= wzrost slaby lub watpliwy, — =¦ brak wzrostu w porównaniu z ujemna kontrola (brak zródla wegla) glukoza + araibinoza + celuloza — fruktoza + inozytol — laktoza + maltoza + ¦ 40 45 50 55 607 mannitol + mannoza + rafinoza — ramnoza — sacharoza + ksyloza + Zakres temperatury (agar drozdzowo-dekstrozowy z solami) 28PC — wzrost dobry 37°'C — wzrost umiarkowany 50°C -<—.brak wzrostu Zapotrzebowanie "tlenu (kultura na slupku agaru drozdzowo-dekstrozowego z sodami)' aerolbowy Redukcja azotanów — dodatnia Streptomyces szczelp iMA 43(83 Morfologia: sporofory rozgalezione, krete, tworza wiazki; zarodniki owalne od cylindrycznych, 0,9Xl,i2 mikrona (W OX), w lancuchach po wiecej niz ; kultura dobrze zarodnikuje na wiekszosci pozywek Agar z pasta pomidorowa i maka owsiana W: spód kolonii barwy (brazowej GP: ziarnista, barwy brazowej, brzegi zielo- nawobrazowe (2 ec) RP; brak Agar Czapek-Ooxa (agar sacharozowo-azotanowy) W: spód kolonii bezibarwny do jasnokremo- wego GP: cienka, plaska, barwy kremowej RIP: brak Agar z albumina jaja W: spód kolonii barwy brazowej GP: cienka, proszkowata, barwy jasnobezo- wej RIP: brak -Agar iglteerynowo-asjparaginowy W: spód. kolonii barwy czerwonawobrazo- wej GP: ziarnista, barwy bezowej z zóltozielony¬ mi tonami {'2, db); brzegi ;z tonami zsza¬ rzalej zóltawej zieleni (2 db) RP-: brak Agar skrobiowy z solami nieorganicznymi W: spód kolonii barwy brazowej z brzega¬ mi barwy zielonawobrazowej GP: proszkowata do ziarnistej, barwy jasno brazowej z tonami zóltawozielonymi (2 ec) RP: barwy brazowej Agar drozdzowo-dekstrozowy z solami W: spód kolonii barwy brazowej, silnie zmarszczony GP: ziarnista, barwy jasnobrazowej z tona¬ mi zóltawozielonymi (2 ec do 2 RSP: 'barwy brazowej Agar drozdzowo-slodowy W: spód kolonii barwy brazowej GP: ziarnista, barwy jasnobrazowej z tona¬ mi zóltawozielonymi (2 db), brzegi bar¬ wy jasnobrazowej RP: barwy brazowej Agar peptonowo-drozdzowy z zelazem W: spód kolonii barwy czerwonawobrazowej 619 8 GP: proszkowata, barwy kremowej do jasno¬ bezowej RP: brak Melanina: ujemna Wytwarzanie H^S: iujemne Agar odzywczy W: spód kolonii barwy brazowej GP: barwy jasnobezowej RP: brak Agar skrobiowy W: spód kolonii barwy ciemnokremowej GP: barwy kremowej do jasnobrazowej RP: brak Hydroliza skrobi: dobra Agar zelatynowy W: spód kolonii barwy brazowej GP: barwy kremowej RP: brak Uplynnianie zelatyny: dobre Slupki zelatynowe W: umiarkowany, pierscienie barwy jasno¬ brazowej GP: brak RP: barwy jasnobrazowej Uplynnianie zelatyny: calkowite Slupki ziemniaczane W: barwy brazowej GP: barwy jasnokremowej do jasnobezowej RIP: nieznaczne brazowienie ziemniaka Pozywka Loefflera z surowica krwi W: barwy brazowej GP: brak RP: brak Uplynnianie: nieznaczne Agar z odtluszczonym mlekiem W: barwy brazowej GP: barwy kremowej do jasnobezowej RP: brak Hydroliza kazeiny: dodatnia 40 Mleko lakmusowe W: dobry wzrost pierscieniowy, barwy bra¬ zowej z purpurowym odcieniem GP: umiarkowana, barwy bialej do bezowej Barwa: ciemnopurpurowa górna polowa, bra- 45 zowa na spodzie, co swiadczy o redukcji lakmusu Koagulacja i/lub peptonizacja: prawie calko¬ wita pepitonizacja, mleko przyjmuje od¬ czyn zasadowy — pH 8,05 50 Odtluszczone mleko W: dobry wzrost pierscieniowy, barwy bra¬ zowej GP: umiarkowana, barwy bezowej Koagulacja i/lub peptonizacja: prawie calko- 55 wita peptonizacja, mleko przyjmuje od¬ czyn zasadowy — pH 7,85 Agar tyrozynowy W: spód kolonii barwy brazowej GP: ziarnista, barwy szarawobrazowej (3 ge) eo RP: brak Rozklad tyrozyny: dodatni Utylizacja wegla Pozywka podstawowa Pridham-Gottlieba + 1% zródla wegla; + = wzrost, ± = wzrost 65 slaby lub .watpliwy, — = brak wzrostu w88 619 9 porównaniu z ujemna kontrola (brak zródla wegla) glukoza + arabinoza — celuloza — fruktoza + inozytol — laktoza + maltoza 4- mannitoi 4- marmoza + rafinoza — ramnoza — sacharoza + ksyloza + Zakres temjperatury (agar drozdzowo-dekstrozowy z solami) 28°C —wzrost dobry 37°C — wzrost umiarkowany SO^C-^brak wzrostu Zapotrzebowanie tlenu (kultura na slupku agaru drozdzowe-dekstrozowego z solami) aerobowy Redukcja azotanów — ujemna S'trelptomyces szczep MA 4364 Morfologia: sporofory rozgalezione, krete, tworza wiazki; zarodniki owalne do cylindrycznych, 0,9X1,2 mikrona (97 OX) w lancuchach po wiecej niz ; kultura dobrze zarodnikuje na wiekszosci pozywek Agar z pasta pomidorowa i rtiaka owsiana W: spód kolonii 'barwy brazowej GP: ziarnista, barwy umiarkowanie czerwo¬ nawobrazowej <4 ge) RP: barwy jasnobrazowej Agar Czapek-Doxa (agar siaicharozowo-azotanowy) W: spód kolonii barwy kremowej GP: cienka, ziarnista, ibarwy kremowej z od¬ cieniem rózowym RP: brak Agar z albumina jaja W: spód kolonii barwy kremowej GP: cienka, proszkowata, barwy kremowej z rózowym odcieniem RP: brak Agar iglicerynowo-asparaginowy W: spód kolonii barwy ciemnobrazowej GP: (granulowana, barwy umiarkowanie czer- wonawobrazowej (4 ge) RP: barwy brazowej Agar skrobiowy z solami nieorganicznymi W: spód kolonii barwy rózowobezowej GP: granulowana, umiarkowanie czerwona- wobrazowa (4 ge) brzegi barwy jasnobe- zowej (3 ec) RP: barwy czerwonawobrazowej Agar drozdzowo-dekstrozowy z solami W: spód kolonii barwy czerwonawobrazo¬ wej GP: granulowana, -barwy jasnobezowej z to¬ nami czerwonymi RP: barwy czerwonawobrazowej Agar drozdzowo-slodowy W: spód kolonii barwy cz^rw^mwbfcrazo- wej GP: ziarnista, barwy umiarkowanie czerwo¬ nawobrazowej (4 ige) RP: barwy czerwonawobrazowej \ ¦ ' Agar peptonowo-drozdzowy z zelazem W: spód kolonii barwy ibrazowej GP: nbarwy bezowej RP: barwy ciemnobrazowej io Melanina: dodatnia Wytwarzanie H^S: dodatnie Agar odzywczy W: spód kolonii barwy brazowej GP: granulowana, barwy"Jasnobeiowej RP: barwy jasnobrazowej Agar skrobiowy W: spód kolonii barwy brazowej GP: barwy bezowej RP: barwy jasnobrazowej Hydroliza skrobi: dobra Agar zelatynowy W: spód kolonii barwy brazowej GP: barwy kremowej do bezowej Uplynnianie zelatyny: dobre Slupki zelatynowe W: wzrost dobry, barwy brazowej GP: brak RP: barwy brazowej Uplynnianie zelatyny: calkowite Slupki ziemniaczane W: barwy brazowej GP: barwy ciemnokremowej RP: barwy brazowej Pozywka (Lóefflera z surowica krwi W: .barwy kremowej GP: brak RP: brak Uplynnianie: brak Agar z odtluszczonym imlekiem 40 w: spód kolonii barwy czerwonawobrazo¬ wej GP: barwy kremowej-do bezowej * RP: barwy czerwonawobrazowej Hydroliza kazeiny: dodatnia 45 Mleko lakmusowe W: silny wzrost pierscieniowy i powierzch¬ niowy, barwy brazowej do szarej z od- - cieniem purpurowym GP: barwy bialej do bezowej 50 Barwa: brazowawopurpurowa górna polowa, brazowa na spodzie, co swiadczy o re¬ dukcji lakmusu Koagulacja i/lub peptonizacja: prawie calko¬ wita peptonizacja, mleko przyjmuje od- 55 czyn zasadowy — pH 8,2 Odtluszczone mleko W: silny wzrost pierscieniowy, barwy ciem¬ nobrazowej GP: umiarkowana, barwy bezowej 60 RP: barwy ciemnobrazowej Koagulacja iAuib peptonizacja: prawie cal¬ kowita peptonizacja, mleko przyjmuje odczyn alkaliczny — pH 8,35 Agar tyrozynowy 65 W: barwy ciemnobrazowej11 88 619 12 GP; ziarnista, ibarwy umiarkowanie czerwo¬ nawobrazowej, brzegi barwy jasnobezo- wej HP: barwy ciemnobrazowej Rozklad tyrozyny: dodatni Utylizacja wegla Pozywka podstawowa Pridham-Gottlieba + l§/t zródla wegla; + = wzrost, ± = wzrost slaby lub watpliwy, — = brak wzrostu w porównaniu z ujemna kontrola {brak zródla wegla) glukoza + arabinoza ± celuloza — fruktoza + inozytol ± laktoza + maltoza + niannitoi + mannoza + rafinoza ± ramnoza + s charoza + ksyloza + Zakres temperatury (agar drozdzowo-dekstrozowy z solami) 28°C — wzrost dobry 37°C — wzrost umiarkowany 50°C —brak wzrostu Zapotrzebowanie tlenu (kultura na slupku agaru drozdzowo-dekstrozowego z solami) aerobowy Redukcja azotanów — dodatnia Streptomyces szczep MA 4390 Morfologia: sporofory rozgalezione, zarodniki owalne do cylindrycznych, 0,9X1,2 mikrona, (97 OX) w lancuchach po wiecej niz 10, zwinietych w ciasne spirale; kultura dobrze zarodnikuje na wiekszosci pozywek Agar z pasta pomidorowa i maka owsiana W: spód kolonii barwy brazowej GP: proszkowata, plaska, srednio intensyw¬ nej barwy brazowej z rózowymi tonami (4 ge) BP: brak Agar Czapek-Doxa (agar sacharozowo-azotanowy) W: spód kolonii barwy jasnoczerwonawo- brazowej GP: cienka, proszkowata, srednio intensyw¬ nej ibarwy czerwonawobrazowej (4 ge) RP: brak Agar. z albumina jaja W: spód kolonii barwy jasnobrazowej GP: cienka, proszkowata, barwy jasnobrazo¬ wej do umiarkowanie czerwonawobra¬ zowej RP: brak Agar glicerynowo-asparaginowy W: spód kolonii barwy jasnoczerwonawo¬ brazowej do brazowej GP: proszkowata, barwy umiarkowanie czer¬ wonawobrazowej RP: brak Agar skrobiowy z solami nieorganicznymi W: spód kolonii barwy jasnoczerwonawo- brazowej GP: cienka, proszkowata, umiarkowanie in¬ tensywnej barwy czerwonawobrazowej <4ge) RP: brak Agar drozdzowo-dekstrozowy z solami W: spód kolonii barwy brazowej GP: proszkowata, umiarkowanie intensyw- nej barwy czerwonawobrazowej i(4 ge), na brzegach obszary wegetatywnego wzrostu barwy ciemnoczerwonawobrazo- wej RP: brak Agar peptonowo-drozdzowy z zelazem W: barwy brazowej GP: skapa, barwy bezowej RP: brak Melanina: ujemna Wytwarzanie H2S: ujemne Agar odzywczy W: spód kolonii barwy ciemnorózowokre- mowej GP: barwy jasnorózowobezowej RP: brak Agar skrobiowy W: spód kolonii barwy rózowobezowej GP: barwy zszarzalej lawendy RP: barwy jasnoczerwonawobrazowej Hydroliza skrobii: dobra Agar zelatynowy W: spód kolonii barwy kremowej z odcie¬ niem rózowym GP: barwy rózowokremowej RP: brak Uplynnianie zelatyny: dobre Slupki zelatynowe W: wzrost pierscieniowy barwy brazowej GP: brak 40 RP: barwy jasnobrazowej Uplynnianie zelatyny: calkowite Slupki ziemniaczane W: barwy brazowej GP: barwy brazowej 45 RJP: barwy jasnobrazowej Pozywka Loefflera z surowica krwi W: barwy kremowej GP: brak RP: brak 50 Uplynnianie: brak Agar z odtluszczonym mlekiem W: spód kolonii barwy ciemnorózowej GP: proszkowata, umiarkowanie intensyw¬ nej barwy czerwonawobrazowej, z ob- 55 szarami barwy szarawobrazowej RP: barwy ciemnorózowej Hydroliza kazeiny: dodatnia Mleko lakmusowe W: dobry wzrost pierscieniowy, barwy sza- 60 rawobrazowej z purpurowym odcieniem GP: brak Barwa: purpurowa górna polowa, rózowawo- brazowa na spodzie, co swiadczy o re¬ dukcji lakmusu 6o Koagulacja i/lub peptonizacja: calkowita13 ' 88619 14 peptonizacja, mleko przyjmuje odczyn zasadowy — pH 7,6 Odtluszczone mleko W: dobry wzrost pierscieniowy, barwy bra¬ zowej GP: brak RP: barwy rózowawobezowej Koagulacja i/lub peptonizacja: calkowita pep¬ tonizacja, mleko przyjmuje odczyn za¬ sadowy — pH 7,4 Agar tyrozynowy W: spód kolonii barwy czerwonawobrazowej GP: proszkowata, plaska, barwy umiarkowa¬ nie czerwonawobrazowej (4 ge) RP: brak Rozklad tyrozyny: dodatni Utylizacja wegla Pozywka podstawowa Pridham-Gottlieba + 1% zródla wegla; + = wzrost, ± = wzrost slaby lub watpliwy, — = brak wzrostu w porównaniu z ujemna kontrola (brak zródla wegla) glukoza + arabinoza + celuloza — fruktoza + inozytol — laktoza + maltoza + mannitol + mannoza + rafinoza + ramnoza — sacharoza + ksyloza + Zakres temperatury (agar drozdzowo-deksitrozowy z solami) 28°C — wzrost dobry 37°C — wzrost umiarkowany 50°C — brak wzrostu Zapotrzebowanie tlenu (kultura na slupku agaru drozdzowo-dekstrozowego z solami) aerobowy Redukcja azotanów: ujemna W powyzszych opisach organizmów Streptomy- ces „N" oznacza wzrost wegetatywny, „GP" grzyb¬ nie powietrzna, a „RP" rozpuszczalny pigment. Je¬ zeli nie zaznaczono inaczej, odczyty poczyniono po trzytygodniowej hodowli, w 28°C, a pH pozywek doprowadzono do wartosci 6,8—7,2. Barwy okresla¬ no na podstawie Color Harmony Manuel, 1968, wydanie 4, Container Corporation otf America, Chi¬ cago, Illinois.Inne mikroorganizmy, których fermentacja daje w efekcie enzymy utleniajace fenole naleza do kla¬ sy Eumycytes, zwlaszcza podklasy Phycomycetes i Fungi impeitfecti klasy Eumycetes, szczególnie szczepy rodzajów Nucor, iSyncephalastrum, Cun- ninghamella, S. Neurospora i Parasitalla podklas Mucorales i Spihoeriales, a sposród Fungi imper- fecti szczepy rodzajów Penicillium, Aspergillus, To¬ rula i Sterigmatocystis. Szczególnie nadaja sie do wytwarzania tych enzymów nastepujace szczepy ze zbiorów firmy Merck & Co., Inc.: Penicillium chrysogenum MF 3905, Cunninghamella sp. NF 4547, Torula cremoria MY-59, Neurospora sp. MF 2347 i Aspergillus sp. MF 4536. Ponadto: Parasi- tella simplex ATOC (0476 {znany równiez jako Mu- cor parasiticus), Syncephalastrutm nigricans QM 835, Cunninghaimella schinulata QM 35L i Sterigmato¬ cystis nigra NBiRL 367 (ATOC oznacza American Type Culture Collection, a QM oznacza Army Quartermaster Corp. Collection, Natick, Massachu¬ setts).Nizej wymienione kultury zostaly nieodwolalnie zdeponowane w zbiorze kultur Northern Regional Research Laboratories, Department of Agricultu- re, Peoria, Illinois, gdzie sa ogólnie dostepne pod nastepujacymi liczbami NiRRIL: Cunninghamella sp.MF 4547 — NiRRIL 5695, Aspergillus sp. MF 4536 — NRRL 5694, Torula cremoris MY-59 — NftsRL Y7495, Neurospora sp. MF 2347 — NRRL, 5692, Pe¬ nicillium chrysogenum MF 3965 — NRRL 5693.Cechy morfologiczne i hodowlane pierwszych dwu mikroorganizmów sa przedstawione w ponizszych tablicach.Cunninghamella szczep MF 4547 Morfologia: konidiofory proste, rozgalezione, zakon¬ czone powiekszonymi glówkami, pokrytymi konidiami o ksztalcie kulistym do owalnego; grzybnia bez przegród Opis hodowli: na agarze Czapek-tDoxa — welnista, rozprzestrzeniajaca sie, barwy jasnobrazo¬ wej; spód kolonii barwy zóltej. Na agarze slodowym — welnista, rozprzestrzeniajaca sie, barwy jasnorózowobezowej, spód kolonii bar¬ wy brazowej. Agar dekstrozowy Saborauda — welnista, rozprzestrzeniajaca sie, barwy jasnorózowobezowej, spód kolonii barwy zól- tawobrazowej.Aspergillus sp. MF 4536 Morfologia: konotidofory krótMe z lancuchami kuli¬ stych konidii tworzacych kolumnowe glówki Opis hodowli: plaska, rozprzestrzeniajaca sie, bar- 40 wy ciemriooliwkowozielonej do szalwiowozie- lonej; spód kolonii barwy zóltej do zóltawo- zielonej (agar Czapek-Doxa, agar dekstrozo¬ wy Saborauda i agar slodowy) Ponizsze przyklady ilustruje sposób wedlug wy- 45 nalazku, nie.ograniczajac go: Przyklad I. Probówke liofilizowanej kultury Parasitella simplex ATOC 6476 zawiesza sie w 10 ml sterylnej pozywki podstawowej. W probówkach o wymiarach 25X150 mm inokuluje sie powyzsza 50 zawiesine porcja po 10 im! sterylizowanej pozywki podstawowej, zawierajacej w tej objetosci 3000 \vg dl-retikuliny. Do inokulacji kazdej 10 ml porcji stosuje sie 0,3 ml zawiesiny. Inokulowane probów¬ ki inkubuje sie w ZB°C w ciagu 5 di$i na obroto- 55 wej wstrzasarce z 5,2 cm wychyleniein, obracanej z szybkoscia 220 obrotów na minute. Po zdjeciu probówek z wstrzasarki dodaje sie do nich po oko¬ lo 1 "ml 0,6 m NaaHPO^ doprowadzonego za po¬ moca NaH^P04 do pH okolo 8, a nastepnie po 2 60 ml octanu etylu. Probówki silnie wstrzasa sie do otrzymania jednorodnej emulsji. Emulsje przenosi sie do probówek wirowniczych i wiruje do rozbi¬ cia emulsji na rozpuszczalnik i frakcje wodna.Ekstrakt organiczny analizuje sie za pomoca chro- 65 matografii cieczowej i chromatografii cienkowar-15 88 619 16 stwowej, dalej opisanymi sposdbaimi, na obecnosc salutarydyny.Podstawowa pozywke otrzymuje sie rozpuszcza¬ jac w wodzie 10 g dekstrozy, 3 g ekstraktu slodo¬ wego i 8 g agaru Difco i uzupelniajac roztwór wo- 5 da do objetosci 1 litra. Bezposrednio przed uzy¬ ciem doprowadza sie pH pozywki do wartosci 7,0 za pomoca wodorotlenku sodu. Pozywka stala za¬ wiera ponadto w 1 litrze 20 g agaru. Sterylizacje pozywki przeprowadza sie ogrzewajac ja w ciagu io minut w autoklawie w 121°C. dl-Retikuline dodaje sie do pozywki aspetycznie, w postaci sterylnego roztworu wodnego, w takiej ilosci, by stezenie jej w pozywce wynosilo 300 ng 9 mi. Roztwór dl-retikuliny sporzadza sie rozpu- 15 szczajac 6 mig zwiazku w 1 ml wody, doprowadza¬ jac pH roztworu do 7 i sterylizujac go przez sa¬ czenie.Ekstrakt w octanie etylu, otrzymany wyzej opi¬ sanym sposobem, bada sie na obecnosc salutary- 20 dyny za pomoca chromatografii cieczowej na zy¬ wicy anionitowej i/lub zelu krzemionkowym, po¬ stepujac jak nizej opisano: 0,5 ml ekstraktu odparowuje sie do sucha w stru¬ mieniu azotu, a do pozostalosci dodaje sie 0,5 ml 25 wodorotlenku sodu, doprowadzonego do pH 11. 10 mikrolitrów roztworu wprowadza sie na kolumne anionitowa i porównuje czas retencji pików na chromatograimie z czasem retencji /+/ salutarydy¬ ny. Typowe wartosci czasu retencji izosalutarydy- 30 ny, /+/ salutarydyny i /—/ retikuliny na kolum¬ nie anionitowej wynosza odpowiednio 4,2, 6,0 i 13,5 minut. Jezeli jeden z pików na chromatogramie uzyskanym na kolumnie anionitowej ma czas re¬ tencji taki jak /+/ salutarydyna, to dla dodatko- 35 wego potwierdzenia identyfikacji 10 mikrolitrów ekstraktu w octanie etylu nanosi sie na chroma¬ tograf cieczowy wyposazony w kolumne z zelem krzemionkowym. Typowy czas retencji /+/ salu¬ tarydyny i /—/ retikuliny na kolumnie z zelem 40 krzemionkowym wynosi odpowiednio 8,2 i 1<8,0 mi¬ nut. W ponizszej tablicy przedstawiono warunki chromatografii cieczowej z zastosowaniem kolumn wypelnionych zywica anionitowa i zelem krzemion¬ kowym. 45 Typ chromatografii: anionowy- adsorpcyjna mienna Kolumna DuPont SAX Nester/iFaust (0,5 m) SIL-X (1 m) 50 Eluent 0,01 m boran cMoroform/me- sodti i(pH 9)/ tanol (9 :1) 0,01 m azotan sodu Cisnienie 55 na kolumnie: 14 atm 50 atm Szybkosc przeplywu 0,4 ml/min 0,6 ml/min Temperatura pokojowa pokojowa Detektor (UV-254) 0,01 OD 0,0il OD eo Szybkosc przesuwu tasmy 0,2" (5,2 mm)/ 0,2" (5,2 mm)/ min min Objetosc injekcji 10 mikrolitrów 10 mikrolitrów Brzeczki fermentacyjne, w których za pomoca 65 chromatografii cieczowej wykryto /+/ salutarydy- ne bada sie w dwóch róznych ukladach chromato¬ grafii cienkowarstwowej, w sposób nizej opisany: na plyte chromatograficzna nanosi sie ekstrakt z brzeczki w octanie etylu, mieszanine ekstraktu z /+/ salutarydyna i czysta /+/ salutarydyne (2 \ig).Rozwiniete plyty obserwuje sie w swietle nadfio¬ letowym na promieniowanie nadfioletowe) i wywoluje pa¬ rami jodu. Drugi sposób moze uwydatnic absorpcje w nadfiolecie. Granica wykrywalnosci kazdego ze sposobów wynosi okolo 1 \ig, co odpowiada 0,25e/o wydajnosci w calej objetosci brzeczki.Uklad chromatograficzny A; metanol/aceton/chlo¬ roform (1 :1:8) na plytach pokrytych zelem krze¬ mionkowym (Silica Gel, Quantum Industries). W tym ukladzie obserwuje sie nastepujace znaczace plamy, uszeregowane wedlug malejacej ruchli¬ wosci: Plama Rf Absorpcja Reakcja z I2 UV Niezidentyfiko¬ wana I 0,65 slaba barwa brazowa /+/ salutarydyna 0,6 silna zólta Niezidentyfiko¬ wana II 0,5 slaba zólta Izosalutarydyna 0,45 silna zólta Izoboldyna 0,3 slaba purpurowa /—/ retikulina 0,1 slaba zólta Uklad chromatograficzny B; chloroform na tlen¬ ku glinu F254 typ T V(E. Merck). Sposród wyzej wymienionych zwiazków, tylko /+/ salutarydyna wedruje z miejsca startu (Rif 0,3), a wystawiona na dzialanie par jodu przyjmuje charakterystyczna barwe szara, szybko przechodzaca w zólta.Przykladu. Za pomoca sterylnej ezy ino¬ kuluje sie zawiesina Parasitella simplex ATCC 6476, otrzymana w sposób opisany w przykladzie I, powierzchnie skosu agarowego, zawierajacego po¬ zywke podstawowa. Skosy inkubuje sie w ciagu dni w 28°C, w którym to czasie nastepuje ofafity wzrost kultury. Kilkoma zawartosciami ezy, zebra¬ nymi z hodowli grzyba na skosie inokuluje sie 40 ml sterylnej pozywki podstawowej. Otrzymana za¬ wiesina inokuluje sie opisana w przykladzie I po¬ zywke podstawowa, rozlana do kol o pojemnosci 250 ml w ilosci po 40 ml na kolbe i zawierajaca w 1 ml 300 mikrogramów dl-retiku¬ liny. Do kazdej z kolb wprowadza sie po 1 ml za¬ wiesiny. Inokulowane kolby i kolby kontrolne, nie zawierajace retikuliny inkubuje sie w ciaigu 5 dni w 28°C na wstrzasarce obrotowej. Nastepnie za¬ wartosc kolb zlewa sie i zarówno brzeczke fermen¬ tacyjna zawierajaca retikuline jak i brzeczke kon¬ trolna bada na zawartosc salutarydyny. Stwierdzo¬ no, ze ibrzeczki kontrolne nie zawieraja salutary¬ dyny, zwiazek ten znaleziono natomiast w brzecz¬ kach zawierajacych dl-retikuline.Przyklad III. Hodowla Parasitella simplex ATCC 6476 na skosie aigarowym, opisana w przy¬ kladzie II, inokuluje sie pozywke podstawowa roz¬ lana porcjami po 40 ml do kolb Erlenmayera o pojemnosci '250 ml. Kolby inkubuje sie na wstrza¬ sarce w ciagu 2 dni w 28°C. Otrzymana hodowla posiewowa inokuluje sie 60 kolb zawierajacych po17 88 619 18 40 ml podstawowej pozywki z retikudina w steze¬ niu 300 ^ig/ml, wprowadzajac do kazdej z kolb po 1 ml hodowli. Po inkubacji prowadzonej w ciagu dni w 28°C, na wstrzasarce, bada sie brzeczke fermentacyjna na zawartosc salutarydyny.Przyklad IV. Zawartosc jedrnej ezy hodowli na skosie agarowym szczepu Parasitella simplex ATOC 6476 przenosi sie do 10 ml sterylnej pozywki podstawowej. Otrzymana zawiesina (0,25 ml) inku- luje sie prp,bówki o wymiarach 25X150 mm, za¬ wierajace 10 ml sterylnej pozywki podstawowej z dl-retikulina w stezeniu 300 (Ag/ml. Inokulowane probówki inkubuje sie w 28°C na wstrzasarce ob¬ rotowej. Poszczególne probówki bada sie na za¬ wartosc salutyrydyny po 4, 5, 6, 7, a, 9 i 10 dniach inkubacji. W ponizszej tablicy przedstawiono wy¬ niki oznaczen salutarydyny w brzeczce fermenta¬ cyjnej, przeprowadzonych opisanymi sposobami: Inkubacja Zawartosc salutarydyny dni g/ml krysztalów barwy jasnozóltej, o temperaturze top¬ nienia 31fc—ai4°C, [a]D +14,7 ± 7^8 /c 0,48, MeOH/, XmaxMeOH (2(80 n^i, /e =6,050/, 241 n^i /e = 18,900/, wM- mo magnetycznego rezonansu jadrowego /QDCV: t 2,66 /C5 —H/, 3,47 /AB kwartet, ¦C1— H i C, —H/, 3,83 /Cg —H/, 6,21 i 6,34 /OCH8/ i 7,61% o /NCH,/, identyczne z widmem /+/ salutarydyny. Widmo masowe M 327, m/e 312, 299, 2i84. Widmo magne¬ tycznego rezonansu jadrowego izosalutarydyny /CDC13/: t 3,37 /G5 — H/, 3,46 /C4 — H/, 3,«0 lCY — H/, 3,83 /C8^H/, 6,19 i 6,28 /OCH,/ i 7,59% o /N —CH,/, wszystko singlety.Przyklad VI. 1 litr sterylizowanej pozywki podstawowej, zawierajacej ;dekstroze, ekstrakt droz¬ dzowy, agar odzywczy Biico i 400 mg dwuwodzia- nu chlorowodorku- /—/ retikuliny [/—/ retikuii- na.HCl.2HiO, równowazniik 339 mg zasady] dnokulu- je sie szczepem Parasitella simplex ATCG 6476 i inkubuje z napowietrzaniem w ciagu 6 dni w 28°C. Do brzeczki fermentacyjnej dodaje sie 100 ml 0,5 «m fosforanu dwusodowego. i 250 ml benze¬ nu. Calosc starannie miesza sie i przesacza, oddzie¬ la warstwe organiczna, a warstwe wodna ekstra¬ huje dodatkowa porcja 250 ml benzenu. Polaczone ekstrakty benzenowe suszy sie nad siarczanem so¬ du i w atmosferze azotu ekstrahuje dwiema por¬ cjami po 50 ml 1 n wodorotlenku sodu. Polaczone zasadowe ekstrakty przemywa sie benzenem, 85% kwasem fosforowym zakwasza do pH 7,5 i dwu¬ krotnie ekstrahuje porcjami po 2)00 ml benzenu.Polaczone ekstrakty benzenowe suszy sie nad siar¬ czanem sodu i odparowuje do sucha pod zmniej¬ szonym cisnieniem, otrzymujac w pozostalosci su¬ rowa /+/ salutarydyne, która poddaje sie chroma¬ tografii sposobem opisanym w przykladzie V, otrzy¬ mujac frakcje /+/ salutarydyny, kitóra po prze- krystalizowaniu z octanu etylu topnieje w tempe¬ raturze 191—194°C (temperatura topnienia próbki /+/ salutarydyny wynosi 190—194°C). Dyspersja skrecalnosci optycznej w etanolu otrzymanego pro¬ duktu i próbki' /+/ salutarydyny sa identyczne.Przyklad VII. Duza liczbe identycznych pro¬ bówek, zawierajacych pozywke podstawowa i 300 Hg/ml /—/ retikuliny inokoluje sie hodowla Para¬ sitella simplex ATCC 6476 i inkubuje w sposób opisany w przykladzie I. Rozpoczynajac od trze¬ ciego dnia hodowli, wykonuje sie podwójne ozna¬ czenia pH i badania brzeczki, w sposób wyzej opi¬ sany. Wyniki oznaczen przedstawiono w ponizszych tablicach: Czas trwania mentacji 3 4 6 7 8 9 11 1'2 Brzeczka pH 7,2 7,6 8,0 8,0 84 8,3 8,5 8,7 8,8 8,8 Salutarydyna Mg/ml 0,1 1,1 2,8 1,1 3,9 3,4 ,6 ,1 4,4 4,7 Przyklad VIII. 500 ml standardowej pozyw¬ ki podstawowej opisanej w przykladzie I i zawie- 4 0,5 0,9 6 3;6 7 1,4 8 3,5 9 2,9 5,7 Przyklad V. Brzeczke otrzymana w wyni¬ ku fermentacji 2250 ml pozywki podstawowej z zawartoscia 67i5 mg dl-retikuliny, w sposób opisa¬ ny w przykladzie III alkalizuje sie do pH 84 do¬ datkiem 14,fi g fosforanu dwusodowego. Zalkali- zowana brzeczke miesza sie z 500 mi octanu ety¬ lu i przesacza. Wodna warstwe przesaczu ekstra- 35 huje sie dwukrotnie porcjami po 350 ml octanu etylu, a polaczone ekstrakty suszy nad siarczanem sodu i zateza pod zmniejszonym cisnieniem. Po¬ zostalosc poddaje sia pod azoitem Tozdzialowi mie¬ dzy 100 mi 4% roztworu wodorotlenku sodu i 40 100 ml benzenu. Warstwe wodna przemywa sie dalsza porcja benzenu i 85% kwasem fosforowym zakwasza do huje sie w atmosferze azotu trzema porcjami po 100 ml chloroformu, ekstrakty laczy, suszy i od- 45 parowuje. - Pozostalosc poddaje sie chromatografii na trzech plytach pokrytych zelem krzemionkowym (E. Merck, 2 mm, ,20X20 cm), w ukladzie 20% metanol w chloroformie.Na rozwinietych plytach obserwuje sie w swietle 50 nadfioletowym dwa intensywne pasma, które ze- skrobuje sie. Zeskrobana krzemionke ekstrahuje sie metanolem, odparowuje a pozostalosc po odparo¬ waniu metanolu ponownie ekstrahuje dwuchloro- metanem, otrzymujac material pozbawiony krze- 55 mionki. Pasmo wolniej wedrujace zidentyfikowa¬ no jako izosalutarydyne. Pasmo szybciej wedruja¬ ce poddaje sie oczyszczeniu na dwóch plytach po¬ krytych tlenkiem glinu (20X20 cm, E. Merck) sto¬ sujac jako rozpuszczalnik chloroform (Rf okolo 0,3). 60 Z produktu zawartego w tym pasmie otrzymuje sie wyzej opisanym sposobem 13,4 mg salutarydyny wzbogaconej w izomer prawoskretny. Produkt ma postac krysztalów barwy zóltej.Krystalizacja z 0,2 ml octanu etylu daje 7,1 mg 65 40 45 50 55 6088 619 19 20 rajacej dl-retikuline w stezeniu 300 ng/ml rozle¬ wa sie na plyte o wymiarach 20X30 cm. Powierzch¬ nie pozywki inokuluje sie rozsiewajac na niej za¬ wiesine zarodników ParasiteMa simplex ATCC 6476, a nastepnie prowadzi inkubacje w ciagu 5 dni w 28°C. Po uplywie tego czasu usuwa sie gesta ma¬ te hodowli z powierzchni plyty i przenosi na inna, zawierajaca jedynie 500 ml 0^1 m buforu octano¬ wego (pH 5,0). Mate utrzymuje sie w ciagu godzi¬ ny na powierzchni buforu, z lekkim kolysaniem, a nastepnie ponownie przenosi sie na plyte zawie¬ rajaca ten sam bufor z Oyl°/o zawartoscia dekstro- zy i 300 ng/ml retikuliny. Plyta inkubuje sie w 28°C w ciagu dalszych 6 dni. Po uplywie 5 dni pozywka hodowlana zawiera 1,3 ng/ml /+/ salu- tarydyny, a pozywka z komórkami w fazie spo¬ czynkowej, po uplywie dalszych 6 dni, 243 mg tego zwiazku. IW fazie spoczynkowej nie stwier¬ dzono wystepowania dodatkowego wzrostu.Przyklad IX. Pozywki zawierajace 300 ^g/rnl /—/ retikuliny, o skladzie przedstawionym w po¬ nizszej talblicy, inokulowano hodowla Parasitella simplex ATCC 6476. Brzeczki analizowano po 4 dniach fermentacji.Sklad pozywki*) Saluitarydyna ^g/ml Standardowa pozywka drozdzowo-slo- dowo-glukozowa+CaCOa w ilosci 1 g w kolbie Standardowa pozywka drozdzowo-slo- dowo-glukozowa+Tween 20 w ilosci 1 kropla na kolibe 2*/o glukozy+5% maki sodowej 2Vo glukozy+5% maki sojowej + 0,3°/o ekstraktu drozdzowego 2*/§ glukozy+2% namoku kukury¬ dzianego 2% glukozy +'5ó/o namoku kukury¬ dzianego +0,3% ekstraktu drozdzowe¬ go 2*/t glukozy+5e/o namoku kukury¬ dzianego+2*/o maki sojowej Standardowa pozywka drozdzowe-slo- dowo-glukozowa (kontrolna) 2,2 Przyklad X. Przeprowadzono fermentacje opisana w przykladzie I, z tym, ze w miejsce Pa¬ rasitella simplex uzyto nastepujacych mikroorga¬ nizmów: Streptomyces sp. MA 4382, Streptomyces sp. MA 4383, Streptomyces sp. MA 4384, Strepto¬ myces sp. MA 4390, Streptomyces griseufc MA-8, Penicillium chrysigenum MF 3965, Syncephalastrum nigricans MF 2684, Cunninghamella echinulata MF 27)57, Torula cremoris MY-59, Pseudomonas sp. MB 3119, Cunninghamella sp. IMF 4547, Neurospora sp.MF 2347, Aspergillus sp. MF 4536, Sterigmatocystis nigra MF 523. We wszystkich przypadkach badania brzeczki fermentacyjnej wykazaly obecnosc /+/ sa- lutarydyny. 3,2 3,4 2,4 2,2 1,7 1,5 1,8 *) Wszystkie pozywki (z wyjatkiem zawierajacych CaCOs) doprowadzono do pH 7,0. Bozlewano do kolb Erlenma- yera o pojemnosci 250 ml, w ilosci po 40 ml pozywki na kolbe./+/ Salutarydyne, otrzymana wyzej opisanymi sposobami, przeprowadza sie, znanymi sposobami, w cenny alkaloid — tabeine. PL PL PL

Claims

1. Zastrzezenia patentowe 5 1. Sposób wytwarzania /+/ salutarydyny z /—/ retikuliny, znamienny tym, ze /—/ retikuline pod¬ daje sie bezposredniemu zetknieciu z utleniajacym fenole enzymem, stanowiacym produkt uzyskany z 10 fermentacji szczepu klasy obejmujacej Schizomy- cetes i Eumycetes w wodnym srodowisku odzyw¬ czym.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji 15 szczepu nalezacego do rzedu Pseudomonadeles lub Actinomycetales.

3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji szczepu nalezacego do gatunku Pseudomonas. 20

4. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji szczepu nalezacego do gatunku Streptomycetes.

5. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji 25 szczepu Streptomycetes griseus.

6. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji szczepu Strepotmycetes sp. NRRL 5i088.

7. Sposób wedlug zastrz. /I, znamienny tym, ze stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji szczepu nalezacego do podklasy Phycomycetes lub Fungi impenfecti.

8. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji 35 szczepu nalezacego do rzedu Mucorales lub Spho- eriales.

9. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji szczepu nalezacego do gatunków z grupy Mucor, 40 Syncephalastrum, Cunninghamella, E.Neurospora i Parasitella.

10. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym ze stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji szczepu Perasitella simplex ATCC 0476. 45

11. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji szczepu Cunninghamella sp. NiREL 5695.

12. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze stosuje sie enzyim, stanowiacy produkt fermentacji szczepu Syncepholastrum nigricans QM 835.

13. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji szczepu nalezacego do rzedu Moniliales.

14. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze 5_ stosuje sie enzym, stanowiacy produkt fermentacji szczepu nalezacego do gatunków Penicillium, As¬ pergillus, Torula lub Sterigmatocystis.

15. Siposób wytwarzania /+/ salutarydyny z /—I retikuliny, znamienny tym, ze w wodnym srodo- m wisku odzywczym, zawierajacym ./—/ retikuline, prowadzi sie fermentacje szczepu nalezacego do klasy obejmujacej Schizomycetes i Eumycetes, po czym ewentualnie wyodrebnia sie /+/ salutarydy¬ ne z brzeczki fermentacyjnej. 65 ,

16. Sposób wedlug zastrz. 15, znamienny tym, ze 5088 619 prowadzi sie fermentacje szczepu Parasitella Sim- plex ATCC 6476.

17. Sposób wedlug zastrz. 15, znamienny tym, ze prowadzi sie fermentacje szczepu Cunnimghamella sp. NRRL 5695. 22

18. Sposób wedlug zastrz. 15, znamienny tym, ze /+/ salutarydyne wyodrebnia sie za pomoca eks¬ trakcji odfiltrowanej, zalkalizowanej brzeczki po¬ fermentacyjnej rozpuszczalnikiem niemieszajacym sie z woda. CH3Q FKich CH3O M\ICK Schemat PL PL PL