CN103911292A - 一株耐受低盐的裂殖壶菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐受低盐的裂殖壶菌及其应用，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8313，保藏日期为：2013年10月9日，分类命名为：裂殖壶菌(Schizochytrium)B4D1。本发明所述裂殖壶菌B4D1能够在低盐浓度下高效表达DHA；因此，其在DHA生产过程中基本不会对设备造成腐蚀，延长设备使用寿命，降低了生产成本；另一方面低盐度的废水也不会对后期处理造成影响，可以很方便的去除掉废水中的大部分有机物，使废水中的COD值易于达到排放标准，保护环境。

Description

一株耐受低盐的裂殖壶菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物应用领域，特别涉及一株耐受低盐的裂殖壶菌及其应用。 

背景技术

二十二碳六烯酸(cis-4,7,10，13，16，19-docosahexaenoic acid，简称DHA)因其在人体体内的重要生理作用越来越受到人们的重视。研究表明，DHA是人体某些组织中细胞膜的基本组分，对婴儿视觉系统和神经系统的发育起着重要作用，此外，它还具有降低胆固醇，抗凝血、预防癌症等生理作用。传统的DHA从深海鱼油中获得，但从鱼油中提取的PUFAs存在着产量不稳、得率低、及含农药残留等问题，并且随着渔业资源的日益紧张，传统的DHA资源已无法满足日益增长的市场需求。因此，开发DHA的新生资源已成为新的研究热点。 

裂殖壶菌(Schizochytrium)是隶属于破囊壶科的一种海洋真菌，该菌中DHA含量丰富，还含有少量的DPA，而其他不饱和脂肪酸的含量很低。破囊壶科真菌不致病、不产毒，美国FDA将其列为公认安全级(Generally Recognized as Safe，GRAS)。此外，裂殖壶菌具有生产周期短、培养简单等优势，被认为是一种具有潜力的DHA的新生资源，是目前进行工业化培养、作为DHA来源最理想的物种之一。 

由于裂殖有壶菌的海生属性，其生长过程要求有适宜的盐度，Zhu等人发现在培养基盐度在1.8-3.6％范围内变化时，裂殖壶菌的干重变化不大，干重平均值为24.51g/L，但是当盐度将至0.9％和0％时，裂殖壶菌的干重明显 降低，分别为18.75g/L和7.86g/L；就油脂含量而言，当盐度从3.6％降至0.9％时，油脂含量从41.34％上升至48.97％，但盐度继续降至0％时，油脂含量则骤降至30.55％(Zhu L，Zhang X，Ji L，et al.Changes of lipid content and fatty acid composition of Schizochytrium limacinum in response to different temperatures and salinities[J].Process Biochemistry,2007，42(2)：210-214.)。陈诚对Schizochytrium limacinum SR21的培养条件进行优化后，认为培养基中海水晶浓度为20g/L时能能够得到较高的DHA产量(陈诚.裂殖壶菌Schizochytrium limacinum SR21发酵制备二十二碳六烯酸(DHA)过程的初步研究[D].浙江大学，2007.)；T.Yaguchi等在对Schizochytrium limacinum SR21进行发酵生产DHA时，在培养基中加入了50％的人工海水(YaguchiT，Tanaka S，Yokochi T，et al.Production of high yields of docosahexaenoic acid by Schizochytriumsp.strain SR21[J].Journal of the American Oil Chemists′Society,1997，74(11)：1431-1434.)。由于在生产过程中一般会采用盐度大于或等于15％的培养基来培养裂殖壶菌，这样高盐度的培养基一方面会加速设备的腐蚀，增加生产成本；另一方面高盐度也会影响废水中有机物的生物处理效果，容易造成生产废水COD超标。因此选育一种能够在低盐浓度下高效表达DHA的微生物对工业生产的改良具有重要的作用。 

发明内容

本发明目的在于提供一株耐受低盐的裂殖壶菌。本发明是利用诱变方法对出发菌株进行诱变筛选出可以在低盐浓度下高效表达DHA的耐受低盐的裂殖壶菌B4D1。 

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为： 

一株耐受低盐的裂殖壶菌，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8313，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日 期为：2013年10月9日，分类命名为：蛞蝓形裂殖壶菌（Schizochytrium limacinum）。 

优选的是，所述裂殖壶菌B4D1是将裂殖壶菌SR21经诱变方法处理后筛选得到的。 

优选的是，将所述裂殖壶菌SR21在无菌条件下用5-20w紫外灯在距离20-60cm处照射10-60s进行诱变处理。 

优选的是，将所述无菌条件下用8w紫外灯在距离25cm处照射10s进行诱变处理。 

优选的是，其在生产DHA中的应用。 

优选的是，其在生产DHA的应用中所用培养基中盐含量为0.18～0.7％。 

本发明的有益效果是本发明将裂殖壶菌SR21做为出发菌株诱变育种，选育得到的一株可耐受低盐的裂殖壶菌B4D1，其能够在低盐浓度下高效表达DHA；所述裂殖壶菌B4D1培养菌体以产生DHA过程中所用培养基中盐含量为0.18～0.7％，与其他裂殖壶菌在生产过程中一般会采用盐度大于或等于15％的培养基来培养裂殖壶菌相比较，产生同量的DHA时对盐度的要求要低很多，因此，本发明所述裂殖壶菌B4D1在DHA生产过程中基本不会对设备造成腐蚀，延长设备使用寿命，降低了生产成本；另一方面低盐度的废水也不会对后期处理造成影响，可以很方便的去除掉废水中的大部分有机物，使废水中的COD值达到排放标准，保护环境。 

附图说明

图1为本发明所述裂殖壶菌SR21的经紫外线照射后的致死率曲线。 

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。 

实施例1：所述耐受低盐的裂殖壶菌诱变筛选方法为： 

1)将裂殖壶菌SR21进行菌种活化，培养获得裂殖壶菌SR21单菌落； 

2)挑取裂殖壶菌SR21单菌落于液体培养基一中，在24～26℃条件下，100-250rpm振荡培养1-2天后，将震荡培养获得的菌液涂布在固体平板上； 

3)无菌条件下用5-20w紫外灯在距离20-60cm处照射所述固体平板10-60s； 

4)将所述固体平板置于暗处24～26℃培养1-3天至长出单菌落，选取致死率在致死率在80-90％之间的所述固体平板挑取单菌落分别进行接入液体培养基中，在24～26℃条件下，600-1000rpm振荡培养2-5天； 

5)采用吸光光度法和荧光光谱法检测各液体培养基二中细胞含量和对应细胞中油脂含量均较高的菌株为初选菌株； 

6)通过气相色谱法测定所述初选菌株中的DHA含量并筛选出DHA产量高的再选菌株； 

7)将所述再选菌株进行传代培养，传至数代后，测定所述再选菌株的第一代和数代后的DHA产量，保留遗传稳定性好的所述再选菌株，即为B4D1。 

所述液体培养基一的成分为： 

50-100％的海水或人工海水、浓度为10-40g/L的葡萄糖溶液为碳源和浓度为1-10g/L的玉米浆或酵母抽提物或蛋白胨为氮源，配制好的培养基调整pH在4-8范围内。 

所述液体培养基二的成分为： 

5-20％的海水或人工海水、浓度为10-40g/L的葡萄糖溶液为碳源和浓度为1-10g/L的玉米浆或酵母抽提物或蛋白胨为氮源，配制好的培养基调整pH在4-8范围内。 

所述出发菌株裂殖壶菌(Schizochytrium)SR21。保藏单位：日本大阪发酵研究所(IFO)，保藏地址：日本大阪，保藏号：SR21。 

从所述液体培养基一和所述液体培养基二的成分可以看出诱变后得到的 菌B4D1比出发菌SR21生活所需盐度大大降低。 

实施例2：裂殖壶菌的选育诱变 

1)挑取裂殖壶菌SR21单菌落，于含有50mL液体培养基的锥形瓶中25℃、200rpm条件下振荡培养1天，无菌条件下5000rpm离心5min收集菌体，用0.5％无菌氯化钠溶液洗涤两次，最后再用0.5％无菌氯化钠溶液重悬菌体； 

2)将菌悬液涂布在低盐固体培养基(葡萄糖30g/L，酵母抽提物2g/L，蛋白胨2g/L，海水晶5g/L，琼脂粉15g/L)上，于无菌条件下用8w紫外灯在距离25cm处处理上述平板0-50s，于暗处25℃培养3天，计算不同条件下的致死率(如图1所示)。 

3)根据图1选择致死率在90％左右诱变时间为10s左右的菌株，挑取单菌落，至96孔板中培养，于25℃条件下，600-1000rpm振荡培养3天； 

4)以OD₆₈₀和尼罗红染色荧光强度为指标，进行第一轮筛选，筛选出细胞数和油脂含量均较高的菌株； 

5)然后以DHA产量为指标，进行第二轮筛选，通过气相色谱法测定菌体中的DHA含量，确定DHA产量最高的菌株为B4D1。 

裂殖壶菌诱变株B4D1与出发株SR21在低盐培养基(葡萄糖30g/L，酵母抽提物2g/L，蛋白胨2g/L，海水晶5g/L)中的特性对比如表1，可以看出与出发株SR21相比，诱变株B4D1在低盐环境下的干重和DHA产量均得到提高。 

表1裂殖壶菌诱变株和出发株特性的比较 

实施例3：B4D1遗传稳定性 

将B4D1在低盐培养基斜面(葡萄糖30g/L，酵母抽提物2g/L，蛋白胨2g/L，海水晶5g/L，琼脂粉15g/L)上进行传代，每2天传代一次，传至10代后，分别对B4D1第一代和B4D1第十一代在低盐培养基(葡萄糖30g/L，酵母抽提物2g/L，蛋白胨2g/L，海水晶5g/L)进行培养，培养结果如表2所示，说明B4D1遗传稳定性好。 

菌株	细胞干重(g/L)
		B4D1第一代	7.91
B4D1第十一代	8.02

表2B4D1第一代和第十一代特性比较 

实施例4：裂殖壶菌B4D1的低盐补料发酵生产 

将生长在斜面上的裂殖壶菌B4D1在低盐培养基中(葡萄糖30g/L，酵母抽提物2g/L，蛋白胨2g/L，海水晶5g/L)活化36h，然后接种至5L发酵罐中。 

发酵罐培养基为：葡萄糖60g/L，酵母抽提物10g/L，蛋白胨10g/L，海水晶5g/L。发酵48h后，进行补料，补料为：葡萄糖400g/L，酵母抽提物10g/L，海水晶5g/L。 

培养132h后停止发酵，发酵液的细胞干重达52.5g/L，DHA含量高达10.2g/L，相同发酵条件下出发株SR21发酵液的细胞干重达为35.32g/L，DHA含量为5.32g/L。 

上述实施例说明本发明所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)B4D1能够在低盐浓度下高效表达DHA，可应用于大规模生产，且在DHA生产过程中基 本不会对设备造成腐蚀，延长设备使用寿命，降低了生产成本，生产的DHA可用作多不饱和脂肪酸来源补充的保健品，也可以作为食用油、乳制品和谷制品等领域的食品添加剂，也可作为水产和畜牧养殖等的饲料添加剂等。 

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。 

Claims (6)

1.一株耐受低盐的裂殖壶菌，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8313，保藏日期为：2013年10月9日，分类命名为：裂殖壶菌(Schizochytrium)B4D1。

2.如权利要求1所述耐受低盐的裂殖壶菌，其特征在于，所述裂殖壶菌B4D1是将裂殖壶菌SR21经诱变方法处理后筛选得到的。

3.如权利要求2所述耐受低盐的裂殖壶菌，其特征在于，将所述裂殖壶菌SR21在无菌条件下用5-20w紫外灯在距离20-60cm处照射10-60s进行诱变处理。

4.如权利要求3所述耐受低盐的裂殖壶菌，其特征在于，将所述无菌条件下用8w紫外灯在距离25cm处照射10s进行诱变处理。

5.如权利要求1～4任一项中所述耐受低盐的裂殖壶菌，其特征在于，其在生产DHA中的应用。

6.如权利要求5所述耐受低盐的裂殖壶菌，其特征在于，其在生产DHA的应用中所用培养基中盐含量为0.18～0.7％。