CN104694402A

CN104694402A - 裂殖壶菌sta-m-3及其应用和产生裂殖壶菌的方法

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Publication number: CN104694402A
Application number: CN201410345189.8A
Authority: CN
Inventors: 李德茂; 王迪; 陈树林; 张可; 王海军; 陈吴西
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2014-07-17
Filing date: 2014-07-17
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2034-07-17
Also published as: CN104694402B

Abstract

本发明公开了一种裂殖壶菌(Schizochytrium)STA-M-3，该裂殖壶菌被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.9381，保藏时间为：2014年6月25日。本发明还公开了一种产生裂殖壶菌的方法，包括如下步骤：步骤一、以裂殖壶菌B4D1和黑曲霉CGMCC3.316作为两亲本，制备两亲本的原生质体；步骤二、将两亲本的原生质体融合；步骤三、将融合后的原生质体接种于淀粉培养基上培养，得到裂殖壶菌STA-M-3。本发明还公开了一种利用裂殖壶菌生产DHA的方法，裂殖壶菌STA-M-3在淀粉培养基中培养，产生DHA。本发明解决了DHA产品价格比较高的问题。

Description

裂殖壶菌STA-M-3及其应用和产生裂殖壶菌的方法

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，涉及一种原生质体融合技术，特别涉及通过原生质体融合构建直接利用淀粉生产DHA的新型裂殖壶菌的方法，特别涉及裂殖壶菌STA-M-3及其应用。

背景技术

DHA(Docosahexaenoic acid，二十二碳六烯酸)，是一种具有重要生理意义和经济价值的多不饱和脂肪酸。DHA不仅是婴幼儿大脑、视觉正常发育的必需物质，而且在延缓老年人大脑和视觉功能衰退、降低血脂、抑制血栓形成、调节免疫功能、抑制肿瘤、防治炎性疾病等方面也有积极的作用。通过微生物发酵法制备DHA，与传统鱼油的来源相比，具有不饱和脂肪酸成分单一、产品质量稳定、无鱼腥味等诸多优点，其发展前景广阔。

裂殖壶菌是生产DHA的理想菌株，其脂质多不饱和脂肪酸组成简单，主要是DHA和DPA，其他多不饱和脂肪酸如EPA、AA含量不到0.5％，而且它耐机械搅拌，对剪切力有较强的耐受能力。通过条件优化，发酵罐培养5天，生物量可达59.2g/L，DHA产量可达15.5g/L。

国内外的研究主要集中在用裂殖壶菌以葡萄糖为底物高效发酵产DHA，但是葡萄糖原料比较贵，导致产品价格比较高。

发明内容

为此，本发明的目的之一是提供一种裂殖壶菌Schizochytrium STA-M-3；

本发明的又一目的是提供一种产生裂殖壶菌的方法；

本发明的再一目的是提供一种利用裂殖壶菌生产DHA的方法；本发明提供的裂殖壶菌Schizochytrium STA-M-3以淀粉为碳源生产DHA，解决了DHA产品价格比较高的问题。

本发明提供的技术方案为：

一种裂殖壶菌Schizochytrium STA-M-3，其分类命名为裂殖壶菌，所述裂殖壶菌被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.9381，保藏时间为：2014年6月25日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，本发明中称为裂殖壶菌STA-M-3。

一种产生所述裂殖壶菌的方法，包括如下步骤：

步骤一、以裂殖壶菌B4D1和黑曲霉CGMCC3.316作为两亲本，制备两亲本的原生质体；裂殖壶菌B4D1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8313，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2013年10月9日，分类命名为：蛞蝓形裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)。黑曲霉CGMCC3.316在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8313，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

步骤二、将两亲本的原生质体融合；

步骤三、将融合后的原生质体接种于淀粉培养基上培养，根据各个菌株的遗传稳定性和菌落形态筛选得到如权利要求1所述的裂殖壶菌。裂殖壶菌的菌落为乳白、灰白或米黄色，正面隆起，表面光滑、湿润，菌落似凝脂状。裂殖壶菌的显微形态特征：营养细胞呈圆形或椭圆形，直径10-15tmi，内有明显油脂粒，分裂方式为二分裂方式，有二分体、四分体等形态，有菌体聚集现象。

优选的是，产生所述裂殖壶菌的方法，所述步骤二中，首先将黑曲霉CGMCC3.316原生质体在50～65℃下处理1～30min，之后再将两亲本原生质体融合。50～65℃热灭活主要作用在细胞质中，使核糖体或核糖体RNA受到损伤，结果使细胞内的功能蛋白、酶蛋白的合成受到影响或使其变性失活，产生致死作用。灭活的目的是为了标记融合子，即让亲本黑曲霉原生质体CGMCC3.316全部致死，而经过融合后所生长的即为融合二倍体。

优选的是，产生所述裂殖壶菌的方法中，所述淀粉培养基包含：淀粉5～10g/L、氮源3～15g/L和海水晶10～30g/L；其中，所述氮源为玉米浆或酵母粉或蛋白胨中的任意一种或几种。

较优选的是，产生所述裂殖壶菌的方法中，所述淀粉培养基包含：淀粉5～10g/L、蛋白胨2～10g/L、酵母粉1～5g/L和海水晶10～30g/L。

更优选的是，产生所述裂殖壶菌的方法中，所述淀粉培养基为使用高渗PBS缓冲液配制的淀粉培养基，所述高渗PBS缓冲液中磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的浓度为0.2mol/L，氯化钾的浓度为0.7mol/L。由于融合后的原生质体的内部渗透压很高，使用高渗PBS缓冲液配制的淀粉培养基培养，可维持原生质体内外渗透压一致。

一种利用裂殖壶菌生产DHA的方法，将该裂殖壶菌STA-M-3在淀粉培养基中培养，产生DHA。

优选的是，所述的方法中，所述淀粉培养基以海水或人工海水作为无机盐来源，盐度约为15％，以淀粉作为碳源，浓度为5g/L，以玉米浆或酵母抽提物或蛋白胨作为氮源，浓度为2g/L，在培养过程中pH在4-8范围内。

优选的是，所述的方法中，培养过程中，在28℃条件下培养7天。

本发明得到的裂殖壶菌STA-M-3以淀粉作为碳源产生DNA，菌株不用在进行糖化才能利用碳源，相对来说，缩短了DHA的生产周期，而且淀粉相对葡萄糖来说，来源广、价格低廉，因此本发明的裂殖壶菌STA-M-3的产生意义重大，在不改变原有生产工艺、不增加其他设备投资的前提下降低生产成本；且裂殖壶菌STA-M-3遗传稳定性好，产物中不饱和脂肪酸成分单一、产品DHA的质量稳定。

附图说明

图1为本发明所述的裂殖壶菌STA-M-3的油脂气象色谱图；

图2为引物对本发明所述的亲本及其融合子的RAPD的扩增的图谱，其中1是指亲本裂殖壶菌B4D1，2指的是融合子裂殖壶菌STA-M-3，3指的是黑曲霉CGMCC3.316。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：

一种裂殖壶菌Schizochytrium STA-M-3，其分类命名为裂殖壶菌，所述裂殖壶菌被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.9381，保藏时间为：2014年6月25日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例2：

所述裂殖壶菌Schizochytrium STA-M-3是以DHA高产菌株裂殖壶菌B4D1和能够高效利用淀粉黑曲霉CGMCC3.316为出发菌株，利用灭活亲本并用原生质体融合的方式，使双亲本原生质体融合而再生，获得同时具有亲本性状的菌株。

一、实验试剂和培养基：

缓冲溶液PBS：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的浓度为0.2mol/L，pH5.8，121℃灭菌20min。

高渗缓冲液HPBS：PBS缓冲液中添加0.7mol/L的KCl。

预处理剂：于PBS缓冲液中添加0.1％EDTA，121℃灭菌20min。临用前添加0.3％β-巯基乙醇。酶液：裂解酶(Lysing enzyme)购自Sigma公司(写一下型号和规格比较好)。称取裂解酶，悬于HPBS中充分振荡并静置，使之完全溶解，至浓度为5mg/ml。经0.22μ微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱备用。

PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂120g/L；

GYP液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白陈10g/L，酵母粉5g/L，海水晶15g/L，pH自然；

菌丝生长培养基：1.2％葡萄糖，0.2％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄，0.04％NaH₂PO₄，0.1％NH₄NO₃，0.1％微量元素(1.1％ZnSO₄，0.1％FeSO₄，0.6％MnSO₄，0.03％CoCl₂，4％CuSO₄，0.06％H₃BO₃)，pH5.8；

淀粉培养基：可溶性淀粉5g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉1g/L，海水晶10g/L，pH自然；

高渗的淀粉培养基：使用HPBS溶液配制的淀粉培养基。

二、实验方法

一种产生裂殖壶菌的方法，包括如下步骤：

(1)两亲本菌体的制备

黑曲霉菌丝培养：

将黑曲霉CGMCC3.316的原始菌种转接至PDA斜面固体培养基上，待孢子生长成熟后，用PBS洗脱孢子，调整孢子浓度为10⁸个/mL，以10％(v/v)的接种量接入菌丝生长培养基中，250mL三角瓶装液量50mL，摇床转速200r/min，培养温度30℃，培养时间12～15h。收集培养液，经PBS缓冲液洗涤后置于盛有50mL离心管中，3500r/min离心10min。弃上清液，保留菌丝体。

裂殖壶菌菌体培养：

裂殖壶菌B4D1以10％(v/v)的接种量，接种于GYP液体培养基，28℃、180r/min条件下培养32～36h，4000r/min离心，用PBS缓冲液洗涤离心两次，收集菌体。

(2)两亲本原生质体的制备

黑曲霉原生质体的制备：

向步骤(1)得到的黑曲霉菌丝体中按照1g菌丝体加入1mL裂解酶液裂解细胞壁的酶，置于温度为25～40℃的恒温摇床中，50～150r/min振荡酶解30～180min，每隔5～10min吹吸原生质体酶解液以释放原生质体并取样镜检，观察原生质体形成和释放情况。酶解结束后，酶解液经4层高级擦镜纸过滤，滤液置于4℃冷冻离心机中用高渗缓冲液HPBS洗涤两次，再将其悬于高渗缓冲液HPBS中，使细胞数量达到10⁶～10⁷个/mL，即得到黑曲霉原生质体。

裂殖壶菌原生质体制备：

将步骤(1)得到的裂殖壶菌菌体加入预处理剂，按照1g菌丝体加入1mL预处理剂，20～30℃，100～250r/min恒温振荡15～45min，收集后加入裂解酶，置于温度为25～40℃的恒温摇床中，50～200r/min振荡酶解10～120min，然后将酶解后的菌体细胞悬液置于4℃冷冻离心机中用HPBS缓冲液洗涤两次，再将其悬于HPBS缓冲液中，使细胞数量达到10⁶～10⁷个/mL，即得到裂殖壶菌原生质体。

(3)两亲本原生质体融合

于50～65℃下对黑曲酶原生质体灭活1～30分钟，热灭活主要作用在细胞质中，使核糖体或核糖体RNA受到损伤，结果使细胞内的功能蛋白、酶蛋白的合成受到影响或使其变性失活，产生致死作用。灭活的目的是为了标记融合子，即让亲本黑曲霉原生质体全部致死，而经过融合后所生长的即为融合二倍体。黑曲霉原生质体灭活后，将两亲本原生质体悬液在离心管中等量混合，于4℃冷冻离心机中3500r/min离心10min，然后加入配比为30％～60％PEG6000(含0.01～0.04mol/L CaCl₂)融合剂，使细胞数量达到10⁶～10⁷个/mL，混匀后放入30℃恒温水浴摇床上，轻轻振荡5～10min以待融合。取出融合后的原生质体悬液，置于4℃冷冻离心机中用HPBS缓冲液洗涤两次，再经稀释将其悬于HPBS缓冲液中，得到融合后的原生质体。

(4)融合子的检出与筛选

将步骤(3)得到的融合后的原生质体悬液稀释适当倍数后接种于若干个高渗的淀粉平板上，在恒温箱28℃培养3～5d，挑选出能够在高渗淀粉培养基生长的菌株，然后使用淀粉培养基培养挑选出的菌株，根据各个菌株的遗传稳定性和菌落形态筛选得到裂殖壶菌STA-M-3。

实施例3：

一种利用裂殖壶菌STA-M-3生产DHA的方法，将该裂殖壶菌STA-M-3在淀粉培养基中培养，产生DHA。

该淀粉培养基以海水或人工海水作为无机盐来源，盐度约为15‰，以淀粉作为碳源，浓度为5g/L，以玉米浆或酵母抽提物或蛋白胨作为氮源，浓度为2g/L，在28℃条件下培养7天，在培养过程中pH在4-8范围内。

实施例4：

淀粉培养基：可溶性淀粉10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，海水晶15g/L，pH自然。

在如上淀粉培养基上培养裂殖壶菌STA-M-3，产生DNA。

实施例5：

淀粉培养基：可溶性淀粉7g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉3g/L，海水晶30g/L，pH自然。

在如上淀粉培养基上培养挑选出的在高渗的淀粉培养基生长出来的菌株，再结合遗传稳定性和菌落形态得到裂殖壶菌STA-M-3。

实施例6：

融合子产DHA性能测试：

将融合子裂殖壶菌STA-M-3菌株转接到淀粉培养基中于28℃培养7天，其中淀粉培养基包含：可溶性淀粉8g/L，蛋白胨6g/L，酵母粉2g/L，海水晶10g/L，pH自然。收集菌体后，使用气相色谱法检测其产DHA含量，气相色谱法条件如下：

岛津GC-2010气相色谱仪，色谱柱：SP-2560(100.0m×0.25mm×0.20μm)。N2为载气，采用程序升温，起始温度140℃，保持5min，然后以4℃/min的速度升至240℃，保持11min。FID检测器，进样口温度为250℃，检测器温度为280℃。采用分流进样，分流比为30，进样量为1μL。

如图1所示，经气相色谱法检测，融合得到的新型裂殖壶菌具有产DHA能力。而且其可以在淀粉为碳源的培养基上生长，具有双亲本的特性。

实施例7：

融合菌株的RAPD鉴定

用20个10bp的寡核苷酸引物对亲本基因组DNA进行PCR扩增，从中筛选扩增条带清晰、重复性好、多态性高的8个引物，分别为P1(GTTTCGCTCC)、P4(GGACTGGAGT)、P5(TGCGCCCTTC)、P10(CTGCTGGGAC)、P11(GTAGACCCGT)、P15(GGAGGGTGTT)、P19(ACCCCCGAAG)、P20(GGACCCTTAC)，用于全部样本的扩增。反应体系(25μL)：DNA模板：0.5μL，2×EasyTaq PCR superMix：12.5μL，随机引物：0.5μL，无菌双蒸水：11.5μL。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，37℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环后，72℃延伸8min，4℃保存。PCR扩增反应结束后，采用1×TAE电泳缓冲液，用1％琼脂糖凝胶在电压为120V的电场中电泳20min，EB染色。在紫外凝胶成像仪上观察并拍照，结果见图2。由图2可知，融合子用引物P1、P10、P15、P19扩增出的条带部分和黑曲霉相同，用引物P4、P5、P10、P11、P20扩增出的条带部分和裂殖壶菌相同，表明在基因水平上，裂殖壶菌与黑曲霉发生了重组，得到了融合菌株STA-M-3。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.一种裂殖壶菌Schizochytrium STA-M-3，其特征在于，所述裂殖壶菌被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.9381，保藏时间为：2014年6月25日。

2.一种产生如权利要求1所述的裂殖壶菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、以裂殖壶菌B4D1和黑曲霉CGMCC3.316作为两亲本，制备两亲本的原生质体；

步骤二、将两亲本的原生质体融合；

步骤三、将融合后的原生质体接种于淀粉培养基上培养，得到如权利要求1所述的裂殖壶菌。

3.如权利要求2所述的产生如权利要求1所述的裂殖壶菌的方法，其特征在于，所述步骤二中，首先将黑曲霉CGMCC3.316原生质体在50～65℃下处理1～30min，之后再将两亲本原生质体融合。

4.如权利要求2所述的产生如权利要求1所述的裂殖壶菌的方法，其特征在于，所述淀粉培养基包含：淀粉5～10g/L、氮源3～15g/L和海水晶10～30g/L；其中，所述氮源为玉米浆或酵母粉或蛋白胨中的任意一种或几种。

5.如权利要求4所述的产生如权利要求1所述的裂殖壶菌的方法，其特征在于，所述淀粉培养基包含：淀粉5～10g/L、蛋白胨2～10g/L、酵母粉1～5g/L和海水晶10～30g/L。

6.如权利要求4所述的产生如权利要求1所述的裂殖壶菌的方法，其特征在于，所述淀粉培养基为使用高渗PBS缓冲液配制的淀粉培养基，所述高渗PBS缓冲液中磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的浓度为0.2mol/L，氯化钾的浓度为0.7mol/L。

7.一种利用如权利要求1所述的裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于，将权利要求1所述的裂殖壶菌在淀粉培养基中培养，产生DHA。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述淀粉培养基以海水或人工海水作为无机盐来源，盐度约为15‰，以淀粉作为碳源，浓度为5g/L，以玉米浆或酵母抽提物或蛋白胨作为氮源，浓度为2g/L，在培养过程中pH在4-8范围内。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，培养过程中，在28℃条件下培养7天。